Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro Impactmodel om subletale chondrocytbeschadiging te genereren bij explantaten van runderkraakbeen

951 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68061

⸱

27 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 3School of Mechanical Engineering, Purdue University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Om de reactie op chondrocytenletsel op een mechanische overbelasting van kraakbeen beter te begrijpen, beschrijft het protocol de ontwikkeling van een ex vivo kraakbeenimpactmodel dat 24 uur lang subletaal was.

Samenvatting

Posttraumatische artrose (PTOA) is een veel voorkomende, degeneratieve en pijnlijke progressieve gewrichtsaandoening die meestal ontstaat na een aanzienlijk gewrichtstrauma en die meer dan 6 miljoen Amerikanen treft. Door impact geïnduceerd kraakbeentrauma resulteert in een reactie op chondrocytletsel die culmineert in PTOA. Inzicht in de moleculaire gebeurtenissen die verband houden met chondrocytbeschadiging is noodzakelijk om therapieën te ontwikkelen om PTOA te voorkomen of de progressie ervan te vertragen. Om dit mogelijk te maken, werd een ex vivo kraakbeenimpactmodel ontwikkeld dat 24 uur lang subletaal was. Osteochondrale explantaten werden geoogst uit rundermetacarpofalangeale gewrichten en een valtoren werd gebruikt om impactbelastingen aan de explantaten te leveren. Om ervoor te zorgen dat de spanning en impact relatief gelijkmatig op het gewrichtskraakbeen werden uitgeoefend, werden explantaten geplaatst met het botoppervlak naar boven gericht en werd het bot van bovenaf beïnvloed. Er werden verschillende belastingen uitgeoefend op de explantaten vanaf sledehoogtes van 4,0 cm, 4,5 cm en 5,0 cm, wat resulteerde in gemiddelde piekspanningen van respectievelijk 10,87 ± 1,84 MPa, 11,69 ± 0,67 MPa en 12,98 ± 0,75 MPa. De studie analyseerde de rol van de aanwezigheid van subchondraal bot in kraakbeen tijdens de cultuur na de impact en het effect van het gebruik van een gemonteerde of losse houder tijdens de impact, waarbij de levensvatbaarheid van cellen en apoptose werden beoordeeld. Gewrichtskraakbeen met een impact vanaf 4,5 cm, gecombineerd met een gemonteerde houder en onmiddellijke botverwijdering, vormde het optimale model om kraakbeenletsel te veroorzaken met minimale celdood 24 uur na de impact.

Inleiding

Posttraumatische artrose (PTOA) is een slopende ziekte die meer dan 5 miljoen volwassenen in de Verenigde Staten treft1. Een enkele traumatische impact op het kraakbeen kan een chondrocytletselreactie veroorzaken, wat leidt tot vroeg optredende symptomen en een levenslange strijd met gewrichtspijn en disfunctie2. Kraakbeen heeft weinig tot geen intrinsiek herstelvermogen en daarom bestaat er een onvervulde behoefte om therapieën te ontwikkelen om de progressie van de ziekte te wijzigen3. Omdat PTOA gecorreleerd is met een enkele, duidelijk gedefinieerde traumatische gebeurtenis, is er een mogelijkheid om in te grijpen voordat de ziekte vordert. De ontwikkeling van deze behandelingen wordt echter belemmerd door de lacune in de kennis over de moleculaire signalering die de reactie op chondrocytenletsel reguleert en leidt tot posttraumatische artrose 2,3,4. Een beter begrip van de moleculaire gebeurtenissen na chondrocytenbeschadiging kan helpen bij het ontwerpen van nieuwe therapeutische behandelingen die de reactie op chondrocytletsel redden en de ontwikkeling van PTOA voorkomen of vertragen 2,5,6.

Om de moleculaire signalering van chondrocytenbeschadiging beter te begrijpen, heeft eerder onderzoek gebruik gemaakt van valtorens of soortgelijke apparaten die mechanisch op kraakbeenexplantaten slaan, zodat een verwondingsreactie wordt geïnitieerd. Deze studies hebben getracht vele aspecten van deze respons te karakteriseren, waaronder veranderingen in mechanische eigenschappen en structuur 7,8, matrixschade en synthese 6,9,10,11, mitochondriale disfunctie12,13,14,15, ionentransportroutes 16,17,18,19, en genexpressie 9,11,20,21,22,23. In veel van deze onderzoeken werd de levensvatbaarheid van cellen echter niet gerapporteerd of was deze in het gedrang gekomen, met in sommige onderzoeken 50% of lagere cellevensvatbaarheid 24,25,26. Verstorende effecten van een lage cellevensvatbaarheid kunnen het moeilijk maken om de letselrespons te bestuderen. Dood van chondrocyten die onmiddellijk volgt op gewrichtstrauma is onomkeerbaar, maar therapieën die chondrocytenletsel behandelen, verminderen de daaropvolgende PTOA27. Om moleculaire veranderingen te identificeren die verband houden met chondrocytenbeschadiging en niet met een verlies van levensvatbare cellen, is een kraakbeenimpactmodel nodig dat de levensvatbaarheid van chondrocyten gedurende een bepaalde periode handhaaft. Bovendien zou een kraakbeenimpact die een chondrocytletselrespons genereert die relatief uniform is in het hele kraakbeenweefsel, de meest consistente resultaten opleveren bij het analyseren van celgedrag.

Het doel van de studie was het ontwikkelen en karakteriseren van een kosteneffectief ex vivo impactletselmodel voor gewrichtskraakbeen dat het vermogen behoudt om signaalroutes te bestuderen die inherent zijn aan de respons op acuut kraakbeenletsel. Bovendien zou een dergelijk model kunnen worden gebruikt om mogelijke behandelingen te evalueren om de letselrespons te redden. Om dit te bereiken, ontwikkelden we eerst een steriele techniek om kraakbeenexplantaten te oogsten van metacarpofalangeale gewrichten van runderen van dieren die volgroeid zijn met het skelet met behulp van een boorbit met diamantpunt dat op een kolomboormachine is gemonteerd. Metacarpofalangeale gewrichten worden door het slachthuis weggegooid wanneer de dieren worden verwerkt voor voedselconsumptie, waardoor dit gewricht een gemakkelijk toegankelijke en goedkope bron van weefsel is. Vervolgens hebben we een impactletselmodel opgesteld waarbij het osteochondrale monster in een houder onder een droptower-apparaat werd geplaatst. In dit model werden de osteochondrale monsters geplaatst met het gewrichtsoppervlak naar beneden gericht op een #8 spiegelgepolijst roestvrijstalen oppervlak, en het bot werd onderworpen aan een impact van bovenaf, waardoor een relatief uniforme belasting op het kraakbeenweefsel werd afgeleverd. Impactparameters die de levensvatbaarheid van chondrocyten gedurende 24 uur na de impact behouden, terwijl ze nog steeds een apoptotische moleculaire letselrespons veroorzaken, werden bepaald. Houders die verschillende hoeveelheden zijwaartse beweging van het monster tijdens de impact mogelijk maakten, werden beoordeeld op hun effect op de levensvatbaarheid van de cellen en apoptose; Ten slotte werd het effect van het verwijderen van kraakbeen uit het subchondrale bot na de botsing geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor het gebruik van runderledematen verkregen uit een plaatselijk slachthuis was geen ethische goedkeuring vereist, aangezien de weefsels post-mortem werden verzameld van dieren die voor voedselconsumptie waren verwerkt.

1. Oogst van osteochondrale explantatie

  1. Steriliseer de volgende materialen met behulp van een autoclaaf voorafgaand aan de oogst van de explantatie: fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; ongeveer 1 l per gewricht), boor, waterdraaiadapter, een autoclaveerbare wasfles, een scalpelhandvat, twee pincetten en een autopsiezaagblad.
  2. Plaats een weefselkweekkap met kolomboormachine en bankschroef in een bassin om PBS te bevatten. Monteer de boor en de zwenkadapter in de kolomboormachine en sluit het mondstuk van de draaibare adapter met een slang aan op een fles gevuld met gesteriliseerd PBS. Zet de autopsiezaag in elkaar en plaats deze in de afzuigkap (Figuur 1A-B).
  3. Spreid wegwerponderpads uit in een stapel in de weefselkweekkap, één voor elk gewricht.
    OPMERKING: Onderpads absorberen PBS en gewrichtsvloeistof die kunnen druppelen tijdens het openen van het gewricht. Door meerdere onderpads op elkaar te stapelen, kan de toplaag gemakkelijk worden verwijderd wanneer deze te nat wordt, waardoor een schone en droge werkruimte ontstaat tijdens de procedure.
  4. Bereid een reageerbuis van 50 ml met 70% ethanol en nog een reageerbuis van 50 ml met 0,13% v/v betadine in PBS voor en plaats deze in de kap. Plaats de tang en het handvat van de scalpel in de ethanol reageerbuis om de steriliteit te behouden tijdens het hanteren van weefsel en plaats een steriele celkweekplaat met 6 putjes aan de achterkant van de kap.
  5. Bereid 3 ml celkweekmedia voor per verwacht monster. Kweekmedia bestaan uit Modified Eagle's Medium (DMEM) met 0,9 mM natriumpyruvaat, insuline, transferrine en selenium (ITS), 50 mg/ml L-ascorbinezuur, minimaal essentieel medium (MEM) niet-essentiële aminozuren, penicilline, streptomycine en amfotericine B. Voeg L-ascorbinezuur en ITS toe op de dag van gebruik28.
  6. Verkrijg binnen 6 uur na het offeren rundervoorpoten van dieren met een volwassen skelet van een plaatselijk slachthuis. Bewaar weefsel op ijs tijdens transport.
  7. Isoleer het metacarpofalangeale gewricht door de hoef te verwijderen met een vleeslintzaag zonder het gewrichtskapsel te openen. Verwijder de huid met behulp van #22 scalpelmesjes zonder de gewrichtscapsule te doorboren.
  8. Spoel elk been buiten de bioveiligheidskast grondig af met koud water om vuil te verwijderen en smeer in met betadine om te desinfecteren.
  9. Open in de weefselkweekkap de gewrichtscapsule met behulp van een nieuw #22 scalpelmes. Isoleer het distale gewricht en houd gewrichtskraakbeen gehydrateerd met PBS uit een wasfles (Figuur 1C). Bedek het gewrichtskraakbeen met steriel gaasje gedrenkt in PBS om de hydratatie te behouden.
  10. Isoleer het distale metacarpofalangeale gewricht verder door de middenvoet door te snijden met de autopsiezaag (Figuur 1D). Plaats het distale gewricht in de bankschroef met het bedekte kraakbeen naar boven gericht en draai vast tot het goed vastzit. Bevochtig tijdens het hele proces het gaas op het kraakbeen regelmatig met PBS.
  11. Vouw het gaas weg van één condylus en pas de positie van de bankschroef zo aan dat de boor zich boven het vlakste gebied van het gewrichtsoppervlak bevindt (Figuur 1E).
  12. Open de fles zodat PBS door de beluchtingsbit kan stromen. Gebruik een wasfles om het weefsel continu te hydrateren met PBS en koel de monsters af tijdens het boren.
    LET OP: PBS uit de gistfles en de wasfles heeft een verkoelend effect tijdens het ontkernen.
  13. Kern langzaam in de condylus door de boor in het oppervlak van de condylus te drukken. Laat de druk regelmatig ontsnappen en laat de warmte afvoeren. Ga door totdat de kerndiepte ongeveer 2 mm in het subchondrale bot is. Herhaal dit voor elke kant (Figuur 1E).
    OPMERKING: Tekenen van oververhitting zijn onder meer snelle verdamping van vloeistof of een brandlucht.
  14. Gebruik de autopsiezaag om osteochondrale kernen los te maken door het bot evenwijdig aan het gewrichtskraakbeenoppervlak te snijden en tijdens het snijden PBS uit de wasfles naar de interface van de autopsiezaag en het osteochondrale bot te blijven knijpen. Houd tijdens deze stap het bevochtigde gaasje op het oppervlak van het gewrichtskraakbeen om uitdroging te voorkomen.
  15. Bewaar osteochondrale kernen (figuur 1F) in verdunde betadineoplossing (zie stap 1.3) totdat alle gewrichten zijn verwerkt.
  16. Spoel osteochondrale kernen in PBS en breng de monsters over in individuele putjes van een steriele plaat met 6 putjes met 3 ml voorverwarmde kweekmedia (DMEM met 0,9 mM natriumpyruvaat, insuline-transferrine-selenium (ITS), 50 mg/ml L-ascorbinezuur, niet-essentiële aminozuren, penicilline, streptomycine en amfotericine B)28. Bewaar de monsters in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 tot de inslagprocedure van de volgende dag.

2. Impact van osteochondrale explantatie

  1. Fabriceer een roestvrijstalen slaghouder met een spiegelgepolijst slagoppervlak (aanvullende afbeelding 1 en aanvullende afbeelding 2) en boor de bijbehorende gaten in de grondplaat van de valtoren (aanvullende afbeelding 3).
  2. Steriliseer de volgende materialen met behulp van een autoclaaf voorafgaand aan de impactprocedure: roestvrijstalen bolvormige impactorkop met een diameter van 15 mm, roestvrijstalen houder met spiegelgepolijst impactoppervlak, 4 6/32 schroeven, 4 ringen, pincet.
  3. Plaats een valtoren die eerder was ontworpen en gefabriceerd29 in een bioveiligheidskast. Gebruik voor dit onderzoek een valtoren met een bolvormige botskop met een diameter van 15 mm gemonteerd op een wagen die is uitgerust met een loadcel en versnellingsmeter (figuur 2A), met een totale wagenmassa van 358,4 g.
  4. Bevestig de houder aan de grondplaat van de valtoren met vier geautoclaveerde schroeven (Figuur 2B). In dit onderzoek werden houders met ronde openingen van 8,7 mm en een diameter van 9,1 mm getest.
  5. Plaats een osteochondrale kern in de houder (aanvullende afbeelding 1, aanvullende afbeelding 2, aanvullende afbeelding 3) onder de kop van het botslichaam van de valtoren met het bot naar boven.
    OPMERKING: Voor een meer homogene belasting is gekozen voor het plaatsen van de osteochondrale kern met het bot naar boven en het gewrichtsoppervlak naar beneden30.
  6. Stel de valtorenwagen in op de gewenste hoogte ten opzichte van de bovenkant van het bot. Bepaal de hoogte van de valtoren bij benadering uit pilotstudies. In dit onderzoek werden hoogtes van 4,0, 4,5 en 5,0 cm geëvalueerd.
  7. Klik op de Start-knop op de data-acquisitiesoftware (aanvullend coderingsbestand 1) net voordat u de drop-tower-wagen loslaat door de spilstop los te maken (Figuur 2A) en de impactorkop onder het gewicht van de zwaartekracht op het monster te laten vallen. Til de slede onmiddellijk op en laat deze op de spindelstop rusten.
    OPMERKING: Tijdens de botsing worden gegevens verzameld op 100 kHz met behulp van data-acquisitiesoftware die is aangesloten op een data-acquisitiemodule, die signalen registreert van een loadcel die tussen de kop van het botslichaam en de wagen is geplaatst, evenals van een versnellingsmeter. Hoewel we de slede zo snel mogelijk na de botsing optillen, heeft deze geen anti-rebound-functie of ander mechanisme om een tweede botsing te voorkomen.
  8. Plaats het .txt bestand dat door de data-acquisitiesoftware is gegenereerd in dezelfde map als de Matlab-gegevensanalysecode (Supplementary Coding File 2, ook beschikbaar op https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) en voer de data-analysecode uit om onbewerkte gegevens te filteren en impactparameters te berekenen.
    OPMERKING: De gegevensanalysecode gebruikt een kraakbeendikte van 0,563 mm om de impactenergie te berekenen. Dit werd bepaald als de gemiddelde kraakbeendikte genomen van > 50 locaties op elk van de vijf monsters in een afzonderlijk onderzoek met behulp van de naaldmethode31 en een Biomomentum Mach-1 mechanische tester. Impactparameters worden berekend zoals eerder beschreven32.
  9. Verwijder kraakbeen van bot met een #11 scalpelmes, indien van toepassing. Breng het monster terug naar de media en bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 tot de beeldvorming op de volgende dag.
    OPMERKING: Het effect van het verwijderen van kraakbeen uit het bot onmiddellijk na de botsing of 24 uur na de botsing werd in dit onderzoek beoordeeld.

3. Karakterisering van de levensvatbaarheid van cellen in kraakbeenmonsters

  1. Verwijder indien nodig kraakbeen van het bot. Snijd het kraakbeenmonster doormidden met een scherp scalpel. Vermijd het maken van meerdere sneden; Streef naar een enkele incisie om een gladde rand te garanderen.
  2. Dompel elk half exemplaar van belang onder in een oplossing bestaande uit 5 μM ethidiumhomodimeer en 2,5 μM calcien AM in PBS. Bescherm tegen licht en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om de levend-dode kleuring te voltooien.
  3. Spoel monsters 2x met PBS en bewaar monsters in PBS tot beeldvorming. Afbeelding zo snel mogelijk nadat de kleuring is voltooid.
  4. Zet het kraakbeenmonster rechtop op een paar druppels PBS in een microscopieschaaltje zodat de volledige halve cirkel zichtbaar is vanaf de voorkant van de microscoop. Maak foto's met een omgekeerde confocale microscoop. Buig het kraakbeen lichtjes met een tang als het niet zelfstandig rechtop kan staan.
  5. Met behulp van FIJI, een distributie van ImageJ met gebundelde plug-ins33, converteert u de afbeelding eerst naar 8-bits door op Afbeelding te klikken > Type > 8-bit. Stel vervolgens de drempel in onder Afbeelding > Drempel > aanpassen en klik op Toepassen. Voer vervolgens de functie Watershed uit onder Proces > binair en voer Deeltjes analyseren uit... onder Analyseren voor zowel het groene als het rode kanaal. Analyseer afbeeldingen die zijn vastgelegd op een consistente z-hoogte voor elk exemplaar voor nauwkeurige vergelijkingen tussen groepen.
  6. Bereken de levensvatbaarheid van cellen door het aantal levende cellen te delen door het totale aantal cellen in de steekproef.

4. Karakterisering van apoptose in kraakbeenspecimens

  1. Dompel elk half exemplaar van belang onder in 8 μM Caspase-3/7 groen detectiereagens in PBS. Beschermen tegen licht en 30 minuten incuberen bij 37 °C.
  2. Was monsters met PBS 3x. Fixeer de bevlekte monsters door gedurende 15 minuten te incuberen in 4% paraformaldehyde (PFA). Was opnieuw met PBS en bewaar in PBS tot beeldvorming. Afbeelding binnen 24 uur na kleuring.
  3. Beeld met confocale microscoop (zie stap 3.4 hierboven). Voor geldige vergelijkingen van fluorescentie-intensiteit tussen groepen, moet u consistente beeldvormingsparameters aanhouden voor alle monsters, inclusief objectieflens, excitatielaservermogen, versterking van de fotomultiplicatorbuisdetector, pinhole-grootte, optische plakdikte, scansnelheid, lijnmiddeling en beeldresolutie.
  4. Selecteer met de FIJI-extensie van ImageJ de optie Gemiddelde grijswaarde onder het menu Metingen analyseren > instellen.
  5. Gebruik de tool Veelhoeksectie om het hele gebied van het monster in een afbeelding te schetsen. Voer de functie Meten uit in het menu Analyseren en noteer de gemiddelde grijswaarde, met behulp van dezelfde verwerkingsparameters in verschillende groepen.
  6. Gebruik de tool Veelhoeksectie om een gebied van de afbeelding te selecteren dat het voorbeeld niet bevat en voer de functie Meten opnieuw uit. Noteer dit als de gemiddelde grijswaarde op de achtergrond.
  7. Bereken de fluorescentie-intensiteit door de gemiddelde grijswaarde op de achtergrond af te trekken van de gemiddelde grijswaarde van de steekproef.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De mechanische impactbelasting op osteochondrale explantaten werd uitgeoefend met behulp van een valtoren met sledehoogtes van 4,0 cm, 4,5 cm en 5,0 cm boven het weefsel (n = 3 of 4). Het vergroten van de hoogte van de wagen voordat deze werd losgelaten, resulteerde in hogere botskrachten, gemiddelde piekspanningen, belastingssnelheden en botsenergieën (tabel 1).

We probeerden een ex vivo model voor kraakbeenletsel te ontwikkelen dat ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van deze studie was het karakteriseren en optimaliseren van een kraakbeenimpactmodel dat de levensvatbaarheid van cellen niet in gevaar brengt voor het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen na beschadiging van chondrocyten, met als uiteindelijk doel een behandeling te ontwikkelen die de gewonde cellen redt om PTOA-progressie te voorkomen. Om dit doel na te streven, werd een mechanische belasting afgeleverd op het botgedeelte van osteochondrale kernen, waardoor de belasting w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door NIH NIAMS Grant R21 AR080255. De auteurs willen Kevin Carr bedanken voor het ter beschikking stellen van zijn expertise op het gebied van machinale bewerking en fabricage aan dit project. De auteurs erkennen de Mooresville Butcher Shop (Mooresville, IN) voor het leveren van weefsel voor deze studie. De auteurs danken het personeel van de kernfaciliteit van het Indiana Center for Biological Microscopy voor hun hulp bij confocale microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#11 steriele scalpelklingThermo Fisher Scientific10-001-823Verwijder kraakbeen van het bot
#22 steriele scalpelklingThermo Fisher Scientific10-001-833Verwijder huid van boviene weefsels en open de gewricht door de ligamenten te snijden
10-1000 ul pipette tipsThermo Fisher Scientific02-707-411Meet en breng over PBS, kweekmedia en andere oplossingen
200 proof ethanolThermo Fisher Scientific03-007-647Gebruikt om 70% ethanol voor te bereiden als steriliserend middel om chirurgische instrumenten te desinfecteren en een steriele omgeving te behouden tijdens weefselvoorbereiding en verwerking.
50 mL centrifuge tube (steriele)Thermo Fisher Scientific339652Gebruikt om media en monsters op te slaan
5-gallon carboyThermo Fisher Scientific04-355-233Steriele PBS-container die via een slang op de draaibare adapter is aangesloten.
6-well plate (steriele)Thermo Fisher Scientific140685Gebruikt om osteochondrale kernen tijdelijk op te slaan in een steriele omgeving met voorverwarmd medium tijdens verzameling, incubatie vóór impactstudies en beeldvorming
AccelerometerKistler8743A5Gebruikt om de versnelling tijdens een impact te meten
Apoptosekleuringskit (CellEvent)Thermo Fisher ScientificC10423Gebruikt om apoptotische cellen te detecteren en visualiseren
Autoclaveerbare spoelflessenNalgene2405-0500Vul met steriele PBS om het kraakbeen te hydrateren tijdens weefseloogst.
AutopsiezaagMopecBD 810Verwijder eventueel overtollig bot na het openen van het gewricht of het extraheren van de osteochondrale kern
AutopsiezaagbladMopecBD 101Gebruikt voor het snijden door bot om osteochondrale explanten te isoleren en los te maken.
BetadineAvrio Health L.P.n/aGebruikt voor desinfectie van de buitenkant van boviene monsters voordat ze naar de kap worden verplaatst en verdund voor desinfectie van de uiteindelijke osteochondrale monsters.
Transparante 4 ft slangn/an/aGebruikt om de 5-liter carboy met PBS aan de draaibare adapter van de boorpers te verbinden om PBS te transporteren.
Boorpunt voor het nemen van kernmonstersUKAM Industrial Superhard Tools3EDCD7160Gebruikt voor het extraheren van osteochondrale explanten uit bot door in het gewrichtskraakbeen en het subchondrale bot te boren. - diameter van het boorpunt: 7/16" (Electroplated Diamond Core Drills)
Crescent-sleutelMcMaster Carr5362A1Gebruikt om de klem (die het gewricht op zijn plaats houdt) en het boorpunt voor het nemen van kernmonsters strakker te draaien
Steriele wegwerppipettenThermo Fisher Scientific13-678-11Meet en breng PBS en kweekmedium over
Steriele wegwerponderlaagThermo Fisher Scientific23-666-062Gebruikt om het werkblad af te dekken om water en vloeistoffen te absorberen tijdens het oogsten voor meer gemak en hygiëne
Weggewerp vacuümfiltereenhedenThermo Fisher ScientificSCGP00525Filter PBS en andere oplossingen
BoorpersWEN433TV 3.25-InchBreng kracht aan om osteochondrale monsters te boren - WEN 433TV 3.25-Inch Industrial Strength Benchtop
Draaibare boorpersbank met hoekinstellingWENTV434Bevestigt osteochondrale monsters in een vaste positie op de gewenste hoek tijdens het kernen.
Drop towerop maat gemaaktn/aGebruikt om de monsters te beïnvloeden
FIJI (ImageJ Extension)n/an/aSoftware die wordt gebruikt voor het verwerken en analyseren van microscoopbeelden, inclusief cellevensvatbaarheid en apoptosekwantificering
PincetFisherbrand12-000-163Gebruikt voor het snijden van weefsel in de kap, het openen van het gewricht en het overbrengen van de monsters
Gaas (steriele)Dukal6412Gebruikt om het gewrichtskraakbeen te hydrateren na het openen van het gewrichtskapsel
Glazen fles van 1 liter voor mediaSigma AldrichCLS13951LHTCGebruikt om steriele PBS op te slaan
HandschoenenThermo Fisher Scientific19-130-1597DGebruikt om het verzamelteam te beschermen
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Gibco41400-045Mediasupplement
LabVIEW data-acquisitiesoftwareNational Instrumentsn/aVang gegevens op van de krachtcel en de accelerometer tijdens impacttesten voor latere analyse.
L-ascorbinezuurMerckA4403Mediasupplement
Laser confocale scanmicroscoopOlympusFV1000DGebruikt om hoogwaardige, driedimensionale beelden van gekleurd weefsel te maken.
Live and dead assaykleuringskitThermo Fisher ScientificL3224Gebruikt om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen in weefselmonsters om de cellevensvatbaarheid te beoordelen
KrachtcelKistler9712B5000Gebruikt om de kracht te meten die tijdens een impact wordt toegepast.
MATLABThe MathWorks Inc.n/a
VleesbandzaagSkymsenMSKLEVerwijder het carpallaagje van boviene monsters
Micropipet 10-100 uLThermo Fisher ScientificFBE00100Meet en breng PBS en kweekmedium over
Minimale essentiële medium (MEM) niet-essentiële aminozuuroplossingGibco11140-050Mediasupplement
Gemodificeerd Eagles medium (DMEM)Gibco10566-016Osteochondrale explant

Referenties

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
  2. Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
  3. Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
  4. Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
  5. Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
  6. Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
  7. Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
  8. Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
  9. Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
  10. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  11. Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
  12. Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
  13. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
  14. Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
  15. Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
  16. Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
  17. Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
  18. Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  19. Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
  20. Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
  21. Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
  22. Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
  23. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
  24. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  25. Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
  26. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
  27. Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
  28. Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
  29. Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
  30. Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
  31. Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
  32. Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Kraakbeenslagmodelposttraumatische artrosetoepassing van mechanische belastingosteochondrale explantatencellevensvatbaarheidsassayapoptotische signaleringdrop tower-technieksubchondraal bot
In vitro Impactmodel om subletale chondrocytbeschadiging te genereren bij explantaten van runderkraakbeen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.