Fluorescentievisualisatie met één molecuul van DNA-polymerasedynamiek bij G-quadruplexen

Summary

Dit protocol schetst een op fluorescentiemicroscopie gebaseerde DNA-replicatietest met één molecuul, waardoor real-time visualisatie van interacties tussen DNA-polymerasen en obstakels zoals G-quadruplex-structuren mogelijk is.

Abstract

Het vermogen van eiwitten die betrokken zijn bij eukaryote DNA-replicatie om obstakels te overwinnen - zoals eiwitten en DNA-'wegversperringen' - is van cruciaal belang voor het waarborgen van getrouwe genoomduplicatie. G-quadruplexen zijn nucleïnezuurstructuren van hogere orde die zich vormen in guaninerijke DNA-gebieden en waarvan is aangetoond dat ze als obstakels fungeren en de genomische onderhoudsroutes verstoren. Deze studie introduceert een real-time, op fluorescentiemicroscopie gebaseerde methode om DNA-polymerase-interacties met G-quadruplex-structuren te observeren. Korte, geprepareerde DNA-oligonucleotiden die een G-quadruplex bevatten, werden geïmmobiliseerd op gefunctionaliseerde glazen dekglaasjes in een microfluïdische stroomcel. Fluorescerend gelabelde DNA-polymerasen werden geïntroduceerd, waardoor hun gedrag en stoichiometrie in de loop van de tijd konden worden gevolgd. Deze benadering maakte het mogelijk om het polymerasegedrag te observeren terwijl het werd vastgehouden door een G-quadruplex. In het bijzonder werd met behulp van fluorescerend gelabeld gistpolymerase-δ vastgesteld dat bij het tegenkomen van een G-quadruplex, het polymerase een continue cyclus van binden en ontbinden ondergaat. Deze test met één molecuul kan worden aangepast om interacties tussen verschillende DNA-onderhoudseiwitten en obstakels op het DNA-substraat te bestuderen.

Introduction

DNA-polymerasen zijn enzymen die de opname van nucleosidetrifosfaten katalyseren om DNA 1,2,3,4,5 te dupliceren. Als zodanig spelen ze een sleutelrol in essentiële DNA-onderhoudsprocessen, waaronder DNA-replicatie ^6,7,8 en reparatie ^9,10,11,12. DNA-polymerasen moeten het genoom nauwkeurig en efficiënt repliceren om de genomische integriteit te waarborgen en de accumulatie van mutaties in het genoom te voorkomen. Tijdens de synthese stuiten polymerasen vaak op "wegversperringen" zoals DNA-gebonden eiwitten of secundaire DNA-structuren¹³. Deze wegversperringen kunnen de progressie van polymerase vertragen of zelfs blokkeren¹⁴. Het overwinnen van deze wegversperringen is belangrijk om getrouwe genoomduplicatie te garanderen, aangezien het nalaten hiervan kan leiden tot genomische instabiliteit^15,16.

Een belangrijke klasse van wegversperringen zijn G-quadruplexen (G4), niet-canonieke secundaire DNA-structuren waarvan is aangetoond dat ze zich vormen in guaninerijke sequenties binnen het menselijk genoom¹⁷. Er zijn meer dan 700.000 verschillende sequenties in het menselijk genoom die in staat zijn om een G4 te vormen, inclusief regio's binnen telomeren en oncogenpromotors¹⁸. Deze DNA-structuren nemen verschillende conformaties aan, afhankelijk van de nucleotidesequentie, de lengte en het gebonden metaalkation 19,20,21. Deze diversiteit betekent dat polymerasen een reeks verschillende G4-topologieën moeten overwinnen, mogelijk met verschillende mate van efficiëntie. Het is aangetoond dat het falen van polymerasen om een G4-structuur te overwinnen of te omzeilen de progressie van de replicatievork in vivo belemmert, wat leidt tot genomische instabiliteit²². In vitro studies hebben aangetoond dat G4-structuren gistpolymerasen kunnen blokkeren of volledig kunnen blokkeren 23,24,25,26,27. Het vermogen van G4-structuren om DNA-polymerasen te blokkeren of te blokkeren is volledig afhankelijk van hun kinetische en thermodynamische stabiliteit, waarbij sommige polymerasen in staat zijn om bepaalde G4's²⁸ te ontvouwen. Hoewel deze studies inzicht geven in het vermogen van de polymerasen om G-quadruplex-wegversperringen te overwinnen, missen ze het vermogen om het gedrag van de polymerase direct te visualiseren bij het tegenkomen van een G4. Het lot van de polymerasen - of ze gebonden blijven, eraf vallen of dynamisch uitwisselen - bepaalt welke stroomafwaartse processen toegankelijk zijn om de G4 op te lossen.

In deze studie werd een op fluorescentie gebaseerde single-molecule microscopietest ontwikkeld om DNA-polymerasebinding met G4-structuren direct in realtime te visualiseren en te monitoren. Deze test omvat het vastbinden van G4-vormende DNA-sjablonen aan een gebiotinyleerd dekglaasje in een microfluïdische stroomcel, waar fluorescerend gelabelde DNA-polymerasen kunnen worden geïntroduceerd om DNA-synthese te starten. Door de fluorescentie van de polymerasen in de loop van de tijd te meten, kan hun gedrag bij het tegenkomen van een G4-structuur direct worden waargenomen. De G4-structuur die in het c-MYC-kankeroncogen werd gevonden, werd voor deze test gekozen vanwege de hoge mate van stabiliteit. Dit protocol kan nu worden aangepast om het gedrag van een verscheidenheid aan polymerasen in alle levensdomeinen die verband houden met verschillende G4-topologieën en -stabiliteiten te catalogiseren. Deze test biedt een innovatieve en high-throughput benadering om de mechanismen op te helderen waarmee DNA-polymerasen door DNA-obstakels navigeren, en biedt een krachtig hulpmiddel om het begrip van de polymerasedynamiek te vergroten.

Protocol

Nadere gegevens over de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Circulaire dichroïsmespectroscopie

OPMERKING: Voorafgaand aan de ontwikkeling van de test was het noodzakelijk om circulaire dichroïsme (CD)-spectroscopie uit te voeren op de geselecteerde G4-sequentie om een correcte vouwing te garanderen. De 22 nt-sequentie (5′-TGAGGGTGGGGAGGGGGGAA-3") vormt de G4-structuur die is afgeleid van het c-MYC-kankeroncogen. CD-spectroscopie werd ook uitgevoerd op een controlesequentie (5′- TGAGTGTGAAGACGATGTAGAA -3) waarvan de belangrijkste nucleotiden zijn gewijzigd die de vorming van G4 voorkomen.

1. Om de DNA-sjablonen voor te bereiden op CD-spectroscopie, voegt u 40 μL van 100 μM van de 22 nt-sjablonen toe aan 360 μL Tris-HCl (pH 8,0), ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (TE) buffer aangevuld met 200 mM kaliumchloride (KCl). Een uiteindelijke DNA-concentratie van 10 μM is gewenst voor CD-spectroscopie-experimenten.
   OPMERKING: De aanwezigheid van K^+- ionen is essentieel voor het stabiliseren van de G4-structuur in de sjabloon.
2. Verwarm de DNA-oplossingen tot 95 °C in een digitaal droogbad gedurende 15 minuten. Als u klaar bent, koelt u de oplossingen een nacht langzaam af door het verwarmingsblok in polystyreen te plaatsen. Dit langzame afkoelproces is verantwoordelijk voor het opvouwen van de G4.
3. Breng 400 μl van de G4-vormende en controlesequentieoplossingen over op een kwartscuvet met een gasdichte spuit met een padlengte van 0,1 cm. Vul de cuvet langzaam om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
4. Meet het CD-spectrum tussen 200 nm en 400 nm met behulp van een spectropolarimeter bij 25 °C. De parameters en voorwaarden voor deze meting zijn eerder beschreven²⁹. De resultaten zijn te vinden in aanvullende figuur 1.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u het cd-spectrum opneemt zodat alleen de buffer als een lege buffer fungeert.

2. Voorbereiding van DNA-sjablonen

OPMERKING: De sjablonen die kunnen worden gerepliceerd, zijn korte, 100 nt geprepareerde lineaire sjablonen die zijn opgesteld met behulp van standaard moleculair-biologische technieken. De G4-vormende sjabloon (5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAGTCAATGAGAA
CTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGGGGTGGGGGGT
GGGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3') bevat de sequentie die in staat is om een MYC-afgeleide G-quadruplex (uit stap 1) in het midden te vormen. De besturingssjabloon (5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGA
ACTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGATGTAGCAGAACT
GTGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3′) heeft hetzelfde controlegebied (uit stap 1) ook in het midden.

1. Om de primer uit te gloeien aan de G4-vormende en controle-DNA-sjablonen, mengt u 20 μM van de primer (5′-Biotine-AF647-TCTTAATGTAAATTTAAAATGTC-3") tot 20 μM van de 100 nt-sjablonen in TE-buffer aangevuld met 200 mM KCl.
2. Verwarm de DNA-sjabloonoplossingen gedurende 15 minuten tot 95 °C in een digitaal droogbad. Als u klaar bent, koelt u de oplossingen een nacht langzaam af door het verwarmingsblok in polystyreen te plaatsen om het vouwen van de G4 en het gloeien van de twee strengen mogelijk te maken.

3. Labeling van DNA-polymerase met AF647

1. Het polymerase labelen met de kleurstof
   OPMERKING: De gist Pol δ werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals eerder beschreven³⁰. Het polymerase moest vervolgens worden geëtiketteerd met de Alexa Fluor NHS-ester monoreactieve kleurstof (AF647) om visualisatie op het niveau van één molecuul mogelijk te maken. Dit werd voltooid zoals eerder beschreven⁵.
   1. Om de N-terminus te labelen, incubeert u een 3-voudige overmaat van de AF647-kleurstof met 320 μL 58,5 μM Pol δ in een buffer die 30 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2 mM dithiothreitol (DTT), 300 mM natriumchloride (NaCl), 50 mM kaliumglutamaat en 10% (v/v) glycerol gedurende 10 minuten bij 4 °C bevat. Draai de oplossing voorzichtig om een grondige menging te garanderen en de efficiëntie van de etikettering te verbeteren.
      OPMERKING: De eiwitsequentie kan extra primaire amines in lysine-aminozuren bevatten. Door de reactiecondities, zoals de pH, aan te passen, kan het label bij voorkeur op de N-terminus worden bevestigd in plaats van op de lysineresiduen. Dit kan verdere optimalisatie vereisen om de etiketteringsefficiëntie te verhogen.
   2. Om de 0,5 ml spin-ontziltingskolommen voor te bereiden (7 K moleculair gewicht afgesneden), centrifugeert u de kolommen eerst 1 minuut op 1500 x g om de bewaaroplossing te verwijderen. Gooi de oplossingen die na het centrifugeren in de opvangbuis zijn gedeponeerd weg.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u de dop van de centrifugatiekolommen losmaakt tijdens de centrifugatiestappen. Dit zorgt ervoor dat de kolommen goed worden geëlueerd.
   3. Breng de kolommen in evenwicht in een buffer met 30 mM Tris-HCl (pH 7,6), 300 mM NaCl, 3 mM DTT, 50 mM kaliumglutamaat en 5% (v/v) glycerol door 300 μL buffer toe te voegen aan de bovenkant van de kolom. Centrifugeer de kolom op 1500 x g gedurende 1 minuut en gooi de doorstroming weg. Herhaal dit proces nog twee keer.
   4. Breng 200 μL van elk Pol δ monster aan op de kolom. Centrifugeer de kolommen gedurende 2 minuten op 1500 x g en vang de gezuiverde Pol δ op in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   5. Vries de gezuiverde fracties in vloeibare N₂ in en bewaar de aliquots bij -80 °C om eiwitafbraak na verloop van tijd te voorkomen.
2. Bepalen van de efficiëntie van etikettering
   1. Laad 2 μL van het nu AF647-gelabelde Pol δ-monster op een UV-vis spectrofotometer³¹.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat eerst een blanco van de Pol δ-buffer wordt gemeten.
   2. Meet de excitatiegolflengten van 650 nm voor de kleurstof AF647 en 280 nm voor de Pol-δ met behulp van de spectrofotometer.
   3. Bereken de etiketteringsefficiëntie met behulp van de wet van Beer-Lambert en de molaire extinctiecoëfficiënten van 270.000 ^{cm-1 M-1} voor de AF647-kleurstof en 195.960 ^{cm-1 M-1} voor het polymerase.
      OPMERKING: De etiketteringsefficiëntie die is bepaald voor de AF647-gelabelde gist Pol δ die in deze test is gebruikt, is berekend op ongeveer 67%.

4. Ensemble primer extensie test

OPMERKING: Voordat replicatie-experimenten met één molecuul worden uitgevoerd, is het noodzakelijk om te bevestigen dat het DNA-polymerase wordt geblokkeerd door de G-quadruplex via bulkreplicatietests.

1. Stel de temperatuur van een verwarmingsblok in een digitaal droogbad in op 30 °C. Dit zorgt voor een maximale activiteit van de gist Pol δ.
2. Bereid "mastermixen" voor de G4-vormende en controlesjablonen voor in replicatiebuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM magnesiumacetaat, 50 mM kaliumglutamaat, 40 μg/ml runderserumalbumine (BSA), 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT en 0,0025% (v/v) Tween-20). Vul elk mengsel aan met 1 mM DTT, 250 μM elk dTTP, dCTP, dATP, dGTP (dNTP's) en 10 nM van de respectievelijke DNA-sjabloon (G4-vorming of controle). Plaats deze in een verwarmingsblok om ervoor te zorgen dat ze 30 °C bereiken.
3. Blus 12 μL van elke mastermix af met 12 μL formamide-laadbuffer (80% (m/v) formamide, 10 mM EDTA) om te fungeren als de T = 0 min-controle.
4. Om de DNA-synthese op gang te brengen, voegt u AF647-gelabelde gist Pol δ toe aan elke mastermix (eindconcentratie van 20 nM). Meng grondig om ervoor te zorgen dat de DNA-polymerasen de sjablonen met maximale efficiëntie repliceren.
   OPMERKING: Bewaar de gist Pol δ tijdens gebruik op ijs om de enzymactiviteit te behouden.
5. Verwijder na 30 s, 60 s en 180 s 12 μL van elk mastermengsel en blus af met 12 μL formamide laadbuffer. De verhouding van 1:1 van het mastermengsel tot de formamide-laadbuffer zorgt ervoor dat de replicatiereactie niet kan doorgaan als deze eenmaal is gedoofd.
6. Verwijder de nu gedoofde oplossingen uit het verwarmingsblok van 30 °C en plaats ze in plaats daarvan in een verwarmingsblok van 98 °C om het dsDNA te denatureren tot ssDNA. Breng na 10 minuten het hele verwarmingsblok naar de geltank om de oplossingen in een denaturerende 15% tris-boraat-EDTA (TBE)-ureumpolyacrylamide (PAGE) gel³² te laden.
   OPMERKING: De PAGE-gel moet worden opgewarmd voordat de monsters worden geladen door de gelelektroforese gedurende 180 minuten op 30 V in 1x TBE-buffer te laten draaien. Als u klaar bent, spoelt u elk putje af om ureum te verwijderen.
7. Laad 15 μL van elk monster op de gel naast een ladder met 0,02 μM 20 nt, 60 nt en 100 nt gelabelde oligonucleotiden in formamide-laadbuffer.
8. Laat de gel 60 minuten draaien op 180 V in 1x TBE-buffer om volledige scheiding te garanderen.
9. Stel de gel in het Cy5-kanaal van een biomoleculaire imager voor. Hiermee kan de gerepliceerde DNA-streng met het AF-647-label worden gemeten.

5. Fluorescentiemicroscopie met één molecuul

1. Functionalisering van dekglaasjes
   OPMERKING: Om de DNA-sjablonen aan het glazen dekglaasje te bevestigen, moet het eerst worden gefunctionaliseerd met aminosilaan, gevolgd door het vastbinden van gebiotinyleerde PEG-moleculen. Dit proces minimaliseert de niet-specifieke interacties tussen het DNA en/of de eiwitten en het oppervlak.
   1. Reinig de dekglaasjes (24 x 24 mm) door ze in kleurpotjes te doen en er ethanol in te gieten. Sonificeer de potten gedurende 30 minuten voordat u de dekglaasjes afspoelt met zuiver water. Herhaal dit proces met 1 M kaliumhydroxide (KOH) voordat u opnieuw spoelt. Herhaal deze reinigingsstappen nog een keer.
   2. Spoel en vul een nieuw potje met aceton en plaats de dekglaasjes erin. Verspreid 3-aminopropyltriethoxysilaan in de pot om een 2% v/v-oplossing te vormen. Schud de pot 3 minuten voordat je de reactie dooft met een grote overmaat water.
   3. Droog de dekglaasjes af met N₂ en leg ze afzonderlijk op een met water gevulde vochtige doos. Zo voorkom je dat de dekglaasjes uitdrogen.
   4. Bereid een 1:25 Biotine-PEG-SVA:mPEG-SVA-ester in 100 mM NaHCO₃ (pH 8,2). Draai dit mengsel gedurende 20 s om een grondige menging te garanderen.
   5. Pipetteer 40 μl van de PEG-oplossing op een droog dekglaasje. Leg er nog een dekglaasje op om de oplossing tussen de twee dekglaasjes te "sandwichen". Hierdoor worden de vlakken van het dekglaasje aan de binnenkant functioneel. Herhaal dit voor alle dekglaasjes.
   6. Incubeer de dekglaasjes 3 uur in het donker. Scheid na de incubatie de dekglaasjes, spoel ze af met overtollig water en droog ze af met gecomprimeerd N_2-gas .
   7. Herhaal stap 4.1.4-4.1.5 om een tweede laag PEG op de dekglaasjes aan te brengen. Zorg ervoor dat u de eerder gefunctionaliseerde zijkanten aan elkaar klemt, dus pas op dat u ze niet per ongeluk omdraait tijdens de wasstappen. Incubeer de oplossingen een nacht in het donker voordat u ze afspoelt en droogt.
   8. Bewaar de dekglaasjes in een vacuüm om hun functionaliteit te behouden. Gefunctionaliseerde dekglaasjes zijn een maand houdbaar als ze op de juiste manier worden bewaard.
2. Bereiding van microfluïdische stroomcellen
   OPMERKING: Een microfluïdische flowcel³³ is geconstrueerd voor experimenten met één molecuul (zie aanvullende figuur 2). Hierdoor kunnen buffers, DNA-sjablonen en eiwitten in contact komen met een gefunctionaliseerd dekglaasje (zie stap 5.1).
   1. Haal een gefunctionaliseerd dekglaasje uit een vacuüm en plaats het op een microbuisjesrek dat gedeeltelijk gevuld is met water (vochtige doos). Meng 100 μL van een blokkerende buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM KCl, 2% (v/v) Tween-20) met 25 μL 1 mg/ml NeutrAvidin-oplossing (10% PBS) en verdeel dit over het oppervlak van het dekglaasje. Laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur in de vochtige doos.
   2. Was het dekglaasje in water en droog het af in N₂. Onthoud dat slechts één kant van het dekglaasje gefunctionaliseerd is, dus onthoud welke kant het is.
   3. Plaats op maat gemaakt polydimethylsiloxaan (PDMS) blok³⁴ op de dekglaasje in de flowcelhouder. Dit genereert een stroomkanaal van 100 μm hoog en 1 mm breed. Polyethyleen buizen (PE-60: 0,76 mm inlaatdiameter en 1,22 mm buitendiameter) kunnen vervolgens in de gaten in de flowcel worden gestoken om toegang te bieden tot buffers en substraten.
3. Beeldvorming van fluorescentie met één molecuul
   OPMERKING: Deze experimenten moeten worden uitgevoerd met zowel de G4-vormende als de controlesjablonen. Hierdoor kunnen beide voorwaarden (blokkering van de Pol-δ door een G4-structuur en geen blokkering) op het niveau van één molecuul worden gevisualiseerd met behulp van totale interne reflectie (TIRF) microscopie.
   1. Verwarm 1 ml aliquots van een Tween blokkerende buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM KCl, 2% (v/v) Tween-20) en 500 μL aliquots van een wasbuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM magnesiumacetaat, 250 mM kaliumglutamaat, 40 μg/ml BSA, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,0025% (v/v) Tween-20) en replicatiebuffer tot 40 °C gedurende 15 min. Hierdoor komen de gassen vrij uit de oplossingen. Ontgas de oplossingen in een vacuümkamer gedurende nog eens 15 minuten bij 800 mbar onder de atmosferische druk.
   2. Neem de geconstrueerde flowcel (zie stap 4.2) en plaats deze op de tafel van de microscoop. Nadat u een druppel olie op het objectief hebt geplaatst, tilt u het doel op om het dekglaasje te raken.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het objectief en de stroomcel de tijd hebben om 31 °C te bereiken. Dit zal de activiteit van de gist Pol δ verhogen en helpen zorgen voor reproduceerbare gegevens.
   3. Steek de inlaatslang in de ontgaste Tween-blokkeerbuffer en sluit de uitlaat aan op de spuitpomp. Trek de spuit terug om de tween-blokkeringsbuffer door de slang in het kanaal te trekken. Laat deze buffer minstens 30 minuten incuberen om niet-specifieke interacties te minimaliseren.
   4. Stroom in 200 μL ontgaste wasbuffer in het kanaal met een snelheid van 100 μL/min. Hierdoor wordt de blokkeringsbuffer van Tween weggespoeld.
   5. Verdun de DNA-sjabloonoplossingen tot 0,5 pM in een replicatiebuffer van 500 μl. Stroom 150 μL in het kanaal met een snelheid van 10 μL/min. Verlicht het monster met behulp van een 647nm-laser op ongeveer 900 ^mWcm-2 op het monstervlak om individuele DNA-sjablonen te visualiseren.
      OPMERKING: Als het gezichtsveld (FOV) met het monster niet volledig scherp is, zit het dekglaasje mogelijk niet gelijk met de onderkant van de geconstrueerde stroomcel. Bouw in dat geval een nieuwe flowcel met behulp van een nieuw dekglaasje.
   6. Zodra een voldoende dichtheid van vlekken (ca 1 vlek per 10 μm²) zichtbaar is, stroomt u in een verse oplossing van replicatiebuffer (aangevuld met 1 mM DTT) in het kanaal om overtollig DNA weg te spoelen. Een volume van 250 μL is voldoende om al het ongebonden DNA volledig te verwijderen.
   7. Ga naar een nieuw gezichtsveld en maak een afbeelding van het DNA om de mate van colokalisatie tussen het gelabelde polymerase en het DNA-substraat te bepalen. Als u klaar bent, verhoogt u het laservermogen om de resterende plekken te fotobleken.
   8. Bereid een polymeraseoplossing voor die 1 mM DTT, 250 μM dNTP's en 20 nM AF647-gelabeld Pol δ bevat in 200 μL replicatiebuffer. Stroom in 100 μl van de polymeraseoplossing met een snelheid van 5 μl/min in het kanaal.
   9. Zodra het monster scherp is en de TIRF-hoek is aangepast, stelt u het laservermogen van een laser van 647 nm in op ongeveer 900 ^mWcm-2 in het monstervlak. Begin vervolgens met het in beeld brengen van het gezichtsveld gedurende de gewenste tijdsduur. Verkrijg tussen 1-5 frame/s gedurende 10-20 minuten om alle replicatiegebeurtenissen vast te leggen.
4. Gegevensanalyse
   OPMERKING: Alle analyses zijn uitgevoerd met behulp van Python (v. 3.11.7). De aangepaste code die wordt gebruikt voor de gegevensanalyse is hier beschikbaar: https://github.com/Single-molecule-Biophysics-UOW/G-quadruplex_binding_analysis.
   1. Colocaliseer eerst de DNA-sjabloonvlekken met de fluorescerende vlekken van de gelabelde gist Pol δ. Er werd vastgesteld dat twee pieken gelokaliseerd waren als hun afstand na driftcorrectie ≤ 3 pixels bedroeg. Alleen de Pol δ plekken die DNA-sjablonen colokaliseren, worden geanalyseerd op hun bindingskinetiek en algemene gedragstrends.
   2. Om bindende gebeurtenisgegevens te bepalen, meet u de intensiteit in de tijd van elke plek, aangezien deze gedurende de hele film "aan/uit"-gedrag vertoont. Dit maakt het mogelijk om te bepalen hoe vaak de Pol δ binding plaatsvindt op een enkel DNA-sjabloon.
      OPMERKING: Deze analyse wordt uitgevoerd voor zowel de G4-vormende als de controlesjabloonexperimenten om de bindingsdynamiek te vergelijken.
      OPMERKING: Er zijn controle-experimenten uitgevoerd die ervoor zorgen dat niet-specifieke bindingsgebeurtenissen aan de G-quadruplex of de sjabloon zelf (23,2 s ± 4,9 s) niet worden opgenomen in de analyse van de bindingsgebeurtenissen.

Results

Voor deze test werden twee DNA-substraten ontworpen met een fluorescerend gelabelde 20-nt primer: één met een G4-vormende sequentie (Figuur 1A, links) en één zonder deze sequentie (Figuur 1A, rechts). Om te bevestigen dat de G-quadruplex een effectieve wegversperring is voor polymeraseactiviteit, werd DNA-synthese door Pol δ gecontroleerd op een denaturerende PAGE-gel. De activiteit van het gezuiverde gelabelde Pol-δ op de DNA-substraten werd onderzocht door middel van gelelektroforese. Figuur 1B (links) laat zien dat de fluorescerend gelabelde Pol δ niet in staat is om voorbij de G-quadruplex te synthetiseren. Vóór de start van de synthese (t = 0 min) is een band aanwezig die overeenkomt met 20 nt, die de gelabelde primer vertegenwoordigt die is gedenatureerd uit de sjabloonstreng. Na 3 minuten werd deze 20-nt-band omgezet in een 60-nt-band, wat aangeeft dat synthese plaatsvond op al het DNA en bevestigde dat het polymerase volledig werd geblokkeerd door de G-quadruplex-structuur. Deze blokkering impliceert dat het polymerase zich niet kan ontvouwen of de structuur kan omzeilen. Daarentegen produceerde de synthese van een controlesjabloon dat niet de G-quadruplexvormende sequentie bevat (Figuur 1A, rechts) na 3 minuten een 100-nt-band (Figuur 1B, rechts).

Na bevestiging van de synthese op de sjablonen en efficiënte blokkering door de G-quadruplex, werden deze metingen herhaald op een fluorescentiemicroscoop met één molecuul om het polymerasegedrag te volgen. De DNA-sjablonen werden vastgemaakt aan gefunctionaliseerde dekglaasjes (Figuur 2A) in een microfluïdische stroomcel en de positie van elk substraat werd bepaald door de fluorescerend gelabelde primer te visualiseren. Vervolgens werd het gelabelde Pol δ geladen in aanwezigheid van dNTP's om de synthese op gang te brengen. Binnen een typisch gezichtsveld worden individuele vlekken gevolgd om te kwantificeren hoe vaak Pol δ bindt en dissocieert van het DNA (Figuur 2B,C). Door de intensiteit te meten als functie van de tijd op elk DNA-substraat, kunnen trajecten van één molecuul worden gegenereerd (Figuur 2C, Aanvullende Figuur 3). De karakteristieke "dwell time", oftewel de gemiddelde duur waarin Pol δ aan het sjabloon gebonden blijft, kan worden gemeten. Voor het G4-substraat werd de verblijftijd bepaald op 6 s ± 2 s, terwijl deze voor het controlesubstraat 10 s ± 3 s was (Figuur 2D, aanvullende figuur 4). Bovendien kan voor elk traject het aantal keren dat Pol δ aan het sjabloon bindt, worden gekwantificeerd. Het aantal bindingsgebeurtenissen aan het G4-substraat is veel hoger in vergelijking met het controlesjabloon (Figuur 2E). Hoewel er gevallen zijn van meer dan één bindingsgebeurtenis in het controlesjabloon als gevolg van scholastisch binden en ontbinden, is er gemiddeld een duidelijke toename van het aantal bindingsgebeurtenissen voor het G4-vormende sjabloon. Dit suggereert dat, nadat de synthese is gestopt door de G-quadruplex, het gebonden polymerase zich dissocieert van het DNA voordat nieuwe polymerasen uit de oplossing een continue cyclus van binden en ontbinden aangaan. Daarom biedt deze test met één molecuul een ongeëvenaard inzicht in hoe DNA-polymerasen reageren op DNA-wegversperringen.

Figuur 1: Ensemble primer extensie test. (A) Schematische weergave van de DNA-substraten. Het G4-substraat (links) bevat een G-quadruplexvormende sequentie, terwijl het controlesubstraat (rechts) dat niet doet. (B) Ensemble-DNA-primase-extensietest van de geprimede G4- en controle-DNA-substraten die aantonen dat fluorescerend gelabelde gist Pol δ volledig wordt geblokkeerd door de G-quadruplex. De PAGE-gel toont de replicatie van de DNA-sjablonen in de loop van de tijd, wat resulteert in een verschuiving van de gelabelde 20 nt primer naar het 60-nt product voor het G4-substraat (links) en het 100-nt product voor de controlesjabloon (rechts). M staat voor een ladder met gelabelde oligo's van 20 nt, 60 nt en 100 nt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Fluorescentiemicroscopie met één molecuul. (A) Schematische weergave van de single-molecule primer extension assay met behulp van AF647-gelabelde gist Pol δ. (B) Typisch gezichtsveld verkregen uit een single-molecule test. Elke vlek vertegenwoordigt een fluorescerend gelabeld Pol δ binding aan een DNA-sjabloon. Schaalbalk: 10 μm. (C) (Boven) Voorbeeldmolecuul uit de single-molecule assay die aan/uit-binding weergeeft als de Pol δ-uitwisselingen. (Onder) Traject van één molecuul van hetzelfde molecuul dat de intensiteit over het tijdsverloop van het experiment aangeeft. De zwarte lijn geeft het Hidden Markov Model (HMM) weer dat bij de gegevens past. (D) Verblijftijd van Pol δ op het G4-substraat (paars) en het controlesubstraat (grijs). De lijnen vertegenwoordigen exponentiële pasvormen, wat een levensduur geeft van 6 s ± 2 s op het G4-substraat en 10 s ± 3 s op het controlesubstraat. (E) Aantal Pol δ bindingsgebeurtenissen aan afzonderlijke DNA-substraten. Het mediane aantal bindingen op het G4-substraat (paars) is 3,5, vergeleken met het controlesubstraat 1 (grijs). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: CD-spectroscopie. CD-spectra van de G4-vormende (paars) en controlesequentie (grijs) in TE-buffer met 200 mM KCl bij 25 °C. De karakteristieke piek bij 260 nm, gevolgd door de negatieve piek bij 240 nm, is kenmerkend voor een parallelle, intramoleculaire GQ. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Constructie van de flowcel. (A) Schema van de afzonderlijke onderdelen van de flowcel. Het vierkante PDMS-blok zit bovenop het dekglaasje van de microscoop. Deze stukken worden vervolgens in elkaar gezet in het deksel en de bodem van de flowcelhouder. (B) De volledige flowcel. Buizen kunnen aan weerszijden van het PDMS-blok worden ingebracht om de kanalen te vormen waardoor buffers via microfluïdica door het apparaat kunnen worden gestroomd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Trajecten van één molecuul. (A) Voorbeeldtraject van een molecuul dat een enkele bindingsgebeurtenis ondergaat gedurende het tijdsbestek van 10 minuten van het experiment. (B) Voorbeeldtraject van een molecuul dat nulbindingsgebeurtenissen ondergaat gedurende het tijdsbestek van 10 minuten van het experiment. De zwarte lijn in (A) en (B) geeft het Hidden Markov Model (HMM) weer dat geschikt is voor de gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Verblijftijden. (A) Verblijftijd van Pol δ op het G4-substraat. De lijn geeft de exponentiële fit weer, wat een levensduur van 6 s ± 2 s geeft. (B) Verblijftijd van Pol δ op het controlesubstraat. De exponentiële pasvorm geeft een levensduur van 10 s ± 3 s. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Controle van fotobleken. De grafiek toont de gemiddelde tijd die nodig is voor een individueel AF647-gelabeld gist Pol δ-enzym om te worden gefotobleekt door de 647 nm-laser. De lijn geeft de exponentiële fit weer, wat een levensduur van 39 ± 6 s geeft. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Hier is een op fluorescentie gebaseerde test met één molecuul beschreven die inzicht geeft in het gedrag van een DNA-polymerase wanneer deze een G-quadruplex tegenkomt. Hoewel de protocollen voor het genereren van DNA-sjablonen, Pol-δ-labeling en bulk-DNA-replicatietests allemaal eenvoudig zijn, is het uitvoeren van microscopietests met één molecuul technisch uitdagender. Vanwege de aard van single-molecule-technieken moet grote zorg worden besteed aan het voorkomen van de introductie van stof, vervuiling of luchtbellen, omdat deze het gezichtsveld verdoezelen en het verzamelen van gegevens belemmeren.

Een beperking van TIRF-microscopie-experimenten met één molecuul is het fotobleken van de fluoroforen die covalent zijn gekoppeld aan de biomoleculen van belang. Fotobleken is een onomkeerbaar proces dat leidt tot permanent fluorescentieverlies³⁵. Om dit tijdens experimenten te verminderen, is het essentieel om de duur van de laserblootstelling te beperken, de laserintensiteit aan te passen en de beeldtiming te optimaliseren. Deze strategieën helpen fluorescentiesignalen te behouden, wat zorgt voor betrouwbaardere en langere observatieperioden. Door deze parameters te finetunen, blijft het Pol δ-signaal aanwezig voor de duur van de meting. Om het laservermogen voor de synthesetests met één molecuul fluorescentiemicroscopie te optimaliseren, is het raadzaam om de fotobleeksnelheid te meten door het gelabelde polymerase op een schoon glazen dekglaasje af te beelden. Door systematisch het laservermogen te variëren en de fotobleeksnelheid over het hele gezichtsveld te beoordelen, kan men de optimale laserintensiteit identificeren die de signaalsterkte van fluorofoor in evenwicht brengt met de weerstand tegen fotobleken (zie aanvullende figuur 5).

Het belangrijkste voordeel van deze benadering met één molecuul ten opzichte van traditionele ensemble-gebaseerde methoden is het vermogen om direct te visualiseren wanneer een individueel DNA-polymerase een G4-structuur tegenkomt en ermee interageert. Traditionele ensemble-gebaseerde methoden (zoals gelelektroforese) hebben aangetoond dat G4-structuren in staat zijn om DNA-polymerasen te blokkeren 23,36,37. Deze technieken slagen er echter niet in om de real-time kinetische en mechanistische informatie van deze interactie te bieden, die nodig is om verschillende moleculaire kinetische stappen en uitkomsten te ontwarren. Single-molecule-technieken bieden een ongeëvenaard inzicht in de kinetiek, mechanismen en het gedrag van biomoleculen die vaak verborgen zijn door ensemble gemiddeld³⁸. Het is nu mogelijk om in realtime te zien hoe DNA-polymerasen werken - of ze DNA-wegversperringen uitwisselen, vastlopen, dissociëren of omzeilen³⁹. Als dit protocol is opgesteld, kan de identiteit van de G4 eenvoudig worden gewijzigd van de gekozen parallelle c-MYC-structuur naar elke parallelle, antiparallelle of hybride topologie. Het toepassen van deze single-molecule assay zal onthullen of dezelfde DNA-polymerasen zich anders gedragen wanneer ze alternatieve G4-topologieën tegenkomen. Als zodanig zijn methoden met één molecuul van vitaal belang voor het beantwoorden van specifieke vragen over hoe de eiwitten en het DNA van het lichaam op elkaar inwerken.

Door directe visualisatie van DNA-polymerase-interacties met G-quadruplexen is een voorheen niet-gekarakteriseerde uitwisselingsroute voor gist Pol δ geïdentificeerd. Deze ontdekking suggereert dat het polymerase zich losmaakt bij het tegenkomen van een G-quadruplex, in afwachting van de tussenkomst van een ander eiwit om de structuur op te lossen voordat de DNA-synthese opnieuw wordt gestart. Dit protocol kan worden aangepast om interacties tussen verschillende genoomonderhoudseiwitten en DNA-obstakels te onderzoeken, en biedt ongeëvenaarde inzichten in hoe cellulaire enzymen door genomische belemmeringen navigeren. De wegversperring van deze test kan bijvoorbeeld worden gewijzigd van een G4-structuur in een eiwit-DNA-crosslink, een type DNA-laesie waarbij een eiwit onomkeerbaar covalent aan DNA is gebonden en als een obstakel voor DNA-replicatie fungeert⁴⁰. Dergelijke onderzoeken zijn cruciaal voor het begrijpen van de fundamentele processen van DNA-replicatie, -reparatie en -recombinatie. Door de studie van de DNA-eiwitdynamiek op moleculair niveau mogelijk te maken, biedt deze test een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan genomische integriteit.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nt control DNA template	Integrated DNA Technologies		Primaire controle template in primerverlengingstests
100 nt G4-vormende DNA template	Integrated DNA Technologies		Primaire G4-vormende template in primerverlengingstests
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12 well, 20 µL	Bio-Rad	4566055	Gelelektroforese
20 nt gelabeld/gebiotinyleerd primer oligonucleotide	Integrated DNA Technologies		Vereist voor primerverlenging van de 100 nt templates
22 nt control DNA template	Integrated DNA Technologies		Primaire controle template in circulair dichroismespectroscopie experimenten
22 nt G4-vormende DNA template	Integrated DNA Technologies		Primaire G4-vormende template in circulair dichroismespectroscopie experimenten
24 x 24 mm dekglas	Marienfeld Superior	100062	Vereist voor TIRF microscopie
3-aminopropyltriethoxysilaan	Thermo Fisher Scientific	A10668.22	Dekglas functionalisatie
647 nm laser	Coherent	1196627	Selecteer golflengte die overeenkomt met de kleurstof/kleurstof van keuze
670 nm emissiefilter	Chroma Technology Corp	ET655lp	Zorgt ervoor dat alleen de relevante golflengten doorgaan naar de detector
Amersham Typhoon 5 biomoleculair imager	Cytiva	29187191	Gelanalyse
Biotin-PEG-SVA (MW 5000)	Laysan Bio	BIO-PEG-SVA-5K-100MG	Dekglas functionalisatie
Deoxynucleotiden trifosfaat oplossing mix	Jena Bioscience	NU-1005L	Replicatiebouwstenen
Digitale droogbad (115V)	Bio-Rad	1660571	Verwarm oplossingen
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	646563	Disulfidebinding reductie
EM-CCD camera	Andor	iXon 897	Opname van single-molecule films
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	DNA denaturering tijdens ensemble DNA replicatie tests
Gasdichte spuit, 1 mL	SGE	21964	Vullen van cuvet voor circulair dichroismespectroscopie
Omgekeerde microscoop met CFI Apo TIRF 100x olie-immersie objectief	Nikon	Eclipse Ti-E	Maakt single-molecule TIRF microscopie mogelijk
J-810 Spectrofotometer	Jasco	J-810	Meten van circulair dichroismespectroscopie
mPEG-SVA (MW 5000)	Laysan Bio	MPEG-SVA-5K-100MG	Dekglas functionalisatie
NanoDrop One Spectrofotometer	Thermofisher Scientific	ND-ONE	Meten van eiwit- en labelconcentraties
NeutrAvidin	Thermo Fisher Scientific	31000	Binden van DNA templates aan de gefunctionaliseerde dekglazen tijdens single-molecule experimenten
Polyethyleen buis	Instech	BTPE-60	Nodig voor flow cell constructie
Kwarts cuvet, 10 mm	Starna Scientific	1/Q/10/CD	Bevat monster voor circulair dichroismespectroscopie
Spuitpomp	Adelab Scientific	NE-1002X	Gebruikt om buffers en substraten door een microfluïdische flow cell te laten stromen
Tris-EDTA buffer	Thermofisher Scientific	93283	DNA oplossing buffer
Gist polymerase δ	Michael O'Donnell Lab		Repliceren van de DNA templates
Zeba spin desalting kolom, 7 K MWCO, 0,5 mL	Thermo Fisher Scientific	89882	Polymerase zuivering