Methodenartikel

In vitro Blootstelling aan cannabis van longepitheelcellen op het grensvlak tussen lucht en vloeistof

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68102

⸱

20 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

In dit artikel

Samenvatting

We stellen een gestandaardiseerd in vitro model op voor het bestuderen van de blootstelling aan cannabisdamp op het grensvlak tussen lucht en vloeistof. Dit model biedt een systematische benadering om de effecten van verdampte cannabis te onderzoeken, waarbij wordt ingespeeld op de groeiende belangstelling voor cannabisverdampers als alternatief voor roken.

Samenvatting

Cannabis wordt naar schatting door 192 miljoen mensen over de hele wereld gebruikt. De meeste mensen gebruiken cannabis door het inademen van cannabisrook, die verbrandingsbijproducten bevat die de gezondheid van de longen negatief kunnen beïnvloeden. Kennis van deze risico's heeft geleid tot een groeiende interesse in cannabisverdampers, die de droge cannabisbloem verwarmen zonder te verbranden. Bij het verdampen van cannabis komen nog steeds cannabinoïden vrij voor inhalatie, maar wordt het plantmateriaal op een lagere temperatuur verwarmd. Er is momenteel geen gestandaardiseerd in vitro model voor het beoordelen van de effecten van droge cannabisdamp. Daarom hebben we een model opgesteld voor de blootstelling van longcelculturen op een lucht-vloeistofinterface (ALI), waarbij cellen apicaal worden blootgesteld aan verdampte cannabis, waardoor de fysiologie van longepitheelcellen nauwkeuriger wordt gesimuleerd. Dit protocol zorgt voor een consistente en reproduceerbare afgifte van cannabisdamp aan het celoppervlak en biedt een betrouwbaar platform voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire effecten van verdampte cannabis. Dit werk is het eerste dat een in vitro cannabisdampafgiftemethode standaardiseert, die als benchmark kan dienen voor toekomstig preklinisch cannabisonderzoek.

Inleiding

Cannabis wordt meestal gebruikt door het inademen van rook van het verbranden van de bloem van de plant in de vorm van een joint, hetzij recreatief of voor medicinale doeleinden. De belangrijkste biologische activiteiten van cannabis zijn te danken aan cannabinoïden zoals Δ 9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) en cannabidiol (CBD), die bij inademing in het lichaam vrijkomen. Cannabisrook bevat ook pyrogene stoffen, waaronder kankerverwekkende, mutagene en teratogenen, die mogelijk nadelige gezondheidseffecten kunnen veroorzaken1. Gezien deze zorgen is er interesse om over te stappen op cannabisverdampers die de cannabisbloem verwarmen zonder te verbranden, in de hoop dat hierdoor cannabinoïden vrijkomen voor latere inhalatie, maar zonder verbrandingsproducten. Er is wat werk gedaan om de chemische componenten van cannabisdamp te karakteriseren, waarbij de aanwezigheid van cannabinoïden maar ook verschillende ademhalingstoxische stoffen wordt aangetoond, waardoor het idee dat deze apparaten veilig zijn wordt uitgedaagd 2,3. Er zijn aanzienlijke hiaten in de kennis over de invloed van verdampte cannabis op de longen en andere organen.

Celcultuurstudies zijn essentieel in de toxicologie om de specifieke effecten van ingeademde stoffen op cellulair niveau te isoleren en te begrijpen, waardoor high-throughput, kosteneffectieve en mechanistische inzichten mogelijk worden die relevant zijn voor de menselijke biologie. De methode van het kweken van de cellen is ook een belangrijke bepalende factor voor de algemene resultaten van een in vitro experiment. De meeste celkweekstudies worden uitgevoerd met behulp van een ondergedompelde omgeving, waar cellen op plastic worden gekweekt en apicaal worden blootgesteld aan waterige media. Luchtwegepitheelcellen vormen in dit opzicht echter een unieke uitdaging. Door het hele ademhalingssysteem staat het apicale oppervlak van epitheelcellen in contact met lucht. In de longblaasjes produceren epitheelcellen oppervlakteactieve stof, terwijl andere luchtwegepitheelcellen slijm produceren; Samen beschermt en behoudt dit de longfunctie. Ondergedompelde culturen slagen er niet in om de blootstelling aan apicale lucht te repliceren, waardoor hun vermogen om de in vivo omgeving nauwkeurig te modelleren wordt beperkt. Een alternatief voor ondergedompelde cultuurmodellen is kweken op de lucht-vloeistofinterface (ALI), waar respiratoire epitheelcellen worden gekweekt op een met collageen bedekt membraan met media aan de basolaterale zijde terwijl ze apicaal worden blootgesteld aan lucht. Epitheelcellen die bij ALI zijn gekweekt, zijn nauwkeurigere modellen van het respiratoire epitheel vanwege hun vermogen om te polariseren, oppervlakteactieve stof of slijm te produceren en juncties te vormen in deze omgeving4.

Een extra overweging waarmee traditionele ondergedompelde celkweekmethoden worden geconfronteerd, is dat hydrofobe verbindingen zoals cannabinoïden slecht oplosbaar zijn in waterige media5. Ethanolische extracten zijn een veelgebruikt oplosmiddel om hydrofobe verbindingen in ondergedompelde culturen te bestuderen 6,7,8,9,10,11,12. Met deze extracten kunnen zowel hydrofobe als hydrofiele verbindingen worden opgelost in een waterig medium. Een beperking is echter het potentieel voor samengestelde agglomeratie en verbindingen die interageren met de media, die beide de biologische beschikbaarheid kunnen veranderen13,14. Er zijn onlangs ontwikkelingen geweest die het mogelijk maken om verbindingen in de aërosolfase aan cellen af te leveren in afwezigheid van een oplosmiddel of media met behulp van geavanceerde blootstellingssystemen zoals de expoCube15 (ALI/Transwell in vitro/ex vivo blootstellingssysteem), evenals andere. Directe depositie van aërosolen en deeltjessuspensies met behulp van een geavanceerd belichtingssysteem elimineert het verzamelingsresuspensusproces dat cruciaal is voor ondergedompelde blootstellingen, waarvan bekend is dat het de fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes aanzienlijk verandert16. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor de blootstelling van een alveolaire epitheelcellijn bij ALI.

Protocol

1. Kweek longepitheelcellen bij ALI

OPMERKING: Hier wordt een protocol beschreven voor het kweken van A549-cellen bij ALI. Raadpleeg de literatuur voor het celtype dat in het onderzoek moet worden gebruikt. Verschillende cellijnen hebben bij ALI een verschillende hoeveelheid tijd nodig om te differentiëren, tight junctions te vormen en oppervlakteactieve stof/slijm te produceren.

  1. Celcultuur
    1. Bereid media voor door 50 ml door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 5 ml Glutamax, 5 ml antibioticum-antimycoticum en 500 μl Gentamycine toe te voegen aan een fles van 500 ml DMEM.
    2. Plaats de voorbereide media 10-15 minuten in een waterbad om op te warmen tot 37 °C.
    3. Spuit de bioveiligheidskast in met 70% ethanol en veeg deze af. Zodra het medium is opgewarmd, plaatst u het onder de gesteriliseerde bioveiligheidskast.
    4. Pipetteer onder de kweekkap ongeveer 10 ml media in een buis van 15 ml.
    5. Haal cellen uit vloeibare stikstof en ontdooi door zachtjes te roeren in een waterbad.
    6. Onder de kweekkap pipetteren de ontdooide cellen van de cryovial in de buis van 15 ml.
    7. Centrifugeer de tube van 15 ml op 300 g gedurende 5 minuten.
    8. Verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de pellet te verstoren.
    9. Meng de pellet met het medium en doe deze in de kolf T75 .
    10. Controleer de T75-kolf onder een microscoop.
    11. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 met verzadigende vochtigheid.
    12. Vernieuw de celkweekmedia elke 2-3 dagen.
    13. Passage en laat cellen groeien totdat het gewenste aantal cellen is bereikt. Om een plaat met 12 putjes te zaaien, zijn 3 × 106 cellen nodig.
  2. Collageencoating van transwells
    1. Bereiding van collageenoplossing
      1. Los 10 mg collageen Type IV op in 20 ml ddH2O met 50 μl ijsazijn.
      2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, af en toe ronddraaiend, tot het volledig is opgelost.
      3. Steriliseer de oplossing door door een filter van 0,22 μm te filtreren.
      4. Verdeel 1,5 ml van de oplossing in buisjes van 15 ml en bewaar bij -20 °C.
    2. Coaten van transwell filters met Collageen Type IV
      1. Ontdooi een tube collageen type IV (50 μg/ml) vanaf -20 °C.
      2. Voeg 150 μL collageen toe aan elk Transwell-filter.
        OPMERKING: Alleen platen met 12 putjes zijn compatibel met het belichtingssysteem.
      3. Laat borden met open deksel 18 uur in de bioveiligheidskast (BSC) drogen om te drogen.
      4. Steriliseer door gedurende 30 minuten bloot te stellen aan ultraviolet (UV) licht.
    3. Bewaar platen maximaal 30 dagen bij 4 °C, verpakt in parafilm.
    4. Spoel voor het uitplateren van cellen beide zijden van de filters af met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Cellen zaaien in inserts en overgaan naar ALI
    1. Bereiding van plaat- en celsuspensie
      1. Pipetteer 1,5 ml voorverwarmde voorbereide media in elk putje van de plaat met 12 putjes.
      2. Plaats de plaat in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 .
      3. Bereid een celsuspensie met een concentratie van 5 × 105 cellen/ml in bereide media.
    2. Cellen zaaien in inserts
      1. Haal de voorbereide celkweekplaat uit de broedmachine en plaats deze onder een gesteriliseerde bioveiligheidskast.
      2. Pipetteer 0,5 ml van de celsuspensie (2,5 × 105 cellen/insert) op de bovenkant van het membraan in de insert.
      3. Dek de plaat af met het plaatdeksel en plaats deze terug in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 .
    3. ALI oprichten
      1. Verwijder de apicale media 24 uur na het zaaien van de cellen.
      2. Vervang de basolaterale media door 0.6 ml voorbereide media. Op dit punt worden de cellen apicaal blootgesteld aan lucht, waardoor de ALI ontstaat.
      3. Kweek de A549-cellen bij ALI gedurende maximaal 2 weken, waarbij de media elke 2 dagen worden gewijzigd om de cellen de kans te geven te differentiëren zoals eerder is gekarakteriseerd4.

2. Dosimetriebeoordeling van de blootstelling aan cannabisdamp met behulp van LC/MS

OPMERKING: In dit deel van het protocol werden celvrije methoden gebruikt om de dosis cannabisdamp die in elke put werd afgezet te karakteriseren door Δ 9-THC-concentraties te analyseren. Δ9-THC hecht zich aan plastic materialen, dus voor het afnemen van monsters mogen alleen glazen flesjes worden gebruikt. Deze methode vereist dat de gekozen cannabiscultivar Δ9-THC bevat.

  1. Voorbereiding en opstelling van het belichtingssysteem
    1. Stel de slang voor het belichtingssysteem in volgens het gespecificeerde stroompad (Figuur 1A, B): EINDIGT eenheid > condensor > puffpomp > isometrische bemonsteringsassemblage met Aeroneb-pomp > expoCube > vochtigheidssensor met filter > expoCube blootstellingsstroompoort.
    2. Schakel de temperatuurregelaar in om het systeem te verwarmen tot 35 °C en 50 °C.
    3. Voer stromingstests uit om er zeker van te zijn dat het systeem lekvrij is en dat de druk correct is ingesteld (zie SCIREQ Technote Een gids voor het oplossen van problemen met ongelijkmatige stromen in de expoCube).
    4. Start de Aeroneb-pompen om een relatieve vochtigheid van meer dan 75% te bereiken.
  2. Dosimetrietesten en bereiding van verdampers
    1. Bereiding van cannabisverdampers
      1. Vermaal de cannabisbloem met behulp van een kruidengrinder.
      2. Weeg 0,25 g aliquots af en gebruik een pillenscheider om elke portie te ordenen.
      3. Plaats roestvrijstalen inzetstukken in de belichtingsrij van de 12-well transwellplaat binnen het belichtingssysteem.
  3. Blootstelling van roestvrijstalen inzetstukken aan cannabisdamp
    1. Begin met belichting
      1. Vul de verdamperoven met 0,25 g cannabis.
      2. Bevestig de cannabisverdamper aan de ENDS-eenheid van het belichtingssysteem met een veilige pakking en begin met het gewenste puffen. Zet de verdamper op de Smart Path Level 2 temperatuurinstelling.
        OPMERKING: Het belichtingssysteem dat in dit onderzoek is gebruikt, heeft vier slimme padniveaus om uit te kiezen, waaronder niveau 1 (176-188 °C), niveau 2 (188-199 °C), niveau 3 (199-210 °C) en niveau 4 (210-221 °C).
      3. Maak een bladerdeegprofiel aan in de flexiWare-software (software voor gegevensverzameling; zie SCIREQ Technote: A Guide to Creating Profiles for flexiWare 8). Gebruik voor dit protocol een bladerdeegvolume van 70 ml met een frequentie van 4 trekjes/min.
      4. Laat de droge kruidenverdamper 5 minuten draaien voordat je de cannabis overschakelt door de cannabisbloem uit de verdamperoven te halen en een verse 0,25 g cannabis aan de verdamper toe te voegen. Wissel af tussen twee verdampers voor continue belichting.
      5. Ga door met de stappen 2.3.1.1-2.3.1.4 totdat de gewenste belichtingstijd is bereikt.
    2. Verwijder na elke belichting de inzetstukken voorzichtig met een pincet uit het belichtingssysteem en bereid ze voor op het afnemen van monsters zoals hieronder beschreven.
  4. Verzameling en voorbereiding van monsters voor LC/MS-analyse
    1. Plaats met een pincet filters die overeenkomen met elke blootstelling in een geëtiketteerde glazen injectieflacon met 10 ml LC/MS-grade methanol (bijv. Blootstelling 1, Blootstelling 2, Blootstelling 3).
    2. Was het inzetstuk.
      1. Plaats elk blootliggend roestvrijstalen inzetstuk in een geëtiketteerde glazen injectieflacon met 10 ml LC/MS-kwaliteit methanol.
      2. Label injectieflacons op basis van blootstelling (bijv. Blootstelling 1 Well 1-4).
    3. Extract Δ9-THC
      1. Gebruik een sonicatorbad om de injectieflacons met inzetstukken gedurende 10 minuten te sonificeren om Δ9-THC te extraheren.
      2. Breng de inzetstukken over naar een tweede set glazen injectieflacons met 10 ml verse methanol en soniceer gedurende nog eens 10 minuten.
    4. Dien alle voorbereide monsters (putten, wassen en filteren) in voor LC/MS-analyse om Δ 9-THC-niveaus te kwantificeren.
  5. Dosimetrie berekeningen
    1. Bereken aan de hand van de LC/MS-analyseresultaten de hoeveelheid gedeponeerd Δ9-THC om de dosimetrie van de belichtingsstroom (hoeveelheid gedeponeerd in het filter) en de dosimetrie in de put te bepalen.
    2. Bereken de verhouding tussen het belichtingsstroomfilter en de putafzetting voor Δ9-THC.
    3. Gebruik deze verhouding om de dosis te bepalen die tijdens de blootstelling aan de cellen wordt afgegeven.

3. Dosimetriebeoordeling van de blootstelling aan cannabisdamp met behulp van een microbalans van kwartskristallen

OPMERKING: Deze methode beschrijft de opstelling en kalibratie van een Quartz Crystal Microbalance (QCM) om de massa cannabisdampdeeltjes te beoordelen die tijdens blootstellingen worden afgezet. Elke QCM biedt real-time metingen, waardoor een nauwkeurige dosimetrie van de blootstelling aan cannabisdamp mogelijk is.

  1. Voorbereiding en instelling van de QCM in het belichtingssysteem
    1. Configureer het belichtingssysteem zoals eerder beschreven.
    2. Sluit elke QCM aan op de elektronicamodule met behulp van de clipconnector en sluit de module aan op de ingangen van de inExpose-unit (inhalatiebelichtingsplatform) met een 7-pins connector.
    3. Plaats QCM-inzetstuk(ken) in een putplaat aan de belichtingszijde van het belichtingssysteem en zorg ervoor dat de QCM goed is uitgelijnd.
    4. Verwarm het belichtingssysteem met de aangesloten QCM's voor totdat het systeem zich stabiliseert op de doeltemperaturen van 35 °C en 50 °C.
    5. Activeer microstromen en belichtingsstromen volgens de experimentele instellingen.
  2. De QCM kalibreren
    1. Gebruik de kalibratiewizard van de data-acquisitiesoftware om de QCM te kalibreren vóór elke belichtingsrun.
    2. Wacht tot de blauwe kalibratiebalk is gestabiliseerd en selecteer vervolgens Volgende om de QCM-resonantiefrequentie op te nemen voor nauwkeurige massaberekeningen.
      OPMERKING: Het verwachte kalibratiebereik is -15% tot 15%. Afwijkingen kunnen duiden op problemen zoals een vuile QCM of een losgekoppelde LEMO-connector.
  3. Real-time monitoring van QCM-signalen
    1. Bewaak de QCM-uitgangen; Het systeem voert de geaccumuleerde massa uit die is afgezet. De waarde wordt in data-acquisitiesoftware zowel als onderdeel van een grafiek als de werkelijke contante waarde weergegeven.
      OPMERKING: Voor elke experimentele run worden de maximale en minimale depositie ook gerapporteerd in de software.
  4. Reiniging van de QCM
    1. Om de nauwkeurigheid te behouden, reinigt u de QCM na elk experiment.
    2. Voeg 1 ml 70% isopropylalcohol toe aan elk QCM-inzetstuk.
    3. Pipetteer de alcoholoplossing 2-3 keer op en neer om resten op te lossen.
    4. Verwijder de alcoholoplossing en laat de QCM voor het volgende gebruik volledig aan de lucht drogen in een stofvrije omgeving.

4. Resultaten van het blootstellen van cellen aan cannabisdamp

OPMERKING: Dit protocol is ontworpen om de effecten van cannabisdamp op ademhalingscellen die bij ALI zijn gekweekt te evalueren met behulp van het expoCube-systeem. Tests na blootstelling, waaronder 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) en lactaatdehydrogenase (LDH), geven inzicht in dosisafhankelijke cytotoxiciteit en metabole activiteit.

  1. Levering van cannabisdamp
    1. Stel het belichtingssysteem in zoals hierboven beschreven: Zorg ervoor dat het systeem een temperatuur van 35 °C en 50 °C heeft bereikt en een relatieve luchtvochtigheid van meer dan 75%.
    2. Als u een QCM gebruikt, bevestigt u het apparaat aan de elektronicamodule met behulp van de clipconnector en sluit u de module aan op de ingangen van de inademingsbelichtingseenheid met een 7-pins connector. Plaats het enkelvoudige QCM-inzetstuk in een putplaat aan de belichtingszijde van de expoCube en zorg ervoor dat de QCM goed is uitgelijnd.
    3. Open het belichtingssysteem en plaats de celkweekplaat erin.
    4. Begin met het bladerdeegregime voor de gewenste duur op basis van sectie 2. Met behulp van de QCM kan de totale afgezette damp in realtime worden gevolgd.
    5. Breng de cellen na de blootstelling terug naar de couveuse tot het gewenste analysetijdstip.
    6. Verzamel indien nodig monsters uit verschillende compartimenten, waaronder het basolaterale compartiment, de apicale compartimentwas (voor oppervlakteactieve stof of slijm) en het cellysaat.
    7. Dosisselectietests: Gebruik LDH- en MTT-assays om de optimale dosis en potentiële cytotoxiciteit te helpen bepalen.
  2. LDH-test voor cellen bij ALI
    1. Verzamel media: Verzamel op het gewenste tijdstip na de belichting media uit het basolaterale compartiment.
    2. Breng 100 μL verzamelde media over op een doorzichtige microplaat met 96 putjes.
    3. Voeg 100 μL vers bereid LDH-reactiemengsel toe aan elk putje.
    4. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (15-25 °C) en bescherm hem tegen licht.
    5. Meet de extinctie bij 490-492 nm, met behulp van een referentiegolflengte van meer dan 600 nm.
    6. Bereken de cytotoxiciteit met behulp van de volgende formule:
      Cytotoxiciteit (%) = (experimentele waarde-negatieve controle)/(positieve controle-negatieve controle) x 100
  3. MTT-test voor cellen bij ALI
    1. Kweek A549-cellen bij ALI zoals eerder vastgesteld.
    2. Na de toediening van de blootstelling in het belichtingssysteem brengt u de cellen terug naar de couveuse tot het gewenste tijdstip van de analyse.
    3. Los 1 mg MTT op in 1 ml PBS om de MTT-oplossing te maken.
    4. Voeg 500 μl MTT-oplossing toe aan de apicale zijde van de cellen en 500 μl MTT-oplossing aan het basolaterale compartiment.
    5. Breng de cellen gedurende 1 uur terug naar de broedmachine van 37 °C.
    6. Verwijder voorzichtig alle media.
    7. Voeg 500 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de apicale zijde en 1.000 μL DMSO aan de basolaterale zijde.
    8. Incubeer gedurende 1 uur om formazankristallen op te lossen.
    9. Verzamel en combineer de oplossing van zowel de apicale als de basolaterale zijde.
    10. Meet de extinctie bij 540 nm (OD540) met een referentie bij 690 nm (OD690).
    11. Bereken de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de volgende formule:
      Levensvatbaarheid van cellen (%) = 100 × (gemiddelde OD_exposure/gemiddelde OD_negative controle)

Resultaten

Tijdens experimenten met het expoCube-systeem ontvangen vier putjes de blootstelling aan cannabisdamp, vier putjes worden blootgesteld aan geconditioneerde lucht als voertuigcontroles en de overige vier putjes zijn volledig ingesloten als negatieve controles (Figuur 1C)17. Deze opstelling maakt een nauwkeurige vergelijking mogelijk tussen behandelde, medium- en negatieve omstandigheden. Het systeem wordt bevochtigd om een omgeving te creëren die geschikt is voor celculturen (Figuur 2), en temperatuurregeling binnen het systeem verbetert de afzetting van deeltjes door middel van thermoforese, waardoor een efficiënte afgifte van verdampte verbindingen aan de cellen mogelijk is18. Om de blootstelling te kwantificeren, meten we de hoeveelheid Δ9-THC als een marker van de afzetting van cannabisdamp op de plaats van de celblootstelling. Deze kwantificering is cruciaal voor het optimaliseren van belichtingstijden en doses, waardoor onderzoekers actieve blootstellingsperioden kunnen aanpassen om de gewenste doses in celkweekexperimenten te bereiken (Figuur 3). Door de verhouding te berekenen van Δ9-THC die in het blootstellingsstroomfilter wordt verzameld tot de hoeveelheid die in individuele putjes wordt afgezet, kunnen we de werkelijke dosis schatten die aan de cellen wordt afgegeven (Tabel 1). Deze berekende dosis informeert het gewenste blootstellingsbereik en helpt bij het bepalen van optimale parameters voor het bestuderen van cellulaire reacties op cannabisdamp op een consistente en meetbare manier. Dit kan worden uitgevoerd voor andere cannabinoïden, afhankelijk van het cannabinoïdeprofiel van de geselecteerde cannabissoort. Bovendien kan QCM-analyse worden uitgevoerd om real-time dampafzetting van cannabis te meten. Figuur 4 toont de afzetting van cannabisdamp over een tijdsverloop van 30 minuten, waarbij de verdamper en het cannabismateriaal elke 5 minuten werden vervangen. Elke put vertoonde een consistente toename van de massa in de loop van de tijd, wat wijst op een effectieve en continue afzetting van hele cannabisdampdeeltjes.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van het ALI/Transwell in vitro/ex vivo belichtingssysteem voor blootstelling aan cannabisdamp bij de ALI. (A) De DaVinci MIQRO-verdamper werd gebruikt om cannabisdamp te genereren. Dit monster wordt bevochtigd en door de isokinetische monsternemer naar de belichtingsplaats gebracht. De besturingseenheid maakt aanpassingen aan de luchtstroomoutput en temperatuurgradiënten mogelijk. (B) Foto's van de opstelling van het belichtingssysteem. (C) De binnenkant van de expoCube is opgedeeld in drie rijen: een testrij voor blootstelling aan cannabisdamp, een voertuigcontrolerij met geconditioneerde lucht en de bijgevoegde negatieve controlerij die onaangetast blijft door enige luchtstroom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Profiel van de relatieve vochtigheid (%) in de loop van de tijd. Deze gegevens tonen de relatieve vochtigheidsniveaus wanneer de Aeronebs worden geactiveerd, waarbij een gemiddelde luchtvochtigheid van 75% wordt bereikt en gehandhaafd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kwantificering van de Δ 9-THC-afzetting via LC/MS-analyse na blootstelling van 30 minuten aan cannabisdamp. (EEN-C) Δ 9-THC-afzetting werd gemeten in elk putje na drie onafhankelijke dampblootstellingen van 30 minuten, elk met 1,5 g van een cannabiscultivar met een hoog THC-gehalte. Δ 9-THC-niveaus werden gekwantificeerd door LC/MS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: QCM-metingen van cannabisdampafzetting in het ALI/Transwell in vitro/ex vivo blootstellingssysteem gedurende een blootstellingsregime van 30 minuten. (A-D) Elke grafiek geeft de cumulatieve afzetting van cannabisdampdeeltjes in putjes 1-4 weer, waarbij de massa wordt gemeten in microgram (μg) in de loop van de tijd. De depositiesnelheid vertoont een gestage accumulatie over alle putten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Primaire stroomfilterafzetting (μg)Goed afzettingen (μg)Percentage van de primaire stroom dat in een put wordt gestort (%)
Belichting 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Belichting 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Belichting 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Gemiddeld2422.94.30.18
Standaarddeviatie292.80.40.03

Tabel 1. Vergelijking van Δ 9-THC-depositie in het ALI/Transwell in vitro/ex vivo blootstellingssysteem tussen het blootstellingsstroomfilter en de celblootstellingsplaats.

Discussie

Het kweken van cellen bij de ALI is een belangrijke methode in respiratoir onderzoek vanwege het vermogen om in vivo luchtwegaandoeningen nauwkeuriger weer te geven in vergelijking met traditionele ondergedompelde culturen19. Door te kweken bij ALI kunnen longepitheelcellen direct worden blootgesteld aan de lucht op hun apicale oppervlak, terwijl essentiële voedingsstoffen uit het kweekmedium aan de basolaterale zijde behouden blijven. Deze opstelling stelt cellen in staat om oppervlakteactieve stof of slijm te produceren, belangrijke componenten van het ademhalingsafweermechanisme die cruciaal zijn voor het opvangen en verwijderen van ingeademde deeltjes en ziekteverwekkers 20,21,22. A549-cellen worden vaak gebruikt voor in vitro studies, maar zijn slechts een van de vele respiratoire epitheelcelculturen die voor ALI kunnen worden gebruikt. Silva et al. hebben cellijnen en primaire culturen van het respiratoire epitheel beoordeeld op ALI van de neusholte tot de longblaasjes22. De flexibiliteit van het gepresenteerde ALI-blootstellingssysteem maakt het mogelijk om het aan te passen voor verschillende cellijnen en primaire cellen.

ALI-culturen worden steeds meer beschouwd als de "gouden standaard" voor in-vitro-inhalatiestudies , met name voor onderzoek naar luchtverontreinigende stoffen, fijnstof en andere inhaleerbare middelen23. Een belangrijk voordeel van ALI-modellen ligt in hun vermogen om inzichten te bieden die beter te vertalen zijn naar in vivo menselijke effecten. Een opmerkelijk nadeel is echter het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen voor ALI-blootstellingen, wat de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen onderzoeken beïnvloedt. Een van de hiaten is een gestandaardiseerde belichtingsworkflow. Door cellen bloot te stellen aan cannabisdamp bij de ALI, kunnen de effecten van cannabis op de cellulaire functie, levensvatbaarheid en cytotoxiciteit worden geëvalueerd. Deze blootstellingen maken een gedetailleerde beoordeling van biologische resultaten mogelijk, waaronder markers van cytotoxiciteit, ontsteking en oxidatieve stress. De nauwkeurige kwantificering van afgezette cannabinoïden maakt reproduceerbaar onderzoek mogelijk naar de cellulaire effecten van cannabisdamp (en andere vormen van cannabisproducten), waardoor we meer inzicht krijgen in de mogelijke gezondheidseffecten ervan in een gecontroleerde laboratoriumomgeving.

Geavanceerde blootstellingssystemen pakken beperkingen in traditionele ondergedompelde culturen aan door directe afzetting van deeltjes op het celoppervlak mogelijk te maken, waardoor meer fysiologisch relevante blootstellingen worden geboden. Dit vermindert ook de potentiële effecten van de oplosmiddelen of dragers. Door directe afzetting van deeltjes mogelijk te maken zonder dat deze oplosmiddelen nodig zijn, helpen blootstellingssystemen voertuiggerelateerde effecten te minimaliseren. Desalniettemin blijven er enkele voertuiggerelateerde overwegingen bestaan. Ongecontroleerde vochtigheidsniveaus kunnen bijvoorbeeld ongewenste celstress veroorzaken24, wat mogelijk van invloed is op experimentele resultaten. Ervoor zorgen dat de luchtvochtigheid zorgvuldig wordt gereguleerd om optimale niveaus te bereiken, is essentieel om de celstabiliteit en nauwkeurigheid van de resultaten te behouden. Bovendien heeft elk deeltje, aerosol of gasmengsel zijn eigen unieke fysisch-chemische eigenschappen, die de afzetting op het celoppervlak kunnen veranderen25. Het is daarom belangrijk om voor elk uniek product een blootstellingsregime te karakteriseren. De factoren die van invloed kunnen zijn op de afzetting van deeltjes zijn onder meer thermoforese, de beweging van deeltjes van een gebied met een hogere naar een lagere temperatuur26. Thermoforese helpt bij het richten van deeltjes naar de cellen en verbetert de depositie-efficiëntie.

Doseringsconsistentie en precisie zijn extra uitdagingen bij het werken met blootstellingssystemen op de ALI, vooral wanneer er aerosolen of deeltjes bij betrokken zijn. In vivo deeltjesafzetting in de long is een complex proces dat wordt beïnvloed door deeltjesgrootte, vorm, dichtheid en oplosbaarheid, evenals het specifieke gebied van de long dat wordt blootgesteld27. Deze factoren resulteren in gevarieerde depositiesnelheden die in vitro moeilijk te repliceren zijn. Wiskundige modellen, zoals multi-path particle dosimetrie (MPPD), zijn nuttige hulpmiddelen voor het schatten van in vivo depositiesnelheden en het begeleiden van in vitro dosistranslatie28. Het afstemmen van in-vitrodosering op in-vivo-blootstellingsscenario's blijft echter een uitdaging, met name voor complexe aerosolen met heterogene samenstellingen.

Voor de karakterisering van celvrije doses is het belangrijk op te merken dat wasbeurten van roestvrijstalen inzetstukken de neiging hebben om de afzetting te overschatten, omdat verbindingen zich kunnen hechten aan zowel de wanden van het inzetstuk als aan de basis waar cellen zich normaal gesproken bevinden. De QCM biedt hier een voordeel door alleen de massa te meten die direct op de celkweeklocatie is afgezet, wat een nauwkeurigere beoordeling oplevert van de afzetting die specifiek relevant is voor de blootstelling aan cellen.

Naarmate de toxicologie evolueert naar meer fysiologisch relevante modellen, zal de toepassing van uniforme ALI-blootstellingsprotocollen van fundamenteel belang zijn om de kloof tussen in vitro bevindingen en in vivo menselijke reacties te overbruggen, en uiteindelijk betrouwbaardere beoordelingen van respiratoire toxische stoffen en hun effecten op de gezondheid te ondersteunen.

Openbaarmakingen

PG en BU zijn werkzaam bij SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW heeft stage gelopen bij SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. via het Mitacs Accelerate Program. De andere auteurs hebben geen conflicten te onthullen

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant 162273. CJB werd gesteund door het Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS). Deze studie werd ook ondersteund door een Mitacs-subsidie #IT34076 aan ETW.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Centrifuge tube, Rack (Polystyrene Rack), SterileMontreal Biotech Inc.MBI601051C
30 mL glass vialsThomas Scientific1755F32
A549 cellsATCCCCL-185
Antibiotic-antimycotic (100x)Wisent450-115-EL
Cannabis herb grinder Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL
ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q&dib_tag=se&
keywords=herb%2Bgrinder&qid=1736346511&
sprefix=herb%2Bgrinder%2Caps%
2C168&sr=8-10&th=1
Collagen from human placenta, type IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane InsertsStemcell Technologies38023
Cytotoxicity detection kit (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C dry herb vaporizerDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich34869
DMEM mediumWisent319-005-CL
Dried cannabis flowerSociété québécoise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Value&fv1=THC		Cannabinoid Content: 17–23% THC < 0.1% CBD 
Fetal bovine serumWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Version 8.4.1
GentamycinWisent450-134-XL
Glacial acetic acidSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube in vitro exposure package  SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
LC/MS-grade methanolSigma-Aldrich106035
Phosphate-buffered salineThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Surface, Filter CapThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Surface, Filter CapThermoFisher Scientific156499
Thiazolyl blue tetrazolium bromideSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Ultrasonic cleaner bathVWR18303Sonicator Bath
Weekly pill organizerHealthSmart640-8223-0000

Referenties

  1. Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
  2. Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
  3. Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
  4. Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
  5. Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
  6. Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
  7. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
  8. Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
  9. Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
  10. Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
  11. Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
  12. Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
  13. Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
  14. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
  15. Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  16. Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
  17. Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  18. Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
  19. Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  20. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  21. Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
  22. Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  23. Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
  24. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
  25. Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
  26. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  27. Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
  28. Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).

Herprints en machtigingen

Tags

Blootstelling aan cannabisdampinhalatietoxicologiedampblootstellingssysteemkwartskristalmicrobalansrespiratoire celkweekreal-time dosimetriemeting van dampdepositiepreklinisch longmodel
In vitro Blootstelling aan cannabis van longepitheelcellen op het grensvlak tussen lucht en vloeistof
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.