Method Article

Gestandaardiseerde modulaire assemblage van polycistronische operons met modulair klonen (MoClo) met behulp van de In-Cloning toolkit

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd dat laat zien hoe modulair klonen (MoClo) kan worden aangepast voor het klonen van polycistronische operonen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modular Cloning (MoClo) toolkits maken de snelle assemblage van multigenconstructen mogelijk. Ze zijn gebaseerd op Golden Gate-klonen, waarbij Type IIS-restrictie-enzymen worden gebruikt die buiten hun herkenningsplaats snijden. Aangezien herkenning en knipsequentie zijn ontkoppeld, kunnen overhangs die zijn gecreëerd door Type IIS-restrictie-enzymen opzettelijk worden gekozen, en kloonstrategieën voorkomen doorgaans het knippen van correct samengevoegde DNA-fragmenten. Dit maakt zeer efficiënte assemblages van meerdere DNA-fragmenten in een enkele reactie mogelijk. In MoClon krijgen individuele functionele DNA-onderdelen zoals promotors, ribosomale bindingsplaatsen, coderende sequenties en terminators, evenals assemblages van hogere orde, gestandaardiseerde overhangen toegewezen, zodat herbruikbare onderdelenbibliotheken kunnen worden gemaakt. De meeste bacteriële MoClo-toolkits zijn ontworpen voor het klonen van monocistronische transcriptie-eenheden en bieden geen gestructureerd pad voor de assemblage van polycistronische operonen. Dit protocol demonstreert de assemblage van polycistronische transcriptie-eenheden met de In- & Out-Cloning toolkit. Dezelfde aanpak is overdraagbaar naar andere MoClo-toolkits.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleculair klonen, de introductie van recombinant DNA in een replicon zoals een plasmide, is een fundamentele methodologie in de moleculaire biologie. De constructie- en assemblagemethoden van DNA zijn de afgelopen decennia steeds geavanceerder geworden. Inmiddels kunnen onderzoekers hele synthetische chromosomen en zelfs genomen bouwen uit gesynthetiseerd DNA1. Traditioneel moleculair klonen is vaak gebaseerd op ad-hockloonstrategieën en kan arbeidsintensief en duur zijn voor grote constructies met meerdere genen2. In de afgelopen jaren zijn Golden Gate (GG) klonen en afgeleide hiërarchische Modular Cloning (MoClo) toolkits 2,3 populaire oplossingen geworden om tijd- en kostenefficiënte DNA-assemblage mogelijk te maken.

Type IIS-restrictie-enzymen zijn endonucleasen die een directionele (niet-palindromische) sequentie herkennen en buiten deze herkenningssequentie splitsen4. Als gevolg hiervan zijn overhangsequenties die door splitsing zijn ontstaan niet afhankelijk van de herkenningsplaats, maar kunnen ze worden gekozen4. Verder kunnen functionele DNA-fragmenten, hier 'onderdelen' genoemd, zo worden ontworpen dat splitsing de herkenningsplaats van de uiteinden van de nog te verbinden delen2 verwijdert. GG-kloonstrategieën maken hiervan gebruik om efficiënte meerdelige DNA-assemblages in eenpotreacties mogelijk te maken5. MoClo-toolkits zijn gebaseerd op GG-klonen en hebben tot doel een modulaire en hiërarchische manier te bieden voor de assemblage van multi-genconstructies. Overhangen die worden gebruikt om onderdelen te assembleren, zijn gestandaardiseerd, waardoor herbruikbare en verwisselbare onderdelenbibliotheken kunnen worden gemaakt. MoClo-toolkits zijn gebaseerd op acceptorplasmiden, die zijn ontworpen om meerdere DNA-sequenties te accepteren en het geassembleerde product vrij te geven. Elk acceptorplasmide bevat twee herkenningsplaatsen van twee verschillende Type IIS-enzymen, waarvan er één wordt gebruikt voor het accepteren van DNA-lading en de andere voor het vrijgeven van geassembleerd DNA 3,6. Een illustratie van dat principe wordt getoond in figuur 1 voor het klonen van een individueel onderdeel, een terminator, in een MoClo-acceptorplasmide (niveau 0). Zowel het acceptorplasmide als het inzetstuk worden doorgesneden door het restrictie-enzym BbsI, op een manier die compatibele overhangen achterlaat en de BbsI-herkenningsplaatsen verwijdert. Correct geligeerde plasmiden worden dus niet meer door BbsI gesneden. Door het resulterende plasmide te knippen met het type IIS-enzym SapI komt het eerder ingebrachte fragment vrij in de volgende assemblagestap (niveau 1).

In dit protocol wordt gebruik gemaakt van de In- en Out-Clonning MoClo toolbox7. Hier bevatten plasmiden van niveau 0 gedefinieerde fundamentele genetische delen zoals promotors met 5' niet-getransleerde regio's (UTR's), coderende sequenties en terminators met 3'UTR's, Figuur 1 toont een schematisch overzicht van niveau 0. Op niveau 1 worden meerdere onderdelen samengevoegd tot een transcriptie-eenheid (TU), Figuur 2 toont een schematisch overzicht van niveau 1 onderdelen en klonen. In- en uitklonen MoClo is ontworpen voor littekenloze assemblage van transcriptie-eenheden in niveau 1 door gebruik te maken van een Type IIS-enzym dat 3-nucleotide-overhangen creëert. Hierdoor kunnen overhangs volledig binnen het codonraster van de coderingssequentie liggen, met behulp van de ATG-start en de TGA-stopcodons voor assemblage. Niveaus M en P worden gebruikt voor de assemblage van meerdere transcriptie-eenheden die vrijkomen uit plasmiden 3,8 van niveau 1. Figuur 3 toont een schematisch overzicht van de onderdelen voor klonen in niveau M en P, en de assemblage van een bicistronisch operon in niveau M (een bicistronisch operon is een transcriptie-eenheid die meerdere coderende sequenties (CDS'en) tot expressie brengt). Niveau P en M zijn ontworpen om iteratieve cycli van de ene naar de andere mogelijk te maken, zodat er geen theoretische limiet is voor het aantal onderdelen dat kan worden geassembleerd, dit wordt echter niet beschreven in dit protocol, aangezien de belangrijkste focus van dit protocol is om de assemblage van een bicistronisch operon te laten zien. Hoewel er geen limiet is aan het aantal onderdelen dat kan worden geassembleerd, is er wel een limiet aan de grootte van een constructie die kan worden geassembleerd; tot 100.000 bp is geassembleerd met behulp van een MoClo-kit9. Bovendien kunnen grote constructies of constructies die giftige genen bevatten een belasting voor de cel veroorzaken; Voor deze gevallen zijn gewijzigde protocollen gepubliceerd10.

In- en Out-Cloning beschreef aanvankelijk geen schema voor de assemblage van polycistronische transcriptie-eenheden. Polycistronische operonen zijn een veel voorkomende manier van genorganisatie in bacteriën 11,12,13, en daarom is er opmerkelijke belangstelling voor hun bottom-up assemblage op een modulaire manier 14. Hier wordt een gestructureerd schema beschreven voor de assemblage van polycistronische operonen met behulp van in- en out-klonen. Het gepresenteerde schema maakt het mogelijk om de positie van coderende sequenties binnen polycistronische transcriptie-eenheden gemakkelijk om te wisselen, evenals assemblages bestaande uit zowel mono- als polycistronische transcriptie.

Het volgende stap-voor-stap protocol toont het ontwerp en het klonen van een polycistronisch operon met behulp van In- en Out-Cloning. De gepresenteerde strategie voor het klonen van polycistronische transcriptie-eenheden kan eenvoudig worden aangepast aan andere MoClo-toolkits.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol beschrijft het ontwerp en de assemblage van een polycistronisch operon door middel van drie niveaus van de In-Cloning-standaard (0, 1 en M). Het polycistronische operon dat hier is geassembleerd, begint met een promotor, gevolgd door een ribosomale bindingsplaats (RBS), een coderingssequentie (CDS), een tweede RBS, een tweede CDS en ten slotte een terminator (Figuur S1). Het wordt sterk aangeraden om moleculaire kloonsoftware te gebruiken om het klonen in silico te simuleren, om er zeker van te zijn dat de ontworpen kloonstrategie correct is. Een voorbeeld van het samenstellen van een promotor als een onderdeel van niveau 0, het samenstellen van een RBS met een coderingssequentie en een terminator tot een transcriptie-eenheid van niveau 1, en de assemblage van een bicistronisch operon in niveau M wordt hier beschreven, en een schematisch overzicht van de hele assemblage wordt weergegeven in figuur S1.

1. Niveau 0: Domesticatie van onderdelen

OPMERKING: De term "domesticatie" wordt gebruikt om aan te geven dat een moleculair onderdeel is geïntegreerd in een MoClo-onderdelenbibliotheek en kan worden geassembleerd op alle niveaus van de MoClo-kit. Doorgaans worden alle herkenningsplaatsen van Type IIS-restrictie-enzymen die in de kit worden gebruikt, verwijderd uit het te domesticeren deel, bijvoorbeeld door synonieme hercodering.

  1. Ontwerp van de insert
    1. Kies de moleculaire onderdelen, zoals promotor, CDS en terminator, die in het operon moeten worden samengevoegd.
      OPMERKING: In dit protocol begint het operon met de promotor PLuxB, die kan worden geactiveerd door het eiwit LuxR in aanwezigheid van de inducerende verbinding N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserinelacton (OC6)17. GFP is de eerste CDS van het operon; zijn RBS is iGEM BBa_B0064. GFP wordt gevolgd door een niet-terminale linker, de 'terminator bridge'. De tweede CDS is mTurquoise. Het RBS is ontworpen door een RBS-calculator18. Ten slotte eindigt het operon met de terminator L3S2P2119.
    2. Kies de positie waarin het onderdeel geassembleerd moet worden, een overzicht wordt getoond in Figuur 1. Kies op basis van de positie het acceptorplasmide dat in de GG moet worden gebruikt.
      OPMERKING: Onderdelen kunnen worden gedomesticeerd voor later gebruik in verschillende posities. Een promotor kan bijvoorbeeld later als een enkel onderdeel worden geassembleerd door verbinding te maken met een 5'UTR-onderdeel (pSL252), of het kan worden gedomesticeerd met een reeds aanwezige 5'UTR (pSL099). Een CDS kan worden geassembleerd in vier acceptorplasmiden, te worden geassembleerd zonder tag (pSL102), te worden geassembleerd met een N-terminal tag (pSL104), te worden geassembleerd met een C-terminal tag (pSL101), of te worden geassembleerd met zowel een N-terminal tag als een C-terminal tag (pSL103). In het gegeven voorbeeld wordt de promotor gedomesticeerd in pSL252, de eerste RBS wordt gedomesticeerd in pSL253, de eerste CDS wordt gedomesticeerd in pSL102, de terminatorbrug wordt gedomesticeerd in pSL106, de tweede RBS wordt gedomesticeerd in pSL099, de tweede CDS wordt gedomesticeerd in pSL102 en de terminator wordt gedomesticeerd in pSL106.
    3. Voeg verlengstukken toe aan het ontworpen inzetstuk op basis van het gekozen acceptorplasmide. Tabel 1 geeft een overzicht van de uitbreiding die nodig is voor GG-assemblage per acceptorplasmide. Deze verlengingen moeten worden toegevoegd tijdens het ontwerp van de primers voor PCR, het ontwerp van de oligo's in het geval van het gloeien van twee oligo's om een onderdeel te construeren, of tijdens gensynthese.
      OPMERKING: Om een onderdeel te domesticeren, is het noodzakelijk ervoor te zorgen dat het onderdeel zelf geen herkenningsplaatsen bevat van de Type IIS-enzymen die in de kit worden gebruikt, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') en BsaI (5'-GGTCTC-3'). De aanwezigheid van herkenningsplaatsen in onderdelen vermindert de efficiëntie van correcte assemblage drastisch, omdat het eindproduct kan worden gesneden door het gebruikte Type IIS-enzym (zie figuur 1).
  2. GG reactie
    1. Voeg voor de GG-reactie 50 fmol van de gewenste insert, 50 fmol van het acceptorplasmide, 1 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μL T4-ligase en 1 μL BbsI toe. Voeg nucleasevrij water toe aan een totaal volume van 10 μL. Voeg bovendien een negatieve controle toe met dezelfde reactie zonder de gewenste insert.
    2. Voer het volgende programma uit in een thermocycler: 25 cycli van 37 °C gedurende 3 minuten (37 °C is de optimale temperatuur van het restrictie-enzym) en 16 °C gedurende 4 minuten (16 °C is de optimale temperatuur van T4-ligase), gevolgd door een eindvertering bij 50 °C gedurende 20 minuten (bij 50 °C vertoont T4-ligase zeer weinig tot geen activiteit, terwijl het restrictie-enzym nog steeds kan functioneren, waardoor de hoeveelheid ongesneden acceptorplasmide in het eindproduct wordt beperkt) en een warmte-inactivatie van de enzymen bij 80 °C gedurende 20 minuten (bij 80 °C worden alle enzymen geïnactiveerd en wordt de reactie beëindigd)6.
    3. Transformeer de GG-reactie door 5 μL van de GG-reactie toe te voegen aan 50 μL chemisch competente E. coli-cellen en voer een hitteschoktransformatie uit met een herstelstap zoals beschreven in een eerder gepubliceerd protocol15.
    4. Verspreid 100 μL van de transformatie-uitgroei op een Luria-Bertani (LB) agarplaat met 100 μg/ml spectinomycine. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C.
    5. Vergelijk de transformatie-efficiëntie van de negatieve controle met die van de volledige assemblage door het aantal witte kolonies op beide platen te tellen. Ga verder met de volgende stap als het geheel ongeveer 10 keer (of meer) witte kolonies heeft dan de negatieve controle.
      OPMERKING: De meerderheid van de resulterende kolonies moet wit zijn, met slechts een klein deel van de rode kolonies. Acceptorplasmiden in de In-Cloning toolkit hebben een dubbele selectiecassette, die ofwel mCherry (niveau 0 en niveau 1) of LacZα (niveau M en niveau P) bevat, en een ccdB-gen, dat codeert voor een gyraseremmer. Transformatie van de GG-reactie wordt uitgevoerd in ccdB-gevoelige E. coli-cellen, dus alleen cellen met het geassembleerde plasmide kunnen groeien, terwijl het oorspronkelijke acceptorplasmide niet kan worden vermeerderd. Voorbeelden van ccdB-gevoelige stammen zijn DH5α en TOP10. De mCherry/LacZα maakt visuele identificatie mogelijk van cellen die ontsnappen aan het ccdB-mechanisme 16.
    6. Kweek voor elke assemblage twee witte kolonies door met een pipetpunt wat materiaal van de kolonie op te nemen en dit opnieuw te suspenderen in 5 ml LB-medium met elk 100 μg/ml spectinomycine en een nacht te incuberen bij 37 °C in een schudbroedmachine bij 250 tpm. Voer een plasmide-extractie op basis van kolommen uit volgens de instructies van de fabrikant. Controleer of het geëxtraheerde plasmide de verwachte sequentie heeft door middel van Sanger-sequencing.

2. Niveau 1: Bepaling van posities

OPMERKING: Niveau 1 is het niveau tussen het domesticeren van onderdelen en het in elkaar zetten van een polycistronisch operon (Figuur 2). Hier worden de posities van tussenassemblages in de uiteindelijke constructie bepaald. De positie van een niveau 1-assemblage in het operon kan worden gewijzigd door een ander niveau 1-acceptorplasmide te gebruiken. Het gegeven voorbeeld beschrijft de assemblage van een bicistronische eenheid, maar het gegeven schema kan eenvoudig worden aangepast voor de assemblage van maximaal zes coderingssequenties (met elk een RBS). Het samenstellen van meer coderingssequenties vereist bovendien een wissel tussen niveau P en M. Met iteratieve cycli tussen niveau P en M is er geen vaste bovengrens voor het aantal coderende sequenties dat in één enkel operon kan worden geassembleerd.

  1. Keuze van onderdelen en acceptor plasmiden
    1. Kies de onderdelen van niveau 0 die in een transcriptie-eenheid moeten worden samengevoegd. Deze moeten minimaal een promotor, een CDS en een terminator bevatten.
    2. Kies de positie waarin de transcriptie-eenheid in het operon moet worden gemonteerd. Kies op basis van die positie het juiste acceptorplasmide. Een overzicht is weergegeven in Figuur 2.
      OPMERKING: De 7 DNA-fragmenten voor de constructie van het bicistronische operon dat als voorbeeld wordt getoond, worden samengevoegd tot twee niveau 1-constructies. De promotor, de eerste RBS, de eerste CDS en de terminatorbrug worden geassembleerd tot pSL68; de tweede RBS, de tweede CDS en de terminator worden geassembleerd tot pSL69.
  2. GG reactie
    1. Voeg voor de GG-reactie 50 fmol van elk van de gewenste inserts, 50 fmol van het acceptorplasmide, 1 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μL T4-ligase en 1 μL SapI toe. Voeg nucleasevrij water toe tot een totaal volume van 10 μL.
    2. Voer het volgende programma uit in een thermocycler: 25 cycli van 37 °C gedurende 3 min en 16 °C gedurende 4 min, gevolgd door een laatste vertering bij 50 °C gedurende 20 min, en warmte-inactivatie van de enzymen bij 80 °C gedurende 20 min6.
    3. Optioneel: Voeg 0,5 μL SapI toe aan de GG-reactie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: SapI is niet zo stabiel als de andere gebruikte type IIS-restrictie-enzymen. Het is gebleken dat een verteringsstap met SapI na de GG-reactie de hoeveelheid kolonies vermindert die het opnieuw geligeerde acceptorplasmide dragen. SapI heeft een isoschizomer, BspQI, die deze laatste verteringsstap misschien niet nodig heeft.
    4. Transformeer 5 μl van de GG-reactie in 50 μl chemisch competente E. coli-cellen en voer een hitteschoktransformatie uit, bij voorkeur met een herstelstap zoals uitgevoerd in stap 1.2.3.
    5. Plaat 100 μL van de transformatie-uitgroei op een LB-agarplaat met 100 μg/ml ampicilline. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C.
    6. Kweek voor elk twee witte kolonies door wat materiaal van de kolonie op te pakken met een pipetpunt en het opnieuw te suspenderen in 5 ml LB-medium met elk 100 μg/ml ampicilline. Incubeer een nacht bij 37 °C in een schudbroedmachine bij 250 tpm. Voer een plasmide-extractie op basis van kolommen uit volgens de instructies van de fabrikant.
    7. Bevestig de juiste montage door middel van een restrictiedigest met BbsI en controleer of de grootte van de uitsparing overeenkomt met de verwachte grootte van de insert. Ontsmeer 1000 ng plasmide-DNA door 1 μL van de juiste 10x digestiebuffer en 1 μL BbsI toe te voegen. Voeg nucleasevrij water toe aan een totaal volume van 10 μL. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    8. Voer gelelektroforese uit door het verteerde plasmide op een 1% agarosegel te laden, laat de gel 35 minuten op 100 V draaien.
      OPMERKING: Een in silico-digestie van het verwachte plasmide kan worden uitgevoerd om een agarosegel te simuleren om het resultaat te voorspellen.

3. Niveau M: Montage van een polycistronisch operon

OPMERKING: In deze stap wordt het polycistronische operon geassembleerd. In het gepresenteerde geval van een bicistronisch operon zijn twee inserts van niveau 1 gemonteerd op de posities 1 en 2. Dienovereenkomstig wordt gekozen voor het acceptorplasmide pMA60. Verder is een eindlinker vereist. Alle plasmiden van niveau M en P acceptor hebben de overhang GGGA als tweede overhang. Eindlinkers slaan een brug tussen de insert en het acceptorplasmide en maken assemblage van een Level P-constructie in Level M mogelijk en vice versa. Voor een Level P-assemblage van twee Level 1-inserts wordt de eindlinker pMA668 gebruikt die de derde en laatste positie inneemt. Een overzicht van niveau M en P en een visualisatie van de kloonstap worden weergegeven in figuur 3. Met assemblage uitsluitend op niveau M (of P) kunnen operaronen van maximaal 6 coderingssequenties worden gekloond (posities 1-6). Positie 7 wordt ingenomen door de eindlinker. De assemblage van een groter aantal coderende sequenties in een operon is mogelijk, maar vereist een cyclus naar niveau M (of P), dat niet in dit protocol wordt beschreven.

  1. Voeg voor de GG-reactie 50 fmol van elke gewenste insert, 50 fmol van het acceptorplasmide, 1 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μL T4-ligase en 1 μL BbsI toe. Voeg nucleasevrij water toe tot een totaal volume van 10 μL.
  2. Voer het volgende programma uit in een thermocycler: 50 cycli van 37 °C gedurende 3 min en 16 °C gedurende 4 min, gevolgd door een eindvertering bij 50 °C gedurende 20 min en warmte-inactivatie van de enzymen bij 80 °C gedurende 20 min6.
  3. Transformeer 5 μl van de GG-reactie in 50 μl chemisch competente E. coli-cellen en voer een hitteschoktransformatie uit met een herstelstap zoals uitgevoerd in stap 1.2.3.
  4. Verdeel 100 μL van de transformatie-uitgroei op een LB-agarplaat met 100 μg/ml spectinomycine. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C of bij 30 °C als u een metabolische belasting of toxiciteit van het geheel verwacht.
  5. Maak voor elke assemblage een cultuur van twee blanke kolonies. Dompel hiervoor een pipetpunt in de kolonie en gebruik deze om 5 ml LB te inoculeren met 100 μg/ml spectinomycine. Incubeer een nacht bij 37 °C of 30 °C in een schudbroedmachine bij 250 tpm. Voer een plasmide-extractie op basis van kolommen uit volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Bevestig de correcte montage door middel van een restrictiedigest met BsaI, waarbij wordt gecontroleerd of de grootte van de uitsparing overeenkomt met de verwachte grootte van de insert, zoals uitgevoerd in stap 2.2.7.
    OPMERKING: De constructie kan te lang zijn om ter bevestiging door Sanger-sequencing te worden gedekt. Het kan vervolgens worden bevestigd door sequencing van het hele plasmide, dat als commerciële service beschikbaar is bij verschillende aanbieders van sequencingdiensten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden de resultaten getoond van een bottom-up assemblage van een polycistronisch operon van niveau 0 tot niveau M (Figuur S1). Het operon begint met de promotor PLuxB, die kan worden geactiveerd door het eiwit LuxR in aanwezigheid van de inducerverbinding N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserinelacton (OC6)17. GFP is de eerste CDS van het operon, de RBS is iGEM BBa_B0064. GFP wordt gevolgd door een niet-terminale linker, de 'terminator brid...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleculair klonen kan tijdrovend en omslachtig zijn, vooral met ad-hockloonstrategieën. MoClo-toolkits kunnen moleculair klonen verbeteren door hun modulariteit, hiërarchische assemblage en zeer efficiënte eenpotreacties. Ze vertrouwen op DNA-assemblage door middel van Golden Gate-reacties. Dankzij gestandaardiseerde overhangen kunnen bibliotheken van moleculaire onderdelen worden hergebruikt en gedeeld met anderen 3,6. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV en DS werden ondersteund door de Max Planck Society in het kader van het MaxGENESYS-project.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinMerck Life ScienceA9518
Bacteriële agarFisher Scientific P0011B
BbsI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5α competent cellen
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal CyclersEppendorf6333000014
EzDrop 1000 Micro-Volume SpectrophotometerBlue-Ray BiotechBRED-1000
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0503
In- & Out- Cloning Toolkit
Ligase bufferNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific BP358
New Brunswick Innova® 42/42R - Stapelbare Incubator ShakerEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+Singer InstrumentsPHB-007
SapINew England BiolabsR0569
SpectinomycineMerck Life ScienceS4014
Standaard labmateriaal
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
TryptoneFisher Scientific LP0042B
GistextractFisher Scientific LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles