Uitgebreide analyse van procoagulerende bloedplaatjes die kenmerken van necrose, apoptose en activering van bloedplaatjes vertonen

Samenvatting

Het huidige protocol biedt een uitgebreide reeks procedures die nodig zijn om procoagulerende bloedplaatjes te analyseren, die overlappende kenmerken van necrose, apoptose en activering van bloedplaatjes vertonen.

Samenvatting

Bloedplaatjes die in de bloedbaan circuleren zijn relatief rustig, maar worden "geactiveerd" bij het tegenkomen van stimulerende middelen of "agonisten" op de plaats van bloedvatbeschadiging. Proaggregatoire en procoagulerende bloedplaatjes vertegenwoordigen twee verschillende populaties van geactiveerde bloedplaatjes. Terwijl proaggregerende bloedplaatjes het stoppen van bloedingen, of 'hemostase', vergemakkelijken door een prop van bloedplaatjes te vormen die samenklonteren via fibrinogeenbruggen, versnellen procoagulerende bloedplaatjes de stollingscascade dramatisch, met als hoogtepunt de vorming van fibrinestolsels. Een interessant aspect van procoagulante bloedplaatjes is dat hun morfologie bepaalde kenmerken van "necrose" en "apoptose" vertoont. Ze kunnen dus een vorm van celdood in bloedplaatjes vertegenwoordigen, zij het met een belangrijke rol bij trombose en hemostase. In dit artikel wordt het concept van procoagulerende bloedplaatjes geïntroduceerd, hun relevantie voor gezondheid en ziekte, en een vergelijking van bestaande methoden voor hun analyse. Vervolgens biedt het uitgebreide protocollen voor het analyseren van procoagulante bloedplaatjes, het onderzoeken van de mechanismen van hun vorming en het beoordelen van hun protrombotische rol bij het vergemakkelijken van coagulatie. Het artikel wordt afgesloten met een bespreking van de belangrijkste stappen, beperkingen en principes voor probleemoplossing voor de beschreven methoden.

Inleiding

Er zijn ten minste twee verschillende populaties van geactiveerde bloedplaatjes ^1,2. Pro-aggregatoire bloedplaatjes worden gekenmerkt door een hoge activering van integrine en een lage of geen blootstelling aan PS. Aan de andere kant worden procoagulante bloedplaatjes gekenmerkt door een lage integrine-activiteit en een hoge blootstelling aan PS ^1,2, wat een oppervlak biedt voor de assemblage van tenase- en protrombinasecomplexen³, dat respectievelijk 10^{5-10 6-voudig} en 300000 keer actiever is dan individuele oplosbare fasefactor IXa en Xa⁴. Procoagulerende bloedplaatjes versnellen dus de stolling drastisch. Een interessant aspect van procoagulante bloedplaatjes is dat hun morfologie lijkt op bepaalde kenmerken van "necrose", zoals microvesiculatie, ballonvorming van de cel met verstoring van het cytoskelet en verlies van membraanintegriteit, evenals die van "apoptose" zoals verlies van membraanfosfolipide-asymmetrie met blootstelling van fosfatidylserine in de buitenste bijsluiter ^5,6. Met andere woorden, de vorming van procoagulerende bloedplaatjes kan een vorm van celdood in bloedplaatjes vertegenwoordigen, zij het met een belangrijke fysiologische functie bij hemostase.

Procoagulerende bloedplaatjes zijn significant geassocieerd met trombotische aandoeningen. Hoewel de meeste gezonde personen geen circulerende procoagulerende bloedplaatjes hebben, neemt ~30% van de normale donorbloedplaatjes ex vivo een procoagulerend fenotype aan na blootstelling aan sterke agonisten zoals trombine en collageen⁷. Circulerende procoagulante bloedplaatjes zijn gemeld bij trauma, waarbij hun vorming activering door histon H4 ^8,9 kan weerspiegelen. Bij de meeste protrombotische aandoeningen worden verhoogde niveaus van procoagulerende bloedplaatjes echter pas gedetecteerd na ex vivo stimulatie¹⁰. Patiënten met een acute beroerte bij wie >51,1% van hun bloedplaatjes werd omgezet in procoagulerende bloedplaatjes (ook bekend als COATed bloedplaatjes) door collageen en trombine, hadden bijvoorbeeld een hazard ratio van 10,72 voor recidiverende beroerte binnen 30 dagen in vergelijking met patiënten met minder procoagulerende bloedplaatjesvorming¹¹. Vergelijkbare resultaten zijn gemeld bij patiënten met voorbijgaande ischemische aanvallen en atherosclerose van de halsslagader¹². Daarentegen is de bloedingsstoornis Scott-syndroom het gevolg van een mutatie van ANO6, die codeert voor de fosfolipide scramblase TMEM-16F, wat leidt tot deficiënte blootstelling aan PS met bloedplaatjes¹³. Idiopathische bloedingsstoornissen en intracraniële bloedingen kunnen in verband worden gebracht met een verminderd vermogen om procoagulerende bloedplaatjes te genereren¹⁴.

Daarom maakt de beoordeling van procoagulerende bloedplaatjes deel uit van elke analyse van de bloedplaatjesfunctie, niet alleen tijdens basisonderzoeken naar mechanismen van bloedplaatjesactivering en daaruit voortvloeiende trombose en hemostase, maar ook tijdens klinische analyse op risico op trombose of bloeding bij patiënten tijdens verschillende pathologische toestanden. Een panel van de International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) adviseerde het gebruik van Annexine V-binding en P-selectine-expressie door middel van flowcytometrie om procoagulantia te onderscheiden van andere subpopulaties van bloedplaatjes¹⁵. Het artikel bespreekt ook de verschillende methoden die kunnen worden gebruikt om procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes te analyseren, maar schiet tekort in het in detail beschrijven van de processen. Deze methoden omvatten detectie van (1) activering van bloedplaatjes door PAC1/JonA of fibrinogeenbinding (flowcytometrie); (2) secretie van alfa-granule door P-selectine-expressie (flowcytometrie); (3) PS-blootstelling door Annexin V/lactadherinebinding (flowcytometrie); (4) verlies van membraanintegriteit door GSAO-labeling (flowcytometrie); (5) morfologische veranderingen zoals ballonvaren (microscopie); (6) detectie van caspase-activering door middel van caspase-assay (immunoblotting/luminometrie/flowcytometrie) of afbraak van cytoskeletsubstraat gelsoline (immunoblotting); (7) verlies van mitochondriaal membraanpotentiaal door mitochondriale potentiaalgevoelige kleurstoffen zoals JC-1/Mitotracker (flowcytometrie); (8) mitochondriale intrinsieke apoptotische markers Bax, Bak en cytochroom c afgifte (immunoblotting); (9) procoagulerende functie door trombinegeneratietest en stollingsfactor Xa/Va-binding (flowcytometrie, microscopie); (10) Cytosolische en mitochondriale calciumstijging door fluorescerende calciumgevoelige kleurstoffen (flowcytometrie, fluorometrie, microscopie).

De huidige studie gaat dieper in op uitgebreide protocollen voor de analyse van procoagulante bloedplaatjes en onderscheidt ze van proaggregatoire en apoptotische bloedplaatjes. De meeste beschreven procedures zijn gebaseerd op flowcytometrie die de voordelen heeft dat (1) ze direct beschikbaar en gebruiksvriendelijk zijn, (2) een laag monstervolume vereisen en (3) gelijktijdige detectie van meerdere subpopulaties van bloedplaatjes (proaggregatie, procoagulans en apoptotisch) mogelijk ^maken15. Deze op flowcytometrie gebaseerde protocollen worden aangevuld met functionele assays van procoagulerende activiteit op basis van coagulatiefactorbinding en op stolsels gebaseerde trombinegeneratietesten.

Protocol

Menselijke deelnemers werden gerekruteerd in de studie voor perifere veneuze bloedafname na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming, strikt volgens de aanbevelingen en goedkeuring van de Institutional Review Board van het Cleveland Clinic Lerner Research Institute, waarbij alle onderzoeksmethodologieën voldoen aan de normen die zijn vastgelegd in de Verklaring van Helsinki. Gezonde volwassen deelnemers ouder dan 18 jaar werden opgenomen, terwijl personen jonger dan 18 jaar, personen met een recente voorgeschiedenis van trombotische voorvallen in de afgelopen zes maanden, personen met een voorgeschiedenis van alcoholisme of drugsmisbruik en deelnemers die in de afgelopen vier weken bloedplaatjesaggregatieremmers of antistollingsmiddelen hadden gebruikt, werden uitgesloten. Een gedetailleerde beschrijving van de materialen en reagentia die in de protocollen worden gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van bloedplaatjes

1. Afname van perifere veneuze bloedmonsters in ACD-antistollingsmiddel (1:9 v/v) van menselijke deelnemers na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming, strikt volgens de aanbevelingen die zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board.
2. Centrifugeer het bloed dat is afgenomen in ACD bij 100 x g gedurende 20 minuten bij 22 °C om bloedplaatjesrijk plasma (PRP) als supernatant te verkrijgen.
3. Centrifugeer de PRP bij 800 x g gedurende 7 minuten bij 22 °C na toevoeging van 3 μM PGE₁ en 2 mM EDTA.
4. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de bloedplaatjespellet opnieuw in buffer A (zie Materiaaltabel) door voorzichtig te pipetteren.
5. Centrifugeer de bloedplaatjes geresuspendeerd in buffer A bij 800 x g gedurende 7 minuten bij 22 °C.
6. Resuspendeer de bloedplaatjeskorrel in buffer B (zie materiaaltabel) door voorzichtig te pipetteren.
7. Pas het uiteindelijke aantal bloedplaatjes aan op 1 × 10⁷/ml met behulp van een geautomatiseerde cellenteller.
   OPMERKING: Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden en neem voorzorgsmaatregelen om de bloedplaatjes in rust te houden door blootstelling aan overmatige afschuiving tijdens het pipetteren te vermijden.

2. Analyse van procoagulerende bloedplaatjes door middel van flowcytometrie

1. Vul gewassen menselijke bloedplaatjes aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjesuspensie).
2. Houd één fractie van de bloedplaatjes niet gestimuleerd en stimuleer de overige fracties met trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml, 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml) of hun combinatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Voeg na stimulatie 1 μL PE-Annexine V, FITC-PAC1 en APC-anti-humaan CD62P-antilichaam toe aan 100 μL gestimuleerde bloedplaatjesuspensies.
4. Incubeer de bloedplaatjes in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
5. Fixeer de bloedplaatjes door een gelijk volume (1:1) van 2% formaline toe te voegen.
6. Analyseer de monsters door middel van flowcytometrie om procoagulante bloedplaatjes te kwantificeren^15,16.
7. Teken een amorfe poort om bloedplaatjes te omvatten en ze te scheiden van ruis en deeltjes met meerdere bloedplaatjes.
8. Verzamel alle fluorescentiegegevens met behulp van logaritmische amplificatie in vier kwadranten voor 10.000 gebeurtenissen in de bloedplaatjespoort van elk monster.
9. Definieer regio's voor bloedplaatjes op basis van fluorescentiepositiviteit of negativiteit voor blootstelling aan fosfatidylserine (PS) (Annexine V-binding), P-selectine (CD62P)-expressie en integrine αIIbβ_3-activering (PAC1-binding).
10. Beschouw bloedplaatjes als positief voor zowel PS-blootstelling (Annexine V-binding) als P-selectine (CD62P)-expressie, maar negatief voor integrine αIIbβ_3-activering (PAC1-binding) als procoagulerende bloedplaatjes (Figuur 1) (Tabel 1).
11. Beschouw bloedplaatjes op dezelfde manier als positief voor zowel integrine αIIbβ_3-activering (PAC1-binding) als P-selectine (CD62P)-expressie, maar negatief voor blootstelling aan PS (Annexine V-binding) als proaggregerende bloedplaatjes.
    OPMERKING: Bloedplaatjes die negatief zijn voor zowel integrine αIIbβ_3-activering (PAC1-binding) als P-selectine (CD62P) expressie, maar positief voor blootstelling aan PS (Annexine V-binding) zijn waarschijnlijk apoptotische bloedplaatjes^15,16.

3. Analyse van mitochondriaal calcium door middel van flowcytometrie

1. Verdun gewassen menselijke bloedplaatjes tot 1 × 10⁶/ml en vul aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjessuspensie).
2. Label de bloedplaatjes met 5 μM Rhod-2 AM (voor mitochondriaal calcium) gedurende 30 minuten in het donker.
3. Poortplaatjes op de juiste manier afschuiven, zoals beschreven in stap 2.
4. Analyseer gebeurtenissen in de bloedplaatjespoort op tijdsafhankelijke veranderingen in de gemiddelde fluorescentie van verworven gebeurtenissen gedurende 5 minuten met behulp van een dichtheidsspreidingsdiagram van PE-fluorescentie (voor Rhod-2 AM) versus tijd.
5. Noteer de calciumspiegels bij aanvang gedurende de eerste 1 minuut.
6. Voeg trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml of 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml of 100 ng/ml) of hun combinatie toe en blijf nog 4 minuten en¹⁷ minuten gegevens verzamelen.

4. Analyse van het mitochondriaal membraanpotentiaal door middel van flowcytometrie

1. Vul gewassen menselijke bloedplaatjes aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjesuspensie).
2. Houd één fractie van de bloedplaatjes niet gestimuleerd en stimuleer de overige fracties met trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml of 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml of 100 ng/ml) of hun combinatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Voeg na stimulatie mitochondriën labelende kleurstof (zie Tabel met materialen) in een eindconcentratie van 500 nM toe aan de gestimuleerde bloedplaatjessuspensies.
4. Incubeer de bloedplaatjes 30 minuten in het donker.
5. Fixeer de bloedplaatjes door een gelijk volume van 2% formaline toe te voegen.
6. Analyseer monsters door middel van flowcytometrie¹⁷.
7. Poortplaatjes op de juiste manier beschrijven zoals beschreven in stap 2.
8. Analyseer gebeurtenissen in de bloedplaatjespoort voor een daling van de fluorescentie in het PE-kanaal (voor de mitochondriën die de kleurstof labelen) van de flowcytometer.

5. Analyse van de activiteit van caspase 3 en caspase 8 door middel van flowcytometrie

1. Vul gewassen menselijke bloedplaatjes aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjesuspensie).
2. Houd één fractie van de bloedplaatjes niet gestimuleerd en stimuleer de overige fracties met trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml of 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml of 100 ng/ml) of hun combinatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Voeg na stimulatie ofwel 1:1000 (v/v) apoptosedetectiereagens (zie materiaaltabel) (voor zowel intrinsieke als extrinsieke apoptoseroutes) of 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (voor caspase 8 van de extrinsieke apoptoseroute) toe aan de gestimuleerde bloedplaatjesuspensies.
4. Incubeer de bloedplaatjes 30 minuten in het donker.
5. Fixeer de bloedplaatjes door een gelijk volume van 2% formaline toe te voegen.
6. Analyseer monsters door middel van flowcytometrie¹⁷.
7. Poortplaatjes op de juiste manier afschuiven, zoals beschreven in stap 2.
8. Analyseer gebeurtenissen in de bloedplaatjespoort op fluorescentie in het FITC-kanaal (voor caspase 3/7 of caspase 8) van de flowcytometer.

6. Analyse van protrombinebinding door flowcytometrie

1. Conjugaat runderprotrombine met Alexa Fluor 488 kleurstof met behulp van een eiwitetiketteringskit (zie Materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
2. Vul gewassen menselijke bloedplaatjes aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjessuspensie).
3. Houd één fractie van de bloedplaatjes niet gestimuleerd en stimuleer de overige fracties met trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml of 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml of 100 ng/ml) of hun combinatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg na stimulatie AF488-geconjugeerd runderprotrombine (100 μg/ml) en 1 μl PE-Annexine V en APC anti-humaan CD62P-antilichaam toe aan 100 μl gestimuleerde bloedplaatjesuspensies.
5. Fixeer de bloedplaatjes door een gelijk volume van 2% formaline toe te voegen.
6. Analyseer monsters door middel van flowcytometrie¹⁷ voor de kwantificering van protrombinebinding aan bloedplaatjes.
7. Teken een amorfe poort om bloedplaatjes te omvatten die gescheiden zijn van ruis en deeltjes met meerdere bloedplaatjes.
8. Verzamel alle fluorescentiegegevens met behulp van logaritmische amplificatie in vier kwadranten voor 10.000 gebeurtenissen in de bloedplaatjespoort van elk monster.
9. Teken gebieden voor bloedplaatjes met fluorescentie-positief of -negatief voor blootstelling aan PS (Annexin V-binding), P-selectine (CD62P)-expressie en AF488-protrombine (protrombinebinding).
10. Bepaal het aandeel van alle voorvallen van bloedplaatjes, evenals het aandeel bloedplaatjes dat positief is voor zowel PS-blootstelling (Annexin V-binding) als P-selectine (CD62P)-expressie (procoagulerende bloedplaatjes), die positief zijn voor protrombinebinding.

7. Analyse van protrombinebinding door confocale microscopie

1. Conjugaat runderprotrombine met Alexa Fluor 488 kleurstof met behulp van een eiwitetiketteringskit (zie Materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
2. Vul gewassen menselijke bloedplaatjes aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjessuspensie).
3. Houd één fractie van de bloedplaatjes niet gestimuleerd en stimuleer de overige fracties met trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml of 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml of 100 ng/ml) of hun combinatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg na stimulatie AF488-geconjugeerd runderprotrombine (100 μg/ml) en 1 μl PE-Annexine V en APC anti-humaan CD62P-antilichaam toe aan 100 μl gestimuleerde bloedplaatjesuspensies.
5. Fixeer de bloedplaatjes door een gelijk volume van 2% formaline toe te voegen.
6. Pellet de vaste plaatjes op met poly-D-lysine beklede dekglaasjes.
7. Monteer dekglaasjes op microscopieglaasjes met behulp van een anti-fade-oplossing.
8. U kunt de dekglaasjes ook gedurende 1 uur in een vochtige kamer insmeren met collageen (100 μg/ml).
9. Blokkeer de gecoate dekglaasjes met 0,5% BSA in PBS gedurende 1 uur.
10. Etiketteer de bloedplaatjes met AF488-geconjugeerd runderprotrombine (100 μg/ml) en 1 μl PE-Annexine V en APC anti-humaan CD62P-antilichaam.
11. Laat de gelabelde bloedplaatjes 20 minuten hechten op met collageen beklede dekglaasjes.
12. Was dekglaasjes met aanhangende bloedplaatjes drie keer met PBS.
13. Fixeer dekglaasjes met 2% paraformaldehyde gedurende 1 uur.
14. Monteer dekglaasjes op microscopieglaasjes met behulp van een anti-fade-oplossing.
15. Bekijk de objectglaasjes onder een confocale microscoop bij een objectiefvergroting van 63×.
16. Analyseer de afbeeldingen met behulp van Fiji-software voor fluorescentiekwantificering.

8. Test voor het genereren van trombine-afhankelijke trombinevorming op basis van bloedplaatjes

1. Vul gewassen menselijke bloedplaatjes aan met 2,5 mM calcium (0,5 μL voorraad CaCl₂ 0,5 M oplossing in 100 μL bloedplaatjesuspensie).
2. Houd één fractie van de bloedplaatjes niet gestimuleerd en stimuleer de overige fracties met trombine (0,1 E/ml, 0,25 E/ml of 0,5 E/ml), convulxine (20 ng/ml, 50 ng/ml of 100 ng/ml) of hun combinatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Voeg 100 μl behandelde bloedplaatjes toe aan een mengsel van 50 μl gepoold normaal plasma en 50 μl kaolienoplossing met een lage troebelheid (20 mg/ml), gepreïncubeerd bij 37 °C gedurende 5 min.
4. Voeg 5 mM CaCl₂ toe aan het mengsel.
5. Bewaak de stolselvorming door middel van troebelheid op een microplaatlezer, waarbij de absorptie elke 60 s gedurende 1 uur bij 660 nm wordt gemeten.

Resultaten

Een deel van de geactiveerde bloedplaatjes wordt "procoagulant" met een karakteristieke toename van de oppervlakte-expressie van zowel fosfatidylserine (PS) als P-selectine, waardoor ze zich onderscheiden van "apoptotische" bloedplaatjes die alleen positief zijn voor blootstelling aan PS, evenals "proaggregerende" bloedplaatjes die positief zijn voor P-selectine-expressie. We ontdekten dat trombine een dosisafhankelijke toename induceert van het aandeel procoagulante bloedplaatjes dat po...

Discussie

Procoagulerende bloedplaatjes vertonen duidelijke en aanhoudende verhogingen van intracellulair calcium bij stimulatie²⁶, maar kunnen via verschillende mechanismen worden verkregen. Ze worden gegenereerd bij sterke agoniststimulatie met collageen en trombine via verschillende mediatoren, waaronder de meest prominente mitochondriale calciuminstroom^18,19 langs de elektrochemische gradiënt over het binnenste ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acid Citrate Dextrose (ACD) solution (Voor 1000 mL)			Tri- Sodium Citrate-            22 g Citric Acid-                                    8 g Dextrose-                                     24.5 g Water-                                      Maak het volume aan tot 1000 mL
Alexa Fluor 488 protein labelling kit	Invitrogen	A10235
APC Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	550888
Bovine Prothrombin	Prolytix	BCP-1010
Buffer A (Plaatje voorbereiding)			M.W         Conc. in 1X         For 100 mL 10X solution HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g NaCl              58.44      134 mM                   7.83 g KCl                74.55       2.9 mM               216.19 mg MgCl2           203.30           1 mM              203.30 mg NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg NaHCO3        84 01           12 mM            1.01 g Water to 100 mL na het aanpassen van de pH tot 6.2 Verdun 10X oplossing 1:10 (v/v) met Milli Q water net voor de plaatjes voorbereiding om de 1X oplossing te verkrijgen die moet worden aangevuld met het volgende                      Conc. in 1X        For 1 ml 1X oplossing EGTA           1 mM       Voeg 10 μL (1:100 v/v) 100 mM EGTA toe  Glucose         5 mM      Voeg 5 μL (1:200 v/v) 1 M glucose toe PGE1            3 μM      Voeg 3 μL (1:333 v/v) 1 mM PGE1 oplossing toe
Buffer B (Plaatje voorbereiding)			M.W         Conc. in 1X         For 100 mL 10X solution HEPES