Optimalisatie van isolatie en zuivering van muriene glomerulaire mesangiale cellen

Summary

Deze studie ontwikkelde een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van muizen mesangiale cellen (MC's) en hun ex vivo celcultuur. Deze cellen kunnen meerdere keren worden gepasseerd, ingevroren, nieuw leven ingeblazen en gekweekt zonder de celgroei of eiwitexpressie in gevaar te brengen.

Abstract

Mesangiale cellen (MC's) zijn stromale cellen die zich in de middelste ruimte van de glomerulus bevinden, met cruciale functies in glomerulaire homeostase. Methoden voor het isoleren, zuiveren en kweken van glomerulaire MC's zijn sinds de jaren 1980 ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gebruik in biomedisch onderzoek, met name op het gebied van nefrologie. Muizen zijn de meest gebruikte proefdiermodellen in onderzoek naar nierziekten. In deze studie hebben we een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld voor de isolatie van muizen MC's en ex vivo celcultuur. Deze cellen kunnen meerdere keren worden gepasseerd, ingevroren, nieuw leven ingeblazen en gekweekt zonder de celgroei of eiwitexpressie in gevaar te brengen. Deze geoptimaliseerde aanpak verkort de studieduur voor onderzoekers aanzienlijk en maakt celbehoud op lange termijn mogelijk. De benodigde apparatuur voor de procedures is gemakkelijk toegankelijk in een eenvoudig biomedisch laboratorium en de procedurele stappen zijn eenvoudig. Het verwerven van doelcellen vereist slechts 2-3 weken, een vermindering van ten minste 1 week in vergelijking met bestaande methoden.

Introduction

De glomerulus is een netwerk van haarvaten dat de essentiële taak vervult om bloed te filteren om urine te vormen¹. Mesangiale cellen (MC's) zijn ingebed in de mesangiale matrix, gelegen tussen de glomerulaire haarvaten, en zijn uniek gepositioneerd om de glomerulaire dynamiek te beïnvloeden door hun diverse functies². MC's spelen een cruciale rol in de glomerulus, waaronder glomerulaire ontwikkeling, structurele ondersteuning voor glomerulaire capillairen, fagocytose en de productie van de glomerulaire basaalmembraanmatrix³. De studie van mesangiale cellen is cruciaal voor het bevorderen van ons begrip van nierfysiologie en pathologie.

De betrokkenheid van mesangiale cellen bij pathologische aandoeningen is ook opmerkelijk. Als reactie op glomerulair letsel of ziekte, zoals diabetische nefropathie of glomerulonefritis, kunnen mesangiale cellen zich vermenigvuldigen en overtollige extracellulaire matrixcomponenten afscheiden, wat leidt tot glomerulosclerose en verminderde nierfunctie ^4,5. Het begrijpen van de functies en regulatiemechanismen van mesangiale cellen is daarom essentieel voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën voor nierziekten.

Muizen mesangiale cellen stellen onderzoekers in staat om de moleculaire en cellulaire processen die betrokken zijn bij aandoeningen zoals IgA-nefropathie⁶, diabetische nefropathie⁷ en focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) te modelleren en te ^{onderzoeken8,9}. Gezien hun rol bij nierfibrose en -ontsteking, worden glomerulaire MC's van muizen vaak gebruikt in klinische onderzoeken om de werkzaamheid van therapeutische verbindingen te beoordelen ^9,10. Bovendien zijn mesangiale cellen van muizen een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van de effecten van verschillende signaalroutes op de nierfunctie, waaronder de RhoA/ROCK-route¹¹ en de Transforming Growth Factor-beta (TGF-β) route¹². Deze studies helpen te verduidelijken hoe deze signaalmoleculen bijdragen aan de progressie van nierziekte. Of ze nu worden gebruikt voor ziektemodellering, therapeutische ontwikkeling of onderzoek naar signaaltransductie, muizen MC's blijven dienen als een cruciale bron voor het vergroten van ons begrip van niergezondheid en -ziekte.

Mackay et al. ontwikkelden in 1988 een methode om ex vivo cellijnen van glomerulaire epitheel-, mesangiale en endotheelcellen van transgene muizen te verkrijgen¹³. Wilson en Stewart ontwikkelden een methode voor het isoleren en zuiveren van primaire MC's uit nierweefsel van patiënten, waarbij drie rondes van zeven en uitgebreid wassen met media¹⁴ betrokken zijn. Menè en Stoppacciaro stelden ook een methode voor om primaire MC's te isoleren uit nierweefsel van patiënten of ratten. Deze techniek omvat twee zeefrondes, twee naalddrukken en collagenasevertering. Cellen verkregen uit 4-8 rattennieren worden geplateerd op een plaat met zes putjes, hoewel de opbrengst relatief laag is¹⁵. Deze methoden vereisen de dissectie van de nieren in kleine stukjes voordat ze worden verwerkt. Bovendien duurt het ongeveer 3-4 weken voordat deze benaderingen gezuiverde MC's opleveren.

Muizen zijn de meest gebruikte proefdiermodellen in het onderzoek naar nierziekten. Een systematische methode voor het isoleren van muizen MC's ontbreekt echter nog. In deze studie hebben we een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld voor de isolatie van muizen MC's en ex vivo celcultuur. Deze methode kan worden gebruikt bij het gebruik van primaire muizen nier-MC's voor experimenteel onderzoek. In vergelijking met eerdere methoden elimineert deze aanpak de noodzaak van weefselsnijden en zeven voorafgaand aan de spijsvertering. In plaats daarvan wordt de hele nier van de muis vermalen met behulp van een celmolen en direct verteerd met collagenase. De digestieoplossing wordt vervolgens twee keer gezeefd, waarbij alle cellen op de tweede zeef worden verzameld en opnieuw worden gesuspendeerd. Met deze methode kunnen twee muizennieren voldoende cellen produceren om binnen 10 dagen twee tot drie kweekschaaltjes van 100 mm te zaaien. Gezuiverde MC's worden vervolgens verkregen door middel van kweek en zuivering met behulp van een gespecialiseerd medium dat D-valine bevat. Deze cellen kunnen meerdere keren worden gepasseerd, ingevroren, nieuw leven ingeblazen en gekweekt zonder de celgroei of eiwitexpressie in gevaar te brengen. De apparatuur die voor deze procedures nodig is, is gemakkelijk beschikbaar voor eenvoudige biomedische laboratoria en het hele proces duurt slechts 2-3 weken om de doelcellen te verkrijgen. Deze methode is geschikt voor studies waarbij muizen MC's betrokken zijn om niergerelateerde ziekten of mechanismen te onderzoeken, omdat het efficiënt en tijdbesparend is.

Protocol

Dierproeven voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen en alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale wetgeving en de richtlijn van de Europese Commissie (2010/63/EU). Muizen werden gehuisvest en onderhouden in pathogeenvrije omstandigheden, in overeenstemming met de vereisten van de Animal Care and Use Committees van het West China Hospital, Sichuan University. Alle experimentele dierstudies werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committees van het West China Hospital, Sichuan University. Acht weken oude C57BL/6JGpt mannelijke muizen werden gebruikt voor mesangiale celisolatie in deze test. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. Figuur 1 illustreert de procedures voor het isoleren en zuiveren van muriene glomerulaire mesangiale cellen.

1. Preparaat van reagentia voor de isolatie van muizen MC's

NOTITIE: Zorg ervoor dat alle reagentia en apparatuur steriel zijn.

1. Type I collagenase (750 E/ml): Weeg poeder en los kort voor gebruik op in RPMI 1640.
2. Mesangiale celkweekmedia 1: Meng RPMI 1640 met 2 mM glutamine, 17% FBS, antibiotica (100 eenheden/ml penicilline plus 10.000 μg/ml streptomycine) en 0,1 E/ml insuline.
3. Mesangiale celkweekmedia 2: Combineer RPMI 1640 (D-valine) met 2 mM glutamine, 10% FBS, antibiotica (100 eenheden/ml penicilline plus 10.000 μg/ml streptomycine), ITS-G (insuline, transferrine, seleniumoplossing 100x) en 0,1 E/ml insuline. Bewaar mesangiale celkweekmedia bij 4 °C en gebruik binnen 1 maand na bereiding.
4. Cryopreservatiemedia voor cellen: Bereid een mengsel van RPMI 1640-medium, serum en DMSO in een verhouding van 7:2:1.

2. Isolatie van muizen MC's

1. Muizen op humane wijze offeren via CO₂ -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Dompel de karkassen onder in een bekerglas met 75% alcohol voor sterilisatie en breng het dier vervolgens over op een aseptisch werkoppervlak.
2. Verwijder aseptisch de nieren van de muis met een schaar en pincet, plaats ze in een petrischaaltje, spoel ze af met EBSS (Earle's Balanced Salt Solution) en verwijder vervolgens voorzichtig het bindweefsel en de niercapsule met een pincet.
3. Halveer de nier verticaal, voeg 3-4 ml collagenase I-oplossing toe en maal met een plastic celstamper.
4. Pipetteer alle tissues en oplossing uit de petrischaal in een centrifugebuis van 15 ml. Spoel de petrischaal af met 1-2 ml collagenase I-oplossing om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt overgedragen. Plaats de oplossing in de shaker bij 37 °C en schud gedurende 30 minuten bij 120 tpm. Voeg vervolgens een gelijk volume stopoplossing toe (kweekmedia 1).
5. Pipetteer de oplossing uit de centrifugebuis van 15 ml, leid deze door een celzeef van 100 μm en vang het filtraat op in een centrifugebuis van 50 ml.
6. Laat de vloeistof vanaf stap 2.5 door een celzeef van 40 μm lopen en houd alleen de cellen op de celzeef van 40 μm vast. Spoel de zeef herhaaldelijk met kweekmedia 1 om ervoor te zorgen dat er zoveel mogelijk cellen op de zeef worden verzameld. Breng de verzamelde cellen van de zeef over in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml.
7. Centrifugeer de suspensie bij 600 x g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur) en suspendeer de cellen vervolgens opnieuw in een celkweekschaaltje volgens de celdichtheid. In het algemeen worden de cellen van twee nieren geresuspendeerd in twee of drie kweekschaaltjes van 100 mm (10 ml kweekmedia 1/100 mm schaaltje). Plaats de gerechten in een celbroedmachine van 37 °C met 95% lucht/5% CO₂.
8. Onderzoek de volgende dag de celmorfologie en hechting onder een microscoop (40×). Als er dode cellen in de kweekmedia aanwezig zijn, gebruik dan een pipet om de media van de bodem van de kweekschaal te verwijderen en zorg ervoor dat u de aangehechte cellen niet verstoort.
9. Voeg 1-2 ml PBS toe langs de binnenrand van de kweekschaal om de cellen te spoelen. Gebruik een pipet om alle PBS van de bodem van de kweekschaal te verwijderen en voeg ten slotte 10 ml cultuurmedia 1 toe langs de binnenrand van de kweekschaal.

3. Zuivering van muizen MC's

1. Verwijder een dag na de scheiding de niet-aanhangende cellen door de kweekmedia voorzichtig te wassen en te vervangen door verse kweekmedia 1 zoals beschreven in stap 2.8. Observeer de glomeruluscellen onder een fasecontrastmicroscoop (40×).
   OPMERKING: De heldere bolvormige vormen vertegenwoordigen de glomerulus, terwijl de omringende cellen geplaveide kenmerken vertonen, kenmerkend voor epitheelcellen (Figuur 2A).
2. Observeer de celmorfologie na 1-3 dagen (Figuur 2B-C). Stellaatvormige en spoelvormige cellen verschijnen rond de geplaveide cellen, zoals te zien is in figuur 2D.
3. Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken (meestal binnen 7-10 dagen), was de cellen dan twee keer met steriel PBS en trypsiniseer de cellen vervolgens met 0,25% trypsineoplossing (2 ml 0,25% trypsineoplossing per schaaltje van 100 mm).
4. Het eerste celtrypsinisatieproces kan ongeveer 20 minuten duren. Plaats na toevoeging van trypsine de schaal in een incubator van 37 °C. Observeer het proces in real-time onder een fasecontrastmicroscoop (40×) om de trypsinisatie van cellen te evalueren.
5. Beëindig het trypsinisatieproces door een gelijk volume media 2 toe te voegen wanneer de meeste cellen een afgeronde morfologie vertonen en loskomen van het oppervlak van de schotel.
6. Centrifugeer de cellen bij 600 × g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur) en suspendeer ze vervolgens opnieuw in media 2. In het algemeen worden de cellen van een schaaltje van 100 mm geresuspendeerd in twee kweekschaaltjes van 100 mm (10 ml kweekmedia 2/100 mm schaaltje).
7. Verander de cultuurmedia 2 de volgende dag. Observeer talrijke zwevende cellen en celfragmenten onder de microscoop (40×), aangezien alleen MC's kunnen overleven en zich kunnen vermenigvuldigen in de media van D-valine¹⁶. Vervang de media elke 1-2 dagen om dode cellen te verwijderen. De aanhangende cellen in de cultuur zijn MC's (Figuur 3A-D). Bepaal de groeisnelheid van geïsoleerde MC's (Figuur 3E).
8. Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken, trypsiniseren en passeren ze. MC's hebben doorgaans ongeveer 5-10 minuten nodig voor trypsinisatie.

4. Langdurige bewaring van muizen MC's

OPMERKING: Aangezien primaire cellen na verloop van tijd en meerdere passages kunnen differentiëren en muteren, moeten MC's na celzuivering worden ingevroren en opgeslagen voor langdurige bewaring.

1. Verwijder het bovenstaande middel voorzichtig langs de onderkant van het schaaltje met behulp van een pipet, was de cellen twee keer met steriel PBS en trypsiniseer vervolgens met 0,25% trypsineoplossing (2 ml 0,25% trypsineoplossing per schaaltje van 100 mm). Volg de stappen voor trypsinisatie zoals beschreven in de stappen 3.3-3.8.
2. Voeg na trypsinisatie een gelijk volume media 2 toe om het proces te beëindigen en breng de volledige vloeistof over in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de cellen bij 600 × g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur), gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml PBS om de cellen te tellen.
3. Gebruik een automatische cellenteller om de cellen te tellen. Neem 20 μl van de 1 ml geresuspendeerde celoplossing en voeg dit toe aan een speciale celtelplaat om het totale aantal cellen te bepalen. Resuspendeer ze op basis van het aantal cellen in cryopreservatiemedia (1 ml cryopreservatiemedia voor cellen per 10⁶ cellen).
4. Breng de celoplossing over in cryopreservatiebuisjes (1 ml cel cryopreservatiemedia per 2 ml cryopreservatiebuis) en vries langzaam in tot -80 °C alvorens over te brengen op vloeibare stikstof voor conservering.
   OPMERKING: Resuspendeer en zaai de cellen in celkweekschaaltjes voor amplificatie indien nodig. Cellen moeten worden gebruikt tussen passages 3 en 8 nadat ze volledig zijn gekarakteriseerd¹⁷.

5. Identificatie van muizen MC's

OPMERKING: Nadat de cellen twee keer zijn gepasseerd, identificeert u de muizen MC's met behulp van de volgende technieken.

1. Westerse vlek van muizen MC's
   OPMERKING: De reagentia die nodig zijn voor de procedure worden vermeld in aanvullende tabel 1.
   1. Probeer de cellen volgens dezelfde stappen als in 3.3-3.8 en stap 4.1.
   2. Na het verzamelen van de cellen, lyseer je de cellen om eiwitten te extraheren en meet je de eiwitconcentratie.
   3. Neem een geschikte hoeveelheid monster (meestal 20 ng), voeg een laadbuffer toe en denatureer gedurende 5 minuten bij 100 °C.
   4. Los het eiwit (20 ng) op met een 10% SDS-PAGE-gel of een 7,5% SDS-PAGE-gel en breng het vervolgens met een constante spanning over op een cellulosemembraan.
   5. Blokkeer het membraan met 5% vetvrije melk en incubeer vervolgens een nacht met het primaire antilichaam bij 4 °C op een shaker.
   6. Incubeer met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur na het wassen met TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) driemaal.
   7. Detecteer signalen met het beeldvormingssysteem.
      OPMERKING: De primaire antilichamen die in dit onderzoek werden gebruikt, waren onder meer anti-αSMA bij muizen (1:500), anti-vimentine bij konijnen (1:2000), antifibronectine bij konijnen (1:2000) en anti-GAPDH bij muizen (1:50000). De secundaire antilichamen die in deze studie werden gebruikt, waren onder meer peroxidase-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L) (1:5000) en peroxidase-geconjugeerde geit anti-muis IgG (H + L) (1:5000).
2. Immunofluorescentiekleuring van muizen MC's
   OPMERKING: De reagentia die nodig zijn voor de procedure worden vermeld in aanvullende tabel 2.
   1. Probeer de cellen volgens dezelfde stappen als in de stappen 3.3-3.8 en 4.1.
   2. Resuspendeer de cellen en tel ze. Neem 1 x 10⁵ cellen en voeg deze toe aan de 15 mm glazen bodem celkweekschaaltje (1 ml kweekmedia 2 per 15 mm glasbodem).
   3. Fixeer de MC's met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten (1 ml 4% paraformaldehyde per 15 mm glasbodem) en was vervolgens drie keer met PBS.
   4. Behandel de MC's met 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten om de celmembranen te permeeren.
   5. Blokkeer na nog drie wasbeurten met PBS de cellen bij kamertemperatuur met 3% BSA PBS-oplossing gedurende 30 minuten.
   6. Was de cellen en incubeer ze 's nachts bij 4 °C met primaire anti-muis αSMA en anti-konijn Vimentin-antilichamen.
   7. Incubeer gedurende 1 uur met secundair ezel anti-muis IgG geconjugeerd aan rood Alexa 594 en ezel anti-konijn IgG geconjugeerd aan groen FITC bij kamertemperatuur.
   8. Gebruik DAPI voor nucleaire tegenkleuring gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
   9. Voeg fluoromount media toe en dek af met een glasplaatje. Analyseer de cellen met behulp van een confocale microscoop.
      OPMERKING: De primaire antilichamen die in dit onderzoek werden gebruikt, waren onder meer anti-αSMA bij muizen (1:200) en anti-vimentine bij konijnen (1:200). De secundaire antilichamen die in deze studie werden gebruikt, waren onder meer ezel-anti-muis IgG geconjugeerd aan rode Alexa 594 (1:400), ezel anti-konijn IgG geconjugeerd aan groene FITC (1:400) en DAPI (1:1000).
3. Flowcytometrie van muizen MC's
   1. Probeer de cellen volgens dezelfde stappen als in de stappen 3.3-3.8 en 4.1.
   2. Resuspendeer de cellen en tel ze. Neem 5 x 10⁵ cellen en was ze een keer met 3 ml PBS.
   3. Resuspendeer de cellen met 100 μL PBS in een flowbuis en voeg vervolgens 1-2 μL anti-muis PDGFRB (CD140b) antilichaam toe.
   4. Incubeer de cellen 30 minuten in het donker op ijs en analyseer ze vervolgens met behulp van flowcytometrie.

Results

Deze studie ontwikkelde een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van muizen MC's en ex vivo celcultuur. Voor zover wij weten, bestaat er geen standaardmethode voor het ex vivo valideren van primaire MC's. Volgens eerdere publicaties worden MC's gekenmerkt door de expressie van αSMA, Vimentin en Fibronectin ^3,14,15. Western blot-analyse werd gebruikt om de expressieniveaus ...

Discussion

Niergerelateerde ziekten komen veel voor en muizen worden veel gebruikt als het primaire diermodel voor het bestuderen van deze aandoeningen vanwege hun genetische gelijkenis met mensen en de beschikbaarheid van gevestigde ziektemodellen. Mesangiale cellen spelen een cruciale rol bij het behoud van de normale structuur en functie van de glomerulus door structurele ondersteuning te bieden, glomerulaire filtratie te reguleren en deel te nemen aan immuunresponsen. Hoewel er verschillende ex...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µm Cell Strainer	Biosharp	BS-100-CS
100 mm Petri Dish	Sorfa	230301
15 mL Centrifuge Tube	Sorfa	411000
15 mm glass bottom cell culture dish	Sorfa	201200
180 kDa Plus Prestained Protein Marker	Vazyme	MP201-01
2 mM L-glutamine	BasalMedia	S210JV
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
40 µm Cell Strainer	Biosharp	BS-40-XBS
50 mL Centrifuge Tube	Sorfa	41000
60 mm Petri Dish	Sorfa	230201
75% Alcohol	Knowles	64-17-5
96 Well Cell Culture Plates, TC-treated	Servicebio	CCP-96H
Antibiotics (10 μg/mL ceftriaxone plus 100 μg/mL gentamicin)	NCM	C100C5
BCA (Bicinchoninic acid) Protein Assay kit	CWBIO	CW0014S
Cell Counting Kit-8	Oriscience	CB101
Confocal Microscope	FV-3000	Olympus
DMSO	Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle's Balanced Salt Solution (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Fetal Bovine Serum (FBS)	Excell	FSP500
Fluorescence Cell Analyzer	Mira FL	Countstar
Fluoromount media	Southern Biotech	0100-01
Insulin, Transferrin, Selenium Solution 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX83
Lysis Buffer	Adilab	PP1101
One-Step PAGE Preparation Kit (10%)	Oriscience	PB102
One-Step PAGE Preparation Kit (7.5%)	Oriscience	PB101
PE anti-mouse CD140b Antibody	Biolegend	323605
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4202
Plastic Cell Pestle	Biofil	CC-4090
Proteinase Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001
PVDF Membrane	Vazyme	E802-01
Recombinant Human Insulin	Solarbio	11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Corning	10-040-CV
SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5x)	Servicebio	G2013
Specially customized Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-valine instead of L-valine)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Biosharp	BS084
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Type I collagenase	Solarbio	CB140