Methodenartikel

Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie

DOI:

10.3791/68167

⸱

3 juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dynamische balans van mitochondriale fusie en splijting draagt direct bij aan de mitochondriale homeostase, die naast de homeostase van adenosinetrifosfaat (ATP) tal van cellulaire functies beïnvloedt. Daarom is het beoordelen van de mitochondriale morfologie onder stressomstandigheden essentieel voor mechanistisch onderzoek. Deze studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor het analyseren van mitochondriale morfologie, dat de bereiding van een MitoTracker-oplossing, kleuring van mitochondriën, optimalisatie van beeldvormingsparameters en detectie van morfologische kenmerken omvat. MitoTrackers zijn veelgebruikte, kosteneffectieve mitochondrion-specifieke kleurstoffen. Sommige veranderingen in de mitochondriale morfologie kunnen echter optreden als gevolg van onjuiste behandeling, die niet waarneembaar kan zijn en niet de ware toestand van mitochondriën weerspiegelt. Daarom is het noodzakelijk om te begrijpen hoe veranderingen in de mitochondriale morfologie kunnen worden geanalyseerd met behulp van MitoTrackers. Het protocol maakte gebruik van SH-SY5Y-cellen gestimuleerd met 1-methyl-4-fenylpyridiniumjodide (MPP+) om het protocol van mitochondriale morfologische analyse te illustreren. Vergeleken met controlecellen vertoonden MPP+-gestimuleerde cellen kleinere en meer gefragmenteerde mitochondriën, met morfologische parameters die een verminderde mitochondriale voetafdruk aangaven. Deze resultaten suggereren dat MitoTracker-kleuring een effectieve en haalbare methode is voor mitochondriale morfologische analyse die (met kleine aanpassingen) kan worden toegepast om verschillende aandoeningen te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale morfologie wordt in stand gehouden door de dynamische balans van mitochondriale fusie en splijting, en beïnvloedt daarom de energiehomeostase en tal van andere cellulaire functies, wat leidt tot verschillende pathologieën zoals neurodegeneratieve ziekten, kanker en ontsteking 1,2,3,4,5 . Om de mitochondriale morfologie te observeren, zijn verschillende mitochondrionselectieve kleuringen, waaronder zowel sondes als antilichamen, ontwikkeld voor gebruik met een confocale microscoop. Sommige mitochondrion-specifieke sondes, zoals tetramethylrosamine en rhodamine 123, functioneren op basis van de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP), wat hun toepasbaarheid beperkt in studies naar MMP-verstorende aandoeningen 6,7. Omgekeerd biedt antilichaamkleuring MMP-onafhankelijke morfologische beoordeling voor het onderzoeken van mitochondriale morfologie in gefixeerde cellen. Hoewel een geschikte kleuring het mogelijk maakt om de mitochondriale morfologie in gefixeerde cellen te beoordelen, blijft het een uitdaging om de mitochondriale morfologie te onderzoeken in levende cellen die zijn aangetast door sommige inductoren. MitoTracker, een celdoorlatende kationische en mitochondrionspecifieke fluorescerende sonde, biedt een oplossing voor deze uitdaging, waardoor kleuring van zowel levende als gefixeerde cellen mogelijk is. Deze sonde is op grote schaal gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken in onderzoeken naar verschillende ziekten 8,9,10,11. Desalniettemin hebben sommige onderzoeken problemen gemeld zoals een hoog achtergrondsignaal en niet-specifieke binding, zelfs wanneer de sonde wordt gebruikt in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de fabrikant. Deze waarnemingen benadrukken het belang van een grondig begrip van monstervoorbereiding en beeldacquisitie voor de succesvolle analyse van mitochondriale morfologie.

Om de analyse van de mitochondriale morfologie te vergemakkelijken, zijn verschillende beeldverwerkingsprogramma's en algoritmen ontwikkeld 12,13,14,15,16. In deze studie hebben we de macro-tool Mitochondrial Network Analysis (MiNA) in ImageJ gebruikt om de mitochondriale morfologie te analyseren13. Deze tool identificeert en karakteriseert effectief morfologische kenmerken van mitochondriale netwerken door negen beschrijvende parameters te berekenen, waaronder het aantal individuen (structuren zonder vertakkingen), aantal netwerken (aantal objecten met ten minste één junctiepixel), gemiddelde lengte (gemiddelde lengte van alle staven en takken), mediane lengte (mediane lengte van alle staven en takken), lengte standaarddeviatie (standaarddeviatie van individuele lengtes), gemiddelde netwerkgrootte (het gemiddelde aantal vertakkingen per netwerk), mediane netwerkgrootte (de middelste waarde van het aantal vertakkingen per netwerk), standaarddeviatie van de netwerkgrootte (standaarddeviatie van het aantal vertakkingen per netwerk) en de mitochondriale voetafdruk (totaal signaalgebied na achtergrondscheiding). In dit protocol werd de mitochondriale voetafdruk geselecteerd als representatieve parameter.

Het doel van deze studie is om een stapsgewijs protocol te bieden voor mitochondriale morfologische analyse, met de nadruk op belangrijke details. We gebruikten MPP+-geïnduceerde SH-SY5Y-cellen om dit protocol te demonstreren. MPP+ remt complex I van de mitochondriale ademhalingsketen in dopaminerge neuronen, wat resulteert in schade aan de mitochondriale morfologie en functie 8,17. Het morfologische analyseprotocol dat in deze studie wordt beschreven, maakt het mogelijk om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen en relevante parameters te beoordelen om morfologische kenmerken van mitochondriale netwerken te definiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding

  1. Los MPP+ op met dimethylsulfoxide (DMSO) tot een stockoplossing van 1 mM en bewaar deze in het donker bij -30 °C (zie materiaaltabel).
  2. Los 50 μg MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) op in 94 μL DMSO om een voorraadoplossing van 1 mM te maken. Verdeel de stockoplossing in verschillende microcentrifugebuisjes en bewaar deze beschermd tegen licht bij -30 °C tot verder gebruik.
  3. Incubeer SH-SY5Y-cellen in kolven met Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS) in een bevochtigde omgeving met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 °C. Voor het passeren worden de cellen losgemaakt met 0,05% trypsineoplossing gedurende 1 minuut en centrifugeren bij 100 × g gedurende 3 minuten.

2. MPP+ stimulatie

  1. Zaai SH-SY5Y-cellen op confocale schalen met een glazen bodem en bewaar ze een nacht in DMEM/F12-medium aangevuld met 1% (v/v) FBS.
  2. Vervang het kweekmedium en incubeer de cellen vervolgens gedurende 24 uur met of zonder MPP+ .

3. MitoTracker-kleuring

  1. Verwarm DMEM/F12 voor en verdun vervolgens de MitoTracker-papieroplossing met DMEM/F12 om een werkoplossing van 50 nM te verkrijgen. Houd de oplossing gedurende de hele procedure beschermd tegen licht.
  2. Verwijder het celkweekmedium en was de confocale vaatjes 2x met verse DMEM/F12.
  3. Incubeer de cellen in elk schaaltje met 1 ml van de MitoTracker-werkoplossing gedurende 15 minuten bij 37 °C in het donker.
  4. Verwijder de MitoTracker werkoplossing en was 2x met DMEM/F12.
  5. Voeg 1 ml DMEM/F12 toe aan elk schaaltje en incubeer in de celincubator voordat u beeldvorming maakt.

4. Beeldvormingsparameters voor confocale microscoop

  1. Breng de microscoop in evenwicht voor volgende bewerkingen. Pas onder het acquisitiepaneel de parameters van het lichtpad aan door de excitatie- en emissiegolflengten in te stellen.
  2. Stel de parameters als volgt in: pinhole-grootte, 1,2 AE; pixelscangrootte, 1.024 x 1.024; pixelverblijftijd, 2,4 μs (gemiddeld 2x)  (houd deze consistent voor kalibratiedoeleinden).

5. Optimalisatie van de beeldvormingsparameters

LET OP: Vermijd blootstelling van de ogen aan zowel directe als verstrooide straling van een zichtbare en/of onzichtbare laser.

  1. Gebruik het halogeenlicht om scherp te stellen op de cellen met behulp van een plan apochromatische 60x objectieflens (1,4 NA) om fototoxiciteit te voorkomen.
  2. Stel het laservermogen en de hoge spanning (HV) in tot net onder het verzadigingsniveau, stel de zoomfactor in op 3 en leg vervolgens de beelden vast.
  3. Verplaats het interessegebied en focus op de cellen om afbeeldingen vast te leggen zonder instellingen te wijzigen.

6. Gegevensanalyse

OPMERKING: Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van ImageJ die vooraf is geïnstalleerd met de MiNA-plug-in13. Om nauwkeurige relevante metingen te verkrijgen, moeten afbeeldingen onafhankelijk opgeloste mitochondriën vastleggen met schone en heldere kleuring.

  1. Om de beeldkwaliteit te verbeteren voorafgaand aan binaire transformatie en skeletvorming, opent u de afbeelding en voert u een voorlopige verwerking uit. Gebruik de ROI-tool om het gebied van een enkele cel te selecteren. Pas het proces toe | Filteren | Onscherp masker om de scherpte te verbeteren en gebruik de functie Proces | Verbeter de contrastfunctie om overversterking van ruis te verminderen. Om specifiek zout- en peperruis te verwijderen, gebruikt u de Process | Filteren | Mediaanfunctie (zie aanvullende figuur S1).
  2. Om een vereenvoudigd morfologisch model te construeren om beschrijvende parameters te berekenen, converteert u de afbeelding naar binair via drempels (klik op Proces | Binair | Maak binair) en skelettiseer vervolgens de binaire afbeelding met behulp van de functie Skeletteren (klik op Proces | Binair | Skeletten) (zie aanvullende figuur S2).
  3. Groepeer alle pixels in het skelet met behulp van de knop Analyseren | Skelet | Analyseer de functie Skelet (2D/3D). Vereenvoudig de analyse door de MiNA-tool te gebruiken om negen beschrijvende parameters in de geskeletteerde afbeelding te berekenen (zie aanvullende afbeelding S3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een gedetailleerde, stapsgewijze procedure voor mitochondriale morfologische analyse door middel van drie onderling afhankelijke optimalisatiemodules: standaardisatie van protocollen voor de voorbereiding van monsters, systematische optimalisatie van optische parameters voor confocale microscopiebeeldvorming en richtlijnen voor computationele beeldverwerking. Een optimaal protocol voor de monstervoorbereiding is van cruciaal belang voor het verkrijgen van betrouwbare...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie stelt een systematische methodologie vast voor het analyseren van mitochondriale morfologie in levende cellen onder stressomstandigheden. Cruciale procedurele stappen bij mitochondriale beeldvorming zijn: een geschikte concentratie van MitoTracker-sondes, het grondig wassen van confocale vaat voorafgaand aan beeldacquisitie, het minimaliseren van verstoringen van de cellulaire toestand en het instellen van geschikte beeldvormingsparameters.

H...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81974501).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-methyl-4-fenylpyridiniumjodide (MPP+)MacklinM875357Gebruikt om oxidatieve stress te induceren
Confocale schaalNEST801001Gebruikt voor het kweken van cellen
Confocale microscoopNikonC2Gebruikt om beelden vast te leggen
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12ThermoFisher Scientific11320033Gebruikt om cellen te voeden
Dimethylsulfoxide (DMSO)BeyotimeST038Gebruikt om de mitotracker-sonde op te lossen
Foetaal runder serum (FBS)ThermoFisher ScientificA3161001CGebruikt om cellen te voeden
ImageJNational Institutes of HealthImageJGebruikt om mitochondriale morfologie te analyseren
MitoTracker Red CMXRosThermoFisher ScientificM7512Gebruikt om mitochondriën te visualiseren
Fosfaatbufferoplossing (PBS)ThermoFisher ScientificC10010500BTGebruikt om de cellen op confocale schalen te wassen
SH-SY5Y-celATCCCRL-2266Gebruikt om de workflow van het analyseren van mitochondriale morfologie te demonstreren
TI-SH-U Stage AdapterNikonMEC59110Gebruikt om monsters te bevestigen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  3. Kalia, R., et al. Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1. Nature. 558 (7710), 401-405 (2018).
  4. Cao, Y. L., et al. MFN1 structures reveal nucleotide-triggered dimerization critical for mitochondrial fusion. Nature. 542 (7641), 372-376 (2017).
  5. Chan, D. C. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev Pathol. 15, 235-259 (2020).
  6. Solaini, G., Sgarbi, G., Lenaz, G., Baracca, A. Evaluating mitochondrial membrane potential in cells. Biosci Rep. 27 (1-3), 11-21 (2007).
  7. Gan, Z., Audi, S. H., Bongard, R. D., Gauthier, K. M., Merker, M. P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 300 (5), L762-L772 (2011).
  8. Zhong, J., et al. Roflupram exerts neuroprotection via activation of CREB/PGC-1α signalling in experimental models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol. 177 (10), 2333-2350 (2020).
  9. Xu, B. T., et al. Mitofusin-2 mediates cannabidiol-induced neuroprotection against cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacol Sin. 44 (3), 499-512 (2023).
  10. Hu, T., et al. PRDM16 exerts critical role in myocardial metabolism and energetics in type 2 diabetes induced cardiomyopathy. Metabolism. 146, 155658(2023).
  11. Reichardt, C., et al. DNA-binding protein-A promotes kidney ischemia/reperfusion injury and participates in mitochondrial function. Kidney Int. 106 (2), 241-257 (2024).
  12. Ahmad, T., et al. Computational classification of mitochondrial shapes reflects stress and redox state. Cell Death Dis. 4 (1), e461(2013).
  13. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple imagej macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  14. Hemel, I., Engelen, B., Luber, N., Gerards, M. A hitchhiker's guide to mitochondrial quantification. Mitochondrion. 59, 216-224 (2021).
  15. Vowinckel, J., Hartl, J., Butler, R., Ralser, M. Mitoloc: A method for the simultaneous quantification of mitochondrial network morphology and membrane potential in single cells. Mitochondrion. 24, 77-86 (2015).
  16. Dagda, R. K., et al. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. J Biol Chem. 284 (20), 13843-13855 (2009).
  17. Przedborski, S., Tieu, K., Perier, C., Vila, M. MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's disease. J Bioenerg Biomembr. 36 (4), 375-379 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MitoTracker kleuringSH SY5Y cellenmitochondriale fusiemitochondriale fissiefluorescentie imagingskeletonisatie analyseMPP stimulatiebeeldsegmentatie

Gerelateerde artikelen