Methodenartikel

Mitochondriaal preparaat uit microglia voor glycaananalyse

DOI:

10.3791/68179

⸱

30 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd een protocol ontwikkeld voor de bereiding van gezuiverde mitochondriën uit microgliacellen, isolatie van mitochondriale eiwitten voor de afgifte van N-glycanen en snelle detectie van subcellulaire, mitochondriale glycanen met behulp van infraroodmatrix-geassisteerde laserdesorptie elektrospray-ionisatie gekoppeld aan nauwkeurige massaspectrometrie met hoge resolutie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van de glycosyleringspatronen van mitochondriale eiwitten in microglia is van cruciaal belang voor het bepalen van hun rol bij neurodegeneratieve ziekten. Hier presenteren we een nieuwe en high-throughput methodologie voor glykomische analyse van mitochondriale eiwitten geïsoleerd uit gekweekte microglia. Deze methode omvat de isolatie van mitochondriën uit microgliale culturen, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, gevolgd door een geoptimaliseerde eiwitextractie om de detectie van glycanen te maximaliseren, en infraroodmatrix-geassisteerde laserdesorptie elektrospray-ionisatie (IR-MALDESI) high-resolution accurate mass (HRAM) massaspectrometrie om gedetailleerde profielen van mitochondriale glycosylering te verkrijgen.

Dit protocol benadrukt het belang van het behoud van de mitochondriale integriteit tijdens isolatie en maakt gebruik van strenge kwaliteitscontroles om de reproduceerbaarheid te garanderen, inclusief het meten van de mitochondriale zuiverheid na extractie. Deze benadering maakt het mogelijk om in vitro een uitgebreide profilering te maken van glycosyleringsveranderingen in microgliale mitochondriën onder verschillende experimentele omstandigheden, wat inzicht biedt in mitochondriale veranderingen die verband houden met neurodegeneratieve ziekten. Deze aanpak kan worden aangepast aan andere in vitro behandelingen, andere gekweekte celtypen of primaire cellen. Door middel van deze gestandaardiseerde aanpak willen we het begrip van microgliale mitochondriale glycanen vergroten en bijdragen aan het bredere veld van neurodegeneratief onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn de dominante aangeboren immuuncellen in de hersenen en zijn goed voor 10-15% van de cellen in de volwassen hersenen 1,2. Ze gebruiken hun receptorrepertoire om de micro-omgeving van de hersenen dynamisch te monitoren en de normale hersenfunctie te reguleren om de homeostase van de hersenen te behouden3. Microglia zijn erg gevoelig voor de veranderingen in hun micro-omgeving en ondergaan veranderingen in celmorfologie, immunofenotype en functie met pathologische aandoeningen of verschillende stimulaties. Microgliale activeringstoestanden worden beïnvloed door de cellulaire energiebehoeften die nodig zijn voor hun functie, zoals fagocytose, cytokineproductie of weefselherstel. Daarom speelt het cellulaire energiemetabolisme een cruciale rol bij het reguleren van veranderingen in de microgliale functie4. Microgliale ontregeling leidt tot overmatige afgifte van pro-inflammatoire cytokines (bijv. IL-1β, TNF-α) en reactieve zuurstofspecies (ROS), waardoor de hersenen vatbaar worden voor neuro-inflammatie 5,6. Chronische microgliale ontregeling en de daaruit voortvloeiende neuro-inflammatoire omgeving leggen een basis voor neurodegeneratie7.

De hersenen zijn goed voor slechts 2% van het lichaamsgewicht, maar 20% van het totale energieverbruik van het lichaam. Mitochondriën zijn de primaire energiebron in hersencellen en fungeren als sleutelspelers in de pathogenese van zowel acute als chronische hersenaandoeningen8. Eerdere studies hebben een sterke correlatie vastgesteld tussen microgliale activering en metabole disfunctie bij veroudering9 en leeftijdsgerelateerde aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer10,11, wat de cruciale rol van mitochondriën bij cellulaire veroudering en neurodegeneratie benadrukt. Een verminderde mitochondriale functie leidt tot verminderde energieproductie, verhoogde oxidatieve stress en verhoogde neuro-inflammatie tijdens veroudering en ouderdomsziekten.

Hoewel uitgebreid onderzoek de rol van mitochondriën in het energiemetabolisme, veroudering en hersenaandoeningen heeft opgehelderd, blijft de rol van veel voorkomende posttranslationele modificaties, zoals glycosylering, in de mitochondriale biologie en functie onvoldoende onderzocht. Glycosylering, de enzymatische toevoeging van suikergroepen, glycanen genaamd, aan eiwitten door glycosyleringsenzymen, is de meest voorkomende posttranslationele modificatie in de meeste hersencellen, waaronder microglia. Geactiveerde microglia moduleren hun immuunfunctie onder ontstekingsstimuli door de intracellulaire of celoppervlak-glycaanexpressie te reguleren12. De pro- en ontstekingsremmende reacties die microglia na stimulatie vertonen, worden ook gereguleerd door de glycanen13. Mitochondriale eiwitten hebben ook deze glycaanmodificaties, die hun functie en lokalisatie reguleren. Een gedetailleerde analyse van de celspecifieke mitochondriale glycosyleringspatronen in de microglia ontbreekt echter vanwege de technische uitdagingen bij het onderzoeken van subcellulaire glycosylering. Ondanks de goed gekarakteriseerde rol van glycosylering bij het moduleren van het microgliale fenotype, blijft de rol van glycanen bij het moduleren van de mitochondriale functie en vervolgens het cellulaire immunofenotype in microglia slecht begrepen.

Beperkte studies naar mitochondriale eiwitglycosylering hebben zich voornamelijk gericht op lectine-gebaseerde identificatie van glycosyleringspatronen. Lectines zijn glycaanbindende eiwitten die biomoleculaire glycaangroepen binden14,15, die de specificiteit en het vermogen missen om gedetailleerde informatie over de glycaansamenstelling te verstrekken. Massaspectrometrische modaliteiten bieden een gedetailleerde identificatie van de glycaansamenstellingen om de analytische uitdagingen van lectineanalyse te overwinnen. Een van die modaliteiten, infrarood matrix-geassisteerde laserdesorptie elektrospray ionisatie (IR-MALDESI), maakt gebruik van een hybride ionisatiestrategie, waarbij een mid-IR-laser wordt gebruikt om water dat in biologische monsters wordt aangetroffen resonant te exciteren16 om de neutrale soorten te desorberen en ze te onderwerpen aan een orthogonale elektrospraypluim, gevolgd door analyse met behulp van een nauwkeurige massa Orbitrap-massaspectrometer met hoge resolutie. IR-MALDESI is eerder aangetoond voor de directe analyse van weefselmetabolieten17, met duidelijke voordelen van snelle analyse18, zachte ionisatiemethode en de voorspelbaarheid van siaalzuurgehalte van N-gebonden glycanen op basis van de isotopendistributiepatronen van gechloreerde glycaanadducten19. De aanpassing van dit platform voor de directe analyse van subcellulaire glycanen is echter niet aangetoond.

Hier rapporteren we een high-throughput protocol voor mitochondriale isolatie van microgliale cellen, isolatie van mitochondriale N-glycanen en mitochondriale N-glycaandetectie en -analyse met behulp van IR-MALDESI massaspectrometrie. Dit protocol zal van fundamenteel belang zijn bij het blootleggen van nieuwe inzichten in de rol van glycosylering in de mitochondriale functie, en mogelijk nieuwe therapeutische doelen voor neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve aandoeningen identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BV2 Microgliale cellijncultuur

  1. Behoud de BV-2-cellen (microgliacellen afgeleid van C57BL/6-muizen) in DMEM-media met een laag glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicillium-streptomycine (PenStrep) en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA).
  2. Laat de cellen in T-175-kolven groeien en laat ze een samenvloeiing van 70-80% bereiken.
  3. Splits de cellen door 5 minuten te incuberen met de celdissociatie-enzymen bij 37 °C in 5% CO2, gevolgd door inactivering van de enzymen met een gelijk volume celmedia en centrifugatie van de cellen gedurende 5 minuten bij 500 × g bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: De celdissociatie-enzymen die hier worden gebruikt, zijn zachter voor BV2-cellen dan trypsine en kunnen worden gebruikt om de antigeenexpressie op het celoppervlak te beschermen.
  4. Zuig de media op, suspendeer de celpellet in 1 ml groeimedia en tel de cellen met trypanblauw (zie de materiaaltabel).
    OPMERKING: We hebben voor deze stap een geautomatiseerde cellenteller gebruikt om cellen te tellen.
  5. Om de mitochondriale isolatie uit te voeren, gaat u te werk als de celpellet 2 × 107 (20 miljoen cellen/pellet) bevat.

2. Isolatie van mitochondriën uit microgliacellen

OPMERKING: Werk snel en houd alles tijdens de procedure in de ijskast. De mitochondriale isolatiekit die wordt gebruikt voor mitochondriale isolatie heeft drie componenten: reagentia A (cellysisbuffer), reagens B (stabiliserende buffer) en reagens C (mitochondriale wasbuffer). Voeg direct voor gebruik proteaseremmers toe aan reagens A en reagens C.

  1. Pellet 2 × 107 cellen door geoogste cellen te centrifugeren in een microcentrifugebuis van 2,0 ml bij 500 × g gedurende 5 minuten. Aspiratie voorzichtig en gooi het bovenliggende weg.
  2. Voeg 800 μL mitochondriaal isolatiereagens A (cellysebuffer) toe, vortex gedurende 5 s met gemiddelde snelheid en incubeer de buis precies 2 minuten op ijs.
    OPMERKING: Overschrijd de incubatietijd van 2 minuten niet.
  3. Voeg 10 μL mitochondriaal isolatiereagens B (stabiliserende buffer) toe, vortex op maximale snelheid gedurende 5 s en incubeer de buis gedurende 5 minuten op ijs, waarbij de vortex elke minuut op maximale snelheid wordt uitgevoerd.
  4. Voeg 800 μl mitochondriale isolatiereagens C (mitochondriale wasbuffer) toe, keer de buis enkele malen om om te mengen en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 700 × g bij 4 °C.
    OPMERKING: Niet draaikolken.
  5. Breng het bovenstaande over in een nieuwe tube van 2,0 ml en draai gedurende 15 minuten bij 3.000 × g bij 4 °C.
  6. Breng het bovenstaande (cytosolische delen) over in een nieuw buisje. De pellet bevat de geïsoleerde mitochondriën.
  7. Voeg 500 μL mitochondriën isolatiereagens C toe aan de pellet en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 × g .
  8. Gebruik de pellet voor het kwantificeren en verwerken van eiwitten of bewaar de pellet bij -80 °C tot verder gebruik.

3. Eiwitschatting met behulp van microBCA-assay

OPMERKING: Eiwitschatting voor dit protocol kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende reagentia en testen. Kwantificering van cytosolische of mitochondriale eiwitten kan worden uitgevoerd door te normaliseren ten opzichte van de totale eiwitconcentratie die in de test wordt gebruikt.

  1. Bereid runderserumalbumine (BSA) tussen 0 μg/ml en 200 μg/ml (0 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml, 200 μg/ml) en blanco's alleen met lysisbuffer.
  2. Voeg 150 μL van elke standaard toe aan de plaat met 96 putjes met platte bodem die de monsters bevat.
  3. Meng 25 delen Micro BCA-reagens MA (bicinchoninezuur (BCA)-oplossing) en 24 delen reagens MB (kopersulfaatoplossing) met 1 deel reagens MC (stabiliserende buffer) (25:24:1, reagentia MA:MB:MC) om een werkend reagens te maken. Voeg 150 μL van het gemengde BCA-reagens toe aan elk monster en elke standaard.
  4. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
  5. Gebruik een plaatlezer om de extinctie bij 562 nm te meten en kwantificeer de eiwitconcentratie met de standaardcurve. Trek de blanco standaardextinctie af van de extinctiemeting van alle andere individuele standaarden en onbekende monsterreplicaten om de eiwitconcentraties van het monster te verkrijgen.

4. Kwaliteitscontrole van de mitochondriale bereiding (western blot)

  1. Resuspendeer de mitochondriale pellet in de buffer van de radio-immunoprecipitatietest (RIPA) om eiwitkwantificering uit te voeren. Bepaal de eiwitconcentratie voor elk monster met behulp van de micro BCA-test.
  2. Denatureer de monsters in een monsterbuffer bij 94 °C gedurende 5 minuten.
  3. Laad gelijke hoeveelheden (20 μg) mitochondriaal eiwit in geprefabriceerde gels (zie materiaaltabel), samen met de molecuulgewichtmarker.
  4. Laat de gel 50 minuten draaien op 100 V.
    OPMERKING: De looptijd kan variëren, dus zorg ervoor dat u de gel stopt wanneer de eiwitten het einde van de gel hebben bereikt dat wordt aangegeven door de kleurstof in de monsterbuffer.
  5. Breng de eiwitten van de gel over naar een polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan met behulp van het dry-transferprotocol in een western blot-overdrachtssysteem gedurende 7 minuten bij 20 V.
  6. Haal het membraan eruit en blokkeer met de blokkeeroplossing (tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Voeg de juiste verdunningen van primair antilichaam toe aan het membraan in een blokkerende buffer 's nachts bij 4 oC (COXIV = 1:3.000, GAPDH =1:3.000).
    OPMERKING: De afwezigheid van nucleaire, endoplasmatisch reticulum (ER) contaminatie in het mitochondriaal preparaat kan worden getest met behulp van aanvullende markers zoals lamin (nucleaire marker) en ERp57 (ER-marker) in western blots.
  8. Was het membraan 3 x 15 minuten met de wasbuffer (tabel 1).
  9. Incubeer het membraan met de juiste verdunning van HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur
  10. Was het membraan 3 x 15 minuten met de wasbuffer.
  11. Gebruik voor het ontwikkelen een chemiluminescente substraatkit.
  12. Scan het membraan met behulp van een gel- en membraanimager.

5. Mitochondriale eiwitisolatie voor N-glycaanextractie uit microglia

  1. Resuspendeer de geïsoleerde mitochondriën in 50 μL eiwitisolatiebuffer (Tabel 1) en laat 20 minuten op ijs staan.
  2. Zuig en doseer drie keer en laat 20 minuten op ijs staan (vortex voor gebruik). Als de mitochondriale pellet niet volledig is oplosbaar, voeg dan nog eens 50 μL van de isolatiebuffer toe en plas in dezelfde buis.
  3. Centrifugeer op 13.000 × g gedurende 10 min.
  4. Herstel het supernatant, vries minimaal 1 uur in bij -80 °C en droog zoveel mogelijk in een vacuümconcentrator.
  5. Resuspendeer vóór glycaanisolatie met behulp van de PNGase-digestbuffer (tabel 1) voor IR-MALDESI.

6. Mitochondriaal N-glycaanpreparaat voor IR-MALDESI

  1. Laad 25-250 μg eiwit (in een maximaal volume van 250 μL) geïsoleerde mitochondriale eiwitten op een 10 kDa moleculair gewicht cut-off (MWCO) filter.
  2. Verminder de eiwitmonsters om de glycaangroepen bloot te leggen door 2 μL 1 M dithiothreitol (DTT) toe te voegen aan elk monster in het filter.
  3. Verdun het monster met 200 μL PNGase digest buffer en vortex lichtjes om te voorkomen dat het filter wordt verstoord.
  4. Denatureer de mitochondriale eiwitten door het monster gedurende 30 minuten bij 56 °C te incuberen.
  5. Gebruik 50 μL 1 M jodoacetamide om de mitochondriën te alkyleren tot een uiteindelijke concentratie van ~200 mM en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C.
  6. Om de gedenatureerde mitochondriale methoden verder te concentreren, centrifugeert u de monsters gedurende 40 minuten bij 14.000 × g . Gooi de doorstroom weg.
  7. Was het monster met 100 μL PNGase-digestbuffer.
  8. Concentreer het glycoproteïne op het filter bij 14.000 × g gedurende 20 minuten en gooi de doorstroom weg. Herhaal de was- en concentraatstap 2x, voor een totaal van 3x, wat een concentraat oplevert in het dode volume van het filter (~5 μL). Gooi alle doorstroom weg.
  9. Gooi de opvangflacon weg zodra de wasbeurten zijn voltooid. Gebruik een nieuwe inzamelflacon voor alle toekomstige verdunningsmiddelen en wasbeurten.
  10. Om de glycanen van gedenatureerde mitochondriale glycopatronen te splitsen, brengt u deze over naar een verse verzamelflacon en voegt u 2 μL glycerolvrije PNGase (75.000 eenheden/ml) toe aan het filter. Voeg 98 μL PNGase digest buffer toe, waardoor het totale volume op 100 μL komt en meng door voorzichtig op en neer te pipetteren op het filter.
  11. Incubeer de monsters gedurende 18 uur bij 37 °C om enzymatisch alle N-glycanen van mitochondriale eiwitten te splitsen.
  12. Elueer de vrijgekomen mitochondriale N-glycanen door het monster gedurende 20 minuten bij 20 °C bij 14.000 g × g te centrifugeren.
  13. Was de mitochondriale glycanen door 100 μL PNGase-digestiebuffer aan het filter toe te voegen en centrifugeer bij 14.000 g × g gedurende 20 minuten bij 20 °C. Verzamel de wash met eventuele resterende N-glycanen in dezelfde verzamelflacon als het eluent. Herhaal dit 2x en verwijder het filter uit de opvangflacon.
  14. Incubeer de mitochondriale glycaanmonsters in de vriezer van -80 °C tot ze bevroren zijn (30-60 min) en droog ze volledig bij kamertemperatuur in een vacuümconcentrator (4-6 uur voor 400 μl).
    OPMERKING: N-glycanen kunnen tot 6 maanden voorafgaand aan de analyse bij -20 °C worden bewaard.
  15. Resuspendeer de gedroogde N-gebonden glycanen in 50 μl water van LC/MS-kwaliteit vlak voor de IR-MALDESI-analyse.

7. Detectie van vrijgekomen glycanen door IR-MALDESI massaspectrometrie

  1. Voer elke dag van het experiment een massakalibratie uit. Vul de kalibratieoplossing op een spuitpomp en duw door met een snelheid van 1,2 μl/min. Pas een spanning van 3,5 kV toe om een stabiele elektrospray-pluim te verkrijgen voor massakalibratie in zowel positieve als negatieve modi.
  2. Pipetteer 5 μL geresuspendeerde mitochondriale glycanen op een monsterplek op een teflon-microtiterobjectglaasje.
  3. Gebruik een mid-IR-laser die werkt op een golflengte van 2.97 μm voor ablatie met een energie van 1.8 mJ per burst.
  4. Ioniseren en detecteren van N-glycanen in negatieve ionisatiemodus. Gebruik een elektrosprayoplosmiddel bestaande uit 60% acetonitril en 1 mM azijnzuur om een stabiele elektrospraypluim te creëren met een debiet van 2 μL/min bij een spanning van 3,2 kV.
  5. Om de analyse uit te voeren, koppelt u IR-MALDESI aan een HRAM-massaspectrometer die is ingesteld op een massaoplossend vermogen van 240.000FWHM bij m/z 200, waarbij tussen 500 en 2.000 m/z wordt geanalyseerd in negatieve ionisatiemodus.
  6. Schakel de automatische versterkingsregeling (AGC) uit en stel een vaste injectietijd van 90 ms in. Gebruik de EasyIC-bron voor real-time interne kalibratie van elk spectrum om een hoge massameetnauwkeurigheid (MMA) te bereiken.

8. Mitochondriale N-glycaan data-analyse

  1. Identificeer handmatig de N-gebonden glycanen door te zoeken naar mono-isotopische massa's en isotopenverdelingen te bevestigen met behulp van de m/z-afstand om dubbel en drievoudig geladen ionen te bepalen met een minimale ionenfluxdrempel van 1.000 ionen/s.
  2. Converteer de ruwe massaspectra van m/z-verhoudingen naar neutrale mono-isotopische massa's.
  3. Upload de mono-isotopische massa's naar een online voorspellingstool voor de oligosacharidestructuur om mogelijke glycaansamenstellingen te bepalen. Bevestig annotaties met behulp van een experimenteel samengestelde glycomic-database20; zorg ervoor dat elke identificatie binnen de marge van 2,5 ppm MMA valt, de N-gebonden glycaankernstructuur bevat (Hex3HexNAc2) en pentose-, KDN- of HexA-monosachariden uitsluit.
  4. Teken de bevestigde glycaanstructuren met behulp van SNFG-nomenclatuur21.
  5. Verkrijg de relatieve overvloed aan glycanen uit de ruwe massaspectra en normaliseer tegen de hoeveelheid mitochondriaal eiwit in μg om ionen/s/μg te verkrijgen.
  6. Gebruik Chi-kwadraatanalyse om de goedheid van de fit tussen de theoretische en experimentele verdelingen van de N-gebonden glycanen te testen om het aantal chlooradducten te bepalen. Dit maakt een directe bepaling van het aantal siaalzuren19 mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de stappen die nodig zijn voor de isolatie van mitochondriën uit de BV2-microgliale cellijn voor massaspectrometrische glycaananalyse. De reproduceerbaarheid van mitochondriale eiwitisolatie tussen verschillende mitochondriale preparaten met dezelfde startdichtheid van de microgliacellen wordt weergegeven in figuur 2, die geen significant verschil laat zien tussen de mitochondriale ei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn de residente immuuncellen van de hersenen en glycaanmodificaties moduleren het immunofenotype en de functie van microglia. Deze immuunfuncties vereisen aanzienlijke cellulaire energie, die voornamelijk wordt geleverd door mitochondriën. Met name vertonen de mitochondriale eiwitten ook glycaanmodificaties, die aanzienlijk onderbelicht zijn gebleven vanwege de technologische uitdagingen bij het onderzoeken van subcellulaire glycosylering. De meeste onderzoeken naar mitochond...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Seth Eisenberg, afgestudeerde student in het Muddiman Lab van NCSU, bedanken voor zijn hulp bij het opnemen van video's van het massaspectrometrische protocol. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het School of Engineering Innovation Fellows Program aan de Universiteit van Alabama in Birmingham, AG068309 naar D.J.T. en R01GM087964-12 naar D.C.M. De schema's in dit manuscript zijn getekend met behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Amersham 600 imagerCytvia 29194217Gel and membrane imager
Countess 3 automated cell counterFisher ScientificX003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120VThermofisher scientific 88870003
i-Blot2 Gel Transfer DeviceInvitrogenIB21001Western blot transfer system
Inverted microscopeCell Treat04355223EA
Microplate reader82050-760
Mini gel tankInvitrogenA25977
Open Air RockerFisher Brand88861025
Pipet boy BioTek229310
Vortex mixerIntegra- VWR
Mitochondria isolation reagents 
Mitochondrial Isolation kitThermofisher scientific 89874
Phosphotase InhibitorThermofisher scientific 1861274
Protease InhibitorThermofisher scientific 1861281
N-glycan isolation and IR-MALDESI reagents
Acetic acid Fisher ScientificA1135050% in ESI solvent
Acetonitrile Sigma Aldrich34851-4L1 mM in ESI solvent
Ammonium bicarbonate Fisher ScientificA643500100 mM
Calibration SolutionThermofisher ScientificA39239Pierce FlexMix
Dithiothreitol Sigma AldrichAC4263801001 M
IodoacetamideSigma AldrichA322-10VL
LC/MS grade waterThermofisher Scientific047146.M6
PNGase FBulldog BioNZPP01075000 U/mL, enzyme for N-glycan release 
N-glycan isolation and IR-MALDESI consumables
Amicon centrifugal filtersFisher Scientific UFC50102410 kDa MWCO
Mass spectrometerOrbitrap Exploris 240
Mid-IR LaserJGM Associates, Burlington, MA, USA
Teflon microwell slideProsolia, Indianapolis, IN, USA
N-glycan analysis softwares
GlycoMod Expasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy https://glyconnect.expasy.org/
Protein isolation and western blot consumables 
Basix gel loading tips ( 10 µL) Basix13-611-102
Basix gel loading tips ( 200 µL) Basix13-611-116
Cell scrapperVWR labs14-388-100
i-Blot NC regular stacksInvitrogenIB23001
i-Blot2 PVDF Regular StacksInvitrogenIB24001
10  µL micropipetteFisher ScientificFBE00010
20 µL micropipetteInvitrogenFBE00020
200  µL micropipette Fisher BrandFBE00200
1000 µL micropipetteFisher brandFBE01000
10  µL pipet tips VWR labs76322-528
20  µL pipet tipsVWR labs76322-134
200  µL pipet tips VWR labs76322-150
1000  µL pipet tipsVWR labs76322-154
Well plate Fisher brand14-388-100
Protein isolation and western blot reagents 
Actin antibody ( Host : Rabbit )Cell Signaling Technologies8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked Cell Signaling Technologies7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris PlusInvitrogenNW04120BOX
Bovine Serum AlbuminFisher bioreagentsBP9700-100
COXIV antibody ( Host : Rabbit)Cell Signaling Technologies4844S
GAPDH antibody ( Host : Rabbit)Cell Signaling Technologies2118S
MicroBCA protein assay KitThermofisher scientific 23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]Thermofisher scientific NP0001
PAGE Ruler prestained protein ladderThermofisher scientific 815-968-0747Dilution= Use 7  µL to load onto first well
Phosphate buffered saline Aniara DiagnosticsA12-9423-5Prepare 1x PBS from 10x powder 
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermofisher scientific 32106Chemiluminescent substrate kit
RIPA BufferThermofisher scientific 89901
Sample BufferNovexB0007The bolt LDS sample buffer is prepared in 3:1 ratio of sample to sample buffer
Tween-20MP BiomedicalsTWEEN201
Tissue culture consumables 
Countess SlidesAvantor229411
Eppendorf tubesCell Treat414004-265612-5884

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dos Santos, S. E., et al. Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function. J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).
  2. Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration. Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).
  3. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns. Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).
  4. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).
  5. Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. Microglia: First responders in the central nervous system. Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).
  6. Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets. Front Immunol. 13, 856376(2022).
  7. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  8. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  9. Picca, A., et al. Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention. Nutrients. 14 (12), 2406(2022).
  10. Mcavoy, K., Kawamata, H. Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).
  11. Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease. Front Immunol. 12, 624538(2021).
  12. Starossom, S. C., et al. Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration. Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).
  13. Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration. Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).
  14. Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins. Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).
  15. Cummings, R. D., Pierce, J. M. The challenge and promise of glycomics. Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).
  16. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  17. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  18. Pace, C. L., Muddiman, D. C. Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).
  19. Palomino, T. V., Muddiman, D. C. Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).
  20. Mariethoz, J., et al. Glycomics@expasy: Bridging the gap. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  21. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  22. Yu, H., et al. Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model. Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).
  23. Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin. MethodsX. 8, 101197(2021).
  24. Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. central science. 9, 1297-1312 (2023).
  25. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).
  26. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy. J Vis Exp. (109), e53735(2016).
  27. Fischler, D. A., Orlando, R. N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols. J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).
  28. Tu, A., Muddiman, D. C. Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).
  29. Barry, J. A., et al. Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  30. Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging. Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microgli le mitochondri nisolatie van mitochondri nN glycaandetectieIR MALDESIhogeresolutie massaspectrometrieprote ne extractiemitochondriale glycosyleringneurodegeneratieve ziektenkwaliteitscontrole

Gerelateerde artikelen