Multimodale analyse van microplastics in drinkwater met behulp van een pijplijn voor siliciumnanomembraananalyse

Summary

Hier presenteren we een protocol met een optisch transparant en vlak substraat voor het gestroomlijnd afvangen en analyseren van verontreinigende deeltjes in drinkwater. Hier wordt de Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) gepresenteerd: een flexibele pijplijn voor het vastleggen, kwantificeren en identificeren van deeltjes in vloeibare media.

Abstract

De biologische impact van microplasticvervuiling in menselijke voedsel- en waterbronnen is grotendeels onbekend, en drinkwaterbronnen zijn niet vrijgesteld van deze microplasticverontreiniging. Hier demonstreren we een gestroomlijnde aanpak voor het opvangen, kwantificeren en identificeren van microplastics in drinkwater. We presenteren een analytische workflow die de Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) wordt genoemd en die gebruikmaakt van nieuwe siliciumnitride-nanomembranen die een significante "concentratiefactor" mogelijk maken, die zwevende deeltjes consolideert in een geplanariseerd observatiegebied voor geïndividualiseerde, kwantificeerbare en multimodale deeltjesanalyse op hetzelfde substraat. De belangrijkste voordelen van SNAP komen voort uit het gebruik van ultradunne, op siliciumnitride gebaseerde membranen die zijn ondergebracht in filterschijven van conventionele grootte, waardoor de directe opname en analyse van polymere MP's op een niet-polymere achtergrond mogelijk is. Drinkwatermonsters afkomstig uit de regio Rochester, NY, werden verzameld uit residentiële kraanbronnen en geanalyseerd met behulp van SNAP. Deeltjes in elk monster werden gekarakteriseerd door optische en scanning-elektronenmicroscopie (SEM), Raman-spectroscopie en energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDX), en verschillende geïdentificeerde bestanddelen werden gekwantificeerd in verhouding tot het totale aantal gevangen deeltjes.

Introduction

Microplastics worden gedefinieerd als synthetische polymeren van kleiner dan vijf millimeter in maat ^1,2. Vervuiling door microplastics (MP) is een groeiend probleem voor de menselijke gezondheid, het milieu en het milieu. MP-verontreiniging is gevonden in alle soorten waterbronnen; zoet water, oceanen en zelfs drinkwaterbronnen³. MP's worden gegenereerd uit de uitsplitsing van primaire plastic bronnen⁴, evenals synthetisch textiel ^5,6,7. MP's zijn alomtegenwoordig en zijn aangetroffen in menselijke weefsels, zoals menselijke placenta, uitwerpselen en bloed ^8,9,10. Er is een toenemende belangstelling voor onderzoek naar parlementsleden, zoals blijkt uit respectievelijk meer dan 4.100 en 4.600 publicaties in 2023 en 2024 (PubMed-gegevens; trefwoord "microplastics"), evenals een toenemende publieke bezorgdheid over de blootstelling van mensen aan parlementsleden. Als reactie op een groeiende publieke bezorgdheid hebben verschillende regelgevende overheidsinstanties, zoals de staat Californië¹¹ en verschillende EU-landen¹², regelgeving hebben (of zullen) uitvoeren met betrekking tot MP-gehalten in drinkwater. Gezien al het bovenstaande heeft het Amerikaanse Environmental Protection Agency onlangs parlementsleden aangekondigd als een nieuwe zorgwekkende verontreiniging. De evaluatie van menselijke risico's wordt echter ernstig belemmerd door een gebrek aan methoden voor de betrouwbare en reproduceerbare detectie van MP's.

Karakterisering van MP's is gebaseerd op analytische methoden zoals optische en elektronenmicroscopie¹³ en spectroscopische en spectrometrische technieken ^1,14,15 om respectievelijk de visuele kenmerken van MP's⁷ en hun samenstelling te begrijpen. Monsters die MP's bevatten, moeten meerdere analyses bevatten om MP's te karakteriseren, identificeren en kwantificeren, en vereisen op zijn minst spectroscopie/spectrometrie (d.w.z. Raman-spectroscopie, infraroodspectroscopie of pyrolyse-gaschromatografie-massaspectrometrie, enz.) volgens sommige minimale vereisten van tijdschriften voor het meten van kunststoffen in milieumonsters, zoals Science of the Total Environment¹⁶. Ramanspectroscopie is veelzijdiger dan infrarood (IR) spectroscopie, vooral met betrekking tot materiaalidentificatie in biologische monsters. Raman-spectroscopie is een lichtverstrooiingstechniek, waardoor kleinere deeltjes gemakkelijker kunnen worden geanalyseerd dan IR, een lichtabsorberende techniek die grotere deeltjes vereist en meer beperkingen heeft voor de plaatsing van monsters¹⁷. Eerder is gesuggereerd dat substraten voor Raman-spectroscopie bestaande uit silicium of siliciumoxide betrouwbare resultaten kunnen opleveren met minimale achtergrondruis¹⁸.

Substraten voor bepaalde analytische technieken die gewoonlijk compatibel zijn met één type analyse (d.w.z. met goud beklede substraten die nodig zijn voor IR-spectroscopie) zijn vaak niet compatibel met transmissie- en/of reflectielichtmicroscopie. Vervolgens is replicate subsampling populair onder onderzoekers om monsters te produceren die geschikt zijn voor elke afzonderlijke analyse, maar subsampling is tijdrovend en kan deeltjes met een lage abundantie uitsluiten ^1,2,6. Doorgaans is handmatige overdracht van deeltjes van het ene substraat naar het andere nodig om hetzelfde deeltje te analyseren voor karakterisering en identificatie volgens verschillende analytische modaliteiten, maar deze langzame, handmatige overdrachten vergroten de kans op vertekening, besmetting en verlies, en beperken de analyse van MP's tot alleen de grootste deeltjes die handmatig kunnen worden gemanipuleerd¹³. Deze suboptimale workflows introduceren tal van uitdagingen en betrouwbaarheidsproblemen, wat bijdraagt aan de aanzienlijke variabiliteit in MP-kwantificering die in de literatuur wordt gerapporteerd ^3,7.

Hier presenteren we een analytische workflow die we de Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) noemen om MP's vast te leggen, te karakteriseren, te identificeren en te kwantificeren, en het nut van SNAP aan te tonen door drinkwatermonsters afkomstig uit de regio Rochester, NY te analyseren. SNAP wordt mogelijk gemaakt door filterschijven met een conventionele diameter van 25 mm en geïntegreerde siliciumnanomembranen (zie aanvullende tabel S1 voor membraaneigenschappen), die een uniform substraat bieden voor het concentreren en analyseren van MP's uit drinkwater met behulp van meerdere technieken^15,19. Na het achtereenvolgens concentreren en vastleggen van MP's op nanomembranen met afnemende afsnijgroottes (20 μm microporeus siliciumnitride (MPSN) met cilindrische poriën en 8,0 μm microspleet siliciumnitride (MSSN) met rechthoekige prismaporiën), faciliteert SNAP drie opeenvolgende analytische stappen: 1) monsterkleuring, optische microscopie en MP-kwantificering, 2) deeltjesidentificatie via Raman-spectroscopie, gevolgd door 3) deeltjeskarakterisering via scanning-elektronenmicroscopie (SEM), waardoor meerdere analyses mogelijk zijn van dezelfde deeltjes die op één nanomembraansubstraat zijn vastgelegd.

We demonstreren meerdere SNAP-pijplijnen door gebruik te maken van zowel ongecoate silicium nanomembraan (SiN) filterschijven als goudgecoate silicium nanomembraan (Au-SiN) filterschijven: Pipeline A) SNAP uitgevoerd op SiN en achtereenvolgens karakteriseren van dezelfde MP's door middel van meerdere analytische technieken; Pijpleiding B) SNAP uitgevoerd op Au-SiN met Raman-spectroscopie; en Pipeline C) SNAP uitgevoerd op Au-SiN met SEM uitgerust met energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDX) (Figuur 1). SNAP-variaties zijn dus flexibele, gestroomlijnde analytische workflows die kunnen worden gebruikt voor een aantal soorten monsters en analytische technieken. In tegenstelling tot eerder gepubliceerde methoden die gebaseerd zijn op polymere membranen¹¹, komen de voordelen van SNAP voort uit het gebruik van siliciumnanomembranen, waarbij synthetische polymeer MP's worden gevangen op een niet-polymeer, op silicium gebaseerd membraan, waardoor de compositorische identificatie van MP's op een niet-polymere achtergrond mogelijk is. Verder bieden siliciumnanomembranen uniforme brandvlakken in tegenstelling tot polymere membranen, die de neiging hebben te kreuken, waardoor meerdere geautomatiseerde microscopie- en spectroscopietechnieken mogelijk zijn.

We hebben eerder het gebruik van siliciumnanomembranen voor MP-analyses gekarakteriseerd door analytische modellering, modeldeeltjesuitdagingen en drinkwater- en luchtmonsters^19,20, en door hun filtratie- en optische microscopie-eigenschappen te vergelijken met behulp van modeldeeltjes tegen vier veelgebruikte membranen¹⁵. In dit protocol demonstreren we heuristisch het nut van SNAP voor de analyse van MP's in vier drinkwatermonsters. Monsters werden verzameld uit vier verschillende waterbronnen rond het grotere gebied van Rochester, NY. Elk monster dat in deze studie is opgenomen, is afkomstig van een afzonderlijke oppervlaktewaterbron, zoals Lake Ontario, Hemlock Lake, een mix van Hemlock en Ontario, en Canandaigua Lake (Figuur 2). Afgevangen deeltjes uit deze drinkwaterbronnen omvatten wijdverspreide kunststoffen zoals polystyreen (PS) en polyethyleen (PE), zware metalen zoals ijzer, silica en niet-synthetische deeltjes.

Protocol

1. Kwaliteitscontroleprocedures en preparaten van Ultrapure-oplossing

1. Laminaire stroming kap en handschoen reiniging
   1. Don PBM (persoonlijke beschermingsmiddelen): 100% katoenen laboratoriumjas en nitril handschoenen.
      OPMERKING: PBM is continu gedurende het hele protocol.
   2. Spuit nitrilhandschoenen in met 99% isopropylalcohol (IPA). Wrijf de handen tegen elkaar en spoel vervolgens af met ~18 MΩ, 0,22 μm gefilterd water. Doe dit 3x om het lossingsmiddel uit de handschoenen te verwijderen.
   3. Vouw een delicate doekje van natuurlijke vezels in vieren en spuit vervolgens met 70% IPA. Veeg het oppervlak van de kap in lange halen van achteren naar voren af en vouw de delicate veeg om de twee halen opnieuw op een ongebruikt oppervlak. Ga door met het schoonmaken van de afzuigkap totdat alle oppervlakken zijn schoongemaakt en vervang het doekje door een nieuw exemplaar zodra het vuil is.
   4. Leg de siliconen rolmat bloot en rol over het oppervlak van de kap om eventuele resterende deeltjes op te nemen. Om de siliconenroller schoon te maken, spuit u met 99% IPA en schrobt u met een gehandschoende hand, daarna spoelt u af met 18 MΩ, 0,22 μm gefilterd water. Herhaal dit 3x en laat vervolgens aan de lucht drogen in de capuchon.
   5. Spoel de handschoenen opnieuw uit zoals in stap 1.1.2.
2. Ultrapuur water en IPA-generatie.
   1. Vul een bekerglas van 1 l met 18 MΩ water en plaats dit in de kap.
   2. Vul een spuit van 60 ml en een aangesloten filter met een afgesneden spuit van 0,22 μm voor door ten minste 200 ml 18 MΩ water door de spuit en het aangesloten filter te filtreren.
      OPMERKING: Een spuitpomp bespaart tijd, maar is geen vereiste om het beschreven protocol uit te voeren.
   3. Spoel een glazen schroefdopreservoir 3x af met 18 MΩ, 0,22 μm gefilterd water. Vul met 0,22 μm spuit gefilterd 18 MΩ gefilterd water.
   4. Herhaal stap 1.2.1-1.2.3 met de gewenste % concentratie IPA in plaats van 18 MΩ, 0,22 μm gefilterd water om ultrazuivere IPA te genereren.

2. Deeltjesopvang uit vloeistofmonsters via filtratie

OPMERKING: Het onderstaande protocol kan worden gebruikt met andere vloeibare monsters dan water. Gevalideerde methoden voor het verzamelen van monsters moeten worden overgelaten aan het oordeel van de onderzoeker op basis van de behoeften van zijn onderzoek en van het monster.

1. Trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat handschoenen en kapoppervlakken worden gereinigd in overeenstemming met de stappen 1.1.2-1.1.5.
2. Spuit een siliconen pakking in met Ultrapure 99% IPA, schrob met gehandschoende vingers en spoel vervolgens af met Ultrapuur water. Herhaal dit 3x voor elke pakking.
   OPMERKING: Het aantal pakkingen dat bij de filtratie moet worden gebruikt, is gelijk aan het aantal te gebruiken filterschijven, plus 1. Raadpleeg Figuur 1B voor de visuele afbeelding van de montage.
3. Spoel met behulp van de spuit die in stap 1.1.2 is geprimed de binnenkant van de spuit van 60 ml met het ultrazuivere water door 30 ml ultrapuur water en 30 ml lucht in de spuit op te nemen. Schroef een spuitfilter erop, schud krachtig en doseer. Herhaal dit 3x.
   OPMERKING: Elke spuit kan indien nodig worden gebruikt op basis van het volume van het monster.
4. Monteer het filterapparaat zoals weergegeven in de visuele montageafbeelding in afbeelding 1B.
   NOTITIE: Gebruik een schoon pincet om filterschijven en pakkingen te hanteren tijdens montage en demontage.
   1. Zorg er bij sequentiële filtraties voor dat er een pakking is tussen de schijf en de steunfrit, een pakking tussen elke schijf en een pakking tussen de schijf en de filtertrechter.
   2. Zorg ervoor dat de schijven zijn geordend met het grootste uitschakelfilter bovenaan de stapel en het kleinste afsnijfilter aan de onderkant.
5. Zet het vacuüm naar het apparaat aan zodat er een negatieve stroom door de stapel filterschijven gaat.
6. Meten van achtergrondverontreiniging
   OPMERKING: Het volgende proces maakt een evaluatie mogelijk van de reiniging van de spuit en het genereren van ultrazuivere media, en een bepaling van de achtergronddeeltjes die door de componenten van het systeem worden bijgedragen.
   1. Doseer met de gespoelde spuit langzaam 50 ml ultrapuur water over het nanomembraan in het midden van de bovenste schijf om ervoor te zorgen dat alle gedoseerde vloeistof wordt gefilterd.
      OPMERKING: Bij het filteren van grotere monstervolumes (d.w.z. >50 ml), wordt een glazen filtertrechter voorgesteld. Reinig de glazen filtertrechter zoals in stap 2.3. Extra laboratoriumartikelen kunnen een extra risico op deeltjesbesmetting met zich meebrengen. Blijf zorgvuldig met reinigingsprocedures en controleer altijd de netheid met blanco filtraties voordat u de monsters van belang gebruikt.
   2. Laat het ultrazuivere water filtreren. Houd de stofzuiger nog een minuut aan na het filteren. Zodra het monster volledig droog is, schakelt u het vacuüm uit.
   3. Verwijder de filterschijven voorzichtig uit de pakkingen met een schoon pincet en plaats de schijven in de juiste schone en geëtiketteerde container voor opslag, zoals een glazen petrischaal of een verduisterde doos.
   4. Beeld de filterschijven af onder microscopie voor optische analyse, deeltjestelling, enz.
7. Reinig voor vloeistofmonsters een extra pakking zoals in stap 2.2. Zorg voor een nieuwe spuit voor elk uniek monster van vloeibare media en herhaal stap 2.3.
8. Neem de gewenste hoeveelheid monster op en verdeel het monster langzaam over het nanomembraan in het midden van de bovenste schijf.
9. Zodra de monsterfiltratie is voltooid, voert u 3x spoelingen uit met 1 ml ultrapuur water om ervoor te zorgen dat alle deeltjes in het monster voldoende van alle oppervlakken op het membraan in het midden van de filterschijf zijn gespoeld.
10. Houd de stofzuiger nog een minuut aan om het 3x gespoelde monster volledig te drogen en schakel vervolgens de stofzuiger uit.
    1. Herhaal stap 2.7-2.10. voor elke replicatie die moet worden uitgevoerd van de steekproef van belang.

3. Fluorescerende kleurstofvoorbereiding en kleuring

OPMERKING: Fluorescerende kleuring met Nijlrood en/of Trypanblauw kan interfereren met Raman-spectroscopielasers die van belang zijn.

1. Kleuring met Nijlrood (NR)
   1. Trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan.
   2. Reinig de handschoenen en de capuchon zoals in de stappen 1.1.2-1.1.5.
   3. Volledige monsterfiltratie zoals beschreven in stappen 2.7-2.10.
   4. Spoel twee glazen containers met schroefdop 3x af met ultrapuur water.
   5. Bereid een 0,1 mg/ml oplossing van NR in Ultrapure 99% IPA in een schone glazen container.
   6. Keer 10x voorzichtig om om te mengen.
   7. Filtreer de NR-oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm in de tweede glazen schroefdopcontainer.
      OPMERKING: Het filter dat wordt gebruikt om de NR voor te filteren, moet een kleinere afkapping hebben dan het filter dat wordt gebruikt om de monsters te filteren.
   8. Plaats de te beitsen filterschijf op de steunfrit van de vacuümkolf.
   9. Pipetteer 20 μl van de 0,1 mg/ml NR-oplossing op het nanomembraan in het midden van de filterschijf.
      OPMERKING: De vlek moet het poreuze oppervlak van het nanomembraan volledig bedekken. Als 20 μL niet genoeg is, voeg dan extra kleuring toe totdat alle poreuze delen van het nanomembraan voldoende met vlekken zijn bedekt.
   10. Incubeer de vlek gedurende 5 minuten.
   11. Vacuüm de vlek zodra de incubatie is voltooid.
   12. Spoel 3x af met 1 ml Ultrapure 99% IPA om overtollige NR-vlekken te verwijderen.
       OPMERKING: Ga na deze stap verder met het gedeelte Trypan Blue-kleuring hieronder als er tegenkleuring moet worden uitgevoerd.
   13. Laat de filterschijf 2 minuten op de steunfritte zitten met het vacuüm aan om eventuele resterende vloeistof te filteren en te drogen. Als de filterschijf na 2 minuten niet droog is, breng dan de filterschijf met behulp van een schoon glazen petrischaaltje gedurende 2-5 minuten over naar een oven van 70 °C.
   14. Eenmaal droog, voert u fluorescentiemicroscopie uit zoals beschreven in stap 2.6.4 en gaat u verder met sectie 4.
2. Kleuring met trypanblauw (TBC)
   1. Trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan.
   2. Reinig de handschoenen en capuchon zoals beschreven in de stappen 1.1.2-1.1.5.
   3. Voltooi de monsterfiltratie vanaf stap 2.7-2.10 of begin met stap 3.2.4.
   4. Spoel twee glazen containers met schroefdop 3x af met ultrapuur water.
   5. Bereid 0,4% TB-vlek voor in één container.
      OPMERKING: Het filter dat wordt gebruikt om de TB voor te filteren, moet een kleinere grenswaarde hebben dan het filter dat wordt gebruikt om de monsters te filteren.
   6. Keer 10x voorzichtig om om te mengen.
   7. Filtreer de TB-vlekoplossing met een spuitfilter van 0,22 μm in de tweede glazen schroefdopcontainer.
      OPMERKING: Het filter dat wordt gebruikt om de TB voor te filteren, moet een kleinere grenswaarde hebben dan het filter dat wordt gebruikt om de monsters te filteren.
   8. Plaats de te beitsen filterschijf op de steunfrit van de vacuümkolf.
   9. Pipetteer 20 μL van de 0,4% TB-vlek op het nanomembraan in het midden van de filterschijf.
      OPMERKING: De vlek moet het poreuze oppervlak van het nanomembraan volledig bedekken. Als 20 μL niet genoeg is, voeg dan druppelsgewijs extra kleuring toe totdat alle poreuze delen van het nanomembraan goed bedekt zijn met de vlek.
   10. Incubeer de vlek gedurende 5 minuten.
   11. Vacuüm de vlek na 5 minuten incubatie.
   12. Spoel 3x af met 1 ml volume ultrapuur water.
   13. Laat de filterschijf 2 minuten op de steunfritte zitten met het vacuüm aan om eventuele resterende vloeistof te filteren en te drogen. Als de filterschijf na 2 minuten niet droog is, breng dan de filterschijf met behulp van een schoon glazen petrischaaltje gedurende 2-5 minuten over naar een oven van 70 °C.
   14. Eenmaal droog, voert u fluorescentiemicroscopie uit zoals beschreven in stap 2.6.4 en gaat u verder met sectie 4.

4. Kwantificering van deeltjes via fluorescentiemicroscopie

1. Optische microscopie beeldopname
   1. Immobiliseer de filterschijf op een microscoopglaasje met behulp van een siliconenpakking, of gebruik een uitlijningsglaasje dat specifiek is voor het gebruik van de filterschijf met een microscooptafel. Verplaats de filterschijf die moet worden afgebeeld naar het microscoopstadium.
   2. Beeld het nanomembraan af met behulp van helderveldverlichting, zodat het maximale aantal gedetecteerde tellingen ~ 90% van het maximale bereik van de detectorcamera is.
      OPMERKING: Deze 90%-waarde is ~59.000 voor een 16-bits detector met witniveaus van 65.535.
   3. Beeld het nanomembraan af met behulp van fluorescentieverlichting, zodat de maximale pixelintensiteiten ongeveer ~25% van het maximale bereik van de detectorcamera zijn.
   4. Sla de afbeelding op in een 16-bits samengestelde TIFF-indeling.
2. Kwantificering van deeltjes via fluorescentiemicroscopie
   1. Gebruik het beeldanalyseplatform om de fluorescerende kanalen van de samengestelde TIFF die in 4.1.4 zijn gegenereerd, te scheiden van het helderveldkanaal met behulp van de Split-Channels-functie .
   2. Drempel de pixelintensiteiten met behulp van de functie Drempel tot een waarde van 10.000.
      OPMERKING: Als er bloei op de deeltjes aanwezig is, is de drempel te laag en moet deze worden verhoogd.
   3. Sla een afzonderlijke afbeelding op in PNG-indeling.
   4. Ontspikkel de afbeelding om ruispixels te verwijderen met behulp van de functie Ontspikkelen .
   5. Watershed de afbeelding met behulp van de Watershed-functie .
      OPMERKING: Deze functie scheidt aangrenzende deeltjes van vergelijkbare grootte, ten koste van het opsplitsen van grote aaneengesloten deeltjes in kleinere stukjes. Omdat er vaak veel meer kleine deeltjes dan grote deeltjes aanwezig zijn, kan dit een goede afweging zijn, maar kan het onbedoelde effecten hebben, zoals het opbreken van lange vezels in strengen van kleine deeltjes. Inspecteer de afbeeldingsresultaten voordat u gegevens accepteert.
   6. Stel de schaal van de gedrempelte fluorescerende beelden in door de breedte van een porie in het helderveldbeeld te meten. Gebruik de gemeten poriebreedte om de schaal in pixels/μm in te stellen.
      OPMERKING: Voor rechthoekige poriën komt de kleinste breedte overeen met het productlabel. Voor cirkelvormige poriën komt de diameter overeen met het productetiket waarop de poriegrootte (d.w.z. afsnijding) van het nanomembraan wordt vermeld.
   7. Pas de functie Deeltjes tellen van het beeldanalyseplatform toe op het gedrempeliseerde fluorescerende beeld, waarbij de oppervlakte, min en max worden geëvalueerd.
   8. Verwerk de fluorescerende en helderveldafbeeldingen om composities te maken die de fluorescerende domeinen visualiseren.
   9. Drempelwaarde voor het fluorescerende beeld met dezelfde waarde als in stap 4.2.2.
   10. Voeg kanalen samen met behulp van het beeldanalyseplatform. Wijs het fluorescerende kanaal toe aan het rode kanaal en de helderveldafbeelding aan het grijskanaal.
   11. Sla de compositie op als een PNG-bestand.

5. Raman-spectroscopie

1. Schakel het Raman-instrument en de bijbehorende computer in, zodat ze allemaal kunnen opstarten.
2. Open de software op de computer die is aangesloten op het Raman-instrument.
3. Wanneer de software is geïnitialiseerd, zorgt u ervoor dat de status Huidige systeemactiviteit en Detector op het onderste lint van het programmascherm respectievelijk Gereed en groen zijn.
4. Als de knop Autokalibratie (AC) onder aan het scherm rood is, voert u de gewenste autokalibratie uit en wacht u deze af te ronden voordat u verder gaat.
5. Als er maar één laser en één rooster worden gebruikt:
   1. Klik op Afsluiten op het scherm Autokalibratie en selecteer vervolgens de gewenste laser en het gewenste rooster in de vervolgkeuzelijsten onder Instrumentinstellingen op het tabblad Acquisitie .
   2. Keer terug naar de rode AC-knop onder aan het scherm en klik op Huidige laser/Rooster en laat de kalibratieroutine uitvoeren.
6. Als u alle lasers en roosters gebruikt, selecteert u eenvoudig Alle lasers en roosters en laat u het systeem draaien.
7. Als u meer dan één laser en/of rooster gebruikt, selecteert u de Aangepaste lasers/roosters en selecteer alle gewenste instellingen. Laat vervolgens de kalibratie uitvoeren.
8. Selecteer het objectief voor een 20x lange werkafstand (LWD) op de instrumententoren en in de software onder Instrumentinstellingen op het tabblad Acquisitie .
9. Als dit objectief niet beschikbaar is, gebruik dan een alternatief objectief met een lage vergroting (bijv. 5x of 10x) met een werkafstand die geschikt is voor de hoogte van de filterschijf.
   OPMERKING: Begin met een doel met een lagere vergroting om de eerste navigatie over het nanomembraan van de filterschijf te vergemakkelijken.
10. Plaats de filterschijf op de microscooptafel zodat deze zich binnen het optische pad bevindt.
11. Klik op Video-acquisitie in het bovenste lint om de visualisatie-optiek in te schakelen.
12. Gebruik de grove en fijne focuswielen op het instrument om het nanomembraan van de filterschijf scherp in beeld te brengen.
13. Vierkant de poriën grofweg met de puntcursorlijnen op het computerscherm.
14. Draai de filterschijf voorzichtig op de tafel om deze vierkante uitlijning te bereiken, of gebruik een uitlijningsglaasje dat specifiek is voor het gebruik van de filterschijf in een microscooptafel.
15. Zorg er op het tabblad Acquisitie in de rechterbovenhoek voor dat de geselecteerde verlichtingsmodus het veld Donker is voor de beste resultaten.
16. Als u een samengevoegde afbeelding wilt verkrijgen, navigeert u naar het tabblad Video op het lint Gegevenstabbladen.
17. Navigeer naar het eerste gewenste gezichtsveld, klik vervolgens op de Mozaïek-knop rechtsboven in het videovenster en voeg toe aan de kaart. Navigeer met de joystick van het instrument naar de tegenoverliggende hoek van het gewenste gebied en voeg toe aan de kaart.
18. Voer de mozaïekacquisitie uit met ViewSharp om ervoor te zorgen dat alle gebieden goed scherp zijn in het uiteindelijke beeld.
    OPMERKING: Objectieven met een lagere vergroting nemen minder tijd in beslag voor het verkrijgen van het beeldmozaïek, terwijl objectieven met een hogere vergroting langer duren.
19. Zodra het afbeeldingsmozaïek is gemaakt, klikt u met de rechtermuisknop op de afbeelding en klikt u op Verzenden naar ParticleFinder.
20. Navigeer naar het tabblad ParticleFinder in het lint rechtsboven om te werken met de drempelinstellingen.
21. Als u ervoor wilt zorgen dat de juiste deeltjes zijn geselecteerd, klikt u met de linkermuisknop op Afbeelding onder het gegevenstabblad ParticleFinder om de vakjes Centrum, Deeltje en Transparantie in te schakelen. Stel de transparantieschuifregelaar in op 50% en de pixelgrootte van Midden op 2px.
    OPMERKING: De selectie Centrum plaatst een stip in het midden van elk deeltje en de selectie Deeltje plaatst een overlay over elk gebied waarvan is vastgesteld dat het een deeltje is, met 50% transparantie. Met deze instellingen wordt elk deeltje gelokaliseerd en worden de randen van elk deeltje gedefinieerd.
22. Bewerk indien nodig de parameters voor deeltjesdrempels en morfologie/grootteselectie onder het tabblad ParticleFinder aan de rechterkant van het programma om ervoor te zorgen dat alle deeltjes en hun grootte-/vormparameters correct worden geïdentificeerd. Raadpleeg Aanvullende Tabel S2 voor een voorbeeld van hoe de morfologische parameters kunnen worden toegepast.
    1. Als automatische deeltjesdetectie niet voldoende is, schakelt u over op handmatig en past u de drempelwaarden stapsgewijs aan totdat een meerderheid van de juiste objecten als deeltjes wordt geïdentificeerd.
    2. Als de morfologie van de gedetecteerde deeltjes verder moet worden verfijnd, vinkt u het vakje naast Morfologische filters toepassen aan. Selecteer geschikte parameters en hun intensiteiten in de resulterende vervolgkeuzemenu's.
       OPMERKING: De volgorde waarin de parameters zijn geselecteerd, kan van invloed zijn op de uitvoer.
23. Als de grootte, vorm of andere morfologische eigenschappen van de deeltjes kritische factoren zijn, vinkt u het vakje naast Deeltjes voorfilter toepassen aan en selecteert en bewerkt u vervolgens de parameters die nodig zijn.
24. Zodra de deeltjes zijn geïdentificeerd en de geselecteerde vormen/randen acceptabel zijn, navigeert u door de schuifbare voorbeeldlijst met deeltjesafbeeldingen onder de sectie Resultaten . Selecteer een of meer interessante deeltjes door op de bijbehorende deeltjesafbeelding te klikken.
25. Schakel de liveweergave in met de videocameraknop bovenaan het scherm.
26. Schakel over naar het 50x LWD-objectief door op het vergrotingsgetal te klikken en het bijbehorende doel te selecteren in het vervolgkeuzemenu, in de toepassing op het onderste lint.
27. Breng indien nodig het (de) deeltje(s) weer in beeld met de fijnafstellingsknop.
28. Leg afbeeldingen vast van individuele deeltjes die kunnen worden geanalyseerd met Raman-spectroscopie en sla de afbeeldingen op als afzonderlijke bestanden met de juiste namen.
29. Zorg ervoor dat het gewenste gebied van het deeltje dat met Raman-spectroscopie moet worden geanalyseerd, correct onder de locatie van de laserstraal is geplaatst.
30. Zodra het juiste gebied van het deeltje is geselecteerd voor analyse, drukt u op de knop STOP ALL bovenaan het venster om de visualisatie-optiek uit te schakelen.
31. Stel de laser in op 532 nm, op 1% vermogen voor niet-gekleurde deeltjes en op 785 nm of 830 nm voor fluorescerend gekleurde deeltjes.
32. Stel de acquisitietijd in op 10 s en de accumulaties op 5.
33. Selecteer het tabblad Spectra in het menu met gegevenstabbladen en druk vervolgens op de afspeelknop om de Real Time Display (RTD) te starten.
    OPMERKING: Gebruik de informatie die tijdens RTD is verkregen om de instellingen te optimaliseren.
34. Als u tevreden bent met de instellingen en de resultaten, drukt u op STOP ALL om de RTD te stoppen.
35. De uiteindelijke acquisitie kan nu worden verzameld door op de cirkel Spectrum Acquisition-knop naast de RTD-knop te drukken.
36. Sla de verzamelde spectra op als afzonderlijke bestanden met de juiste namen.
37. Herhaal stap 5.28-5.36. voor elk interessant deeltje.
38. Wanneer u klaar bent met het monster, verwijdert u de filterschijf en plaatst u het objectief terug naar de 20X LWD, zowel handmatig op de richtkijker als in de software.
39. Herhaal stap 5.10-5.37 voor nieuwe monster(s).

6. Spectrale identificatie

1. Als er geen aangeschafte of zelfgebouwde Raman-spectrale database beschikbaar is, navigeert u naar de open-source spectroscopiebibliotheek op: https://www.openanalysis.org/openspecy/
   OPMERKING: OpenSpecy is een open-source Raman- en IR-spectroscopiedatabase die 636 spectra bevat uit drie verschillende bibliotheken van 276 polymeren en materialen die van toepassing zijn op het identificeren van milieu-MP's en -vezels²¹. Voor- en nabewerkte spectrale gegevens zijn even levensvatbaar voor gebruik met deze bron.
2. Sla Raman-spectra op als afzonderlijke .csv-bestanden.
   1. Label kolom A als golfgetal gevolgd door de golfnummers van de spectra, en kolom B moet worden gelabeld met Intensiteit gevolgd door de piekintensiteitswaarden per golfgetal.
3. Open de spectra door het .csv bestand naar de bladerbalk linksboven te slepen en neer te zetten.
4. Schakel Voorverwerking en identificatie in.
5. Schakel onder Voorverwerking drempelsignaalruis, Min-Max normaliseren, Afvlakken/afgeleide, Golfgetallen conformeren en Basislijncorrectie in.
   OPMERKING: De specifieke instellingen daarin kunnen worden aangepast afhankelijk van de individuele kenmerken van de spectra die worden geanalyseerd.
6. Selecteer onder Identificatie Raman als het spectrumtype en Afgeleide als de bibliotheektransformatie.
   OPMERKING: Deze bibliotheek kan ook worden gebruikt voor IR-spectroscopie. Het analysevenster toont een wit spectrum, het geüploade spectrum voor analyse, en een rood spectrum, de vermoedelijke identificatieovereenkomst.
7. Met spectra die geen match r > 0,70 of redelijke piekvormcorrelaties opleveren, gebruikt u de top 5 voorgestelde resultaten als een plek om te beginnen met het onderzoeken van mogelijke matches naar voorkeur.
8. Zorg ervoor dat de gemeten piekwaarden binnen ±10 golfgetallen van een overeenkomstige piek in de geselecteerde referentiespectra liggen voordat u een overeenkomst voor die piek bevestigt.
9. Noteer spectrale correlaties, hun correlatiewaarden en de database waaruit de vermoedelijke overeenkomst afkomstig is.
10. Download bestanden op basis van individuele behoeften.

7. Scanning elektronenmicroscopie

OPMERKING: Als de filterschijf niet met metaal is bekleed vóór de SEM-analyse, gaat u verder met sectie 7.2.

1. Metalen coating van monsters voor SEM
   1. Monteer de filterschijf op een stalen SEM-stomp met behulp van carbontape.
   2. Plaats deze in een sputterer en pomp de kamer naar beneden tot 50 mTorr.
   3. Open de sputterende Ar (Argon) isolatieklep.
   4. Ontlucht het systeem door Ar via een naaldklep in de kamer te brengen tot een druk van 300 mTorr en evacueer vervolgens de kamer tot 50 mTorr. Herhaal 3x.
   5. Stel de einddruk in op 100 mTorr via het naaldventiel.
   6. Gebruik een Au-doel om Au op de filterschijf af te zetten door middel van sputteren.
      OPMERKING: Andere doelbronnen (bijv. Pt, Ir, Si, enz.) kunnen ook worden gebruikt in plaats van Au; 20 mA stroom produceert 0,1 Angstroms/s afzetting bij 100 mTorr.
   7. Ontlucht het systeem en verwijder de filterschijf. Houd de filterschijf aan de roestvrijstalen stomp geplakt.
2. SEM-afbeelding vastleggen
   1. Bevestig de stomp met een stelschroef aan de meertraps Zeiss Auriga-houder.
   2. Schakel de SEM en de computers waarop deze wordt uitgevoerd in en laat ze allemaal opstarten.
   3. Open de software die aan de SEM is gekoppeld.
   4. Controleer of het systeem onder vacuüm staat (5e-6 Torr).
   5. Ontlucht de laadvergrendeling door op Vent op het hoofdgedeelte van de laadvergrendelingskamer te drukken en open de laadvergrendeling.
   6. Monteer de meertrapshouder op de insteekmal met tefloncoating en bevestig de overdrachtsarm met behulp van de bijgevoegde schroefplaat.
   7. Sluit de laadvergrendeling en pomp de laadvergrendeling naar beneden door op Opslaan op het hoofdgedeelte van de laadvergrendelingskamer te drukken.
      OPMERKING: De voltooiing vindt plaats wanneer de groene lampjes stoppen met knipperen op de Store-knop .
   8. Laad de meertrapshouder op de tafel in de hoofdobservatiekamer door de overdrachtspoort te openen.
   9. Druk op Transfer op het hoofdgedeelte van de lastvergrendeling. De poort zal vallen en de binnenkamer blootleggen.
   10. Plaats de lastvergrendelingsarm (in de meertrapshouder geschroefd) en bevestig de meertrapshouder op de tafel.
   11. Schroef de transferarm van de lastvergrendeling los en trek de arm volledig in zodat deze in de laadvergrendeling zit.
   12. Sluit de overdrachtspoort door op Transfer te drukken.
   13. Open de isolatieklep door op EHT aan te drukken in de rechterbenedenhoek van de software.
   14. Stel de werkafstand in op 5 mm in de datazone van de software en de versnellingsspanning op 20 kV.
   15. Lokaliseer het membraan van de filterschijf met behulp van de XY - en Z-joysticks.
   16. Breng het podium omhoog met de Z-joystick totdat het beeld scherp wordt.
   17. Corrigeer voor astigmatisme door de XY-stigmatorknoppen en het focuswiel op de middenconsole aan te passen.
   18. Afbeelding samplen deeltjes met de gewenste vergroting door het vergrotingswiel op de middenconsole aan te passen, waardoor beelden met een resolutie van 2.048 x 1.536 worden vastgelegd in 8- of 16-bits TIFF-indeling.
3. Analyse van EDX-deeltjes
   1. Schakel de ChamberScope CCD uit op het bureaublad van de SEM-computer.
      OPMERKING: Als deze stap niet is voltooid, wordt de EDX-detector overweldigd door het signaal en worden er geen gegevens geregistreerd.
   2. Koel de EDX-detector af door de APEX EDX-software op de EDX-computer te openen door de detector in het menu in de rechterbovenhoek in te schakelen.
   3. Leg een SEM-afbeelding met een lage resolutie vast die kan worden gebruikt voor toewijzing door op Afbeelding vastleggen te klikken.
   4. Open het menu Tabblad Toewijzing boven aan het softwarescherm.
   5. Pas onder Instellingen de resolutie (256 x 256) en pixelverblijftijd (0,16 μs) en framenummer (32-64) aan om een geschatte opnametijd te geven die ~5 minuten lang zou moeten zijn.
   6. Klik op Kaart maken in de linkerbovenhoek van het menu.
   7. Selecteer Elementvoorbeeld bevestigen om het zoeken naar elementen handmatig aan te passen of vertrouw op de automatisch geïdentificeerde pieken van de software.
   8. Genereer na voltooiing een rapport met behulp van de AutoReport-functie in de rechterbovenhoek van de kaartsoftware.

Results

Blanco's en achtergrondverontreiniging van het proces
Een acceptabel blanco resultaat is een resultaat dat geen deeltjes bevat of zo weinig deeltjes dat de achtergrondverontreiniging (d.w.z. proces) (indien aanwezig) geen grote kans heeft om de resultaten van het experiment te verwarren of te verstoren. Een suboptimaal blancoresultaat is een resultaat dat veel deeltjes bevat waarvan de deeltjes van belang moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrondvervuiling.

Het aanvaardbare niveau van procesverontreiniging moet op of zo dicht mogelijk bij nul liggen, maar als nul niet kan worden bereikt, is consistentie in het aantal waargenomen achtergronddeeltjes van cruciaal belang. Voer verschillende lege steekproeven uit om de consistentie van de resultaten te bepalen. Zorgvuldigheid in kwaliteitscontroleprotocollen (zie hoofdstuk 1), beperking van verontreiniging en de juiste omgevingsomstandigheden tijdens de verwerking zijn van het grootste belang om lage achtergrondverontreinigingsniveaus te behouden. De resultaten en aanvaardbaarheid van achtergrondverontreiniging kunnen ook sterk afhangen van de afsnijding van de nanomembranen die worden gebruikt en de algehele reinheid van de laboratoriumomstandigheden. Houd er rekening mee dat bij het analyseren van kleinere deeltjes met lagere afgesneden membranen (bijv. < 8 μm), de relatieve overvloed van de interessante deeltjes en achtergrondverontreinigingen van vergelijkbare grootte beide exponentieel zullen toenemen, waardoor hogere niveaus van strengheid in kwaliteitscontrole moeten worden toegepast²². Hoewel elk niveau van verontreiniging niet aanvaardbaar is, kunnen goede analyses van microplastics in het milieu of interessante analyses worden uitgevoerd, zolang de omstandigheden streng worden gecontroleerd en een hoge mate van consistentie wordt bereikt.

Monster filtratie
Een ideale monsterfiltratie is nodig om een getrouwe multimodale analyse te genereren, zoals weergegeven met de voorbeeldgegevenscascade in figuur 3. Een dergelijke monsterfiltratie zal resulteren in goed verspreide deeltjes over het nanomembraanoppervlak (bijv. met ongeveer een derde van de dekking van het membraanoppervlak). Slecht verspreide deeltjes, zoals het geval is bij deeltjesaggregatie (grote klonten overlappende deeltjes), zullen zowel handmatige als geautomatiseerde deeltjestelmethoden verwarren, omdat overlappende deeltjes niet gemakkelijk met zekerheid kunnen worden onderscheiden. Dergelijke gegevens worden meestal uitgesloten van analyse, wat kan leiden tot het verlies van waardevolle informatie die van belang is. Goed verspreide deeltjes, zoals weergegeven in figuur 4A,B, zorgen ervoor dat spectroscopische of kwantificeringsanalyses niet worden bemoeilijkt door gestapelde of overlappende deeltjes van verschillende samenstellingen, die resultaten zouden kunnen opleveren die moeilijker nauwkeurig te interpreteren, te identificeren en te kwantificeren zijn.

Nijlrood en trypanblauw kleuring
Representatieve beelden van optimale kleuring van fluorescerende deeltjes worden getoond in figuur 3B op een 20 μm afgesneden SiN-filterschijf. Onderspoeling van de NR- of TB-vlek van het nanomembraanoppervlak kan vals-positieve resultaten opleveren. Resterende deeltjes die bestaan uit vlekken die op het oppervlak van het membraan zijn vastgehouden als gevolg van onvoldoende spoelen, kunnen ten onrechte worden geïnterpreteerd als gekleurde deeltjes. Een teken dat er onvoldoende spoeling is opgetreden, is als delen van het nanomembraan zonder deeltjes of detecteerbare restfilms/residuen van het gefilterde monster tijdens de waarneming fluoresceren, zoals weergegeven in figuur 5A. Na beeldvorming, zolang de filterschijf in schone omstandigheden werd gehouden, kan een nieuwe spoeling worden uitgevoerd door de individuele nanomembraanfilterschijf terug op het vacuümfiltratieapparaat (minus de pakkingen) te plaatsen, het vacuüm aan te zetten en nog een volume Ultrapure 99% IPA (voor NR) of Ultrapuur water (voor TB) op het nanomembraan van de filterschijf te filteren. Noteer het totale volume van de gebruikte extra spoelmedia. Voor de beste resultaten maakt u microscopiebeelden van het gehele nanomembraanoppervlak voordat u opnieuw spoelt om rekening te houden met eventuele verontreiniging die mogelijk is opgelopen door de stap van het opnieuw spoelen.

Raman-spectroscopie
Raman-spectroscopie uitgevoerd op niet-gecoat SiN kan een prominente piek produceren, afhankelijk van de lasergolflengte, en deze piek kan signalen met een lage abundantie maskeren ongeveer binnen het golfgetalgebied van 520 ^{cm-1 23}. Als de Raman-spectra die van belang zijn voldoende gescheiden zijn van de achtergrondpiek van silicium of siliciumnitride, zou het gebruik van niet-gecoate SiN-filterschijven voldoende Raman-spectroscopieresultaten moeten opleveren. In dit rapport gebruikten Pipelines B en C beide Au-SiN-filterschijven. De gouden coating van Au-SiN maskeert de inherente Si-piek, waardoor spectra met een lage abundantie betrouwbaarder kunnen worden verzameld in de buurt van of bij 520 ^cm-1 golfgetallen. Bovendien kan Au-SiN worden gebruikt met IR-spectroscopie als Raman niet beschikbaar is. Begin altijd met de laagste vermogensinstellingen (dwz laserintensiteit) op het instrument en verhoog deze dan geleidelijk, aangezien sommige interessante deeltjes kwetsbaar kunnen zijn, zoals geoxideerde deeltjes, en door de laser kunnen worden beschadigd of vernietigd.

Bij het analyseren van gekozen deeltjes met Raman-spectroscopie is het bepalen van de betrouwbaarheid van een geretourneerd spectrum cruciaal. Sommige deeltjes kunnen automatisch fluoresceren, en deze fluorescentie zal ruis toevoegen aan de spectrale meting die de interpretatie van deeltjessignalen kan maskeren of bemoeilijken. Deze ruis zal de vorm aannemen van een band met hoge intensiteit die een breed scala aan golfgetallen omvat, waarbij de onderliggende gegevens worden samengevoegd. De juiste spectra, gedemonstreerd in Figuur 3C en Figuur 4C,D, zullen zelfs vóór de basislijncorrectie duidelijk gedefinieerde pieken hebben over kortere reeksen van golfgetallen. Als er geen pieken ontstaan die minstens drie keer groter zijn dan een van de omringende signalen, dan is het waarschijnlijk dat de verzamelde spectra ofwel achtergrondruis zijn, ofwel dat er andere instrumentinstellingen nodig zijn om het deeltje in kwestie te analyseren. Zorg ervoor dat voor elk monster de juiste lasergolflengte is geselecteerd. Lasers met een lagere golflengte, zoals een laser van 532 nm, kunnen het signaal dat door fluorescentie wordt gegenereerd niet voldoende aan. Een laser met een hogere golflengte, zoals een laser van 782 nm of 830 nm, kan voldoende van de fluorescentie negeren om een spectrum terug te geven. Afhankelijk van het type monster zijn verschillende lasers geschikt voor verschillende deeltjestypen en kunnen ze, indien mogelijk, worden uitgewisseld tijdens het verzamelen van gegevens op een enkele filterschijf.

Om de samenstelling van deeltjes te bepalen, worden hun verzamelde spectra vergeleken met die in een referentiespectradatabase. Betrouwbare identificatie van een bepaald deeltjesspectra levert een Pearson-coëfficiënt (r) op van meer dan 70% (r > 0,70). Suboptimale Raman-gegevens worden weergegeven in figuur 5B, waar < 0,70 zijn. MP-identificatieresultaten zijn nuttig bij het bepalen van potentiële bronnen van MP-vervuiling. Om de resultaten van deeltjesidentificatie weer te geven, kunnen een afbeelding en spectra van het geanalyseerde deeltje worden weergegeven zoals in Figuur 3C en Figuur 4C.

Scanning elektronenmicroscopie
Zowel SiN- als Au-SiN-filterschijven zijn compatibel met SEM onmiddellijk na het afvangen van deeltjes door filtratie. Als de SiN-filterschijven niet zijn gecoat met Au of Pt voorafgaand aan SEM en na het opvangen van deeltjes, kunnen sommige deeltjes gemakkelijker worden "opgeladen" door de ionisatiestraal van de SEM, waardoor het deeltje kan gloeien of erg helder kan lijken in afbeeldingen. Deze helderheid/gloeiing kan problemen veroorzaken met de visualisatie als gevolg van een slecht contrast, zoals het maskeren van de morfologie van het deeltje. Om te verzachten, voert u optische/fluorescentiemicroscopie en Raman-spectroscopie uit vóór SEM om moeilijk te analyseren of kleine deeltjes die van belang zijn te markeren voor latere SEM/EDX-analyse, bedek vervolgens het nanomembraan met Au of Pt zoals beschreven in protocolsectie 7 en voer SEM/EDX uit.

Het coaten van SiN of Au-SiN met Au of Pt na het afvangen van deeltjes en voorafgaand aan SEM-analyse helpt bij het voorkomen van dit oplaadeffect tijdens beeldvorming, omdat deeltjes nu niet langer gevoelig zijn voor ionisatie onder de afgezette metaallaag. Deze coating verbetert het contrast en de resolutie, zodat een beter morfologisch begrip van een bepaald deeltje kan worden verkregen, zoals te zien is in Figuur 3D (vezel versus fragment) of oppervlaktemorfologieën, zoals putjes en kloven op geoxideerde deeltjes. Metaalcoating van deeltjes voorafgaand aan SEM-analyse zal permanent voorkomen dat ze verder worden geanalyseerd met spectroscopie of fluorescentiebeeldvorming, waardoor alleen SEM/EDX-analyses nog mogelijk zijn. Het coaten van de deeltjes en het uitvoeren van SEM/EDX zouden dus de laatste stappen in elk proces moeten zijn, indien bedoeld.

EDX-metingen kunnen zowel voor als na het coaten van het metaal worden uitgevoerd op afgevangen deeltjes. EDX kan de specifieke elementaire samenstelling van een bepaald deeltje of gebied onthullen, die goed samengaat met deeltjes die kleiner zijn dan de detectielimiet voor Raman-analyse, of elementaire samenstellingen die moeilijk te analyseren zijn met bepaalde Raman-lasergolflengten zoals metaal, legeringen, met water verzadigde deeltjes en deeltjes die sterk fluoresceren wanneer ze worden blootgesteld aan de Raman-laserstraal(s) die beschikbaar zijn voor gebruik. In deze studie werden de deeltjes bedekt met een 6 nm dikke laag Au. SEM-beeldvorming werd gedaan met een vergroting van 200x-3.000x met een straalvermogen van 20 kV en een brandpuntsafstand van 5 mm. Respectieve SEM-beelden van geselecteerde deeltjes worden weergegeven in figuur 3D.

Representatieve EDX-resultaten worden weergegeven in figuur 3F. Gedetecteerde elementen met een gewichtspercentage van minder dan 1% kunnen als sporen of onbetrouwbaar worden beschouwd, afhankelijk van de gevoeligheid van het instrument; Daarom stellen we een drempel op 1%. Als geselecteerde deeltjes voor EDX-analyse zijn gecoat, zal een detecteerbare hoeveelheid van de coating aanwezig zijn in het elementaire gegevensrapport. Bij gebruik van ongecoate SiN-filterschijven worden Si- en N-signalen waargenomen, zoals weergegeven in figuur 3F. De meeste synthetische polymeerdeeltjes bevatten helaas ook de elementen C, H en O, aangezien de meeste niet-synthetische deeltjes uit biologische bronnen ook van dezelfde elementen zijn gemaakt, maar niet-synthetische deeltjes kunnen ook elementen zoals S bevatten, zoals in het geval van eiwitten. Deze gelijkenis in samenstelling is de reden waarom de tegenkleuringsmethode met Nijlrood en Trypanblauw nuttig is om onderscheid te maken tussen synthetische versus niet-synthetische deeltjes, maar geen uitputtend identificatiehulpmiddel is, aangezien Nijlrood in bepaalde gevallen ook in staat is om niet-synthetische deeltjes te kleuren. Aanvullende analyseparameters zoals hierboven voorgesteld, moeten worden gebruikt in combinatie met eventuele kleuringsprocedures om de resultaten te bevestigen. Bovendien kan EDX een nuttig hulpmiddel zijn voor het identificeren van deeltjes die buiten de detectielimiet voor Raman-spectroscopie vallen (d.w.z. nanoplastics van < 1 μm).

Figuur 1: SNAP-pijpleidingen. (A) Schema's van SNAP-pijpleidingen, waarbij dezelfde deeltjes op hetzelfde nanomembraan worden gekarakteriseerd via een reeks verschillende analytische technieken. Pijpleiding A) demonstreert 1) Gevangen deeltjes van belang uit drinkwatermonsters via vacuümfiltratie zijn 2) gekleurd met Nijlrood en Trypanblauw voor differentiatie van respectievelijk synthetische versus niet-synthetische polymere deeltjes, gevolgd door 3) deeltjesidentificatie via Raman-spectroscopie, en 4) SEM/EDX om deeltjesmorfologie en elementaire identificatie te karakteriseren. Pijpleiding B) demonstreert 1) Deeltjesvangst op Au-SiN gevolgd door 2) Raman-spectroscopie. Pijpleiding C) demonstreert 1) Deeltjesafvang op Au-SiN gevolgd door SEM/EDX. (B) Schema van de filterschijf en siliconenpakking in de filtratieopstelling in het vacuümapparaat, met weergave van de sequentiële filtratie door een 20 μm MPSN, vervolgens 8,0 μm MSSN nanomembraan, gescheiden door siliconen pakkingen. Afkortingen: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = scanning-elektronenmicroscopie; EDX = energiedispersieve röntgenspectroscopie; MPSN = microporeus siliciumnitride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Bronnen voor het verzamelen van drinkwatermonsters. Een regionale kaart gepubliceerd door de Monroe County Water Authority met de locaties waar elk van de vier drinkwatermonsters werd verzameld in de regio Greater Rochester, NY. Monsters zijn afkomstig van verschillende oppervlaktewaterbronnen: Lake Ontario (blauw), Hemlock Lake (groen), zowel Hemlock Lake als Lake Ontario (geel) en Canandaigua Lake (paars). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Samenvatting van analyses van SNAP Pipeline A uitgevoerd op deeltjes die zijn afgevangen uit drinkwatermonsters. (A) Grijswaardenbeeld van opgevangen deeltjes van één representatief drinkwatermonster op een SiN van 20 μm. (B) Vals gekleurd overlay-beeld van tegengekleurde deeltjes om Nijlrood (vals gekleurde rode deeltjes) en Trypan Blue (vals gekleurde blauwe deeltjes) weer te geven. (C) Referentie (rood) en verzamelde (witte) Raman-spectra die een Nijlrood gekleurd deeltje identificeren als polyethyleen met Pearson's r-waarde van 0,97, met een representatief beeld van het geanalyseerde deeltje. (D) Elektronenmicrofoto van twee verschillende deeltjestypen die deeltjesmorfologieanalyse van een vezel (bovenpaneel) en fragment (onderpaneel) demonstreert, beide die de Trypan Blue-kleuring opnemen. (E) Kwantificering van met Nijlrood gekleurde deeltjes die achtereenvolgens zijn vastgelegd op zowel 20 μm als 8 μm afgesneden nanomembranen. (F) Samengevatte EDX-elementaire analyse van een willekeurig geselecteerd fragment en analytische details van de resultaten met een representatief SEM-beeld van het geanalyseerde deeltje. Afkortingen: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = scanning-elektronenmicroscopie; EDX = energiedispersieve röntgenspectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Samenvatting van analyses van SNAP Pipeline B uitgevoerd op deeltjes die zijn opgevangen uit drinkwatermonsters. Raman spectrale analyse van drie gerandomiseerde deeltjes uit vier huishoudelijke drinkwatermonsters vastgelegd op 20 μm MPSN en 8,0 μm MSSN Au-SiN filterschijven. Representatieve donkerveldbeelden van het totale actieve membraanoppervlak voor de 20 μm en 8 μm Au-SiN worden respectievelijk weergegeven in A en B. Deeltjes worden geel weergegeven in deze beeldvormingsmodus, terwijl de achtergrond donker blijft, waardoor het gemakkelijk is om deeltjes automatisch te tellen. Representatieve Raman-spectra van synthetische en niet-synthetische deeltjes op (C) 20 μm en (D) 8,0 μm Au-SiN. Het totale aantal deeltjes voor (E) 20 μm en (F) 8,0 μm Au-SiN wordt gebind op basis van groottebereiken die worden bepaald door de geautomatiseerde software voor het vinden van deeltjes. Afkortingen: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = scanning-elektronenmicroscopie; EDX = energiedispersieve röntgenspectroscopie; MPSN = microporeus siliciumnitride; MSSN = microspleet Siliciumnitride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Suboptimale fluorescentiebeeldvorming en Raman-spectroscopie resultaten. (A) Een suboptimaal fluorescentiebeeld van gekleurde deeltjes (linkerpaneel), waarbij het membraan de Nijlrode vlek vasthield, waarschijnlijk door onderspoeling. Twee deeltjes, een Trypan Blue-gekleurd vezel en een Nijl Red-gekleurd fragment (rechterpaneel), werden geselecteerd voor Raman-spectroscopie. (B) Suboptimale Raman-spectroscopieresultaten wanneer de coëfficiënt van Pearson (r) minder dan 70 % (r < 0,70) bedraagt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: Eigenschappen van silicium nanomembranen in filterschijven. In deze tabel zijn de eigenschappen van de membranen in de SiN-filterschijven weergegeven, waaronder de minimale poriegrootte, het percentage porositeit, de dikte van de membranen met en zonder Au-coating, het actieve gebied van het membraan en de gasdoorlaatbaarheid door het membraan met positieve druk uitgeoefend bij een ingestelde constante druk. Afsnijding (d.w.z. poriegrootte), porositeit, dikte en membraanoppervlak bepaald door het meten van kenmerken op SEM-beelden. De gegevens over de gaspermeentie worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 10) voor N 2 positieve druk uitgeoefend bij 103,42 kPa. Afkortingen: Au = Goud; Si_x N_y = Niet-stoichiometrisch siliciumnitride. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S2: ParticleFinder-deeltjestellingen en parameters. Van elk monster werden beeldmozaïeken van het hele membraangebied genomen en elk beeldmozaïek werd geanalyseerd om het totale aantal deeltjes te verzamelen. In deze tabel worden de parameters weergegeven die worden gebruikt en in welke volgorde het totale aantal deeltjes voor elk voorbeeldbeeld moet worden bepaald, en het aantal deeltjes bij een gegeven groottefracties. Parameters variëren van monster tot monster, afhankelijk van het type, de hoeveelheid en de vorm van deeltjes, evenals de specifieke reflectiviteit van elk membraan tijdens de beeldvorming. De gegevens uit deze tabel zijn gevisualiseerd in figuur 4. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De beperking van de vervuiling door microplastics is een groeiend onderwerp van zorg; En de eerste stap van mitigatie is het identificeren van de aanwezigheid van besmetting. Een gestroomlijnde methode voor het vastleggen en onmiddellijk analyseren is cruciaal om onderzoekers tijd te besparen en gevoelige steekproefstatistieken te behouden. Dit rapport beschrijft flexibele workflows op basis van variaties van onze ontwikkelde SNAP-methoden voor de analyse van dergelijke MP's in vloeibare monsters, waarbij gebruik wordt gemaakt van een enkel substraat voor alle uitgevoerde analyses. Het monster moet vacuüm worden gefilterd, zodat de deeltjes worden opgevangen en geïsoleerd op een siliciumnanomembraan dat zich in een filterschijf bevindt. Voldoende beperking van achtergrondverontreiniging is van cruciaal belang voor zinvolle resultaten. Eventuele verontreinigende deeltjes op de doseerspuit of glazen vacuümtrechter tijdens filtratie kunnen het monster verontreinigen en tegelijkertijd worden opgevangen, dus het zorgvuldig volgen van de kwaliteitscontroleprotocollen van sectie 1 is van cruciaal belang voor nauwkeurige resultaten. Controles met alleen media worden aanbevolen om onderzoekers te informeren over achtergrondverontreiniging die specifiek is voor individuele processen en laboratoriumomstandigheden. Het hierin beschreven protocol is gebaseerd op vacuümfiltratie van een vloeistofmonster en het opvangen en isoleren van deeltjes uit het monster op twee verschillende afgesneden SiN-filterschijven. Voor alle pijpleidingen geldt dat het vastleggen en isoleren van deeltjes voorafgaat aan andere methoden, maar alle andere identificatiemethoden kunnen worden uitgevoerd in de volgorde die het meest geschikt is voor de onderzoeker.

Voor dit onderzoek werden twee fluorescerende microscopen gebruikt om de herhaalbaarheid van de resultaten in verschillende instrumenten aan te tonen. Instructiestappen beschrijven specifiek het gebruik van een Olympus BX61 voor fluorescentiemicroscopie vanwege het overwicht van het gebruik ervan en werden bediend volgens de instructies van het instrument met behulp van helderveld voor grijswaardenbeeldvorming, TRITC-kanaal (bijv. ~543 nm; Em. ~593 nm) voor beeldvorming van NR-gekleurde deeltjes en Cy5-kanaal (bijv. ~649 nm; Em. ~667 nm) voor beeldvorming van met TB gekleurde deeltjes, indien van toepassing. Om de resultaten van de kleuring weer te geven, raden we aan om een overlay van de kanaalafbeeldingen te construeren (we gebruiken FIJI/ImageJ voor beeldverwerking, later het beeldanalyseplatform genoemd), met een resolutie van 2.048 x 2.040 pixels en een diepte van 16 bits. Afbeeldingen van het hele nanomembraan kunnen worden weergegeven zoals in Figuur 4A,B of als geselecteerde interessegebieden zoals weergegeven in Figuur 3A,B.

Nijlrood wordt vaak gebruikt om synthetische polymeer MP's te kleuren, maar kan niet-synthetische polymeren uit biologische bronnen kleuren vanwege de lipofiele en hydrofobe aard ervan, waardoor mogelijk valse positieven worden geïntroduceerd die de MP-kwantificeringsresultaten vervormen 24,25,26. Een tegenkleuringsstap van Trypan Blue, zoals beschreven in protocolsectie 3, wordt aanbevolen om te helpen bij het differentiëren van vals-positieve voorvallen, maar is geen uitputtende oplossing en moet worden gecombineerd met aanvullende analysemetrieken om de resultaten te bevestigen. Nijlrode fluorescentie van deeltjes is een punt van zorg bij Raman-spectroscopie-analyse, omdat het het achtergrondsignaal aanzienlijk kan verhogen. In deze studie hebben we echter polymeren gekleurd met Nijlrood en Trypanblauw voorafgaand aan Raman-spectroscopie met een laser van 830 nm, en er werd weinig ruis waargenomen, zoals weergegeven in figuur 3.

Sommige golflengten van lasers die geschikt zijn voor Raman-spectroscopie zijn niet in staat om fluorescentie van gekleurde deeltjes te negeren, zoals een laser van 532 nm, en kunnen daarom aanzienlijke problemen opleveren bij het correct schatten van de samenstelling van het deeltje van belang. Metaalcoating van de deeltjes na het vastleggen is nuttig voor het verbeteren van het contrast tijdens SEM-beeldvorming, maar is onverenigbaar met latere spectroscopische of fluorescerende analyse. Noteer alle gewenste metingen voorafgaand aan de experimentele opstelling om er zeker van te zijn dat er goed rekening wordt gehouden met de processtroom en coatingtypes. De Au-SiN-filterschijven kunnen worden gebruikt voor alle genoemde analyses waarbij transmissiemicroscopie niet cruciaal is voor de workflow, of wanneer Raman- of IR-spectroscopie wordt gebruikt.

De hier getoonde methoden, evenals de nanomembranen die worden gebruikt om interessante deeltjes vast te leggen en te isoleren, kunnen worden aangepast aan de behoeften van individuele onderzoekers. De nanomembranen zijn geschikt voor een aantal spectroscopische analyses en de onderzoeker kan de gefilterde media verwisselen voor een ander interessant monstermedium, inclusief maar niet beperkt tot verteerde dierlijke weefsels²⁷, injecteerbare geneesmiddelen en oliemonsters. Voor deze studie werden twee Raman-spectroscopie-instrumenten gebruikt, en de instructiestappen beschrijven specifiek het gebruik van een Horiba XploRA Plus Raman-instrument, dat alle gegevens verzamelde en verwerkte die in figuur 4 worden weergegeven. Het is ook belangrijk om de detectielimiet voor elke Raman-microscoop te erkennen, om ervoor te zorgen dat de interessante deeltjes op de juiste manier kunnen worden geanalyseerd met de spotgrootte van de lasers van het instrument. Om de resultaten van deeltjesidentificatie met Raman weer te geven, kunnen de referentie- en monsterspectra, plus een afbeelding van het geanalyseerde deeltje, worden weergegeven zoals in Figuur 3C en Figuur 4C.

Protocol sectie 6 bevat gedetailleerde instructies voor deeltjesidentificatie met behulp van een open-source spectrale bibliotheek. De vlakke opvang van deeltjes op een uniform vlak membraan, evenals de regelmatige reeks poriën van het membraan, maakt voorspelbare, geautomatiseerde beeldvorming mogelijk. Zowel de 400 nm of 1.000 nm diktes van het SiN als hun siliciumnitridesamenstelling geven ze een uitstekende optische transparantie, maar kunnen ook een intense siliciumpiek opleveren in sommige spectroscopische instrumentparameters. Voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van kale, niet-metalen gecoate SiN met Raman-analyse. De Si-piek kan functioneren als een kalibratiesignaal, maar de intensiteit van de piek kan ook de signalen van spectra met een lagere intensiteit maskeren in hetzelfde golfgetalgebied als het signaal van de Si. Dergelijke Si-pieken werden niet waargenomen bij gebruik van de 830 nm-laser in dit onderzoek.

De ultradunne aard van het SiN (400 nm of 1.000 nm dik) en Au-SiN (520 nm of 1.120 nm dik) dat hier wordt gebruikt, schonk ze hun uitstekende filtratie-, optische en spectroscopische eigenschappen. Deze membranen moeten echter worden beschermd tegen fysieke schade, zoals door een te hoog drukverschil (d.w.z. ≥-206 kPa), directe aanraking met een pincet of vingers, of door onjuiste plaatsing van de pakking. De filterschijf waarin de membranen zijn ondergebracht, beschermt ze en zorgt voor gebruiksgemak bij normaal gebruik. Raak bij het manipuleren van de filterschijven alleen de zwarte buitenring aan en nooit het actieve membraangebied. Hoewel hier niet kwantitatief gerapporteerd, verkort het verzamelen van gevangen deeltjes op een kleine hoeveelheid membraanoppervlak (respectievelijk 3 x 3 mm voor 20 μm en 3 x 0,7 x 3 mm voor 8,0 μm afgesneden membranen) mogelijk de totale analysetijd van het monster, door de tijd te verkorten die nodig is om interessante deeltjes te vinden en te analyseren. Deze "concentratiefactor" is het waard om in de toekomst te worden onderzocht en kan een uniek voordeel van SiN-filterschijven bieden voor onderzoekers. In combinatie met hun hogere oppervlakte-genormaliseerde stroomsnelheden versus andere veelgebruikte membranen voor MP-karakterisering¹⁵, kunnen geautomatiseerde deeltjesbeeldvormingsroutines die slechts een relatief kleiner gebied van uniform vlak en scherp SiN in beeld hoeven te brengen, de totale analysetijden verder verkorten. Eventuele voordelen met betrekking tot de veronderstelde concentratiefactor moeten echter nog empirisch worden aangetoond door de totale verwerkingstijden (van filtratie tot beeldanalyse) op conventionele en SiN-filterschijven te vergelijken.

We hebben het nut van de SNAP-variaties op lokale kraanwatermonsters heuristisch aangetoond. Het hier beschreven protocol richt zich op het opvangen van MP's uit drinkwaterbronnen rond Rochester, NY. De monsterafname verliep als volgt: voor elke monsterafname werd minimaal één liter water door de kraan gehaald voordat de afname begon. Nieuwe, verzegelde polypropyleen flessen werden naar de lopende kraan gebracht en direct voor het ophalen geopend. Flessen werden niet gespoeld met drinkwater voordat de inzameling plaatsvond. Elk monster bestond uit twee flessen van 500 ml die direct na elkaar werden verzameld. Elk watermonster was afkomstig van het leidingsysteem van een afzonderlijk huishouden en het leidingmateriaal was niet consistent tijdens de bemonstering. Variabelen zoals de hoeveelheid recent watergebruik, het tijdstip van verzameling, de ouderdom van de leidingen en de leeftijd van het huis waar de steekproef vandaan kwam, konden in dit onderzoek niet worden gecontroleerd. Dit was geen gevalideerd protocol voor het afnemen van monsters. Elke onderzoeker moet zijn eigen verzamelingsprocedures ontwikkelen en valideren. Omwille van de volledige openbaarmaking van de methoden is de bovenstaande beschrijving echter opgenomen. De filterschijven maken herhaalde analyse op hetzelfde substraat mogelijk voor een aantal analytische methoden. Er zijn geen subsampling of meerdere samples nodig buiten de standaard proefreplicaten. Het elimineren van de noodzaak van subsampling en meerdere steekproeven verhoogt het vertrouwen in het vastleggen van informatie over doelen met een lage abundantie. Naast het mogelijk maken van multimodale analysemethoden, bieden de SiN-filterschijven een duidelijk voordeel ten opzichte van andere analoge filtratiemedia vanwege de tijdbesparende kwaliteit van een snellere filtratiesnelheid per oppervlakte-eenheid¹⁵.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass beaker	Pyrex	1000-1L
1 L Glass vacuum collection flask	Millipore Sigma	Z290459-1EA
100% cotton lab coat	Landau	LA-3172
100 mL glass filtration funnel	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99% isopropyl alcohol	Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX		EDX software used to perform EDX analysis on captured particles.
Denton Prep Sputtering System	Denton Vacuum	DESK II : 293618089	Gold coating system
FIJI, image analysis platform	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI is just ImageJ) - a distribution of ImageJ
Glass screw-cap bottle	Corning	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	Horiba Scientific		Horiba Raman software containing ParticleFinder and ViewSharp
Laminar flow hood	Air Science	VLF-72A
Microscope	Olympus  / Nikon	BX61 / Ti2e	Any microscope with suitable fluorescence can be utilized for optical microscopy.
MPSN SiN filters	SiMPore Inc.	FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Monoject 60 mL syringes	Coviden	8881560265
Nile Red powder	TCI	N0659
Nitrile Gloves	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		Open source, spectral library
Oven	VWR	1310	Gravity Convection Utility Oven
P20 Pipette	Brandtech	705872
Pipette tip	Premium Vials	GS 151140R
Pourous support frit	Advantec	311000	Part of bundle
Raman instrument	Horiba	Xplora PLUS
Rubber stopper	Advantec	311000	Part of bundle
SEM instrument	Ziess	Auriga	Auriga Series, Modular Crossbeam workstation
Silicone gaskets	SiMPore	GASKET-25-R	Clear-cast PDMS gaskets, 0.8 mm thick
Silicone Roller	Sanyue	(ASIN: B07XDTNPS3)	Silicone roller -  8 x 5 x 2 inches
SmartSEM	Zeiss	V8	SEM software used to operate the Zeiss Auriga
Spray bottle	Uline	S-7273
Syringe filters	Thermo Scientific	CH2225-PES	0.22 µm luer lock syringe filters, 25 mm
Syringe pump	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	Optional, but reccomended
Trypan Blue - 0.4%	Millipore Sigma	T8154-20ML
Tweezers	SiMPore	K6TWZR
Vacuum pump	Welch	847-676-8800
Vacuum tubing	Grainger	ZUSA-HT-4037