Methodenartikel

Gevalideerde immunochemische test voor uitgebreide bepaling van de humane epidermale groeifactorreceptor 2 die vrijkomt uit en gebonden is aan cellen

DOI:

10.3791/68204

⸱

9 mei 2025

 ,  ,  , 
1SDS Optic S.A.

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een gevalideerde sandwich-ELISA-test met behulp van nieuwe anti-HER2 monoklonale antilichamen. Deze test maakt een nauwkeurige kwantificering mogelijk van celgebonden en vrijgegeven HER2-eiwit uit in vitro gekweekte cellen en andere monsters, waaronder bloed en weefsels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2) is een gevestigde kankermarker. Het werd een zeer succesvol diagnostisch en therapeutisch doelwit, vooral bij borstkanker en andere kankertypes die HER2 tot expressie brengen. In de kliniek worden de gouden standaard immunohistochemische diagnostische methoden die gebruik maken van de specifieke anti-HER2-antilichamen gebruikt om het expressieniveau van de membraangebonden receptor te meten. Het oplosbare extracellulaire domein (ECD) van HER2 dat vrijkomt uit de cellen met overexpressie circuleert in het bloed en kan de weefselexpressie van de receptor weerspiegelen. Er is behoefte aan nauwkeurige en gevalideerde testen om de concentratie van het circulerende HER2-eiwit te correleren met klinische manifestaties van de ziekte.

Ons team heeft de nieuwe sandwich-enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) ontwikkeld en gevalideerd voor kwantificering van het membraangebonden en het uit cellen vrijgekomen ECD-domein van HER2. De test maakt gebruik van twee unieke monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor HER2 die eerder zijn ontwikkeld. Het kwantificeringsbereik omvat de HER2-concentratie van 1,56-100 ng/ml, die wordt verwacht voor in vitro gekweekte kankercellen en een gevoeligheid vertoont op het niveau van 0,5 ng/ml. De bevredigende precisie en nauwkeurigheid van de methode binnen en tussen de tests maken deze toepasbaar voor HER2-kwantificering in verschillende soorten biologische monsters, waaronder celkweekmedium, serum en vast tumorweefsel. Hier richten we ons op de uitgebreide bepaling van de receptor-geassocieerde en uitgescheiden door de in vitro gekweekte kankercellen. Het artikel presenteert een stapsgewijs protocol voor de kwantificering van HER2-eiwit dat kan worden gebruikt voor het testen van een verscheidenheid aan cellijnen, bloed en weefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van moderne therapieën heeft vaak betrekking op precisiegeneeskunde die gebaseerd is op nauwkeurige identificatie van therapiegevoelige patiënten1. Onder deze therapieën bevinden zich de anti-HER2-geneesmiddelen die gericht zijn op de receptor die tot overexpressie wordt gebracht op een verscheidenheid aan tumoren, waaronder borst, endometrium, maag, longen en andere. Er zijn verschillende HER2-gerichte middelen beschikbaar met bevestigde voordelen bij patiënten met HER2-positieve kankers, waaronder HER2-laag type2. Bevestiging van de HER2-positieve status is van cruciaal belang voor de identificatie van de potentieel reagerende patiënten; het blijft echter een uitdaging, vooral in de HER2-low groep.

De gouden standaardmethoden in klinische omgevingen, die routinematig worden gebruikt voor HER2-testen, omvatten immunohistochemie (IHC) eiwitexpressie en HER2-genamplificatie door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) -benaderingen. Bovendien wordt de Oncotype DX-assay gebruikt voor HER2-mRNA-expressie. Weefselbiopsie die voor deze methoden nodig is, maakt het onzeker of de patiënt in aanmerking komt voor de juiste behandeling en of hij mogelijk op therapieën kan reageren. Ondanks de bijgewerkte richtlijnen van 2018 door de American Society of Clinical Oncology (ASCO) en het College of American Pathologists (CAP) om de variabiliteit tussen de testeenheden te verminderen, blijft HER2-concordantie een onderwerp voor verbetering3.

HER2 is een proto-oncogen lid van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR)-familie die overexpressie en activering in de pathologische toestanden resulteert in een agressief resultaat of bijdraagt aan een slechte prognose4. HER2 is een modulair eiwit van 185 kDa verankerd in het celmembraan dat een cytoplasmatisch tyrosinekinase en een extracellulair domein (ECD) bevat. De HER2 ECD kan uit cellen worden afgestoten om te worden vrijgegeven in de extracellulaire matrix5 als het celvrije eiwit, dat verder in het bloed circuleert. Verhoogde HER2-expressie kan worden weerspiegeld door het hogere niveau van de circulerende ECD, met een waardevolle voorspellende en prognostische marker 6,7, een surrogaatmarker van de behandelingsrespons8, of als een aanvullende methode voor IHC om patiënten te identificeren die in aanmerking komen voor anti-HER2-behandeling9. De uitdaging blijft echter om de correlatie vast te stellen tussen de tumor HER2-expressie en het systemische niveau van de receptor in het bloed dat een klinische betekenis zou kunnen hebben.

De vrijgekomen HER2 ECD kan worden gekwantificeerd met behulp van Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)10. De sandwich-ELISA is een benadering die gebruik maakt van twee specifieke antilichamen die verschillende epitopen aan hetzelfde doelwitantigeen binden. Het maakt een nauwkeurige meting mogelijk van oplosbare eiwitten in het gemakkelijk toegankelijke biologische materiaal op basis van bloed en vloeistof (de zogenaamde vloeibare biopsie). Ondanks de aanwezigheid van door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde testen, is er controverse over het nut van de HER2 ECD-diagnostiek5 en de afkapwaarde voor een verhoogd HER2-gehalte in het bloed. Meer onderzoek met de gevalideerde methoden en uniform geaccepteerde drempels is nodig om de toepasbaarheid van de assayste bevestigen 11.

De kritische componenten van elke ELISA zijn het vastleggen (geïmmobiliseerd op de plaat en het definiëren van de testspecificiteit en gevoeligheid) en het detecteren van antilichamen (toegevoegd nadat de monsters zijn aangebracht) antilichamen (Figuur 1). In dit rapport presenteren we het ELISA-protocol op basis van de recent ontwikkelde nieuwe anti-HER2 ECD monoklonale antilichamen (mAb) die werden gegenereerd, gezuiverd op een affiniteitskolom en grondig gekarakteriseerd, en unieke sequenties presenteren12. De ontwikkelde ELISA, die gebruik maakt van deze aangepaste antilichamen, toont zijn nut aan voor een nauwkeurige kwantificering van het HER2-eiwit dat is geassocieerd met het celmembraan en wordt vrijgegeven in een kweekmedium voor een uitgebreide beoordeling van de receptorstatus. De test kan worden gebruikt in preklinische tests en ter ondersteuning van lopend onderzoek. De prestaties van de test zijn verder getest op biologische monsters van verschillende oorsprong, waaronder serum- en weefselhomogenaten12, om potentieel aan te tonen voor de ontwikkeling van onderzoek, diagnostiek en nieuwe anti-HER2-behandelingen in de toekomst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kweek van menselijke kankercellen

  1. Cultuur MDA-MB-231, SK-BR-3 en SK-OV-3 lijnen in Dulbecco's Modified Eagle's medium met 4,5 g/L ᴅ-glucose (DMEM-HG), aangevuld met 2 mM ʟ-glutamine en 10% (v/v) door warmte geïnactiveerde FBS. Incubeer culturen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
  2. Wanneer de cultuur ~80% samenvloeiing bereikt, maakt u cellen los door trypsinisatie en verzamelt u ze in afzonderlijke conische buizen van 15 ml.
  3. Tel de cellen met een automatische cellenteller en zaadcellen voor het experiment in platen met 12 putjes met een dichtheid van 3 × 105 cellen/per putje in 1 ml groeimedium. Incubeer culturen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
    OPMERKING: Zaai één putje per elk tijdstip van het experiment. Zowel post-kweekmedium als cellysaten zullen worden gebruikt in verdere analyse.

2. Monsterverzameling en voorbereiding

  1. Verzamel van de 24-uurs kweek het kweekmedium uit één putje van elke cellijn in een buisje van 1,5 ml.
  2. Centrifugeer de verzamelde monsters gedurende 10 minuten bij 10 000 ×g bij 10 000 g bij 4 °C. Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje en bewaar het bij -20 °C om het uitgescheiden ECD HER2-niveau verder te bepalen.
  3. Was de resterende cellen op de plaat met 1 ml koude PBS, aspireer voorzichtig en gooi de PBS weg.
  4. Voeg 200 μL RIPA buffer (aangevuld met 1% proteaseremmer) toe aan elk putje en incubeer gedurende 5 min. Schraap de cellen met de celschraper en meng door meerdere keren te pipetteren om het lysaat te homogeneren.
  5. Verzamel de gelyseerde cellen in een nieuwe buis en zuig ze langzaam op in een spuit van 2 ml met een naald (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Herhaal de aspiratiestap 5-10 keer om cellen verder te desintegreren.
  6. Centrifugeer de verzamelde monsters gedurende 10 minuten bij 10 000 x g bij 4 °C. Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje en bewaar het bij -20 °C voor verdere bepaling van de celgebonden fractie van het HER2-eiwit.
  7. Herhaal het verzamelen van kweekmedium en cellulair materiaal, volgens de voorbereidingsstappen voor de resterende tijdstippen - 48 uur en 72 uur cultuur.

3. Uitvoeren van een sandwich-ELISA voor HER2-bepaling

  1. Bereid de buffers voor.
    1. Coatingbuffer: Bereid 0,1 M NaHCO3-oplossing door 0,42 g NaHCO3 op te lossen in 50 ml gedestilleerd water en meng grondig. Stel de pH in op 9,6 met 3 M NaOH.
    2. Blokkeerbuffer: Bereid 5% magere zuivelmelk (NFDM) in PBS door 0,5 g vloeimelkpoeder toe te voegen aan 10 ml PBS en goed te mengen.
    3. Wasbuffer: Bereid fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween 20 (PBST) door 0.5 ml 0.05% Tween-20 toe te voegen aan 1000 ml PBS en meng (vermijd overmatig schuimen).
  2. Biotinylaat het detecterende antilichaam.
    1. Biotinylaat 50-200 μg detecterend anti-HER2-antilichaam (kloon 70.21.73.67) met behulp van een in de handel verkrijgbare biotine-etiketteringskit volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: De betrouwbaarheid en herhaalbaarheid van het biotinyleringsproces zijn gebaseerd op de meting van de uiteindelijke eiwitconcentratie van het resulterende antilichaam en de vergelijking van batch tot batch van het product.
  3. Smeer de plaat in.
    1. Verdun het anti-HER2-vangende antilichaam (kloon 70.27.58) tot de concentratie van 1 μg/ml in de coatingbuffer. Gebruik voor het coaten van één plaat 6,5 ml van de afvangende antilichaamoplossing.
    2. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl van de afvangende antilichaamoplossing (bereid in stap 3.3.1) toe aan elk putje op een ELISA-plaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Vermijd de buitenste putjes van de plaat (bijv. A1, H12) om de variabiliteit veroorzaakt door het randeffect te verminderen. De buitenste putten moeten worden gevuld met gedestilleerd water om stabiele reactieomstandigheden te garanderen.
    3. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie.
    4. Incubeer de plaat een nacht (O/N) bij 4 °C.
    5. Plaats de plaat na O/N-incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) op een horizontale microplaatschudder (20-30 tpm met een kantelhoek van 4°-6°).
    6. Zuig met behulp van een microplaatwasser de coatingoplossing op en was de plaat drie keer met een wasbuffer (3 x 300 μL PBST per putje).
  4. Blokkeer de plaat .
    1. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL blokkeerbuffer (5% NFDM in PBS) toe aan elke gecoate put om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren.
    2. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie.
    3. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C in een vochtigheidskamer.
    4. Zuig met behulp van een microplaatwasser de coatingoplossing op en was de plaat drie keer met een wasbuffer (3 x 300 μL PBST per putje).
  5. Bereid een kalibratiecurve en positieve controle voor (figuur 2).
    1. Bereid de werkende standaardoplossing van HER2-antigeen voor door 2 μl 1 mg/ml stockoplossing toe te voegen aan een PBS-gehalte uit 1998 μl om een HER2-concentratie van 0,001 mg/ml (1000 ng/ml) te verkrijgen.
    2. Verdun de werkende standaardoplossing (WSS) door 200 μl van de oplossing toe te voegen aan 1800 μl PBS om de standaardoplossing 1 (STD 1) te verkrijgen.
    3. Bereid de volgende zes standaarden (STD 2-STD 7) voor door seriële verdunningen van STD 1 in PBS (Figuur 2).
      1. STD 2: Voeg 500 μL STD 1 toe aan 500 μL PBS en meng grondig om 50 ng/ml te bereiden.
      2. STD 3: Voeg 500 μL STD 2 toe aan 500 μL PBS en meng grondig om 25 ng/ml te bereiden.
      3. STD 4: Voeg 500 μL STD 3 toe aan 500 μL PBS en meng grondig om 12,5 ng/ml te bereiden.
      4. STD 5: Voeg 500 μL STD 4 toe aan 500 μL PBS en meng grondig om 6,25 ng/ml te bereiden.
      5. STD 6: Voeg 500 μL STD 5 toe aan 500 μL PBS en meng grondig om 3,125 ng/ml te bereiden.
      6. STD 7: Voeg 500 μL STD 6 toe aan 500 μL PBS en meng grondig om 1,5625 ng/ml te bereiden.
      7. STD 8: Voeg 500 μL PBS toe om 0 ng/ml te bereiden.
    4. Positieve controle: Verdun STD 1 door 100 μl van de STD 1-oplossing toe te voegen aan 900 μl PBS om een oplossing van HER2 met een eiwitconcentratie van 10 ng/ml te verkrijgen.
  6. Bereid monsters voor op spike- en herstelexperimenten.
    1. Bereid de matrixmonsters (PBS, cellysaten en kweekmedium) voor met de bekende HER2-eiwitconcentratie. Verdun cellysaten 1:2000 door 2,5 μL geschikt cellysaat toe te voegen aan 5 ml PBS om een monstermatrix te verkrijgen met een HER2-niveau onder de LOD van de methode.
    2. Gebruik WSS (1000 ng/ml) en STD1 (100 ng/ml) om matrixmonsters te pieken.
    3. Bereid voor elke matrix 6 monsters voor met concentraties van 0, 2, 5, 10, 30 en 50 ng/ml.
    4. Om 0 ng/ml te bereiden, voegt u 400 μL PBS/kweekmedium/cellysaat toe.
    5. Om 2 ng/ml te bereiden, voegt u 8 μL STD1 toe aan 392 μL PBS/kweekmedium/cellysaat en mengt u grondig.
    6. Om 5 ng/ml te bereiden, voegt u 20 μL STD1 toe aan 380 μL PBS/kweekmedium/cellysaat en mengt u grondig.
    7. Om 10 ng/ml te bereiden, voegt u 4 μL WSS toe aan 396 μL PBS/kweekmedium/cellysaat en mengt u grondig.
    8. Om 30 ng/ml te bereiden, voegt u 12 μL WSS toe aan 388 μL PBS/kweekmedium/cellysaat en mengt u grondig.
    9. Om 50 ng/ml te bereiden, voegt u 20 μL WSS toe aan 380 μL PBS/kweekmedium/cellysaat en mengt u grondig.
  7. Voeg het voorbeeld toe, leeg en standaard.
    1. Voeg met behulp van een enkelkanaalspipet 100 μL standaarden, blanco (PBS) en geteste monsters (cellysaten en kweekmedium) toe aan de juiste putjes.
      OPMERKING: Het wordt aangeraden om elk monster in drievoud uit te voeren.
    2. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie.
    3. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C in een vochtigheidskamer.
    4. Zuig met behulp van een microplaatwasser de coatingoplossing op en was de plaat drie keer met een wasbuffer (3 x 300 μL PBST per putje).
  8. Detecteer antilichaambinding.
    1. Verdun het gebiotinyleerde detectie-antilichaam (kloon 70.21.73.67) in PBS tot een werkconcentratie van 1 μg/ml. Gebruik voor één plaat 6,5 ml werkende oplossing voor het detecteren van antilichamen.
    2. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl van de detecterende antilichaamwerkoplossing toe aan elk putje.
    3. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie.
    4. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C in een vochtigheidskamer.
    5. Zuig met behulp van een microplatenwasser de coatingoplossing op en was de plaat drie keer met een wasbuffer (3 x 300 μL PBST per putje).
  9. Voeg Avidin-HRP conjugaat toe.
    1. Verdun het in de handel verkrijgbare Avidin-HRP-conjugaat 1:40.000 door 1 μL enzymatisch conjugaat toe te voegen aan 40 ml PBST.
    2. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl van het verdunde conjugaat toe aan elk putje.
    3. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie.
    4. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C in een vochtigheidskamer.
    5. Zuig met behulp van een microplaatwasser de coatingoplossing op en was de plaat drie keer met een wasbuffer (3 x 300 μL PBST per putje).
  10. Colorimetrische reactie
    1. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) substraat toe aan elk putje.
    2. Dek de plaat af met een afdichtingsfolie.
    3. Incubeer de plaat gedurende 1-5 minuten op 37 °C afstand van licht en controleer de kleurontwikkeling.
    4. Wanneer de kleur het verwachte niveau bereikt, voegt u 100 μL stopoplossing toe om de reactie te beëindigen.
      OPMERKING: Het verwachte niveau komt overeen met een intens blauwe kleur in putjes met monsters met een hoge concentratie van de analyt.
  11. Gegevens verzamelen en analyseren.
    1. Meet de extinctie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer.
    2. Bereken met behulp van een kalibratiecurve van 4 parametrische parameters de monsterconcentratie op basis van de curvevergelijking.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematisch diagram van de ontwikkelde anti-HER2 sandwich ELISA-workflow. Overzicht van de belangrijkste stappen in de sandwich-ELISA-procedure. Deze omvatten de kritieke stappen (gemarkeerd met een rood kader) zoals plaatcoating met het vastleggen van anti-HER2-antilichaam 70.27.58, de toevoeging van monsters (curvestandaarden, blanco, experimentele monsters van de cellysaten of het kweekmedium) en binding van het detecterende anti-HER2-antilichaam 70.21.73.67. De test wordt afgesloten met signaaldetectie en gegevensanalyse, waarbij het colorimetrische signaal wordt gekwantificeerd met behulp van een microplaatlezer om de concentratie van het doelantigeen te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Schema met de bereiding van de standaardoplossingen voor de kalibratiecurve. Seriële verdunningen van het HER2-recombinante eiwit worden bereid om een kalibratiecurve te genereren in een concentratiebereik van 1,56-100 ng/ml (injectieflacons STD 1-STD 7). Bovendien wordt het negatieve controlemonster zonder het HER2-eiwit opgenomen (STD 8). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sandwich ELISA-validatie
De nieuw ontwikkelde test vereist een validatieprocedure. De belangrijke validatieparameters omvatten lineariteit, precisie en detectielimieten, d.w.z. de ondergrens van detectie (LLOD) en de bovengrens van detectie. In de vorige paper hebben we een grondige methodevalidatie uitgevoerd. De Elisa-lineariteit werd getest door de nagemaakte monsters te gebruiken voor lage (2, 5, 10 ng/ml), middelhoge (30 ng/ml) en significant verhoogde (50 ng/ml)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de kritische componenten bij het maken van een sandwich-ELISA is het opvangen van antilichamen die op de plaat worden geïmmobiliseerd en bijdragen aan de testspecificiteit en gevoeligheid. In de gepresenteerde test hebben we als vangantilichaam het nieuwe monoklonale eiwit (HER2/70.27.58) gebruikt dat intern is gegenereerd en gekarakteriseerd. Het antilichaam had een unieke sequentie van de CDR (complementariteitsbepalende regio) en op basis van de affiniteit vertoonde het een ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L., A.A., A.M., M.S. verklaren financiële steun van SDS Optic S.A.; A.A, A.M., M.S. verklaren SDS Optic S.A. in aandelen te bezitten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd ondersteund door een fonds van het National Centre for Research and Development grant STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 en EU, Horizon 2020 SME Instrument grant No. 783818.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biotin labeling kit-NH2AbnovaKA0003
Blotting Grade, powdered milk, low in fatRothT145.1
Cell Counting Slides for TC10/TC20 cell Counter, Dual-ChamberBio-Rad145-0011
Cell Culture PlatesBiologix07-6012
Cell ScrapersBiologix70-1250
CentrifugeOhaus30130868
Class II Biological Safety Cabinet - Telstar Bio II Advance 6TelstarN/A
Clear Flat-Bottom 96-Well PlatesThermo Fisher442404
Culture Safe CO2 Incubators - Touch 190SLeecN/A
Dimethyl sulfoxide Sigma AldrichD2650
DMEM - high glucoseSigma AldrichD0822
ELISA plate readerBioTek800TSUVI
FBS Standard, fetal bovine serumPAN BiotechP30-19375
Forced circulation laboratory dryerBINDER9090-0018
HRP-AvidinThermo Fisher43-4423
Human Her2 / ErbB2 Protein, Fc Tag, premium gradeAcroBIOSYSTEMSHER2-H5253
Immunowash Microplate WasherBio-Rad170-7009
L-Glutamine solutionSigma AldrichG7513
mAb a-HER2 (clone 70.21.73.67)SDS OpticBIO-ABH-2
mAb a-HER2 (clone 70.27.58)SDS OpticBIO-ABH-1
MDA-MB-231 Cell lineATCCHTB-26
NaHCO3POCH810530115
NaOHPOCHBA0981118
Protease Inhibitor CocktailSigma AldrichP8340
RIPA BufferSigma AldrichR0278
ROTI Fair PBSRoth1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] Cell lineATCCHTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Cell lineATCCHTB-77
Stop solution 1xAbcamab210900
TC20 Automated Cell CounterBio-rad1450102
TMB substrate 1xAbcamab210902
Tween-20Sigma AldrichP9416
VortexOhaus30392117
Wave motion shakerOhaus30391968

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subbiah, V., Kurzrock, R. Debunking the delusion that precision oncology is an illusion. Oncologist. 22 (8), 881-882 (2017).
  2. Swain, S. M., Shastry, M., Hamilton, E. Targeting HER2positive breast cancer: advances and future directions. Nat Rev Drug Discov. 22 (2), 101-126 (2023).
  3. McLemore, L. E., et al. HER2 testing in breast cancers: comparison of assays and interpretation using ASCO/CAP 2013 and 2018 guidelines. Breast Cancer Res Treat. 187 (1), 95-104 (2021).
  4. Iqbal, N., Iqbal, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in cancers: overexpression and therapeutic implications. Mol Biol Int. 2014, 852748(2014).
  5. Tsé, C., Gauchez, A. S., Jacot, W., Lamy, P. J. HER2 shedding and serum HER2 extracellular domain: biology and clinical utility in breast cancer. Cancer Treat Rev. 38 (2), 133-142 (2012).
  6. Reix, N., et al. A prospective study to assess the clinical utility of serum HER2 extracellular domain in breast cancer with HER2 overexpression. Breast Cancer Res Treat. 160 (2), 249-259 (2016).
  7. Di Gioia, D., et al. Serum HER2 supports HER2testing in tissue at the time of primary diagnosis of breast cancer. Clin Chim Acta. 430, 86-91 (2014).
  8. Carney, W. P., et al. Monitoring the circulating levels of the HER2/neu oncoprotein in breast cancer. Clin Breast Cancer. 5 (2), 105-116 (2004).
  9. Azar, F. P., Fatemeh, H. S. Value of serum human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)/neu testing in breast cancer patients to maximize detection of HER2/neupositive patients and susceptibility to trastuzumab. Clin Biochem. 44 (13), (2011).
  10. Pandey, I., Misra, V., Pandey, A., Verma, A. Expression of HER2/neu in gastric adenocarcinoma and its correlation with serum HER2/neu level and Ecadherin expression. Indian J Pathol Microbiol. 65 (1), 35-41 (2022).
  11. Agnon, V., et al. ELISA assay employing epitopespecific monoclonal antibodies to quantify circulating HER2 with potential application in monitoring cancer patients undergoing therapy with trastuzumab. Sci Rep. 10 (1), 3016(2020).
  12. Antos, A., et al. The unique monoclonal antibodies and immunochemical assay for comprehensive determination of the cellbound and soluble HER2 in different biological samples. Sci Rep. 14 (1), 3978(2024).
  13. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Front Neurol. 6, 179(2015).
  14. Perrier, A., Gligorov, J., Lefèvre, G., Boissan, M. The extracellular domain of HER2 in serum as a biomarker of breast cancer. Lab Invest. 98 (6), 696-707 (2018).
  15. Van Gorkom, T., van Arkel, G. H. J., Voet, W., Thijsen, S. F. T., Kremer, K. Consequences of the edge effect in a commercial enzymelinked immunosorbent assay for the diagnosis of Lyme neuroborreliosis. J Clin Microbiol. 59 (8), e0328020(2021).
  16. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatographymass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures. J Vis Exp. 159, e61031(2020).
  17. Giordani, E., et al. Monitoring changing patterns in HER2 addiction by liquid biopsy in advanced breast cancer patients. J Exp Clin Cancer Res. 43 (1), 182(2024).
  18. Wu, Y., et al. Imaging and monitoring HER2 expression in breast cancer during trastuzumab therapy with a peptide probe 99mTcHYNICH10F. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 47 (11), 2613-2623 (2020).
  19. NinioMany, L., et al. miR125a induces HER2 expression and sensitivity to trastuzumab in triplenegative breast cancer lines. Front Oncol. 10, 191(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HER2 QuantificationSandwich ELISAExtracellular Domain HER2Cell Bound HER2Released HER2Monoclonal AntibodiesCancer BiomarkerCell Lysate AnalysisCalibration Curve

Gerelateerde artikelen