Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In kleine diermodellen van cardiovasculaire ontwikkeling en ziekten maken onderwerpspecifieke computationele simulaties van de bloedstroom kwantitatieve beoordelingen van hemodynamische metrieken mogelijk die moeilijk experimenteel te meten zijn. Computationele vloeistofdynamische simulaties werpen licht op de cruciale rol van mechanica in de cardiovasculaire functie en ziekteprogressie. Het verkrijgen van hoogwaardige volumetrische beelden van de vaten van belang is van cruciaal belang voor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten van morfologische metingen en stroomkwantificering. Deze studie stelt een snelle, kosteneffectieve en toegankelijke methode voor voor beeldvorming met hoge resolutie van het vaatstelsel van kleine dieren met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. Het gemodificeerde iDISCO+ (immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) light-sheet sample preparation protocol omvat (1) het labelen van het vaatstelsel met een fluorescerend middel, (2) het conserveren van het monster en (3) het transparant maken van het monster. In tegenstelling tot klassieke iDISCO+, die immunohistochemische kleuring gebruikt, labelen de auteurs vasculair endotheel met FITC-gelabeld poly-L-lysine, een betaalbare niet-specifieke fluorescerende kleurstof die zeer goed bestand is tegen fotobleken, in een proces dat 'endo-schilderen' wordt genoemd. De snelle etikettering verkort de voorbereidingstijd van het monster van ongeveer vier weken tot minder dan 3 dagen. Bovendien maakt het gebruik van het minimaal gevaarlijke oplosmiddel ethylcinnamaat (ECi) als klaringsmiddel en beeldvormingsoplossing de monsters veiliger te hanteren en compatibel met een breder scala aan beeldvormingsfaciliteiten. Het voorgestelde protocol wordt toegepast om zeer opgeloste light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldstapels van het cardiovasculaire systeem in kuikenembryo's te verkrijgen, variërend van dag 3 (HH18) tot dag 8 (HH34). Deze studie toont verder de geschiktheid van deze methode aan voor vasculaire kwantificering door middel van 3D-reconstructie en computationele hemodynamische modellering van een dag 5 (HH 26) kuikenembryo.
Inleiding
Volumetrische beeldvorming is noodzakelijk voor nauwkeurige studies van cardiovasculaire fysiologie en ziekte. Kwantitatieve beeldvorming produceert beeldstapels met een hoge resolutie en intacte volumetrische afmetingen. Monsters moeten zowel worden bewaard om hun in-vivo morfologie en lumenvolume te behouden, als worden afgebeeld in een uniforme hoge resolutiecapaciteit. Op basis van beeldvormingsstacks met hoge resolutie kan de gebruiker high-fidelity driedimensionale vasculaire weergaven genereren die een volledige weergave van de vormen, structuur en connectiviteit van bloedvaten mogelijk maken1.<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het Office of Laboratory Animal Welfare interpreteert het beleid van de Public Health Service als van toepassing op het kuikenmodel als een "gewerveld dier" pas na het uitkomen. Deze embryo's zijn op dezelfde manier vrijgesteld van de jurisdictie van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De relevante veelgestelde vragen van de National Institutes of Health zijn te vinden op: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.
1. Embryoverzameling, etikettering en fixatie
- Fashion trok glazen capillaire staven met een binnendiameter van 0,75 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het snelle, hele monteerbare beeldvormingsprotocol met hoge resolutie dat hier wordt gepresenteerd (Figuur 1, Tabel 1) produceert duidelijk omlijnde vatlumen, zoals weergegeven in Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4, waarbij het vasculatuurendotheel van het kuikenembryo GFP-fluorescerend is en daarom groen wordt omlijnd in de embryonale stadia van vroege tot volwassen harton.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het vermogen om biologie in 3D te bestuderen is van cruciaal belang voor een nauwkeurig begrip van morfologische complexiteit, inwendige orgaanstructuur en vasculaire verbindingen. Nauwkeurige en betrouwbare 3D-vasculaire beelden staan ook centraal in onderwerpspecifieke computationele hemodynamische simulaties, die vaak de enige betrouwbare manier zijn om belangrijke hemodynamische parameters zoals wandschuifspanning en drukverdeling te kwantificeren. Hier introduceren de auteurs een sn.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een American Heart Association Career Development Award, Burroughs Wellcome Fund Career Award bij de Scientific Interface, Additional Ventures Single Ventricle Research Fund en de UCSD School of Medicine Microscopy Core (Grant P30 NS047101). De auteurs danken Dr. Bobby Thompson voor zijn inleiding tot endo-schilderen, de UCSD School of Medicine Microscopy Core en Robert Porter (UCSD) voor experimentele ondersteuning.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55-forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 0.03 inch inner diameter silicone tubing | VWR | 32829-182 | |
| 20 μL pipette tips | VWR | 76322-134 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 10799-192 | |
| 5 mL plastic syringe | VWR | BD 309646 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Raadpleeg MSDS. Opgeslagen in zijkast onder afzuiging |
| Ethyl cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich | 112372 | Opgeslagen bij 4 °C |
| Fine Curved scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | |
| FITC-poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P3069 | Bewaar bij -20 °C (poeder, stockoplossing), 4ºC (werkoplossing) |
| Fluoresent microscope | EVIDENT SCIENTIFIC | MVX10 | |
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | Sutter Instrument | FG-GB100-75-10 | |
| Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 system | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775 | Raadpleeg MSDS. Opgeslagen in brandkast onder afzuiging |
| Microforge | Narishige International USA, Inc. | MF2 | |
| Micromanipulator | World Percision Instrrument | M3301R | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% | Thermo Scientific | J19943.K2 | Raadpleeg MSDS. Opgeslagen bij -20 °C (poeder), 4 °C (4% werkoplossing) |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva | SH30256.01 | Opgeslagen op werkblad |
| SimVascular | open source software www.simvascular.org | ||
| Tyrode’s Solution | Zelf gemaakt |
Referenties
- Lindsey, S. E., Butcher, J. T., Vignon-Clementel, I. E. Cohort-based multiscale analysis of hemodynamic-driven growth and remodeling of the embryonic pharyngeal arch arteries. Development. 145 (20), dev162578(2018).
- Lindsey, S. E., Vignon-Clementel, I. E., Butcher, J. T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
