Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Samenvatting

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Samenvatting

In kleine diermodellen van cardiovasculaire ontwikkeling en ziekten maken onderwerpspecifieke computationele simulaties van de bloedstroom kwantitatieve beoordelingen van hemodynamische metrieken mogelijk die moeilijk experimenteel te meten zijn. Computationele vloeistofdynamische simulaties werpen licht op de cruciale rol van mechanica in de cardiovasculaire functie en ziekteprogressie. Het verkrijgen van hoogwaardige volumetrische beelden van de vaten van belang is van cruciaal belang voor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten van morfologische metingen en stroomkwantificering. Deze studie stelt een snelle, kosteneffectieve en toegankelijke methode voor voor beeldvorming met hoge resolutie van het vaatstelsel van kleine dieren met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. Het gemodificeerde iDISCO+ (immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) light-sheet sample preparation protocol omvat (1) het labelen van het vaatstelsel met een fluorescerend middel, (2) het conserveren van het monster en (3) het transparant maken van het monster. In tegenstelling tot klassieke iDISCO+, die immunohistochemische kleuring gebruikt, labelen de auteurs vasculair endotheel met FITC-gelabeld poly-L-lysine, een betaalbare niet-specifieke fluorescerende kleurstof die zeer goed bestand is tegen fotobleken, in een proces dat 'endo-schilderen' wordt genoemd. De snelle etikettering verkort de voorbereidingstijd van het monster van ongeveer vier weken tot minder dan 3 dagen. Bovendien maakt het gebruik van het minimaal gevaarlijke oplosmiddel ethylcinnamaat (ECi) als klaringsmiddel en beeldvormingsoplossing de monsters veiliger te hanteren en compatibel met een breder scala aan beeldvormingsfaciliteiten. Het voorgestelde protocol wordt toegepast om zeer opgeloste light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldstapels van het cardiovasculaire systeem in kuikenembryo's te verkrijgen, variërend van dag 3 (HH18) tot dag 8 (HH34). Deze studie toont verder de geschiktheid van deze methode aan voor vasculaire kwantificering door middel van 3D-reconstructie en computationele hemodynamische modellering van een dag 5 (HH 26) kuikenembryo.

Inleiding

Volumetrische beeldvorming is noodzakelijk voor nauwkeurige studies van cardiovasculaire fysiologie en ziekte. Kwantitatieve beeldvorming produceert beeldstapels met een hoge resolutie en intacte volumetrische afmetingen. Monsters moeten zowel worden bewaard om hun in-vivo morfologie en lumenvolume te behouden, als worden afgebeeld in een uniforme hoge resolutiecapaciteit. Op basis van beeldvormingsstacks met hoge resolutie kan de gebruiker high-fidelity driedimensionale vasculaire weergaven genereren die een volledige weergave van de vormen, structuur en connectiviteit van bloedvaten mogelijk maken¹.

Cardiovasculaire structuren bezitten complexe driedimensionale anatomische kenmerken die niet nauwkeurig kunnen worden vastgelegd wanneer ze door een tweedimensionale, onsamenhangende lens worden onderzocht. Stereoscoop, breedveld, morfologische beeldvorming en histologische doorsneden zijn ontoereikend voor het vastleggen van complexe driedimensionale variaties ^1,2,3. Micro- en nano-computertomografiebeelden zijn de gouden standaard voor kwantitatieve volumetrische beeldvorming van kleine dieren ^1,4, maar zijn niet algemeen toegankelijk of overgenomen in de biologische gemeenschap. Recente innovaties op het gebied van weefselopruiming en microscopie van hele organen/kleine dieren hebben kwantitatieve toepassingen mogelijk gemaakt van opruimings- en vasculaire labelingtechnieken voor hele bergen ^5,6,7. Weefselopruiming werkt om de verstrooiing van licht in weefselmonsters te homogeniseren, waardoor vertragingen in de voortplanting van licht door het medium worden verminderd door de kans op lichtverstrooiing of -absorptie te verkleinen. Hoge transparantie vereist een strikte weefselverwerking die de antigeniciteit of helderheid van de fluorescentiesignaallabeling kan beïnvloeden⁸. Lightsheet-microscopie is naar voren gekomen als een snel, krachtig beeldvormingsinstrument dat op grote schaal wordt gebruikt door biologen⁹, en biedt een snelheidswinst van verschillende ordes van grootte ten opzichte van scanmicroscopen en de capaciteit om monsters van meer dan 1 cm groot af te beelden. Door middel van light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) verlicht een laser een monsterdoorsnede met verhoogde snelheid en diepte in vergelijking met confocale microscopie; Om deze reden vereist de methode een hoge monstertransparantie.

Hier passen de auteurs recente iDISCO+-opruimingsmethoden toe en combineren ze met endo-painting¹⁰ in het diermodel van het kuikenembryo om de werkzaamheid van de methode van vroege tot late cardiovasculaire ontwikkeling te demonstreren. iDISCO (immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) is een op organische oplosmiddelen gebaseerde clearingmethode die, in tegenstelling tot op waterige klaring gebaseerde methoden, niet onderhevig is aan beeldvormingsartefacten veroorzaakt door verdamping van oplosmiddelen. iDISCO verschilt van iDISCO+ doordat de tetrahydrofuraan-dehydratatiestap van de eerste (iDISCO) wordt vervangen door een mildere methanoldehydratie gevolgd door een lipide-extractiestap (iDISCO+). Voordelen van de iDISCO+ clearing-methode zijn onder meer immunolabeling van grote volwassen monsters en embryo's, lage weefselkrimp en hoge transparantie ^8,11. Belangrijk is dat iDISCO+ het mogelijk maakt om beeldstapels met hoge resolutie te genereren, waarbij traditionele biologische immunolabelingtechnieken worden uitgebreid om informatie te verkrijgen over grote orgaanmonsters of een heel embryo in plaats van beperkt te zijn tot het bemonsteren van kleine regio's die geen informatie hebben over de hele organisatie op weefselniveau, zoals bij traditionele histologie⁹. Nadelen van iDISCO+ zijn onder meer het feit dat genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten niet bewaard blijven¹¹. De weefsellabelingsmethode van endo-painting werd voor het eerst geïntroduceerd als een high-throughput screening op cardiovasculaire defecten met behulp van HH31-HH36 kippenembryoharten die werden geperfundeerd met 0,5 mg/ml FITC-poly-L-lysine in de linkerventrikeltop. De kleurstof heeft 4 minuten kunnen binden voordat hij werd gefixeerd en bewaard¹⁰.

Uit de huidige studie bleek dat dezelfde FITC-poly-L-lysineconcentratie kon worden gebruikt voor een breder scala aan embryo's (HH18 - HH34), maar vond dat de ideale fixatietijd varieerde (van 5-10 minuten) om helder gelabelde bloedvaten te garanderen. Gebruikers van de huidige endo-DISCO-techniek willen misschien de kleurstofconcentratie aanpassen (afnemend met 0,1 mg/ml per keer) als de oplossing te stroperig blijkt te zijn om alle gewenste bloedvaten te labelen, maar worden aangemoedigd om eerst de fixatietijd aan te passen en de spiercontractie van de linkerventrikel te optimaliseren voordat de kleurstofconcentratie wordt aangepast. De auteurs probeerden endo-painting met een concentratie van 0,1 mg/ml en ontdekten dat de kleurstof zich weliswaar gemakkelijker door kleine bloedvaten verspreidde, maar gemakkelijker werd weggespoeld bij PFA-perfusie. De auteurs tonen aan dat de beeldvormingsstacks met hoge resolutie die met de huidige techniek worden gegenereerd, van voldoende kwaliteit zijn voor computationele hemodynamische modellering. Bloedstroompaden en bijbehorende hemodynamische krachten, waaronder druk- en wandschuifspanningsverdelingen, komen voor in complexe gelokaliseerde patronen die alleen kunnen worden opgelost door middel van computationele stroomsimulaties ^1,12. Deze biomechanische krachten beïnvloeden het gedrag van aangrenzende cardiovasculaire weefsels en veroorzaken vasculaire aanpassing, groei en hermodellering¹³. Het begrijpen van lokale hemodynamische krachtwaarden werpt een kritisch licht op de mechanistische regulatoren van de cardiovasculaire functie en het ontstaan of de progressie van de ziekte².

Protocol

Het Office of Laboratory Animal Welfare interpreteert het beleid van de Public Health Service als van toepassing op het kuikenmodel als een "gewerveld dier" pas na het uitkomen. Deze embryo's zijn op dezelfde manier vrijgesteld van de jurisdictie van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De relevante veelgestelde vragen van de National Institutes of Health zijn te vinden op: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.

1. Embryoverzameling, etikettering en fixatie

1. Fashion trok glazen capillaire staven met een binnendiameter van 0,75 in gesneden micronaalden met behulp van een microsmederij ^1,12.
   OPMERKING: De grootte van de benodigde tip is afhankelijk van de gewenste leeftijd/debiet van het dier. De micronaald kan ook worden geknipt met een microdissectietang of schaar met sterk verminderde precisie.
2. Verwarm de oplossing van Tyrode tot ongeveer 38^°C.
3. Los de vaste stof van FITC poly-L-lysine op in de oplossing van Tyrode om een stockoplossing van 0,5 mg/ml te bereiden.
   OPMERKING: Deze concentratie is geoptimaliseerd voor het labelen van eicelslagaders van kuikens. De optimale concentratie voor andere weefseltypen kan variëren. De extra voorraadoplossing moet worden bewaard bij -20 °C.
4. Ontleed het vogelembryo (variërend van HH18 (dag 3) tot HH34 (dag 8) voor het huidige kippenhartonderzoek) uit de eidooier door rond het embryo te knippen met een schaar met gebogen punt en met behulp van een transferpipet of een spatel het embryo over te brengen naar een petrischaaltje van 35 mm gevuld met warme Tyrode's oplossing.
5. Verwijder voorzichtig de chorion- en allantoïsche membranen die het embryo omhullen en het hartzakje rond het hart met een tang met fijne punt door kleine (~0,1 mm) incisies in de membranen te maken en ze weg te trekken van het embryo.
6. Breng het embryo over naar een nieuw, schoon petrischaaltje gevuld met warme Tyrode's oplossing om het hart te laten kloppen.
7. Vul een plastic spuit van 5 ml met warme Tyrode's oplossing. Knip het brede uiteinde van een plastic pipetpunt van 0-20 μl af en bevestig deze aan de platte punt van de spuit. De spuit is nu uitgeschoven tot de diameter van de fijne pipetpunt.
8. Bouw een "injectielijn" door een segment van 0.03-inch siliconenslang met een binnendiameter te bevestigen aan het nieuw vastgezette pipetpuntspuitapparaat (stap 1.7). Bevestig een glazen capillaire micronaald aan het andere uiteinde van de slang.
9. Monteer de micronaald op de micro-injectiehouder die aan een micromanipulator is bevestigd. Ontdoe de siliconenslang en de micronaald van luchtbellen.
10. Steek met behulp van de micromanipulator de naald in de top van het hart en perfuseer het embryo ^1,12 door de oplossing van Tyrode langzaam in het hart te injecteren. Ga door met het perfunderen van het embryo totdat het grotendeels ontdaan is van bloed.
11. Gebruik de micromanipulator om de naald en de injectieleiding terug te trekken van de inbrengplaats en richt de naald zo dat deze niet wordt gestoord tijdens de voorbereiding van de volgende injectielijn. Verwijder de siliconenslang van de naald en spuit.
    OPMERKING: Sommige gebruikers vinden het misschien optimaal om de naald aan het hart vast te houden, in welk geval de gebruiker de siliconenslang tussen de naald en de spuit moet verwijderen, terwijl de naald op zijn plaats blijft.
12. Voer endo-painting uit om het vasculaire endotheel te labelen met groene fluorescentie.
    1. Laad met een micropipet 20-40 μL FITC poly-L-lysine stockoplossing in de siliconenslang en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan voor de FITC-vloeistofbarrière.
    2. Bevestig de spuit gevuld met Tyrode's oplossing weer en gebruik de micromanipulator om langzaam in de top van het hart te injecteren, waarbij u de naald indien nodig opnieuw inbrengt. Verwijder de naald nadat de FITC poly-L-lysine is verspreid en voordat er luchtbellen in het hart komen.
    3. Laat FITC poly-L-lysine 5-10 minuten in het embryo zitten.
       OPMERKING: (optionele kwaliteitscontrole) Om de fluorescentie te controleren, maakt u een foto met een fluorescerende stereo of macroscoop. De afbeelding kan worden gebruikt om een uitdrogingsfactor te bepalen nadat de embryoklaring is voltooid.
13. Vul een spuit van 5 ml met 4% paraformaldehyde (PFA) en bevestig deze aan de siliconeninjectieslang voor een derde injectiestap.
14. Doordrenk het embryo ^1,12 met 4% PFA totdat alle cardiovasculaire structuren op volle volumecapaciteit zijn en het weefsel ondoorzichtiger begint te worden.
15. Laad het embryo voorzichtig in een injectieflacon van 2-5 ml gevuld met voldoende 4% PFA om het monster te bedekken. Zorg ervoor dat u het embryo niet overmatig vervormt.
    OPMERKING: Kies een injectieflacon die groot genoeg is voor het monster van belang om te voorkomen dat het monster wordt verpletterd of vervormd.
16. Incubeer het embryo een nacht bij 4 °C met een schudder.

2. Uitdroging en opruiming van embryo's

1. Piket voorzichtig de 4% PFA eruit.
   OPMERKING: Vermijd vanaf dit punt direct contact met het embryo om weefselbeschadiging of vervorming te voorkomen.
2. Om het embryo te wassen, incubeert u het embryo gedurende 30 minuten in een verse fosfaatbufferoplossing (PBS) bij kamertemperatuur terwijl u zachtjes schudt. Herhaal dit nog twee keer voor een totaal van 3 wasbeurten.
3. Begin met het uitdrogen van het embryo in een zuurkast. Piket voorzichtig de PBS uit en incubeer het embryo in een graduele reeks van 5 methanolincubaties bij kamertemperatuur gedurende elk 1 uur: 20%, 40%, 60%, 80% en 100% methanolconcentratie.
4. Laat het embryo een nacht in verse 100% methanol bij kamertemperatuur staan.
   OPMERKING: (Optioneel stoppunt). Embryo's kunnen worden bewaard bij -20 °C in 100% methanol voor later gebruik gedurende maximaal 6 maanden.
5. Begin in de zuurkast met de procedure voor het verwijderen van lipiden. Incubeer het embryo in een 2:1 (volume naar volume) DCM: methanoloplossing bij kamertemperatuur gedurende 3 uur, zachtjes schudden.
   LET OP: DCM is giftig en moet in de zuurkast worden gehanteerd. Neem extra voorzorgsmaatregelen bij het werken met DCM. Dubbele handschoenen kunnen een extra barrière vormen.
6. Neem ethylcinnamaat (ECi) uit 4 °C en laat het op kamertemperatuur ontdooien.
7. Was de embryo's in verse 100% DCM op kamertemperatuur gedurende 15 minuten, schuddend. Herhaal 100% DCM-wasbeurt om in totaal 2 wasbeurten te bereiken.
8. Pipetteer DCM eruit en incubeer het embryo in 100% ECi. Laat het embryo in ECi totdat het in ongeveer 1 uur is verdwenen. Schud de tube indien nodig voorzichtig.
9. (Optionele verificatiestap) Onderzoek de kwaliteit van het opruimen en het bevlekken van bloedvaten met een fluorescerende stereo of macroscoop. Maak een foto van het embryo om de stadium-/leeftijdsspecifieke uitdrogingsschaalfactor te bepalen.
10. Bewaar het geklaarde embryo maximaal 6 maanden bij 4 °C totdat het klaar is om te worden afgebeeld, zodat het embryo beschermd blijft tegen licht.

3. Verwerving van gegevens

1. Gebruik een fluorescerende microscoop om embryo's in beeld te brengen. Bevestig de kop van een optisch geklaard embryo op een glazen capillair met behulp van superlijmgel.
2. Monteer het glazen capillair op de monsterhouder, vul de beeldvormingskamer met ECi en laat het embryo in de beeldkamer zakken.
3. Pas de parameters aan en voer beeldvorming uit.

4. Kwantitatieve toepassing: 3D-reconstructie en computationele vloeistofdynamische modellering

OPMERKING: In deze stappen worden door lightsheets gegenereerde beeldstapels met hoge resolutie geladen in de open-source software SimVascular¹⁴ voor 3D anatomische reconstructie en computationele vloeistofdynamische modellering. Gedetailleerde tutorials zijn te vinden op de SimVascular-website (zie Materiaaltabel). Reconstructie bestaat uit het creëren van paden in de vaten van belang, het maken van 2D-segmentaties langs de paden en het combineren van loftsegmentaties tot een 3D-solide model. Computationele modellering bestaat uit het voorbereiden van een vermaasde geometrie, het definiëren van randvoorwaarden en het uitvoeren van simulaties.

1. Maak een nieuw SVProject onder Bestand en upload een lightsheet-beeldstapel met hoge resolutie door met de rechtermuisknop op Afbeeldingen te klikken en vervolgens op afbeelding toevoegen/vervangen.
2. Volg de stappen van de softwarehandleiding om vasculaire anatomieën in silico te reconstrueren.
   1. Maak een padlijn door met de rechtermuisknop op Paden te klikken en pad maken te selecteren. Plaats padmarkeringen langs een interessant vaartuig. Herhaal dit voor elk vaartuig van belang.
   2. Trek voor elke gemaakte padlijn 2D-scheepsdoorsneden over door met de rechtermuisknop op Segmentaties te klikken en de groep Contouren maken te selecteren. Selecteer het vaartuigpad en dubbelklik op de naam van het vaartuig onder Segmentatie om de handmatige segmentatie te starten.
   3. Zodra alle schepen zijn gesegmenteerd, maakt u een model door met de rechtermuisknop op Modellen te klikken en vervolgens model maken te selecteren. Selecteer PolyData-type , voer een modelnaam in, klik op Solide model maken en selecteer alle segmentaties die deel moeten uitmaken van het model.
3. Combineer de geometrie door de Tetgen-mesher uit te voeren die is ingebouwd in SimVascular SVMesher. Definieer een maximale randgrootte en voer zowel oppervlakte- als volume-meshing uit.
   OPMERKING: Kies een maaswijdte die fijne geometrische details en gelokaliseerde hemodynamische variabiliteit in het bloedvat kan oplossen. Begin met de knop Een globale maasgrootte schatten . Een onderzoek naar mesh-convergentie kan nodig zijn bij het afronden van simulaties.
4. Zet een computationele bloedstroomsimulatie op met behulp van de SimVascular Solver. Maak simulatiebestanden door met de rechtermuisknop op Simulaties te klikken en Simulatietaak maken te selecteren. Pas basisparameters aan en selecteer inlaat- en uitlaat-BC's voor specifieke randvoorwaarden.
   1. Pas de Oplosser-parameters aan, navigeer naar het tabblad Bestanden maken en simulatie uitvoeren, selecteer mesh-bestand, klik op Gegevensbestanden maken voor simulatie.
5. Start de simulatie met behulp van een high-performance computing-werkstation of supercomputer.

Resultaten

Het snelle, hele monteerbare beeldvormingsprotocol met hoge resolutie dat hier wordt gepresenteerd (Figuur 1, Tabel 1) produceert duidelijk omlijnde vatlumen, zoals weergegeven in Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4, waarbij het vasculatuurendotheel van het kuikenembryo GFP-fluorescerend is en daarom groen wordt omlijnd in de embryonale stadia van vroege tot volwassen harton...

Discussie

Het vermogen om biologie in 3D te bestuderen is van cruciaal belang voor een nauwkeurig begrip van morfologische complexiteit, inwendige orgaanstructuur en vasculaire verbindingen. Nauwkeurige en betrouwbare 3D-vasculaire beelden staan ook centraal in onderwerpspecifieke computationele hemodynamische simulaties, die vaak de enige betrouwbare manier zijn om belangrijke hemodynamische parameters zoals wandschuifspanning en drukverdeling te kwantificeren. Hier introduceren de auteurs een sn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55-forceps	Fine Science Tools	11295-51
0.03 inch inner diameter silicone tubing	VWR	32829-182
20 μL pipette tips	VWR	76322-134
35 mm Petri dish	VWR	10799-192
5 mL plastic syringe	VWR	BD 309646
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Raadpleeg MSDS. Opgeslagen in zijkast onder afzuiging
Ethyl cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich	112372	Opgeslagen bij 4 °C
Fine Curved scissors	Fine Science Tools	14061-09
FITC-poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P3069	Bewaar bij -20 °C (poeder, stockoplossing), 4ºC (werkoplossing)
Fluoresent microscope	EVIDENT SCIENTIFIC	MVX10
Glass capillary tubes (0.75 mm ID)	Sutter Instrument	FG-GB100-75-10
Lightsheet microscope	Zeiss	Z.1 system
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775	Raadpleeg MSDS. Opgeslagen in brandkast onder afzuiging
Microforge	Narishige International USA, Inc.	MF2
Micromanipulator	World Percision Instrrument	M3301R
Paraformaldehyde (PFA) 4%	Thermo Scientific	J19943.K2	Raadpleeg MSDS. Opgeslagen bij -20 °C (poeder), 4 °C (4% werkoplossing)
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva	SH30256.01	Opgeslagen op werkblad
SimVascular			open source software www.simvascular.org
Tyrode’s Solution			Zelf gemaakt