Snelle detectie van fecaal antigeen van Helicobacter pylori-infectie op basis van dubbele antilichaamsandwichdetectietechnologie

Samenvatting

In deze studie werd een sandwichdetectietechniek op basis van dubbele antilichamen ontwikkeld voor snelle detectie van fecale antigenen geïnfecteerd met Helicobacter pylori.

Samenvatting

Helicobacter pylori kan parasitair zijn in het maagslijmvlies, dat na infectie een reeks gastro-intestinale aandoeningen kan veroorzaken en nauw verwant is aan gastritis, maagzweren en maagkanker. De hoge prevalentie van H. pylori-infectie in regio's met een slechte medische infrastructuur en ontoereikende sanitaire voorzieningen blijft een belangrijk probleem voor de volksgezondheid. Daarom is de ontwikkeling van snelle, eenvoudige en kosteneffectieve screeningmethoden voor H . pylori-detectie in omgevingen met beperkte middelen van het grootste belang.

In deze studie voerden we een community-based screening uit in Shitan Village, in de provincie Guangdong, een afgelegen en onderontwikkeld gebied dat wordt gekenmerkt door een permanente bevolking van ongeveer 300 inwoners met over het algemeen een laag opleidingsniveau. We gebruikten een dubbele antilichaamsandwichtest voor de detectie van H. pylori fecaal antigeen, een methode die is gekozen vanwege de mogelijke toepasbaarheid ervan in omgevingen met weinig middelen. In totaal werden 261 deelnemers uit het dorp ingeschreven en hun ontlastingsmonsters werden geanalyseerd met behulp van deze techniek. Voor vergelijkende validatie werden dezelfde monsters onderworpen aan kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-analyse. Vergeleken met qPCR-resultaten waren de gevoeligheid en specificiteit van de detectie van H. pylori-antigeen in de ontlasting 60,24% en 80,08%. De resultaten toonden een sterke overeenkomst aan tussen de fecale antigeendetectiemethode en qPCR (Kappa = 0,630). Deze studie verduidelijkte systematisch de principes, procedures, methodologieën en klinische toepassingen van fecale antigeendetectie voor H. pylori-infectie , met als doel op latex gebaseerde dubbele antilichaamsandwichtechnologie te onderzoeken en nieuwe strategieën en praktische richtlijnen vast te stellen voor de aanvullende diagnose.

Inleiding

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) is een micro-aerofiele, spiraalvormige, gramnegatieve bacterie¹. Vanwege zijn vermogen om de menselijke maag te koloniseren en chronisch te infecteren², is deze ziekteverwekker geïdentificeerd als een belangrijke etiologische factor bij de ontwikkeling van maagadenocarcinoom ^3,4. In 2015 leden ~4,4 miljard mensen in de wereld aan een H. pylori-infectie ⁵. De prevalentie van H. pylori-infectie vertoont aanzienlijke geografische variatie, waarbij ontwikkelingslanden aanzienlijk hogere percentages ervaren in vergelijking met ontwikkelde landen. Met name in lage-inkomenslanden en onder bepaalde kwetsbare bevolkingsgroepen kan het infectiepercentage oplopen tot 75%⁶.

Hoewel traditionele detectiemethoden zoals gastroscopie nauwkeurig zijn, is hun toepassing bij grootschalige screening en routinematige follow-up beperkt vanwege hun invasiviteit, hoge kosten en lage acceptatie door de patiënt⁷. Daarom is de zoektocht naar niet-invasieve, eenvoudige en snelle diagnostische methoden een belangrijke richting geworden van het moderne klinische geneeskundeonderzoek. Het belangrijkste doel van een niet-invasieve diagnose van H. pylori is om nauwkeurig, veilig en gemakkelijk te detecteren of de patiënt is geïnfecteerd met H. pylori zonder endoscopisch onderzoek. De ureumademtest (UBT), H. pylori fecale antigeentest (FAT)⁸ en serologische test⁹ zijn populaire niet-invasieve technieken.

Hiervan is de UBT de minst opdringerige en meest nauwkeurige procedure die beschikbaar is¹⁰. De sensitiviteit en specificiteit van UBT zijn hoger dan 95%¹¹. Van de beschikbare niet-invasieve diagnostische methoden is aangetoond dat de UBT de meest nauwkeurige en betrouwbare is, zoals blijkt uit een validatiestudie uitgevoerd in Irak, de UBT kan worden aanbevolen als de eerste keuze vanwege de hogere prestaties in vergelijking met andere methoden¹². UBT heeft echter ook zijn nadelen, zoals de hoge kosten en de behoefte aan massaspectrometrische analyse, waardoor de toepassing in afgelegen of beperkte middelen wordt beperkt¹³.

De ontwikkeling van een snelle, niet-invasieve en kosteneffectieve diagnostische methode voor het detecteren van H. pylori-infectie is van cruciaal belang, vooral in regio's met beperkte middelen. In deze studie hebben we een snelle detectietechnologie ontwikkeld voor H. pylori fecaal antigeen op basis van dubbele antilichaamsandwichdetectietechnologie, die H. pylori-antigeen in fecale monsters snel, effectief en tegen lage kosten kan detecteren. Deze technologie biedt aanzienlijke voordelen, waaronder betaalbaarheid, niet-invasief, gebruiksvriendelijkheid en aanpasbaarheid aan afgelegen gebieden. Onze hypothese is dat de dubbele antilichaamsandwichmethode voor het detecteren van H. pylori fecaal antigeen een gevoeligheid en specificiteit zal vertonen die vergelijkbaar is met qPCR, waardoor het een levensvatbaar hulpmiddel is voor niet-invasieve klinische diagnose.

We hebben de principes, procedures, methodologische sterke punten en klinische toepasbaarheid van fecale antigeendetectie voor H. pylori-infectie uitgebreid beschreven. Om de bruikbaarheid ervan te valideren, hebben we een epidemiologisch onderzoek en screening uitgevoerd in Shitan Village, Qingyuan City, provincie Guangdong, China, een afgelegen en onderontwikkeld gebied met een permanente bevolking van ongeveer 400 en een beperkt opleidingsniveau. Onze resultaten tonen aan dat de snelle detectietechnologie van H. pylori-antigeen in ontlasting die hier is ontworpen, binnen 20 minuten kan worden voltooid. Benadrukt wordt dat de snelle detectie van H. pylori-antigeen in ontlasting een potentieel en veelbelovend hulpmiddel is voor een snelle en betrouwbare diagnose van H. pylori-infectie in afgelegen en achtergebleven gebieden.

Protocol

Deze cross-sectionele studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Guangdong Provincial People's Hospital (goedkeuringsnummer: KY2024-445-01) en de persoonsgegevens van alle proefpersonen waren tijdens het onderzoek strikt vertrouwelijk. Alle deelnemers ondertekenden vóór de experimenten een schriftelijke geïnformeerde toestemming. De inwoners van het dorp Shitan in Qingyuan City, in de provincie Guangdong, werden in 2024 geselecteerd als proefpersonen en er waren geen beperkingen op leeftijd en geslacht. De hieronder beschreven sandwichtest met dubbele antilichamen (een kwalitatief experiment) werd uitgevoerd door professioneel medisch en technisch personeel volgens de instructies. De gehele permanente bevolking van het dorp werd geselecteerd voor deze studie, ongeacht of ze gezond waren of symptomen hadden of bestaande ziekten die verband houden met gastro-intestinale aandoeningen.

1. Selectie van patiënten

1. Sluit patiënten uit als ze in de afgelopen 1 maand protonpompremmers of bismut,_{H-2-receptorblokkers} of antibiotica hebben gebruikt.
2. Vraag alle deelnemers om de vragenlijst anoniem in te vullen. De inhoud van de vragenlijst bestaat uit vijf vragen: Eet u regelmatig drie maaltijden? Drink je alcohol? Kent u H. pylori al? Vindt u het nodig om een H. pylori-inspectie uit te voeren? Begrijpt u de nadelige gevolgen van een H. pylori-infectie ?

2. Procedure voor de detectie van fecale H. pylori-infectie-antigeendetectie

OPMERKING: Het algoritme voor het testen van H. pylori-ontlastingsantigeen , is ontworpen om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de resultaten te garanderen, met inachtneming van eenvoud en hygiëne. Het hele proces is onderverdeeld in vijf stappen: monsterverzameling, monsterverwerking, monsteropslag, detectie en resultaatinterpretatie. Het werkstroomschema en het schematische diagram van monsterdetectie worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2.

1. Stalen collectie
   OPMERKING: Voor het afnemen van monsters moeten H . pylori-antigeenspecifieke containers worden gebruikt. De monsters mogen niet worden gemengd met water, urine, ontsmettingsmiddelen en rioolwater.
   1. Nadat de ontlasting is voltooid, verwijdert u het bovendeksel van de speciale container om de bemonsteringsstaaf te verwijderen.
   2. Steek de bemonsteringsstaaf continu in vijf verschillende posities van de ontlasting voor bemonstering en zorg ervoor dat het draaduiteinde van de bemonsteringsstaaf volledig in de ontlasting is gestoken.
   3. Steek de bemonsteringsstaaf terug in de reagensbuis nadat de bemonstering is voltooid; Het monstervolume is in totaal ~5-50 mg.
2. Verwerking van monsters
   1. Schud de reagensbuis gedurende ~10 s heen en weer om het ontlastingsmonster grondig in het verdunningsmiddel te mengen (hoofdingrediënten: ethyleendiaminetetra-azijnzuurtetranatriumhydraat 0,018 g/ml en natriumchloride 0,01 g/ml).
3. Opslag van monsters
   1. Test de monsters zo snel mogelijk na de bemonstering; Bewaar ze niet langer dan 6 uur bij kamertemperatuur en onder gekoelde omstandigheden (niet langer dan 72 uur bij 2-8 °C en niet langer dan 6 maanden ingevroren bij -25 °C tot -15 °C) indien nodig om de afbraak van antigeen en de microbiële activiteit te vertragen.
      OPMERKING: Monsters kunnen tot 3x herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid, en zowel gekoelde als ingevroren monsters moeten vóór het testen worden teruggebracht naar kamertemperatuur.
4. Detectie van monsters
   1. Open het witte deksel op het deksel van de reagensbuis en houd de reagensbuis rechtop.
   2. Druk het deksel naar beneden tot het laagste punt, zodat het monster op de testkaart stroomt en door het detectiegebied (T) en het kwaliteitscontrolegebied (C) gaat dat is gecoat met het anti-Hp-antilichaam van de muis.
5. Interpretatie van de resultaten
   1. Wacht 10-20 minuten zodat elk H. pylori-antigeen in het monster, indien gebonden aan het antilichaam, een macroscopische chromogene reactie vormt in het detectiegebied. Dit wordt meestal weergegeven als een rode of paarse lijn die contrasteert met de lijn in het kwaliteitscontrolegebied.
   2. De aan- of afwezigheid van de kleurreactie en de diepte van de kleur zijn gerelateerd aan de concentratie van H. pylori-antigeen in het monster. Vergelijk de kleurenkaarten om de resultaten snel en nauwkeurig te interpreteren (zie afbeelding 3).

3. DNA-extractie

1. Doe een geschikte hoeveelheid ontlasting in een reageerbuis, voeg PBS-oplossing toe en meng grondig door te schudden. Centrifugeer het mengsel gedurende 5-10 minuten bij 12.000 × g en verzamel vervolgens voorzichtig 200 μL van het bovenstaande voor verdere extractie.
2. Bereid op basis van het aantal monsters een gelijk aantal centrifugebuisjes van 1,5 ml voor. Voeg aan elke buis achtereenvolgens 20 μl proteïnase K (20 mg/ml), 10 μl magnetische kralen, 200 μl van het monster supernatant en 200 μl lysisbuffer A toe. Meng grondig door de buisjes om te keren en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in een metalen bad bij 55 °C.
3. Nadat de pyrolyse is voltooid, plaatst u de centrifugebuis op het magnetische frame, laat u deze staan en laat u de adsorptie gedurende 1 minuut op de kralen plaatsvinden. Nadat de vloeistof in de buis volledig is geklaard, gooit u het bovenstaande weg en probeert u de magnetische kralen niet te verstoren.
4. Haal de buizen uit het magnetische rek en plaats ze op een centrifugebuisrek van 1.5 ml. Voeg met behulp van een pipet 500 μL wasbuffer E toe aan elke buis, meng grondig gedurende 1 minuut en doe de buisjes vervolgens terug in het magnetische rek. Laat de buisjes 1 minuut staan, gooi het bovenstaande na klaring weg en vermijd het opzuigen van de magnetische kralen.
5. Herhaal het wasproces door 500 μL wasbuffer W2 aan elke tube toe te voegen. Meng 1 minuut grondig, plaats de buizen op het magnetische rek en laat ze 1 minuut staan. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg nadat de oplossing is opgehelderd en zorg ervoor dat de magnetische kralen ongestoord blijven.
6. Voeg 100 μL verdunningsmiddel toe, meng en incubeer gedurende 55 minuten bij 55 °C.
7. Plaats de buizen op het magnetische rek en laat ze 2 minuten staan. Zodra de oplossing is geklaard, brengt u het geëlueerde nucleïnezuur voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis, waarbij u het opzuigen van de magnetische kralen vermijdt.
8. Evalueer de zuiverheid van het geëxtraheerde DNA door de absorptie te meten bij 260 nm (A₂₆₀) en 280 nm (A₂₈₀). Bereken de A₂₆₀/A_{280-verhouding} , die idealiter groter zou moeten zijn dan 1,8 voor zeer zuiver DNA.

4. qPCR voor de detectie van H. pylori en resistentie tegen antibiotica

OPMERKING: We hebben qPCR uitgevoerd voor de detectie van H. pylori-infectie door het ureA-gen te amplificeren. Alle producten voor negatieve kwaliteitscontrole zijn steriel, gezuiverd water. Het positieve kwaliteitscontroleproduct in de H. pylori-nucleïnezuurdetectiekit is geïnactiveerde H. pylori-standaardkorrels (ATCC 43504). Een CT_≤ 30 met een typische S-vormige curve wordt als positief beschouwd.

1. Afhankelijk van het aantal te testen monsters, neemt u het gevriesdroogde H . pylori-preparaat uit de set en draait u het snel rond om het gevriesdroogde poeder op de bodem van de buis te houden.
2. Open voorzichtig het deksel van het gevriesdroogde preparaat; neem het nucleïnezuur van het te testen monster; voeg 25 μl nucleïnezuur van het monster toe aan het gevriesdroogde preparaat; En dek de buis goed af.
3. Schud en meng het PCR-reagens gelijkmatig gedurende 8-10 s en draai het dan snel 3-5 s.
4. Bereid voor elk monster op een plaat met 32 putjes 25 μl van het PCR-reactiemengsel (gevriesdroogd poeder [met het Taq-enzym (5 E/μl), desoxyribonucleosidetrifosfaat (2,5 mmol/l), UNG-enzym (2 E/μl), ureA voorwaartse (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') en omgekeerde (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') primers (40 μmol/l)]) en 25 μl (2,5 μg) van het geëxtraheerde DNA.
5. Voer het qPCR-bord met 32 putjes uit op de qPCR-machine. Programmeer de thermische cycler: 42 °C en 95 °C (beide voor één cyclus) gedurende elk 2 minuten; 95 °C gedurende 10 s en 65 °C gedurende 45 s (twee stappen zijn één cyclus) gedurende 10x; 95 °C gedurende 10 s en bij 58 °C gedurende 45 s (twee stappen zijn één cyclus) gedurende 35 cycli.
6. Analyseer de gegevens met behulp van specifieke software voor qPCR en laat het instrument automatisch basislijndrempels selecteren.

5. Statistische analyse

1. Gebruik de chi-kwadraattoets om de experimentele gegevens te analyseren om de consistentie tussen deze methode en de qPCR-resultaten te evalueren en vergelijk het positieve percentage van deze technologiescreening met de positieve percentagegegevens van H. pylori-infectie op grotere schaal (bijv. landelijk). Beschouw verschillen als statistisch significant bij P < 0,05.

Resultaten

Vragenlijst enquête
In totaal namen 261 deelnemers deel aan het onderzoek, waaronder 144 vrouwen en 117 mannen, in de leeftijd van 4 tot 99 jaar. De gemiddelde leeftijd van de proefpersonen was 48,30 ± 17,61 jaar. Er waren 17 minderjarigen (0-17 jaar), 202 volwassenen (18-64 jaar) en 42 oudere deelnemers (>64 jaar). De resultaten van de vragenlijst worden weergegeven in tabel 1. De meerderheid (90,8%) van de proefpersonen vond het nodig om een H ....

Discussie

H. pylori vertegenwoordigt een van de meest verspreide bacteriële infecties over de hele wereld¹⁵. Uit de resultaten van de vragenlijst bleek dat 55,2% van de bevolking niet op de hoogte was van H. pylori, terwijl 90,8% van mening was dat H. pylori-screening noodzakelijk is. Deze bevindingen onderstrepen het belang van het implementeren van H. pylori-screeningprogramma's in economisch achtergestelde en afgelegen gebieden

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DNA extractiekit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	Geen
H. pylori fecal antigeendetectiekit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	Geen
H. pylori nucleïnezuurdetectiekit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	Geen
Real-time fluorescente kwantitatieve PCR	Shanghai Hongshi medische behandelingstechnologie co., ltd	20183221659	Geen
Statistische product- en serviceoplossingen	IBM-bedrijf	Geen	Geen