Methodenartikel

Nieuw eilandjesmodel voor 3D-studie van endotheel- en β-celinteracties: relevantie voor het screenen van cytoprotectieve middelen

DOI:

10.3791/68220

⸱

17 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een gedetailleerde procedure om stabiele sferoïden van muisachtige alvleeskliereilandjes te genereren, en gedetailleerde methoden voor 3D-kleuring, schoonmaak en montage, aangepast aan hun kleine grootte.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de productie van kleine stabiele sferoïden, hun kweek en 3D-beeldvorming, voor de studie van de interacties tussen endotheel- en insulineproducerende β cellen in een 3D-model van pancreaseilandjes. De 150-200 μm sferoïden, die het laagste bereik van eilandgrootte weerspiegelen, werden bereid uit een geselecteerde verhouding die 1 intra-eiland endotheelcellen (MS-1 cellen) combineerde met 20 insuline-afscheidende cellen (β-TC-6). Kleuring, opruiming en montage van uitdagingen van kleine sferoïden en hun aanpak door gebruik te maken van agarose met een laag smeltpunt en de CUBIC-clearingtechniek worden gedetailleerd, evenals belangrijke punten voor een efficiënte analyse van de 3D-structuur met verschillende probes. Gegevens geven aan dat NTPDASE-ectonucleotidase 3 niet colokaliseert met insuline in het sferoïdemodel, wat wijst op variërende rijpheid en functionele niveaus van β-TC6 en dat de volledige procedure ook kan worden toegepast op geïsoleerde alvleeskliereilandjes, met duidelijke onderzoeken van intra-eilandjes. Deze bevindingen onderstrepen de effectiviteit van het 3D-beeldvormingsprotocol bij het aan het licht brengen van complexe pancreascelorganisatie en interacties binnen het eilandjesmodel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantatie van het pancreaseilandje wordt vaak bemoeilijkt door een onmiddellijke bloedgemedieerde ontstekingsreactie (IBMIR), die de intra-eiland endotheelcellen (IEC) aanzienlijk beschadigt met invloed op de perfusie en functie van het transplantaat. Op de lange termijn worden bij patiënten, 4 jaar na transplantatie,beschreven een verminderde massa functionele eilandjes en het verlies van insulineonafhankelijkheid. Hoewel muis- of rattenmodellen van eilandjestransplantatie zijn ontwikkeld, ontbreken gestandaardiseerde modellen om farmacologische doelen voor de preconditionering van eilandjes te onderzoeken, die van bijzondere relevantie zijn in de context van cytokine-gedreven graftschade veroorzaakt doorIBMIR. Inderdaad, een sferoide constructie is bijzonder geschikt voor het identificeren van nieuwe farmacologische doelwitten en de evaluatie van cytoprotectieve moleculen tegen cytokine-geïnduceerde celdysfunctie. Bovendien biedt het een alternatieve benadering om het gebruik van diermodellen van type 1 diabetes en eilandtransplantatie te beperken.

Het vinden van geschikte kleurings-, optische opklarings- en montageomstandigheden voor kleine sferoïden van een eilandjesgrootte blijft een uitdaging. In de literatuur beschrijven zeer weinig studies de omgang met kleine sferoïden en hun belangrijkste structurele kenmerken. De moeilijkheid ontstaat ook uit de noodzaak om weefselpenetratie, signaalbehoud en structurele integriteit in balans te brengen, terwijl de kwetsbare aard van deze miniatuur 3D-celstructuren behouden blijft. Daarnaast hebben conventionele kleuringsmethoden vaak moeite om een uniforme etikettering van sferoïden te bereiken. Dit probleem wordt verergerd door de dichte cellulaire organisatie, die de diffusie van reagentia kan belemmeren vanwege de beperkte penetratie van antilichamen en kleurstoffen 3,4. Ten slotte moet het proces van optische clearing, cruciaal voor het verminderen van de lichtverstrooiing op de achtergrond en het verbeteren van beelddiepte, zorgvuldig worden geoptimaliseerd om te voorkomen dat de structuur van de bol wordt verstoord of biologische eigenschappenverandert 5.

Het monteren van kleine sferoïden voor 3D-microscopie vormt een andere uitdaging. Traditionele montagemedia bieden mogelijk onvoldoende ondersteuning voor deze kwetsbare structuren, wat kan leiden tot hun vervorming of instorting tijdens beeldvorming. Bovendien moet de brekingsindex-matching die vereist is voor een optimale beeldkwaliteit nauwkeurig worden gecontroleerd om een nauwkeurige visualisatie te garanderen over de diepte van de sferoïde 6,7. De ontwikkeling van protocollen die zijn afgestemd op kleine sferoïden wordt verder bemoeilijkt door de diversiteit aan celtypen en experimentele omstandigheden die in sferoidculturenworden gebruikt 3. Ten slotte is de noodzaak van gespecialiseerde benaderingen om de integriteit van meerdere celpopulaties gedurende de kleurings- en clearingprocessen te behouden cruciaal voor de beoordeling van celreacties.

Om de specifieke uitdagingen van de studie van IBMIR-gemedieerde eilandjesstress aan te pakken, werd een 2000-cel sferoïdemodel ontworpen, dat muis-IEC combineert en insuline die β cellen afscheiden, met een verhouding van 1:20 IEC tot β cellen vergelijkbaar met die waargenomen in een alvleeskliereilandje. Daarnaast hebben eerdere experimenten aangetoond dat de structuur levensvatbaar blijft gedurende 96 uur, waardoor een fysiologisch relevant 3D-model wordt geleverd voor de observatie van korte (uur-bereik) of langere stress-geïnduceerde celresponsen (dagen) en hun farmacologische modulatie. Het sferoidmodel bestaat uit MS-1 muisachtige intra-eiland endotheelcellen, kenmerken van de eilandjesmicrovasculatuur, en constitutieve insuline die β cellen afscheidt, β-TC-68. Het was ontworpen om het kleinste dimensiebereik van pancreaseilandjes (50-200 μm diameter) en hun gemiddelde celgetal9 nauwkeurig na te bootsen.

Er wordt een nieuwe oogst- en kleuringsmethodologie gerapporteerd, specifiek geoptimaliseerd voor het hanteren van kleine sferoïden (150-200 μm in diameter), die optimale penetratie van fluorescerende kleurstoffen en antilichamen door de hele sferoïde structuur en minimale achtergrond mogelijk maakt. Het protocol omvat een montageprocedure waarbij agarose (LMPA) met een laag smeltpunt wordt gebruikt om zachte structurele ondersteuning te bieden aan gevoelige sferoïden, terwijl optimale brekingsindexafstemming mogelijk is. LMPA is een gemodificeerde vorm van agarose met verminderde gelering (ongeveer 27 °C) en smelttemperatuur (ongeveer 65 °C) die de integriteit van het monster tijdens het inbedden behoudt en een optisch heldere matrix creëert met minimale autofluorescentie 4,6. Ten slotte wordt de clear unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis (CUBIC)10-methode gebruikt voor optische clearing om maximale visualisatie van interne structuren mogelijk te maken en de integriteit van kwetsbare cel-celinteracties te behouden 5,6,10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van menselijk alvleesklierweefsel en alle experimentele protocollen werd goedgekeurd door het Ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek van de Franse overheid (Directoraat-Generaal voor Onderzoek en Innovatie, Bio-ethische Eenheid) en geregistreerd onder nummer DC-2019-3439. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de wettelijke voogden van alle betrokkenen.

1. Sferoide voorbereiding

OPMERKING: De muis IEC-lijn MS-1 en de muis β-pancreascellijn β-TC6 werden gelijktijdig gekweekt om een voldoende celhoeveelheid voor de sferoidkweek te verkrijgen. MS-1 werd gekweekt in T75-adherent-cel kolven in DMEM High Glucose medium met 4,5 g/L glucose, met 5% foetaal runderenserum en 1% penicilline/streptomycine in een vochtige atmosfeer bij 37 °C. Passages werden uitgevoerd bij confluentie (2 dagen kweek) na loskoppeling met Trypsine EDTA 1x en drie wasbeurten in Hank Balanced Solution (HBSS). β-TC6 werden gekweekt in T75 voor moeilijk hechtende cellen in DMEM High Glucose medium met 4,5 g/L glucose, met 15% foetaal rundserum en 1% penicilline/streptomycine in een vochtige atmosfeer van 37 °C. Passages werden uitgevoerd bij β-TC6 confluentie (10 dagen kweek) na loskoppeling met Trypsine EDTA 1x en 3 wasbeurten in Hank Balanced Solution (HBSS).

  1. Bereid de sferoïdecultuurplaat voor
  2. Was de plaat met 500 μL anti-adhesie spoeloplossing die door de fabrikant wordt verstrekt om celadhesie te voorkomen en de vorming van sferoiden te bevorderen.
  3. Centrifugeer de plaat op 1.300 x g gedurende 5 minuten in een schwenkbare emmerrotor met plaathouders op kamertemperatuur.
  4. Bekijk de plaat onder een lichtmicroscoop om te verzekeren dat er geen belletjes in de microwells achterblijven. Zo ja, centrifugeer dan een tweede keer op 1.300 x g gedurende 5 minuten.
  5. Verwijder anti-hechtingsspoeling en was de put 3 keer met 1 ml warme HBSS.
  6. Verwijder HBSS en vervang door 500 μL warm sferoide medium: DMEM High Glucose met 4,5 g/L glucose, 10% foetaal rundserum en 1% penicilline/streptomycine.
  7. Houd de plaat op 37 °C in een vochtige atmosfeer terwijl je de sferoiduspensie voorbereidt.
  8. Incubeer MS-1 en β-TC6 gelijktijdig met trypsine-oplossing en tel de levende cellen in elke lijn.
    OPMERKING: Bij het zaaien worden de sferoïden gevormd met de celverhouding van 1 IEC tot 20 β die typisch is voor pancreaseilandjes. Gebruik een 24-put sferoïde-cultuurplaat, waarbij elke put 300 microwells bevat die één sferoïde van 2000 cellen kunnen huisvesten, voor een totaal van 600.000 cellen per put. In het huidige onderzoek toonden metingen identieke sferoide volumes aan die werden ingenomen door de geselecteerde β-TC6- en MS1-cellijnen na de 48-uur sferoidkweek.
  9. Meng de twee cellijnen tot een verhouding van 1 op 20 voor 24 putten en suspendeer ze vervolgens in 24 mL sferoidmedium.
    OPMERKING: Gebruik een pipet van 10 mL of 25 mL in zuigbeweging om de ophanging te homogeniseren.
  10. Pipette 1 mL per put en voer een zuig-stroombeweging uit om de celsuspensie gelijkmatig in de put te verdelen.
  11. Centrifugeer de plaat op 130 x g gedurende 5 minuten in een schwenkbare emmerrotor met plaathouders op kamertemperatuur.
  12. Bekijk de plaat onder een microscoop om te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn over de microwells.
    OPMERKING: Tijdens deze centrifugatiestap gebruik je hoge versnellings- en vertragingsraten (70%-90% van de acceleratie- en vertragingsschalen), anders zullen de celklonten naar de zijkant van de microwell verplaatsen.
  13. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5%CO2.
  14. Monitor de vorming en groei van de sferoiden met een lichtmicroscoop.
    OPMERKING: β-TC6 / MS-1 sferoïden zouden na 24 uur kweek moeten beginnen te vormen en na 48 uur een bolvorm bereiken. De levensvatbaarheid kan worden gemonitord met trypan blue na sferoidvernieling door trypsine in gedupliceerde monsters en werd gedurende 96 uur (80%-90%) gehandhaafd.

2. Sferoidenoogst en kleuring

  1. Suspendeer de sferoïden voorzichtig opnieuw met een P1000-pipet in hun medium.
  2. Werp de sferoïden uit in kleine volumes in een 15 mL Falcon en centrifugeer op 130 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur
  3. Aspireer het medium voorzichtig terwijl je de pellet met de sferoïden vermijdt.
  4. Was de pellet twee keer met 2 ml HBSS, voorzichtig, om dissociatie van de sferoïden te voorkomen, en centrifugeer op 130 x g gedurende 5 minuten.
  5. Onder een chemische kap verwijder je de HBSS en suspendeer je de sferoïden opnieuw in 1 mL 4% PFA-oplossing bij 4 °C om ze te fixeren.
  6. Centrifugeer de buis op 130 x g gedurende 5 minuten, gooi de 4% PFA-oplossing weg en was 3 keer met 2 ml 1x PBS (bereid in laboratoriumkwaliteit ultrazuiver water).
  7. Opnieuw ophangen in 2,5 ml HBSS.
  8. Doseer de sferoiduspensie in een 6-well plaat.
  9. Onder een verrekijker vergrootglas pluk je 20 tot 30 sferoïden met een P200-pipet en plaats je ze in een buis van 1,5 mL.
    OPMERKING: Elke 1,5 mL buis is een kleuringsconditie met 20 tot 30 sferoïden. Onder de 20 geoogste sferoïden wordt het moeilijk ze te zien wanneer ze vervolgens opnieuw worden opgehangen.
  10. Evenwichtig de volumes van de 1,5 mL buizen en centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Vanaf dat moment worden alle aspiratiestappen van de oplossing uitgevoerd met behulp van een vergrootglas. Het is erg moeilijk om sferoïden te zien onder kunstlicht. Voer overdag altijd de volgende stappen uit, met de buizen tegen het daglicht gehouden. Alle oplossingen worden geaspireerd met een P1000-tip met een P10-tip aan het uiteinde.
  11. Verwijder zoveel mogelijk HBSS zonder de sferoïden opnieuw te suspenderen.
  12. Susse de sferoïden opnieuw in 400 μL afkoeloplossing (0,5 M glycine in 1x PBS (pH 7-7,4)) om toekomstige achtergrondruis veroorzaakt door achtergebleven aldehyden van de PFA-fixatie te voorkomen. Broeden op 37 °C gedurende 2 uur.
  13. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten en pipetteer de afkoeloplossing.
  14. Resuspendeer in 400 μL penetratiebuffer (0,2% Triton X-100, 0,3 M glycine, 20% DMSO in 1x PBS). Dit zal helpen de penetratie van antilichamen en nucleaire sondes te verbeteren. Broeden op 37 °C gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Vanaf dit stadium vestigen de sferoïden zich vanzelf en hechten ze zich niet langer aan de buiswand. Centrifugatie is niet langer nodig als volumes zachtjes worden geaspireerd zonder de sferoidepellet te verstoren. Centrifugeer indien nodig op 800 x g gedurende 5 minuten.
  15. Verwijder de penetratiebuffer en incubeer in 400 μL blokkeringsbuffer (0,2% Triton X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% geitenserum in 1x PBS) 's nachts bij 37 °C.
  16. Verwijder de blokkerende buffer en incubeer 's nachts bij 37 °C in 300 μL primaire antistofoplossing (0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% Geitenserum in 1x PBS).
    OPMERKING: Gebruikte primaire antilichamen zijn: anti-CD31 (eindconcentratie van 2,2 μg/mL), anti-Integrine β1 (1,43 μg/mL), anti-Insuline (0,66 μg/mL) en anti-muis NTPDase311 (verdunning 1:1000) (zie Materiaaltabel). Controle-IgG's van respectievelijke identieke isotypen moeten op dezelfde structuur worden gevalideerd om positieve labeling vast te stellen met fluorescentiemicroscopie.
  17. Gooi de primaire antistofoplossing weg en was 3 keer met 400 μL wasbuffer (0,2% Tween 20, 1% BSA in 1x PBS). Schud 5 minuten tussen de wasbeurten.
  18. Incubeer 300 μL van de secundaire antistofoplossing (DAPI (2 μg/mL), 0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% Geitenserum in 1x PBS) 's nachts bij 37 °C. Bescherm de buizen met aluminiumfolie.
    OPMERKING: DAPI moet altijd worden toegevoegd aan de kleuringsomstandigheden, omdat dit het makkelijker maakt om sferoïden te vinden tijdens microscopische beeldvorming en helpt om de verschillende fluoroforen/kleurstoffen niet te bleken. Alle secundaire antilichamen hebben een eindconcentratie van 2 μg/mL (zie Materiaaltabel).
  19. Gooi de secundaire antistofoplossing weg en was 3 keer met 400 μL van een tweede wasbuffer: 0,2% Tween 20, 1% BSA in 1x PBS. Houd de laatste wasbeurt en bewaar de buizen op 37 °C tot ze dezelfde dag monteren.

3. Oplossingsvoorbereiding

  1. Optische zuiveringsoplossing bereiding
    OPMERKING: De optische clearing-oplossing volgt de CUBIC10-procedure en is voorbereid zoals voorgesteld door Gunasingh et al.4. De componentverhoudingen worden gegeven in percentages van het eindgewicht van de oplossing (w/w), omdat Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) ethyleendiamine te viskeuze is om te pipetteren en moet worden gewogen.
    1. In een glazen fles weeg je 9% (w/w) N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethyleendiamine, 22% (w/w) ureum, 44% (w/w) sucrose, 0,1% (w/w) Triton X-100 en 24,9% (w/w) laboratoriumkwaliteit ultrazuiver water.
      OPMERKING: Ongeveer 60 g oplossing is nodig om een 24-well-plaat te clearen.
    2. Voeg een magnetische staaf toe die is aangepast aan de diameter van de fles.
    3. Verhit en roer de oplossing tot 56 °C. Houd een controleglas gevuld met water op hetzelfde bord om de temperatuurstijging te monitoren.
    4. Regelen de roersnelheid om een vloeiende vortex te behouden en roer de oplossing totdat alle verbindingen volledig zijn opgelost. De oplossing moet volledig vloeibaar en helder zijn. Dit kan tot 1 uur duren.
    5. Houd het op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: De reinigingsoplossing moet minstens 24 uur voor optische ontginning worden voorbereid, zodat de oplossing kan ontgassen en eventuele bubbels die deze bevat kan verwijderen. Om belletjes te voorkomen, moet je de oplossing nooit meer schudden. Nooit in de koude opslag bewaren.
  2. 2% LMPA oplossingsvoorbereiding
    1. Weeg 0,5 g LMPA op een precisiebalans en plaats het in een 100 mL Erlenmeyer-fles.
      VOORZICHTIG: Neem geen kleinere Erlenmeyer, want er is risico op brandwonden als het overloopt.
    2. Oplos in 25 mL 1x PBS bij kamertemperatuur.
    3. Meng het poeder grondig in de 1x PBS door voorzichtig de Erlenmeyer-kolf te roeren.
      VOORZICHTIG: Voor de volgende stap is het essentieel om beschermende uitrusting te dragen: handschoenen en een masker voor de ogen en het gezicht, om te beschermen tegen spetters en brandwonden.
    4. Verwarm de Erlenmeyer-kolf in de magnetron.
    5. Let op wanneer de oplossing begint te koken (aanwezigheid van belletjes in de vloeistof), en verwijder het direct voordat het overkookt.
    6. Roer de Erlenmeyer voorzichtig om het poeder te verwerken.
      VOORZICHTIG: Roer niet te hard, want de vloeistof kan overlopen/overkoken en spetteren.
    7. Zet de Erlenmeyer terug in de magnetron, herhaal dit totdat de LMPA volledig is opgelost.
    8. Verwijder de Erlenmeyer en aliquot snel 1 mL 2% LMPA-oplossing voordat de LMPA stijgt in 1,5 mL buizen. Bewaar op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het proces kost veel tijd. Bereid de oplossing van tevoren voor en bewaar deze voor later gebruik.

4. Montage en optische clearing

  1. Verwarm de plaatcentrifuge voor tot 40 °C, waarbij een lange cyclus wordt uitgevoerd om de monsterplaat voor te bereiden.
    OPMERKING: LMPA gelt bij 30 °C. Laat de centrifuge niet onder de 40 °C lopen. Als de centrifuge het toelaat, verhoog dan tot 50 °C.
  2. Vloeibaar maken van aliquots van 2% LMPA in een waterbad of buisverwarmer bij 70 °C gedurende 5 tot 10 minuten.
  3. Verlaag en houd de temperatuur van de 2% LMPA op 55 °C.
  4. Plaats de beeldplaat voorzichtig op de plaatverwarmer, voorverwarmd tot 50 °C.
    OPMERKING: Wees voorzichtig dat je het fragiele polymeer dat als basis voor de putten wordt gebruikt niet breekt of krasst.
  5. Wees voorzichtig dat de plaat heet is voordat je de 2% LMPA toevoegt. Het mag op dit moment niet samenwerken.
  6. Pipetteer 200 μL van 2% LMPA in elke put. Bedek de hele onderkant van de steun om een eerste vloeibare basis te verkrijgen, wat een vloeibaardere verdeling van de sferoïden mogelijk maakt.
  7. Verwijder de wasbuffer uit de buizen, suspendeer de sferoïden opnieuw in 300 μL van 2% LMPA en pipetteer ze direct in hun put. Voer altijd een voorzichtige resuspension uit om bellen te voorkomen.
  8. Bedek de plaat met aluminiumfolie om de fluoroforen te beschermen.
  9. Weeg het bord snel zonder aluminiumfolie en zet het terug in de plaatverwarmer.
  10. Bereid een bord met 24 putten voor en voeg water toe voor evenwicht.
  11. Verwijder snel de plaat met aluminiumfolie uit de plaatverwarming om de fluoroforen te beschermen die gekoppeld zijn aan de secundaire antilichamen. Houd het in de hand, leg het niet op een koud oppervlak.
  12. Verwijder de aluminiumfolie en plaats die in de centrifuge van de plaat.
  13. Centrifugeer op 1000 x g gedurende 15 minuten bij 40 °C. Controleer de temperatuur van de rotor, die op kamertemperatuur moet zijn.
  14. Tijdens de centrifugatie bereid je een ijsbakje voor: plat het ijs zodat de plaat op een vlak oppervlak kan worden geplaatst.
  15. Haal het bord eruit en leg het op het ijs, waarbij het dienblad of bord wordt bedekt met aluminiumfolie. Laat het bord 10 minuten op ijs staan.
  16. Haal het bord uit het ijs en laat het 20 minuten in het aluminium staan om op kamertemperatuur te stabiliseren.
  17. Pipette 1 tot 1,5 mL van de reinigingsoplossing per put, bedek met aluminiumfolie en laat optisch helder zijn bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, gedurende minstens 48 uur.
    OPMERKING: Bewaar het bord nooit bij 4 °C. De LMPA kan samentrekken, loskomen van de bodem van de put en in de clearing-oplossing blijven drijven. Afbeelding binnen een week na het opruimen.

5. Beeldvorming

  1. Gebruik een confocale draaiende schijfmicroscoop, kies (minimaal) het 30x objectief.
  2. Behoud de clearing-oplossingen, omdat ze de brekingsindexen homogeniseren en de 3D-beeldvorming vergemakkelijken.
  3. Vind de sferoïden door het DAPI-kanaal te selecteren om te voorkomen dat de andere fluoroforen bleken.
  4. Verzamel beelden met behulp van de Z-stack-functie. Selecteer de boven- en onderkant van de sferoïde en plaats de optische sneden 10 μm uit elkaar.
    OPMERKING: Beeldverwerving en beeldanalyse werden uitgevoerd op het beeldplatform van de CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de effectiviteit van de etikettering en optische clearing te beoordelen, werden verschillende modellen aan hetzelfde protocol onderworpen en vervolgens vastgesteld (Figuur 1). Sferoïden met verhoudingen van 1 IEC tot 20 β-cellen en 1 IEC tot 50 β-cellen werden gekweekt volgens de hierboven beschreven methode. Opmerkelijk is dat de verhouding van 1 IEC tot 20 β-cellen ongeveer die van een menselijk pancreaseilandje benadert. Het gebruik van trypanblauw om ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een sferoid model ontwikkeld dat MS-1 murine IEC en muis β cellen β-TC6 nabootst en de driedimensionale structuur van alvleeskliereilandjes nabootst. Dit model is geschikt voor de analyse van stress-geïnduceerde IEC-disfunctie over 72 uur en de impact daarvan op de levensvatbaarheid en functie van β-cellen, met betrekking tot onderzoek naar eilandtransplantaties. Belangrijk is dat het sferoid, bestaande uit muiscellen, homogeen van aard was en een relevante intra-eiland endothelial...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs zijn Pascal Kessler van het PICSTRA imagingplatform dankbaar voor deskundige hulp bij spinning disk microscopie en het extraheren van de ruwe labelgegevens uit de Z-stack. Auteurs willen het vriendelijke geschenk van gezuiverde menselijke eilandjes erkennen door Dr. W. Bietiger, Dr. A. Langlois en Dr. K. Bouzakri van het European Center for the Study of Diabetes (CEED, Straatsburg, Frankrijk)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µ-plate 24 well Black ID 14 mm IBIDI82426
AggreWell 800 ( 24 wells)StemCell34815
Anti-Adherence Rinsing solution StemCell7010
Anti-CD31 antibody [P2B1]abcamab24590Finale concentratie 2,2µg/mL
Anti-Integrin β1 Antibody, clone MB1.2MerckMAB1997 Finale concentratie 1,43µg/mL
Cell culture flask, T-75, oppervlak, oppervlak : Cell+, filtreerkapSarstedt83.3911.302β-TC6-cultuur
Cell culture flask, T-75, oppervlak: Standaard, 2-positie schroefdopSarstedt83.3911.02MS-1-cultuur
DAPI dihydrochlorideThermofisher,D1306Finale concentratie 2µg/mL
Dimethyl Sulfoxide SigmaD8418-250ML
DMEM, hoge glucose, GlutaMAX™ Supplement, pyruvateThermofischer scientific31966047
Dulaglutide
DulaglutideLillyTrulicity 1,5 mg pen
Fetal Bovine SerumBiowestS1810-500
GlycineSigmaG7126-1KG
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21435Finale concentratie 2µg/mL
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488Thermofischer A-11029Finale concentratie 2µg/mL
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 633ThermofischerA-21071Finale concentratie 2µg/mL
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21434Finale concentratie 2µg/mL
Goat serumSigmaS26-100ML
HBSS zonder Calcium & magnesium  &fenol roodCorning21-022-CV
Insulin (C27C9) Rabbit mAbCell signaling3014SFinale concentratie 0,66µg/mL
Isolated human pancreatic islet Centre Européen d'Etude du Diabete (CeeD)Vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Karim Bouzakri. Klinische kwaliteit, geïsoleerd volgens richtlijnen.
Low geling temperature AgaroseMerckA9414-10G
MS-1 cellenATCCCRL-2279
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS 1xFischer scientific15670799
PBS 10xEuromedexET330-AVerdund 1x in laboratoriumkwaliteit ultrapuur water
Penicillin-StreptomycinPAN BiotechP06-07100
Polyclonal guinea pig anti-mouse NTPDase3 antibodies mN3-1CI4; mN3-2C(I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpVerdunning 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) ethyleendiamine Sigma122262-1L
Spinning-disk Olympus IXplore SPIN Olympus Scientific Solutions
Sucrose voor moleculaire biologieSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Bioquality Laboratory GradeEuromedex2000-A
Trypsin/EDTA (10x)PAN BiotechP10-025100
Tween-20Euromedex//
UreaSigmaU-5128
β-TC6 cellenATCCCRL-11506

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eilandjes sfero demodelInteractie tussen EndotheelcellenInteractie tussen B tacellen3D beeldvormingPancreatische EilandjesCytoprotectieve ScreeningSfero dekweekCUBIC clearingInsulinesecreterende CellenLaagsmeltende Agarose

Gerelateerde artikelen