Methodenartikel

Identificatie van Mycobacterium-soorten door middel van DNA-microarray-chipmethode

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een DNA-microarray-chipmethode voor het identificeren van Mycobacterium-soorten , die de diagnostische nauwkeurigheid en efficiëntie van verwante ziekten voor klinisch gebruik zal verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een DNA-microarray-chipmethode die is ontworpen voor de nauwkeurige identificatie van Mycobacterium-soorten . Door gebruik te maken van asymmetrische PCR-amplificatie- en hybridisatieprincipes, richt deze methode zich op 17 veel voorkomende mycobacteriën, waaronder die in het Mycobacterium tuberculosis-complex en verschillende niet-tuberculeuze mycobacteriën. Het is van toepassing op een breed scala aan klinische monsters zoals sputum, pus, bronchoalveolaire lavagevloeistof, hersenvocht en prikvloeistof van patiënten die verdacht worden van mycobacteriële ziekten. De test omvat het versterken van doelsequenties in het Mycobacterium-genoom door middel van asymmetrische PCR, gevolgd door hybridisatie met de sondes op de microarray-chip. De unieke opstelling van de sonde (5x herhaald in een microarray met 12 rijen x 10 kolommen) en het gebruik van controletasters verhogen de betrouwbaarheid. Klinische onderzoeken met 1.724 monsters toonden hoge prestaties aan. De methode bereikte 100% klinische specificiteit, gevoeligheid en algehele overeenstemming in vergelijking met sequentieresultaten, met uitzondering van twee zeldzame niet-tuberculeuze mycobacteriële monsters buiten het detectiebereik. Deze DNA-microarray-chipmethode biedt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van traditionele diagnostische technieken, verkort de diagnosetijd en biedt een uitgebreidere detectie, waardoor het een groot potentieel heeft voor de diagnose en behandeling van mycobacteriële ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium, een geslacht van bacteriën, omvat een diverse groep organismen met aanzienlijke implicaties voor de gezondheid van mens en dier. Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose (tbc), is al lang een wereldwijde plaag voor de gezondheid. Ondanks tientallen jaren van inspanningen op het gebied van preventie en behandeling, blijft tuberculose een grote bedreiging voor de volksgezondheid, verantwoordelijk voor een duizelingwekkend aantal jaarlijkse sterfgevallen en nieuwe infecties wereldwijd 1,2. Niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM) worden ook steeds meer erkend als belangrijke pathogenen, vooral in specifieke patiëntenpopulaties en omgevingsomgevingen.

De nauwkeurige identificatie van Mycobacterium-soorten is de hoeksteen van een effectief ziektebeheer 3,4. Traditionele diagnostische methoden hebben inherente beperkingen. Op cultuur gebaseerde technieken, waarop van oudsher werd vertrouwd, zijn notoir tijdrovend. Het proces van het isoleren en kweken van mycobacteriën kan weken tot maanden duren, waarbij patiënten ziekteprogressie en mogelijke overdracht op anderen kunnen ervaren. Bovendien zijn sommige mycobacteriële soorten buitengewoon moeilijk te kweken, wat leidt tot vals-negatieve resultaten en vertraagde of onjuiste behandeling 5,6.

Zuurvaste kleuring, een andere veelgebruikte methode, kan mycobacteriën identificeren op basis van hun unieke celwandeigenschappen die bestand zijn tegen ontkleuring. Het mist echter de specificiteit om onderscheid te maken tussen verschillende Mycobacterium-soorten , wat slechts een brede indicatie geeft van de aanwezigheid van mycobacteriën7. Moleculaire methoden zoals polymerasekettingreactie (PCR) zijn naar voren gekomen als alternatieven om enkele van deze nadelen te overwinnen. PCR kan mycobacterieel DNA sneller detecteren dan kweekmethoden, waardoor een snellere diagnose mogelijk is. Conventionele PCR-testen zijn echter doorgaans gericht op een beperkt aantal genen en bieden mogelijk geen uitgebreide soortidentificatie, vooral wanneer het gaat om nauw verwante Mycobacterium species5.

DNA-microarray-technologie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van microbiologie en diagnostiek. Het biedt de mogelijkheid om tegelijkertijd meerdere genetische doelen te analyseren, waardoor een uitgebreider en gedetailleerder beeld wordt verkregen van de microbiële populatie 8,9. Recent onderzoek op dit gebied heeft het potentieel en het belang van geavanceerde moleculaire technieken voor de identificatie van Mycobacterium verder belicht. Een studie van Wang et al.10 toonde bijvoorbeeld de verbeterde gevoeligheid en specificiteit aan van een gemodificeerde DNA-microarray-chip bij het detecteren van zeldzame Mycobacterium-soorten in een klinische setting. Hun bevindingen benadrukten de waarde van continue optimalisatie van microarray-technologie. Een andere studie van Wang en collega's11richtte zich op de integratie van DNA-microarray-gegevens met klinische resultaten bij tbc-patiënten. De resultaten gaven inzicht in de prognostische waarde van nauwkeurige identificatie van Mycobacterium-soorten en het potentieel voor gepersonaliseerde geneeskunde.

Principe van testen
Deze kit maakt gebruik van DNA-microarray-chiptechnologie, gecombineerd met asymmetrische polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie- en hybridisatieprincipes, voor de identificatie van Mycobacterium-soorten . De kit bevat een Mycobacterium-identificatiechip en asymmetrische PCR-amplificatiereagentia. De chip wordt gefixeerd met soortspecifieke sondes voor de detectie en identificatie van Mycobacterium-soorten . De detectiedoelen omvatten 17 klinisch veel voorkomende soorten of groepen, zoals het Mycobacterium tuberculosis-complex , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae en Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum en Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai en Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi en Mycobacterium smegmatis.

De detectie van deze 17 Mycobacterium-soorten is van cruciaal belang voor een nauwkeurige klinische diagnose en een op maat gemaakt patiëntenbeheer. Het Mycobacterium tuberculosis-complex (MTBC) krijgt prioriteit vanwege zijn rol bij tuberculose, waardoor onmiddellijke isolatie en multidrugtherapie nodig zijn om de overdracht te beteugelen en resistentie tegen geneesmiddelen aan te pakken. Soorten binnen het Mycobacterium avium-intracellulare-complex (MAC), zoals M. avium en M. intracellulare, treffen voornamelijk immuungecompromitteerde personen (bijv. HIV/AIDS) of mensen met chronische longziekte, waarvoor langdurige op macrolide gebaseerde regimes nodig zijn. Snelgroeiende mycobacteriën (RGM's) zoals M. abscessus en M. fortuitum zijn berucht om hun antibioticaresistentie en veroorzaken vaak ernstige huid-, weke delen of longinfecties, waardoor agressieve combinaties van chirurgie en gerichte antibiotica (bijv. amikacine, macroliden) nodig zijn. Milieusoorten zoals M. gordonae of M. smegmatis zijn frequente contaminanten, maar kunnen in specifieke contexten opportunistische infecties veroorzaken, waardoor een zorgvuldige klinische correlatie nodig is om onnodige behandeling te voorkomen. Pathogenen zoals M. marinum (geassocieerd met blootstelling aan aquatisch water) en M. ulcerans (die Buruli-ulcus veroorzaakt) hebben verschillende epidemiologische niches, die als leidraad dienen voor beoordelingen van de blootstellingsgeschiedenis. Zeldzame maar klinisch relevante soorten (bijv. M. szulgai, M. malmoense) bootsen tuberculose na en vereisen soortspecifieke regimes. Nauwkeurige identificatie is van het grootste belang, aangezien de duur van de behandeling, de selectie van het geneesmiddel (bijv. gevoeligheid voor rifampicine in M. kansasii versus intrinsieke resistentie bij NTM's) en de prognose drastisch variëren. Moleculaire diagnostiek en antimicrobiële gevoeligheidstesten zijn essentieel om de resultaten te optimaliseren, met name bij immuungecompromitteerde populaties of complexe infecties.

Eerst worden de doelsequenties in het genoom van Mycobacterium geamplificeerd door middel van asymmetrische PCR. Vervolgens worden de versterkte producten gehybridiseerd met de sondes op de chip. Als het doelwit Mycobacterium in het monster aanwezig is, zullen de geamplificeerde producten specifiek binden aan de overeenkomstige sondes op de chip. Ten slotte kan door het scannen van de hybridisatiesignalen op de chip de soort Mycobacterium in het monster worden bepaald.

Met behulp van genchip micro-arraying-technologie worden specifieke sondes voor het detecteren van de bovengenoemde genen en verschillende controlesondes op het substraat bevestigd. Elke detectiesonde en controlesonde wordt 5x herhaald en vormt een microarray van 12 rijen x 10 kolommen. De opstelling van de sonde wordt weergegeven in figuur 1. Elke chip bevat vier identieke microarrays en elke microarray kan één monster detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University (goedkeuring nr. 2024-K035). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten voorafgaand aan het verzamelen van klinische monsters. Patiënten werden geïnformeerd over het doel van het onderzoek, de betrokken procedures en hun recht om zich op elk moment terug te trekken zonder hun medische zorg te beïnvloeden.

1. Vereisten voor monsters

OPMERKING: Volg deze stappen bij het verzamelen van monsters van patiënten met klinisch vermoedelijke tuberculose en niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM) ziekten voor testen met deze kit:

  1. Verzamel monsters zoals sputum, pus of afscheidingen, bronchoalveolaire lavagevloeistof, prikvloeistof (inclusief hersenvocht, pleura- en peritoneale vloeistof, pericardvloeistof, gewrichtsvloeistof en gal) en urine van de patiënten.
    1. Voor sputummonsters:
      1. Instrueer de patiënt om 's ochtends de mond te spoelen met schoon water en vervolgens diep sputum op te hoesten in een steriele opslagcontainer voor monsters, deze af te sluiten en op te sturen voor testen.
      2. Voeg 1-2x het volume van 4% NaOH toe, schud en meng gelijkmatig.
      3. Voeg na 15-20 minuten een gelijk volume pH 6,8 fosfaatbuffer toe en meng gelijkmatig.
      4. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 2.000 × g en gooi het bovenstaande weg. Voeg 1 ml 0,9% NaCl toe via een pipet en meng grondig; Gebruik voor detectie.
    2. Voor pus of secretiemonsters:
      1. Spoel het oppervlak af met steriele normale zoutoplossing. Verzamel de pus of afscheiding met een steriel wattenstaafje, verzegel het en stuur het op voor testen.
      2. Voeg 3x het volume van 4% NaOH toe en schud het goed om goed te mengen.
      3. Laat het 20 minuten bij kamertemperatuur staan (schud het in deze periode 2x handmatig), centrifugeer 15 minuten bij 2.000 × g bij kamertemperatuur en gooi het supernatant dan weg. Voeg 1 ml 0,9% NaCl toe via een pipet en meng het gelijkmatig; Gebruik voor detectie.
    3. Voor bronchoalveolaire lavagevloeistof:
      1. Injecteer 10-20 ml normale zoutoplossing via een beschermde bronchoalveolaire lavage (PBAL) buis.
      2. Verzamel het monster in een steriele fles door middel van onderdruk en stuur het op voor testen.
    4. Voor hersenvocht:
      1. Verzamel ten minste 2 ml monster met behulp van een aseptische techniek.
      2. Centrifugeer bij 2.000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg. Voeg 1 ml 0,9% natriumchloride-oplossing toe via een pipet, meng grondig en gebruik voor testen.
    5. Voor urinemonsters:
      OPMERKING: Het is raadzaam om de eerste volledige hoeveelheid urine 's ochtends of 's avonds laat te gebruiken. De urine kan ook worden opgevangen door katheterisatie.
      1. Verzamel het monster in een steriele container en laat het verzamelde urinemonster 4-5 uur staan.
      2. Centrifugeer bij 2.000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg. Voeg 1 ml 0,9% natriumchloride-oplossing toe via een pipet, meng grondig en gebruik voor testen.
  2. Opslag van monsters
    OPMERKING: Monsters op vaste stof mogen niet ingevroren worden bewaard, omdat bevriezing latere bewerkingen kan beïnvloeden.
    1. Bewaar monsters die in het vloeibare medium bestaan bij -70 °C gedurende niet langer dan 5 jaar.
    2. Bewaar alle monsters niet langer dan 2 maanden bij 2-8 °C.
  3. Monster transport
    1. Zorg er bij het vervoer van de testisolaatmonsters voor dat u een gesloten container gebruikt die voldoet aan de bioveiligheidseisen onder de voorwaarden die zijn toegestaan door de regelgeving.

2. Voorbereiding van het experiment

  1. Bereiding van oplossingen voor het wassen van spanen
    NOTITIE: Bereid Chip Washing Solution I en Chip Washing Solution II volgens het aantal chips. Het volume moet zodanig zijn dat de spanen tijdens het wassen volledig kunnen worden ondergedompeld. Meng ze gelijkmatig en breng ze in evenwicht tot kamertemperatuur (10-30 °C). De uiteindelijke concentratie van SSC is 2x en de uiteindelijke concentratie van SDS is 0,2%.
    1. Om Chip Washing Solution I te bereiden, mengt u 20x SSC, gedestilleerd water (of gezuiverd water) en 10% SDS in de verhouding van 10:88:2 in volgorde om Chip Washing Solution I te bereiden. Meet bijvoorbeeld bij het bereiden van een totaal volume van 600 ml eerst 60 ml 20x SSC en 528 ml gedestilleerd water (of gezuiverd water) af en doe deze in een bekerglas van 1 l en meng gelijkmatig met een roerstaaf. Voeg vervolgens 12 ml 10% SDS toe en meng opnieuw gelijkmatig.
    2. Voor het bereiden van Chip Washing Solution II: De uiteindelijke concentratie SSC is 0,2x. Meng 20x SSC en gedestilleerd water (of gezuiverd water) in een verhouding van 1:99 om Chip Wash Solution II te verkrijgen. Neem als voorbeeld de bereiding van een totaal volume van 600 ml, meet 6 ml 20x SSC en 594 ml gedestilleerd water (of gezuiverd water) af en doe ze in een bekerglas van 1 l en meng gelijkmatig.
      OPMERKING: Als de 10% SDS-oplossing witte vlokkige neerslag ontwikkelt, verwarm deze dan tot 50 °C, meng grondig en bereid vervolgens de microarray-wasbuffer voor. Als Washing Buffer I witte vlokkende neerslag ontwikkelt, verwarm het dan op 50°C, meng grondig, breng in evenwicht met kamertemperatuur voor gebruik.
  2. Bereid 350 ml ijs-watermengsel.
  3. Maak gedestilleerd water (of gezuiverd water) klaar.

3. Voorbereiding van instrumenten en materialen

  1. Instrumentselectie en -opstelling
    1. Identificeer en bereid de microarray-chipscanner voor, zorg ervoor dat deze gekalibreerd en klaar voor gebruik is.
    2. Stel het nucleïnezuurextractie-instrument in, controleer de functies en laad de benodigde reagentia.
    3. Plaats de hybridisatiebox voor genmicroarray-chip op de juiste locatie en controleer of deze goed werkt.
  2. Voorbereiding van pipetteergereedschap
    1. Verzamel micropipetten met specificaties van 0,1-10 μl, 2-20 μl en 20-200 μl, samen met de bijbehorende schone en steriele pipetpunten. Zorg ervoor dat de micropipetten nauwkeurig zijn gekalibreerd en dat de punten goed zijn aangebracht.
  3. Opstelling van de hulpapparatuur
    1. Bereid een waterbad met constante temperatuur voor en stel het in op de gewenste temperatuur (50 °C).
    2. Plaats de microcentrifuge die centrifugebuisjes van 1.5 ml kan centrifugeren en controleer de balans- en snelheidsinstellingen.
    3. Plaats schone en steriele centrifugebuisjes (200 μl en 1,5 ml) en optionele schone en steriele strips met acht putjes (200 μl) op de rekken van de centrifugebuisjes.
  4. Gereedheid van monsterbehandelingsapparatuur
    1. Plaats een schudder met constante temperatuur op een handige plaats en stel de juiste schudparameters in.
    2. Zet twee bakjes opzij voor het wassen van frites en zorg ervoor dat ze schoon en droog zijn.
    3. Plaats diarekken en een centrifuge en houd een container voor het centrifugeren en drogen van spanen bij de hand.
  5. Voorbereiding PCR-versterker
    1. Schakel de PCR-versterker in en programmeer deze volgens het experimentele protocol, zodat deze klaar is om amplificatiereacties uit te voeren.

4. Nucleïnezuur-extractie

OPMERKING: Voer de handeling uit in het voorbereidingsgebied van het sample en volg deze stappen:

  1. Voorbereiding
    1. Voeg 80 μL nucleïnezuurextractieoplossing toe aan de nucleïnezuurextractiebuis en voeg 1 ml 0,9% NaCl toe.
  2. Verzameling van isolaatmonsters
    1. Om de monsterafname te starten, onderzoekt u de bron van de monsters, of ze nu van een vast medium of een vloeibaar medium zijn.
    2. Om monsters van vaste bodems te verzamelen, gebruikt u een steriele inoculatielus om een zichtbare kolonie van het juiste vaste medium te kiezen. Als de bacteriën zijn uitgegroeid tot het hele medium, kies dan een overeenkomstige hoeveelheid bacterieel gazon. Plaats het voorzichtig in de nucleïnezuurextractiebuis met de nucleïnezuurextractieoplossing en zorg ervoor dat u zoveel mogelijk niet op het vaste medium klikt.
    3. Zuig voor monsters van vloeibare media 10-20 μL van de bacteriële suspensie op met een troebelheid gelijk aan of groter dan 1 McFarland-standaard. Injecteer het in de nucleïnezuurextractiebuis met de nucleïnezuurextractieoplossing.
      OPMERKING: Na het verzamelen van monsters, hetzij van vast of vloeibaar medium, zijn de monsters klaar voor de daaropvolgende nucleïnezuurextractie.
  3. Nucleïnezuur extractie
    1. Na het toevoegen van de voorbehandelde monsters of isolaatmonsters uit de hierboven genoemde stap 1.1, gebruikt u het nucleïnezuur-snelextractie-instrument om nucleïnezuren te extraheren. Plaats de geëxtraheerde nucleïnezuren bij -20 °C voor tijdelijke opslag.
      OPMERKING: Als indicator van de extractie-efficiëntie kan de automatische extractor monsters extraheren met een virale nucleïnezuurbelasting van meer dan 100 kopieën/ml. De tijdelijke bewaartermijn mag niet langer zijn dan 2 maanden.

5. PCR-amplificatie

  1. Voorbereiding van het PCR-reactiesysteem
    1. Bereid in de opslag- en bereidingsruimte van reagentia centrifugebuizen van 200 μl of strips met acht putjes voor, afhankelijk van het aantal te testen monsters, en markeer de monsternummers van tevoren. Haal de PCR-amplificatiereagentia uit de set, laat ze op natuurlijke wijze ontdooien en smelten, schud en meng ze voorzichtig en meng ze gelijkmatig, en centrifugeer vervolgens snel om de reagentia op de bodem van de buisjes te laten verzamelen.
    2. Afhankelijk van het aantal monsters worden de PCR-amplificatiereagentia in centrifugebuisjes van 200 μl of strips met acht putjes in een volume van 18 μl per buis verrijkt. Sluit de buisdoppen goed en breng ze vervolgens over naar het bereidings- en amplificatiegebied van het versterkingsreactiemengsel.
    3. Voeg 2 μL sjabloon-DNA (het DNA van het te testen monster (d.w.z. het bovenstaande in de nucleïnezuurextractiebuis), positieve controleproducten of negatieve controleproducten) toe in het voorbereidingsgebied van het monster. Zorg ervoor dat het totale volume van elk PCR-reactiesysteem 20 μL bereikt.
      OPMERKING: Gebruik positieve controleproducten en negatieve controleproducten elke keer tijdens de versterking. Het positieve controleproduct kan worden gebruikt voor kwaliteitscontrole in de PCR-amplificatie- en hybridisatieprocessen, en het negatieve controleproduct kan worden gebruikt om de omgeving en het bedieningsproces te bewaken.
  2. Amplificatie
    1. Plaats de centrifugebuisjes of strips met acht putjes met de reagentia in het PCR-amplificatie-instrument. Zorg ervoor dat het instrument is voorverwarmd tot de gewenste temperatuur. Voer de PCR-amplificatiereactie uit volgens het volgende thermische cyclusprogramma: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 600 s (1 cyclus); 35 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en rek bij 72 °C gedurende 40 s; een laatste verlenging bij 72°C gedurende 420 s (1 cyclus); Onbeperkt vasthouden bij 4 °C (1 cyclus).

6. Chip hybridisatie

OPMERKING: Voordat de PCR-amplificatiereactie eindigt, voert u de volgende handelingen uit:

  1. Stel de temperatuur van het waterbad met constante temperatuur in op 50 °C en verwarm het voor.
  2. Bereiding van frites
    1. Voeg 200 μL gedestilleerd water (of gezuiverd water, zoals weergegeven in figuur 2A) toe aan de bodem van de hybridisatiebox voor genmicroarray-chips. Plaats de beugel tussen de twee positioneringskolommen in de doos.
    2. Plaats de chip voorzichtig met de voorkant naar boven op de beugel en bedek de chip met de dekstrip met de vier nokken naar beneden (zoals weergegeven in afbeelding 2B).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de dekstrook in de juiste plaatsingsrichting staat, zodat het uiteinde is uitgelijnd met het label aan het einde van de chip.
  3. Bereiding, denaturatie en koeling van hybridisatiereactiemengsel
    1. Bereid centrifugebuisjes van 200 μl of reepjes met acht putjes voor, afhankelijk van het aantal monsters en label ze op de juiste manier.
    2. Haal de hybridisatiebuffer uit de set en verwarm deze op 50 °C tot hij volledig gesmolten is. Na grondig mengen, centrifugeer het snel in een microcentrifuge. Aliquot 9 μL van de hybridisatiebuffer in elke voorbereide centrifugebuis van 200 μL of strip met acht putjes. Voeg vervolgens 6 μL van het overeenkomstige PCR-product toe aan elke buis, wat resulteert in een totaal volume van 15 μL per hybridisatiereactiemengsel.
    3. Verwarm het hybridisatiereactiemengsel (met inbegrip van de hybridisatiebuffer en het PCR-product) tot 95 °C (in een PCR-instrument of een waterbad) en denatureer het gedurende 5 min. Verwijder het hybridisatiereactiemengsel dat in de vorige stap de denaturatiebehandeling heeft ondergaan en dompel het onmiddellijk 3 minuten onder in een ijswatermengsel.
  4. Hybridisatie reactie
    1. Haal het hybridisatiereactiemengsel uit het ijsbad, pipetteer het 2x op en neer met een micropipet om het gelijkmatig te mengen. Nadat het witte vlokkige neerslag (indien aanwezig) is verdwenen, voegt u 13.5 μL van het hybridisatiereactiemengsel toe door het laadgat van de dekstrook (zoals weergegeven in afbeelding 2C), bedekt u snel de hybridisatiedoos en sluit u deze af (zoals weergegeven in afbeelding 2D). Noteer het chipnummer, de positie van de microarray en het bijbehorende monsternummer.
      OPMERKING: Er kan slechts één monster aan elke microarray worden toegevoegd.
    2. Plaats de verzegelde hybridisatieboxen onmiddellijk horizontaal in het waterbad met constante temperatuur dat is voorverwarmd tot 50 °C. Start de timer op 120 minuten nadat alle hybridisatieboxen zijn geplaatst.
      OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen tijdens het laadproces. Vermijd in alle stappen vanaf het begin van het laden tot het drogen van de chips dat de vloeistof op de chipmicroarrays lange tijd direct aan de lucht wordt blootgesteld om te voorkomen dat de chipachtergrond te hoog wordt door uitdroging en de interpretatie van het resultaat verstoort.
  5. Wassen en drogen van spanen
    1. Nadat de hybridisatiereactie is voltooid, haalt u de hybridisatiedozen er horizontaal uit, demonteert u ze en haalt u de spanen eruit om te wassen. Plaats de spanen onmiddellijk op het schuifrek in de container (zoals een bekerglas) gevuld met Chip Wash Solution I die in evenwicht is gebracht met kamertemperatuur (10-30 °C). Was ze op een snelheid van 80-100 tpm op een shaker met constante temperatuur gedurende 3 minuten op kamertemperatuur.
    2. Was de spanen met Chip Washing Solution II in evenwicht tot kamertemperatuur met een snelheid van 80-100 tpm op een shaker met constante temperatuur gedurende 3 minuten op kamertemperatuur.
    3. Plaats de chips in een centrifuge en centrifugeer 5 minuten bij 100 × g bij kamertemperatuur. Scan ze na het drogen.
      OPMERKING: Laat de spanen niet tegen elkaar botsen of wrijven.

7. Chipscanning en interpretatie van resultaten

OPMERKING: Gebruik de microarray-chipscanner en de bijbehorende software om signalen te lezen en resultaten te interpreteren. Zie ook Tabel 1 voor afwijkende resultaten en probleemoplossing. Volg deze stappen om te werken (raadpleeg de gebruikershandleidingen van de scanner en de software).

  1. Schakel de scanner en de bijbehorende software in en klik vervolgens op de knop Laserbesturing om deze 10 minuten te laten voorverwarmen.
  2. Voer verschillende soorten informatie in met betrekking tot de monsters, zoals het voorbeeldnummer.
  3. Nadat de scanner klaar is met voorverwarmen, klikt u op de knop Uitwerpen en plaatst u de chip stabiel op het kleine beugelstuk. Duw de chip voorzichtig en horizontaal in de opening van het scannercompartiment en klik op de knop Laden .
  4. Voer het chipnummer in, klik om het detectiegebied te selecteren (microarray 1-4) en klik vervolgens op Monster selecteren om de bijbehorende monsters voor elke microarray te kiezen. Klik vervolgens op de knop Detectie starten om een chipscan uit te voeren. De scanresultaten worden op het scherm weergegeven en automatisch opgeslagen.
  5. Herhaal na het scannen van één chip stap 7.3 en 7.4 om de volgende chip te scannen. Volg deze procedure totdat alle chips zijn gescand.
  6. Gebruik de pagina Gegevensquery's om gegevensquery's en afdrukbewerkingen uit te voeren.
  7. Nadat u alle bewerkingen hebt voltooid, schakelt u eerst de laser uit, sluit u vervolgens de software af en schakelt u ten slotte de scanner uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Positieve resultaten
Voor de sondes van het geslacht Mycobacterium (interne controle, IC) en Mycobacterium tuberculosis worden de positieve resultaatwaarden bepaald door de Receiver Operating Characteristics (ROC)-methode. Voor de sondes die worden gebruikt voor het detecteren van de andere 16 NTM, worden hun positieve resultaatwaarden bepaald door de percentielmethode.

Experimentele kwaliteitscontrole
...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De DNA-microarray-chipmethode die in dit artikel wordt geïntroduceerd, kan direct nucleïnezuren detecteren in klinische monsters (waaronder sputum, pus, bronchoalveolaire lavagevloeistof, hersenvocht en prikvloeistof) van patiënten die verdacht worden van tuberculose en niet-tuberculeuze mycobacteriose en kan de tijd voor bevestigde diagnose aanzienlijk verkorten. De DNA-microarray-chipmethode die in deze studie wordt gepresenteerd, vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in de ide...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Fujian Provincial Natural Science Foundation Project (2024J011521) en het Quanzhou Science and Technology Plan Project (2024NY006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% Sodium Chloride Injection (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Applied Biosystems amplification apparatusThermo Fisher ScientificVeriti 96-Well Thermal Cycler
CapitalBio LuxScan10K/BCapitalBioLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 CapitalBioSlideWasher 24 
 Centrifuge Eppendorf5424RMaX.speed 15000 min-1
Hybridization buffer
HybSet gene microarray chip and cover
Mycobacterium species identification kitCapitalBio301030
Negative controls, positive controls
Nucleic acid extractorTIANLONGGeneRotex 96
PCR amplification reagent
pH 6.8 phosphate bufferShangHai yuanye Bio-TechnologyR20029-10
pipettors and tipsThermo Scientific0.1 - 10 μL, 2 - 20 μL, and 20 - 200 μL, 100-1000 μL
qEx-DNA/RNA Nucleic acid extraction or purification kitTIANLONGqEx-DNA/RNA
SDSCapitalBio441060
Sodium hydroxide(NaOH)XILONGS  ScientificXK13-011-00027
SSCCapitalBio441050
thermostatic water bathSURUIHH-W600

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Asymmetrische PCRHybridisatieprincipesMycobacterium Tuberculosis ComplexNiet tuberculose mycobacteri nKlinische monstersMoleculaire diagnostiekProbe hybridisatie

Gerelateerde artikelen