Methodenartikel

Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68244

⸱

6 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Centre, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Montreal, 3Lady Davis Institute for Medical Research, 4Department of Medicine, McGill University, 5Gerald Bronfman Department of Oncology, McGill University, 6Department of Medicine, University of Montreal

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een op fosfoflowcytometrie gebaseerde methode beschreven om de signalering stroomafwaarts van de mTORC1-, JAK/STAT5- en MAPK-routes te analyseren in acute menselijke myeloïde leukemiecellen die xenotransplanteerd zijn in muizen en verkregen uit beenmergaspiraten. p-STAT5-, p-4EBP1-, p-RPS6- en p-ERK1/2-niveaus worden tegelijkertijd gemeten met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid.

Samenvatting

Om goedgekeurde behandelingen aan te passen en te weerstaan, activeren cellen van acute myeloïde leukemie (AML) specifieke moleculaire routes die leiden tot veranderingen in genexpressie, eiwitniveaus en activiteit. In dit protocol wordt een benadering gerapporteerd om doelen te onderzoeken die stroomafwaarts van oncogene signalering in AML zijn gefosforyleerd: p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) en p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Deze methode maakt het mogelijk om te beoordelen hoe deze routes - belangrijke regulatoren van stambehoud, immuunontwijking, eiwitsynthese en aanpassing aan oxidatieve en metabole stress - worden gemoduleerd door een of meer geteste verbindingen in beenmergcellen die zijn geoogst van levende muizen door aspiratie voor en na de behandelingsfase. Deze minimaal invasieve methode behoudt de celintegriteit en vermindert stress in vergelijking met botverpletteringstechnieken, die schade kunnen veroorzaken en mogelijk de experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Om de intracellulaire antilichaamkleuring voor flowcytometrische analyse te optimaliseren, werd een protocol ontwikkeld met behulp van paraformaldehydefixatie en methanolpermeabilisatie. Deze aanpak zorgt voor een hoge kleuringsprecisie en minimaliseert achtergrondruis, waardoor een betrouwbare detectie van intracellulaire signaalmarkeringen mogelijk is. Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de ontwikkeling van een multiparametrisch antilichaampanel, waarmee de vier routes binnen hetzelfde monster gelijktijdig kunnen worden beoordeeld. Met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid werden dynamische verschuivingen in de activering van de route waargenomen, afhankelijk van de behandelingsomstandigheden in vergelijking met de basislijnwaarden van vóór de behandeling bij dezelfde muizen. Deze methodologie maakt een nauwkeurige in vivo analyse mogelijk van de modulatie van de signaalroute in van de patiënt afgeleide xenotransplantaatbeenmergmonsters zonder dat euthanasie van de dieren nodig is, wat waardevol inzicht biedt in de adaptieve mechanismen van AML-cellen en kan leiden tot de evaluatie van therapeutische strategieën die gericht zijn op het richten op deze routes om resistentie te overwinnen.

Inleiding

Acute myeloïde leukemie (AML) is een agressieve hematologische maligniteit die wordt gekenmerkt door de accumulatie van onrijpe myeloïde voorlopercellen in het beenmerg en perifeer bloed. Dit verstoort de normale hematopoëse, wat leidt tot levensbedreigende cytopenie en systemische complicaties. Hoewel de vooruitgang in chemotherapeutische regimes, gerichte therapieën en hematopoëtische stamceltransplantatie voor sommige patiënten betere resultaten heeft opgeleverd, blijven de overlevingspercentages na 5 jaar over het algemeen rond de 30%, met een slechtere prognose bij oudere patiënten of mensen met ongunstige genetische profielen1. Een belangrijke uitdaging bij de behandeling van AML is het veelvuldig ontstaan van resistentie tegen geneesmiddelen, wat bijdraagt aan terugval en falen van de behandeling2. Dit onderstreept het belang van het verkrijgen van een beter begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die de progressie en therapeutische resistentie van AML aansturen.

Om deze uitdaging aan te gaan, wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor beenmergaspiraties in combinatie met multiplex intracellulaire fosfoflowcytometrie, die een krachtig hulpmiddel biedt om intracellulaire signaalroutes te onderzoeken in AML-patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen (PDX) (Figuur 1A,B). Hoewel beenmergaspiratie in PDX-modellen eerder is beschreven3, is dit protocol geoptimaliseerd om leukemische cellen te bewaren voor fosfoflowanalyse. Het algemene doel van deze methode is om een minimaal invasieve procedure te bieden die longitudinaal toepasbaar is tijdens de progressie van leukemie en therapeutische respons met eencellige resolutie. Door herhaalde bemonstering van hetzelfde dier mogelijk te maken, biedt deze techniek een nauwkeurigere weergave van de evolutie van de ziekte tijdens de behandeling. De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze techniek ligt in de behoefte aan een dynamische beoordeling met hoge resolutie van intracellulaire signalering in AML-cellen. Traditionele methoden, zoals Western blotting, vereisen grote celaantallen, missen een resolutie van één cel en multiplexing4. Fosfoflowcytometrie daarentegen behoudt de cellulaire heterogeniteit en maakt de detectie mogelijk van meerdere gefosforyleerde signaaleiwitten in verschillende leukemische subpopulaties5, wat belangrijke inzichten biedt in de activering van de route als reactie op AML-behandelingen.

Centraal in de biologie van AML staan signaalroutes die cellulaire proliferatie, overleving en metabole aanpassing reguleren, waaronder de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK), mechanistische target van rapamycine complex 1 (mTORC1) en januskinase/signaaltransducer en activator van transcriptie 5 (JAK/STAT5) signaalroutes. Naast hun rol in de proliferatie en overleving van leukemische cellen, zijn deze routes ook van cruciaal belang bij belangrijke oncogene processen zoals het behoud van stammen, het ontwijken van het immuunsysteem en aanpassing aan oxidatieve en metabole stress4. Naast het bevorderen van celgroei en overleving, orkestreert de overspraak tussen deze routes kritieke processen zoals transcriptie, translatie en cellulair metabolisme, waardoor AML-cellen hun groei kunnen behouden en apoptotische signalen kunnen weerstaan, zelfs in het licht van therapeutische interventies 6,7 (Figuur 1A).

De MAPK-route, die belangrijke effectoren zoals p-ERK1/2 (extracellulair signaalgereguleerd kinase 1/2) omvat, speelt een cruciale rol bij de integratie van extracellulaire signalen, zoals groeifactoren en cytokines, om celproliferatie en overleving te reguleren. ERK1/2-activering vindt plaats via de RAS (Rat Sarcoma)-RAF (Quickly Accelerated Fibrosarcoma)-MEK (MAPK/ERK Kinase)-ERK-cascade, waarbij RAS-GTP RAF rekruteert, wat leidt tot sequentiële fosforylering van MEK1/2 en vervolgens ERK1/2 bij Thr202/Tyr204. Eenmaal gefosforyleerd, dimeriseert ERK1/2 en transloceert het naar de kern, waar het transcriptiefactoren zoals MYC (Myelocytomatosis viral oncogene homolog), ELK1 (ETS Like-1 Protein) en AP-1 (Activator Protein-1) fosforyleert, waardoor celproliferatie, differentiatieblokkade en overleving worden bevorderd8. Bij AML resulteren mutaties in FLT3 (fms-achtig tyrosinekinase 3), RAS, of KIT vaak in constitutieve ERK-activatie 9,10 (Figuur 1A).

Mutaties in FLT3, RAS of KIT veroorzaken ook de opregulatie van mTORC1-signalering, die AML-groei en therapeutische resistentie mogelijk maakt door oncogene processen te ondersteunen, zoals metabole herbedrading, modulatie van eiwitsynthese, ribosoombiogenese en autofagie11. Door de regulatie van mRNA-translatie vergemakkelijkt mTORC1 de productie van oncogene eiwitten en andere essentiële factoren voor de progressie van AML. Een belangrijke groep mTORC1-substraten omvat 4E-BP's (Eukaryote initiatiefactor 4E-bindende eiwitten). In hun gehypofosforyleerde toestand binden 4E-BP's aan eIF4E (eukaryote initiatiefactor 4E), waardoor cap-afhankelijke translatie wordt geremd. Fosforylering van 4E-BP1 op Thr37/46 door mTORC1 veroorzaakt de afgifte van eIF4E, waardoor de translatie van belangrijke oncogene mRNA's, zoals MYC, CCND1 (cycline D1) en MCL-1 (myeloïde celleukemie 1) kan worden geïnitieerd, waardoor leukemische proliferatie en overleving worden bevorderd 8,12. Bovendien verbetert RPS6-fosforylering bij Ser240/244, gemedieerd door S6K1 (ribosomaal eiwit S6-kinase bèta-1) stroomafwaarts van mTORC1, de biogenese van ribosoom en mRNA-translatie, waardoor de synthese van eiwitten die nodig zijn voor metabole aanpassing, stressbestendigheid en snelle proliferatie toeneemt 8,13. Met name mTORC1-activiteit is nauw verbonden met metabole aanpassing, een cruciale overlevingsstrategie die wordt gebruikt door AML-cellen onder therapeutische stress 13,14,15 (Figuur 1A).

De JAK/STAT5-route is een andere cruciale signaalas in AML, vooral in gevallen met mutaties die cytokinereceptoren of signaalmediatoren beïnvloeden, zoals JAK2, FLT3 en CALR (calreticuline)16,17. STAT5 wordt geactiveerd als reactie op cytokinesignalering via receptoren zoals FLT3 en JAK2. Bij ligandbinding fosforyleren geassocieerde Januskinasen (JAK's) STAT5 op Tyr694. Gefosforyleerd STAT5 dimeriseert en transloceert naar de kern, waar het zich bindt aan specifieke DNA-sequenties om de transcriptie te reguleren van genen die betrokken zijn bij celoverleving, proliferatie en differentiatie8. Bij AML leidt constitutieve activering van STAT5, vaak als gevolg van mutaties in FLT3 of JAK2, tot persistente expressie van genen die leukemogenese bevorderen18 (Figuur 1A).

Naast hun individuele bijdragen komen deze routes samen om zowel transcriptie als translatie te reguleren, waardoor het proteoom van AML-cellen wordt gevormd op een manier die overleving en resistentie bevordert. In het bijzonder is mRNA-translatie in opkomst als een sleutelfactor in de pathofysiologie van AML, omdat het de snelle productie van oncogene eiwitten en stressresponsfactoren mogelijk maakt die AML-cellen in staat stellen zich aan te passen aan omgevingsuitdagingen en de effecten van gerichte therapieën te ontwijken. Ontregeling van vertaalmachines, zoals eukaryote initiatiefactoren (eIF's) of ribosomale eiwitten, is betrokken bij therapeutische resistentie en slechte prognose bij AML19. Een gedetailleerd onderzoek naar de rol van de MAPK-, mTORC1- en JAK/STAT5-routes in transcriptionele en translationele regulatie is essentieel om een uitgebreid begrip te krijgen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan AML-progressie en -resistentie. Dergelijke inzichten zijn van cruciaal belang voor het identificeren van nieuwe biomarkers van behandelingsrespons en het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën die zich richten op deze routes om resistentie te overwinnen. Dit artikel biedt een protocol dat speciaal is ontworpen om deze signaleringsnetwerken te onderzoeken in AML-patiënt-afgeleide xenotransplantaat (PDX)-modellen.

Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de integratie van beenmergaspiratie met intracellulaire fosfoflowcytometrie, waardoor een dynamische en minimaal invasieve beoordeling van de activering van de signaalroute in AML-patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen (PDX) mogelijk is. Dit is met name waardevol voor het bewaken van de activeringsstatus van belangrijke routes zoals MAPK, mTORC1 en JAK/STAT5 als reactie op gerichte therapieën. De combinatie van deze technieken maakt het mogelijk om een uitgebreid en met hoge resolutie begrip van AML-biologie te verwerven, wat uiteindelijk helpt bij de ontwikkeling van effectievere therapeutische strategieën.

Protocol

De volgende experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van het McGill University Animal Care Committee (CIHR PJT-186019) en de Institutional Review Board van het Jewish General Hospital (11-047). In dit protocol werden mannelijke NOD-scid IL2Rg^null-3/GM/SF (NSGS) muizen van 8 weken tot 6 maanden en met een gewicht van 20-30 g eerder getransplanteerd met menselijke, van patiënten afkomstige AML-cellen. Details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Beenmergaspiratie

LET OP: Veiligheidsmaatregelen rond het gebruik van naalden moeten worden gevolgd.

  1. Peri-operatieve analgesie: 1-4 uur voorafgaand aan de beenmergaspiratie injecteren de muizen subcutaan (s.c.) met 0,1 mg/kg buprenorfine met langzame afgifte. Dit zorgt voor analgesie tot 72 uur na de procedure.
  2. Bereid het operatiegebied onder de laminaire flowkap voor met een chirurgisch kussen, een tondeuse, een verwarmingslamp en al het benodigde materiaal voor beenmergaspiratie (spuiten van 25 g, microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met 0,5 ml PBS op ijs, 70% isopropanolstaafjes). Zet de neuskegel vast voor het inademen van isofluraan met plakband (Figuur 2A).
  3. Maak twee spuiten van 25 G klaar voor elke zuigkracht, één voor botpunctie ("droge naald") en één waarvan de naaf is gespoeld met PBS voor aspiratie ("doorgespoelde naald").
  4. Verdoof de muis met behulp van isofluraaninhalatie door een gecertificeerde verdamper, volgens de instructies van de fabrikant en veterinaire richtlijnen. Lokale procedures kunnen variëren. Ter referentie: dit protocol volgde de standaard operationele procedures van McGill University voor muizenanesthesie20.
  5. Bevestig de diepte van de anesthesie door niet te reageren op beknelling van de voet en spierontspanning. Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl het dier onder narcose is. Bewaak continu de ademhalingsfrequentie tijdens anesthesie.
  6. Scheer het hele been waar de aspiratie zal worden uitgevoerd met behulp van de tondeuse. Desinfecteer de aspiratieplaats (dijbeen) met een antiseptisch kussen verzadigd met isopropylalcohol (Figuur 2B).
  7. Leg het gewrichtsoppervlak van het dijbeen, waar de prikplaats zich bevindt, bloot door de knie te buigen en het been te immobiliseren met behulp van de niet-dominante hand. Plaats de duim op het scheenbeen, de wijsvinger op het dijbeen en de middelvinger en stabiliseer alles aan de buitenkant van de twee botten (Figuur 2C).
    NOTITIE: Zorg voor een zeer stabiele positionering van het been met behulp van de niet-dominante hand om elke beweging van het been tijdens de aspiratie te voorkomen die kan leiden tot falen of letsel. Als de immobilisatie van het been niet stabiel is, verplaats dan de hand en probeer het opnieuw voordat u een lekke band aangaat.
  8. Terwijl u immobiliseert met de niet-dominante hand, desinfecteert u het kniegebied opnieuw met isopropylalcohol (Figuur 2C) om de resterende haren weg te verwijderen om de visualisatie van de botstructuur te verbeteren.
  9. Gebruik de eerste droge spuit van 25 G om een gat in het femorale gewrichtsoppervlak te maken door deze in het midden van het dijbeengewricht te plaatsen en zonder te forceren te draaien (Figuur 2D,E). Zorg ervoor dat de naald van de spuit volledig is uitgelijnd (0° afwijking) met de lengteas van het dijbeen om het merg correct binnen te gaan.
    NOTITIE: Behoud deze uitlijning om een soepele toegang te garanderen zonder onnodige schade aan de omliggende weefsels te veroorzaken. Wanneer de naald het midden van het dijbeen binnendringt, duidt een lichte afname van de weerstand op een succesvolle penetratie in de mergholte (Figuur 2F). Vermijd het uitoefenen van overmatige kracht op de naald bij deze stap, omdat dit verlies van de juiste uitlijning, breuk of trauma kan veroorzaken. Door gebruik te maken van een roterende boorbeweging is de kans groter dat de naald de weg van de minste weerstand volgt en op de juiste manier de dijbeenholte binnengaat. Een naald die op de juiste manier in het dijbeen is geplaatst, moet verticaal blijven, zelfs als de hand die hem vasthoudt wordt verwijderd.
  10. Eenmaal in het merg, verwijdert u de spuit geleidelijk door te draaien (Figuur 2G) en steekt u de tweede doorgespoelde spuit in het gat dat door de eerste naald is gemaakt (Figuur 2H,I).
    OPMERKING: Er wordt een tweede spuit gebruikt omdat de eerste tijdens het boren vaak wordt geblokkeerd door bot.
  11. Breng vacuüm aan op de spuit die in het dijbeen is ingebracht terwijl u de spuit voorzichtig draait en geleidelijk terugtrekt. Ongeveer 10-20 μl beenmerg moet zichtbaar zijn in de naaf van de spuit (figuur 2J).
    OPMERKING: Schuif indien nodig de naald voorzichtig terug in het bot om de mergextractie te optimaliseren.
  12. Breng het beenmerg over door de inhoud van de spuit in de gekoelde microcentrifugebuis met 500 μl PBS te spoelen (figuur 2K). Blijf op ijs en ga zo snel mogelijk door naar stap 2-3.
  13. Oefen gedurende 30 s lichte druk uit op de prikplaats met een isopropanolstaafje om eventuele bloedingen te stoppen (Figuur 2L).
  14. Plaats de muis in een schone herstelkooi die is verwarmd met een warmhoudlamp. Bewaak de ademhaling en mobiliteit totdat het dier wakker en volledig hersteld is voordat u het in gemeenschappelijke kooien met de rest van de muizen plaatst. Controleer op tekenen van bloeding.

2. Levend/dood en kleuring van oppervlaktemarkeringen

OPMERKING: Houd de cellen gedurende de hele procedure op ijs. Bereid mastermengsels van antilichaamkleuringsoplossingen (voor stap 2.4 en stap 2.7) vóór stap 2 en stap 3 en houd ze bij 4 °C beschermd tegen licht. Bereid een verse 1,6% formaldehydeoplossing (stap 3.1) en een 100% methanoloplossing bij -20 °C (stap 3.6).

  1. Tel de levensvatbare cellen met behulp van acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) met de cellenteller21.
  2. Breng het juiste volume voor 1 miljoen cellen over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Als het volume niet voldoende is, neem dan het hele volume. Bundel de resterende cellen en aliquot in 3 replicate buisjes (elk 1 M) voor kleuring met isotypecontrole en 1 buisje voor ongekleurde controle.
  3. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4°C. Zuig voorzichtig aan en gooi het bovenstaande weg met behulp van een vacuümaspiratiesysteem.
  4. Voeg 200 μL per monster fluorescerende celkleuringsoplossing verdund 1/100 in PBS toe om de dode cellen te labelen. Resuspendeer de cellen voorzichtig met de pipet. Doe hetzelfde met de extra buisjes voor kleuring tegen isotypecontrole.
  5. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
  6. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig voorzichtig aan en gooi het bovenstaande weg met behulp van een vacuümsysteem.
  7. Voeg 100 μL per monster van hCD45-BUV395-antilichaam verdund 1/100 in PBS met 2% foetaal runderserum toe om de menselijke hematopoëtische cellen te labelen. Doe hetzelfde met de extra buizen die worden bewaard voor isotype-controles.
  8. Incubeer 15 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Ga direct verder met stap 3.

3. Fixatie en permeabilisatie

  1. Bereid een verse 1,6% formaldehyde/PBS-oplossing voor: Meng voor elk monster 29,5 μL 37% formaldehydestockoplossing + 970,5 μL PBS (houd uit voorzorg wat extra volume). Bewaar de 1,6% formaldehyde/PBS-oplossing bij kamertemperatuur.
    LET OP: Formaldehyde moet in een chemische kap worden behandeld en worden afgevoerd in overeenstemming met de institutionele veiligheidsvoorschriften.
  2. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met behulp van een vacuümsysteem.
  3. Resuspendeer in 1 ml 1,6% formaldehyde/PBS-oplossing.
  4. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  5. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met behulp van een vacuümsysteem.
  6. Voeg 1 ml 100% methanol gekoeld bij -20 °C rechtstreeks toe aan de buis.
  7. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij -20 °C, beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Op dit punt is het mogelijk om gefixeerde en permeabiliseerde cellen maximaal een maand vóór analyse bij -80 °C te bewaren.

4. Fosfoflow-kleuring

OPMERKING: Het volgende antilichaampaneel is gevalideerd met behulp van de flowcytometer die is uitgerust met de volgende lasers: 320 nm, 355 nm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm en 808 nm. Dit paneel moet opnieuw worden gevalideerd als er verschillende cytometers worden gebruikt met verschillende laser- en detectoropstellingen.

  1. Bereid een antilichaamhoofdmengseloplossing met de volgende verdunningen in een in de handel verkrijgbare kleuringsbuffer (tabel 1), waarbij een volume van 50 μl voor elk monster wordt berekend. Beschermd tegen licht bewaren bij 4 °C.
  2. Bewaar PBS voor wasbeurten (stappen 4.8, 4.10) op ijs (2 ml voor elk monster).
  3. Bereid een tweede mastermixoplossing voor de technische replica's van de isotypecontrole in de kleuringsbuffer (tabel 1), waarbij een volume van 50 μl voor elk monster wordt berekend. Beschermd tegen licht bewaren bij 4 °C. Voor de technische reproduceerbaarheid wordt aanbevolen ten minste twee isotype-controlemonsters te gebruiken.
  4. Centrifugeer de cellen uit stap 3.7 bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met behulp van een vacuümsysteem.
    OPMERKING: Na fixatie en permeabilisatie kunnen de cellen er doorschijnender uitzien.
  5. Voeg 50 μl antilichaammengoplossing (stap 4.1) of isotypecontrolemengoplossing (stap 4.2) toe. Resuspendeer de cellen voorzichtig met een pipet.
  6. Incubeer alle monsters een nacht bij 4 °C beschermd tegen licht.
  7. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met behulp van een vacuümsysteem.
  8. Wassen met 1000 μL PBS door voorzichtig opnieuw te suspenderen met de pipet.
  9. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met behulp van een vacuümsysteem.
  10. Voer een tweede wasbeurt uit met 1000 μL PBS door voorzichtig opnieuw te suspenderen met de pipet.
  11. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en gooi het weg met behulp van een vacuümsysteem.
  12. Resuspendeer de monsters in 200 μl PBS. Overgebracht naar FACS-buisjes of -platen voor analyse met behulp van flowcytometrie (Figuur 3).
  13. Bereid compensatiecontroles met één kleur voor met kralen door 0.1 μL van elk antilichaam met compensatiekralen te incuberen, volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).

Resultaten

Het experimentele ontwerp heeft tot doel de fosforyleringstoestand van geselecteerde eiwitten van belang op verschillende tijdstippen te volgen, bijvoorbeeld 1 dag vóór de start van de behandeling en 15 dagen na de start van de behandeling. Deze basislijn dient als een kritische controle om de waarheidsgetrouwheid van latere veranderingen in de activering van de signaalroute na behandeling te verifiëren. Na vijftien dagen behandeling wordt een tweede vergelijking uitgevoerd om de modulatie van de route bij behandelde muizen te evalueren versus met vehiculum behandelde controles (Figuur 4). Deze tweefasenbenadering maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen door de behandeling geïnduceerde effecten en de variabiliteit bij baseline.

Voor deze studie werd een AML PDX-muismodel gebruikt. De muizen werden getransplanteerd met van de patiënt afgeleide AML-cellen die werden gekenmerkt door de volgende mutaties: DNMT3AMR882H met een variante allelfractie (VAF) van 48%, NPM1W288fs VAF 36%, FLT3ITD VAF 10% en IDH2R140Q VAF 44%. Na de transplantatie werd drie weken de tijd gegeven voor tumorgroei voordat de behandeling werd gestart. De FLT3-mutant-getransplanteerde PDX-muizen werden gedurende vijftien dagen behandeld met een van de drie regimes: placebo, gilteritinib (15 mg/kg per dag) of een combinatie van venetoclax (50 mg/kg per dag), 5-azacitidine (2,5 mg/kg per dag) en cedarizudine (3 mg/kg per dag) (Figuur 4A).

Met betrekking tot de verkregen resultaten is het opmerkelijk om te vermelden dat behandeling met een op venetoclax gebaseerd regime resulteerde in een significant verbeterde STAT5- en RPS6-fosforylering, wat suggereert dat deze routes bijdragen aan therapieresistentie (Figuur 4E). Daarentegen verminderde gilteritinib, een geneesmiddel gericht tegen FLT3, de fosforyleringsstatus van mutante FLT3-effectoren niet. Het is mogelijk dat in het geteste AML-monster de aanwezigheid van andere secundaire mutaties dan FLT3-ITD (bijv. IDH2) bijdraagt aan de activering van deze routes of dat de medicamenteuze behandeling gedurende twee weken resulteert in selectieve eliminatie van AML-cellen met verminderde signalering. Aangezien alle geanalyseerde fosfoproteïnen afkomstig zijn van dezelfde celpopulatie, is het mogelijk om de activering van fosfoproteïnen te vergelijken. In dit experiment lijkt de sterkste correlatie in fosfoproteïnekleuring te zijn tussen p-STAT5 en p-RPS6 (Aanvullende Figuur 1A), die beide na behandeling in deze experimentele groep worden opgereguleerd (Figuur 4E). Er lijkt een kleinere relatie te zijn tussen p-STAT5 en p-ERK (aanvullende figuur 1B). Belangrijk is dat de celgrootte (beoordeeld met behulp van FSC-A) geen belangrijke bijdrage levert aan de algehele p-STAT5-positiviteit, wat benadrukt dat kleuringspositiviteit niet alleen een product is van celgrootte (aanvullende figuur 1C). Dit experimentele kader maakt een uitgebreide evaluatie mogelijk van de effecten van deze behandelingen op de modulatie van de signaalroute.

figure-results-1
Figuur 1: Visualisatie van de signaalroutes van het doelwit en de strategie voor de analyse ervan. (A) Overzicht van de signaalroutes waarbij p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) en p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) betrokken zijn. In de p-STAT5-route ondergaat JAK autofosforylering, waardoor de katalytische activiteit toeneemt en vervolgens specifieke tyrosineresiduen worden gefosforyleerd, waardoor aanlegplaatsen voor STAT-eiwitten ontstaan. Gefosforyleerd STAT5 (Tyr694) homodimeriseert en transloceert naar de kern, waar het bindt aan specifieke STAT-responsieve elementen in de promotorregio's van doelgenen. In de RAS-RAF-MEK-ERK-cascade leidt autofosforylering van de FLT3-receptor of andere receptortyrosinekinasen (RTK's) bij ligandbinding tot de uitwisseling van GDP voor GTP op RAS, waardoor RAS wordt geactiveerd. Geactiveerde RAS-GTP rekruteert RAF naar het plasmamembraan, waar RAF een conformatieverandering ondergaat en actief wordt. RAF fosforyleert en activeert vervolgens MEK1/2, een kinase met dubbele specificiteit, die op zijn beurt ERK fosforyleert bij Thr202/Tyr204-residuen. Geactiveerd ERK1/2 transloceert naar de kern, waar het specifieke transcriptiefactoren fosforyleert. ERK1/2 is ook in staat, via intermediaire signaalroutes, om de mTORC1-activiteit te verhogen en eIF4E op specifieke plaatsen te fosforyleren om de translatieactiviteit te verhogen. Geactiveerd door voedingsstoffen en groeifactoren via FLT3 en andere RTK's, fosforyleert mTORC1 stroomafwaartse doelen zoals S6K1 en 4E-BP1. S6K1 fosforyleert op zijn beurt RPS6, wat de ribosoomfunctie verbetert en de translatie activeert. Bij hyperfosforylering van 4E-BP1 komt eIF4E vrij, waardoor het translatie-initiatiecomplex eIF4F kan worden geassembleerd en cap-afhankelijke translatie kan worden geactiveerd. Al deze routes zijn sterk betrokken bij AML en dragen bij aan verworven aanpassingen door de celproliferatie, het metabolisme en de resistentie tegen apoptotische signalen te verhogen. (B) presenteert de belangrijkste stappen van het protocol voor beenmergaspiratie en intracellulaire fosfoflowkleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Visualisatie van kritieke stappen tijdens de beenmergaspiratieprocedure. Het operatiegebied en de benodigde materialen zijn opgesteld onder een laminaire stromingskap. Na anesthesie door inhalatie van isofluraan (A) wordt het femorale gewrichtsoppervlak voorbereid op aspiratie (B,C). Het dijbeen wordt doorboord door een eerste spuit die is uitgelijnd met het midden van het dijbeen (D). Het is van cruciaal belang om geen sterke druk op de naald uit te oefenen en in plaats daarvan een roterende boorbeweging uit te voeren; Dit is meestal voldoende voor de naald om het oppervlak van het bot te perforeren en het pad van de dijbeenholte te volgen. Vervolgens wordt het beenmerg met een tweede spuit door de prikplaats (I,J) opgezogen. Na het overbrengen van het beenmergaspiraat naar een microcentrifugebuis (K), wordt zachte druk uitgeoefend om het bloeden in het gebied te stoppen (L) en wordt de muis in een warme en schone kooi geplaatst voor herstel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Workflow voor de analyse van de poortstrategie, inclusief isotypecontroles. (A) vertegenwoordigt poortstrategieën voor levende cellen, uitsluiting van doubletten en hCD45-positieve AML-cellen. (B) toont signalen voor elk fosfoproteïne in bruin en isotypecontroles in zwart (twee biologische replicaten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Workflow voor de detectie en analyse van intracellulaire fosfoproteïnen na immuno-stating van levensvatbare AML-cellen in het beenmerg. (A) NSG-SGM3-muizen getransplanteerd met door de patiënt gedoneerde AML-cellen werden behandeld met vevehiculum (controle) of venetoclax, 5-azacytidine en cedazuridine (vene/aza/CDZ) of gilteritinib. Na 15 dagen werden beenmergaspiraten (BM) verwerkt. (B) vertegenwoordigt de gatingstrategie voor de analyse van levensvatbare AML-cellen (bijv. hCD45/Zombie-NIR-positief) 15 dagen na de behandeling. (C,D) vertegenwoordigen de normalisatie van het signaal voor elk van de fosfo-antilichamen zoals aangegeven, in 10.000 AML-cellen geïsoleerd uit muizen die zijn behandeld met venetoclax/5-azacytidine/cedazuridine of vehiculum (B) of gilteritinib of vehiculum (C). De sporen vertegenwoordigen de signalen in AML-cellen geïsoleerd uit de controlemuis die zijn behandeld met vehiculum (lichtblauw), vene/aza/CDZ (rood) of gilteritinib (paars). (E) Het histogram geeft de gemiddelde waardeveranderingen weer in de kleuringsintensiteiten voor elk fosfoproteïne dat is getest op levende menselijke AML CD45+ -cellen van drie muizen en SD. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. De sterretjes geven significante verschillen aan in kleuringsintensiteiten zoals beoordeeld door ANOVA met p-waarden lager dan 0,05 (*) en 0,01 (**). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AntistofFluorchroomVerdunning
p-RPS6 (Ser240/244)AF5941/50
p-4EBP1 (Thr37/46)AF4881/50
p-STAT5 (Tyr694)PE1/100
p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204)AF6471/100
Konijn IgG controleAF5941/50
Konijn IgG controleAF4881/50
Konijn IgG controlePE1/100
Konijn IgG controleAF6471/100

Tabel 1: Lijst van geoptimaliseerde verdunningen voor antilichamen.

Aanvullende figuur 1: Vergelijking van p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 en FSC-A in een representatieve AML PDX-steekproef. Deze figuur toont een voorbeeld van de relatie tussen p-STAT5, p-ERK en p-RPS6 in muis "E9" op dag 15 van de behandeling met venetoclax/5-azacitidine/cedazuridine (resultaat van figuur 4C). In deze steekproef lijkt de sterkste correlatie in fosfoproteïnekleuring te zijn tussen p-STAT5 en p-RPS6 (A), die beide na behandeling in deze experimentele groep worden opgereguleerd (Figuur 4E). Er lijkt een mindere relatie te zijn tussen p-STAT5 en p-ERK (B). Belangrijk is dat de celgrootte (beoordeeld met behulp van FSC-A) geen belangrijke bijdrage levert aan de algehele p-STAT5-positiviteit, wat benadrukt dat kleuringspositiviteit niet alleen een product is van celgrootte (C). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Kritieke stappen
Het gebruik van immunologisch gebaseerde technieken bij de studie van complexe signaalroutes door middel van specifieke detectie van fosfoproteïnen vereist dat experimentele variabelen streng worden gecontroleerd22, de monstervoorbereiding nauwgezet is en aanvullende technieken worden gebruikt voor validatie. De integratie van deze praktijken zorgt voor de reproduceerbaarheid, precisie en robuustheid van de gegevens, wat uiteindelijk bijdraagt aan betrouwbaardere biologische conclusies. Deze inspanningen verbeteren niet alleen de wetenschappelijke nauwkeurigheid van de methode, maar verbreden ook de toepasbaarheid ervan in complexe studies van celsignalering en -regulatie. De juiste anesthesie en zachte behandeling zijn van cruciaal belang voor het minimaliseren van fysiologische stress, die de experimentele resultaten aanzienlijk kan veranderen, vooral in onderzoeken die gericht zijn op immuunresponsen of signaalroutes. Zorgen voor passende pijnstillende protocollen helpt verder bij het handhaven van het dierenwelzijn en voorkomt pijngerelateerde stress die de gegevens zou kunnen verstoren. Het handhaven van aseptische omstandigheden tijdens de procedure is van vitaal belang om infecties te voorkomen, die kunnen leiden tot ontstekingsreacties en mogelijk experimentele resultaten kunnen verwarren. Dit omvat het steriliseren van apparatuur, het gebruik van schone handschoenen en het grondig desinfecteren van de aspiratieplaats.

Gefosforyleerde eiwitten zijn zeer gevoelig voor defosforylering door fosfatasen tijdens de manipulatie van biologische monsters22,23. Om de fosforyleringstoestand tijdens de verwerking te behouden, is onmiddellijke fixatie essentieel. Er werden twee verschillende fixatie-/permeabilisatiemethoden getest: een cytofix/cytoperm-kit en de gebruikelijke formaldehyde/methanol-methode die in het protocol wordt beschreven. Hiervan leverde de op methanol gebaseerde methode schonere resultaten op met helderdere fluorescentiesignalen, waardoor het de voorkeurskeuze was. Na fixatie kunnen monsters op korte termijn worden bewaard bij -20 °C of langdurig bij -80 °C. In experimenten leverden vaste monsters die tot drie maanden bij -80 °C werden bewaard, consistente resultaten op. Voor antilichaamkleuring kan een nachtelijke incubatie de nauwkeurigheid verbeteren, vooral voor subtiele fosforyleringsverschuivingen, hoewel dit afhangt van het specifieke experiment en de geneesmiddeleffecten die worden onderzocht. Een kortere incubatie van 1 uur werd ook getest op ijs, beschermd tegen licht, wat in bepaalde gevallen acceptabele resultaten opleverde. Om een nauwkeurige beoordeling van achtergrondgeluid te garanderen, worden isotype-controles aanbevolen als referentie voor niet-specifieke binding, zoals weergegeven in figuur 3.

Aanpassingen en probleemoplossing van de techniek
Om technische vaardigheid te ontwikkelen, oefenen stagiairs in onze groep de naaldinbrengtechniek op geëuthanaseerde muizen, waarbij de juiste plaatsing kan worden bevestigd door dissectie. De procedure voor levende dieren wordt het meest efficiënt uitgevoerd door twee operators, waarbij de ene zich kan concentreren op de aspiraties, terwijl een assistent zich bezighoudt met de taken van diermonitoring en monsterbehandeling. In zeldzame gevallen waarin het na meerdere pogingen niet mogelijk is om een aspiratie te verkrijgen, is het raadzaam om de procedure af te breken, omdat het risico op blessures bij elke poging toeneemt. Toezicht op de dieren na de procedure is net zo belangrijk. Het observeren op tekenen van infectie, pijn of stress zorgt voor het welzijn van de muizen en de betrouwbaarheid van het onderzoek. Huisvestingsomstandigheden moeten het herstel ondersteunen, met geschikt beddengoed en voeding om externe stressfactoren tot een minimum te beperken.

Voor flowcytometrische analyse wordt aanbevolen om alle gefixeerde en geconserveerde monsters van verschillende beenmergaspiratiedagen tegelijkertijd te verwerken. Variaties in de rehydratatie en kleuring van het monster als gevolg van verschillen in verwerkingsdagen of operators kunnen de fluorescentiegevoeligheid beïnvloeden die door de cytometer wordt gedetecteerd. Om consistente resultaten te garanderen, optimaliseert u de spanningsinstellingen van de cytometer om alle gekleurde monsters binnen het detectiebereik te houden voordat u verder gaat. Het Alexa Fluor 488-geconjugeerde p-4EBP1-eiwit vertoont de hoogste helderheid van de markeringen in dit paneel, waardoor het een betrouwbare referentie is voor het instellen van het maximale detectiebereik. Hoewel het antilichaampaneel dat in dit protocol wordt gepresenteerd, geen compensatieaanpassingen vereiste, kan dit variëren afhankelijk van de gebruikte spectrale flowcytometer.

Beperkingen
Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is het aantal cellen dat tijdens beenmergaspiratie wordt geëxtraheerd. Om betrouwbare resultaten te garanderen, is het essentieel om voldoende cellen te kleuren om minimaal ongeveer 10.000 cellen per monster te analyseren. Het analyseren van te weinig cellen kan leiden tot aanzienlijke variaties tussen monsters, waardoor de nauwkeurigheid en interpreteerbaarheid van de gegevens in het gedrang komen. Zorgen voor een voldoende aantal cellen is van cruciaal belang voor robuuste en reproduceerbare mechanistische studies.

Voor data-analyse wordt de poortstrategie toegepast die wordt geïllustreerd in figuur 3A . Eerst worden de cellen van belang, na uitsluiting van doubletten, geïdentificeerd met behulp van een humaan CD45-antilichaam in combinatie met BUV395. Vervolgens wordt de poort voor levende cellen gedaan met behulp van Zombie NIR. Ten slotte wordt de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) berekend voor elk fosfoproteïne (Figuur 3B). Alle cellen die voor alle gefosforyleerde eiwitten werden geanalyseerd, werden volgens dezelfde strategie afgeschermd, waardoor consistentie en vergelijkbaarheid tussen AML-celpopulaties werd gegarandeerd.

Een andere beperking van deze methode is de kans op achtergrondruis, die kan ontstaan door niet-specifieke antilichaambinding, onvoldoende wassen, autofluorescentie van cellen of onjuiste permeabilisatie. Dit kan de signaalspecificiteit beïnvloeden en de nauwkeurigheid van fosfoflowcytometrieanalyse verminderen. Voor gebruikers die deze problemen ondervinden, wordt een extra wasstap aanbevolen om achtergrondgeluid te verminderen, en Fc-blokkerende reagentia kunnen worden gebruikt om niet-specifieke binding te minimaliseren. Bovendien kan fluorescentie van dode cellen de resultaten verstoren, waardoor het gebruik van levensvatbare kleurstoffen essentieel is. Belangrijk is dat voor een nauwkeurige analyse het aantal geanalyseerde cellen niet minder dan 500 AML-cellen mag zijn om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te garanderen. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat tijdens het kleuren een vergelijkbaar aantal cellen wordt gebruikt om de consistentie van de monsters te behouden. Ondanks deze beperkingen kan een zorgvuldige optimalisatie van controles en poortstrategieën de betrouwbaarheid van de methode verbeteren.

Betekenis van de techniek
De beenmergaspiratietechniek is al gepubliceerd3; In dit protocol is echter een bijgewerkte techniek opgenomen met een uitleg waarin twee voordelen worden benadrukt: verbeterde immobilisatie en het gebruik van een benadering met twee naalden om de precisie en consistentie bij de beenmergaspiratie te verbeteren, waardoor problemen met verstopping van de naald met botfragmenten worden voorkomen. Voor longitudinale studies kan femorale aspiratie meerdere keren worden uitgevoerd, wat een krachtige methode biedt om biologische veranderingen in de loop van de tijd bij individuele dieren te volgen. Een herstelinterval van minimaal een maand wordt aanbevolen tussen aspiraties op hetzelfde dijbeen om voldoende botgenezing en regeneratie van het beenmerg mogelijk te maken. Bij gebruik van het contralaterale dijbeen is een korter interval van een week voldoende om ervoor te zorgen dat de muis is hersteld van de effecten van analgesie en anesthesie zonder onnodige stress of fysiologische variabiliteit te introduceren.

Al met al biedt deze gecombineerde beenmergaspiratie- en flowcytometrietechniek bij muizen waardevolle inzichten in belangrijke signaalroutes, waaronder JAK/p-STAT5, mTORC1/p-4EBP1, mTORC1/p-RPS6 en MEK/p-ERK1/2. Deze routes spelen een belangrijke rol bij behandelingsresistentie bij AML. Deze techniek maakt herhaalde bemonstering van hetzelfde dier mogelijk, waardoor real-time monitoring van ziekteprogressie en therapierespons op eencellig niveau mogelijk is.

Fosfoflowcytometrie legt fosforyleringsgebeurtenissen vast en behoudt de cellulaire heterogeniteit 4,23,24. Dit maakt het bijzonder waardevol voor het begrijpen van de dynamische cellulaire reacties op therapie in specifieke leukemische subpopulaties.

Toekomstige toepassingen
Dit protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de onderliggende mechanismen van behandelingsaanpassing en het ontstaan van resistentie bij AML, en maakt de weg vrij voor diepere inzichten en mogelijke therapeutische vooruitgang. Toekomstige studies zouden deze benadering kunnen integreren met single-cell transcriptomics of proteomics om de moleculaire mechanismen die resistentie en ziekteprogressie aansturen verder te ontleden25. Bovendien zou het toepassen van deze methode op andere hematologische maligniteiten of ontstekingsaandoeningen de impact ervan in translationeel onderzoek kunnen verbreden.

Door dit protocol te verfijnen en de beperkingen ervan aan te pakken, zou deze benadering een standaardmethode kunnen worden voor het bestuderen van fosfoproteïnesignalering bij hematologische aandoeningen, wat uiteindelijk kan helpen bij de ontwikkeling van effectievere therapeutische strategieën. Concluderend biedt dit protocol een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de onderliggende mechanismen van behandelingsaanpassing en het ontstaan van resistentie bij AML, en maakt het de weg vrij voor diepere inzichten en potentiële therapeutische vooruitgang.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Transition Grants voor LH en FEM van de Cole Foundation, en subsidies van de Leukemia and Lymphoma Society of Canada en de Canadian Institutes for Health Research (PJT-186019) aan LH en FEM. FEM is een FRSQ Junior 2 Clinical Scientist en LH is een FRSQ Junior 2 Scientist. VG heeft een doctoraatsbeurs van de Cole Foundation. Afbeelding 1 is gemaakt met BioRender onder een licentieovereenkomst. Flowcytometriegrafieken werden gegenereerd met behulp van FlowJo-software. Speciale dank aan Dr. Colin Crist en Victoria Richard voor het verlenen van toegang tot hun faciliteit voor dierenchirurgie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuiten 25G x 5/8 TW BD Biosciences#309626Spuiten voor beenmergaspiratie
1,7 mL MicrocentrifugebuizenFroggaBio#LMCT1.7BOm de cellen die zijn teruggewonnen door beenmergaspiratie te verdelen
BD Horizon Brilliant Stain BufferBD Biosciences#563794Voor kleuringsprocessen
BuprenorfineFidelis Animal HealthEthiqa XRAnalgesie voor muizen
CellDrop FL UnlimitedFroggaBio#CellDrop FL- UNLTDVoor celtelling
D-PBSWisent Inc.#311-425-CLMedia voor cellen teruggewonnen door beenmergaspiratie
Eppendorf Centrifuge 5427 RMillipore Sigma#EP5429000260
Fetaal bovien serum Warmte-inactiveerd Premium CAWisent Inc.#090-450Voor kleuringsprocessen
Formaldehyde-oplossingMillipore Sigma#F1635Cellen Permeabilisatie
humanCD45 [HI30] antilichaam BD Biosciences#563792Antilichaam gekoppeld met BUV395
ID7000 Spectral Cell AnalyzerSonySpectral flow cytometer analyzer
Isofluraan 99,9% vloeistofMcKesson#803250Anesthesie voor muizen
Isospire (isofluraan) InhalatieanesthesieDechraAnesthesie voor muizen
Live/dead AO/PIFroggaBioCD-AO/PI-1.5Voor celtelling
Live/dead Zombie NIRBioLegend+B6:C12#423106Voor spectrale flowcytometrie
MethanoloplossingMillipore Sigma#179957Cellen Fixatie
P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] antilichaamCell Signaling Technology#2846Antilichaam gekoppeld met Alexa Fluor 488
p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] antilichaamCell Signaling Technology#13148Antilichaam gekoppeld met Alexa Fluor 647
p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] antilichaamCell Signaling Technology#9468Antilichaam gekoppeld met Alexa Fluor 594
p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] antilichaamCell Signaling Technology#14603Antilichaam gekoppeld met PE
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#2975Antilichaam gekoppeld met Alexa Fluor 488
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#2985Antilichaam gekoppeld met Alexa Fluor 647
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#8760Antilichaam gekoppeld met Alexa Fluor 594
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#5742SAntilichaam gekoppeld met PE
OntsmettingsdoekjesUnited Canada#UCDWPR-9022Desinfectie voor beenmergaspiratie

Referenties

  1. Ferrara, F., Schiffer, C. A. Acute myeloid leukaemia in adults. Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).
  2. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  3. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. J Vis Exp. (89), e51660(2014).
  4. Haas, A., Weckbecker, G., Welzenbach, K. Intracellular Phospho-Flow cytometry reveals novel insights into TCR proximal signaling events. A comparison with Western blot. Cytometry A. 73 (9), 799-807 (2008).
  5. Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines. Cells. 11 (13), 2072(2022).
  6. Kornblau, S. M., et al. Simultaneous activation of multiple signal transduction pathways confers poor prognosis in acute myelogenous leukemia. Blood. 108 (7), 2358-2365 (2006).
  7. Perl, A. E. The role of targeted therapy in the management of patients with AML. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2017 (1), 54µ65(2017).
  8. Márton, A., et al. The roles of phosphorylation of signaling proteins in the prognosis of acute myeloid leukemia. Pathol Oncol Res. 30, 1611747(2024).
  9. Levis, M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 220-226 (2013).
  10. Roux, P. P., Topisirovic, I. Signaling pathways involved in the regulation of mRNA translation. Mol Cell Biol. 38 (12), e00070-e00118 (2018).
  11. Nepstad, I., Hatfield, K. J., Grønningsæter, I. S., Reikvam, H. The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in human Acute Myeloid Leukemia (AML) Cells. Int J Mol Sci. 21 (8), ijms21082907(2020).
  12. Jia, X., Zhou, H. Phospho-eIF4E: A new target for acute myeloid leukemia. Curr Protein Pept Sci. 22 (4), 328-335 (2021).
  13. Ghosh, J., Kapur, R. Role of mTORC1-S6K1 signaling pathway in regulation of hematopoietic stem cell and acute myeloid leukemia. Exp Hematol. 50, 13-21 (2017).
  14. Park, H. J., et al. Therapeutic resistance in acute myeloid leukemia cells is mediated by a novel ATM/mTOR pathway regulating oxidative phosphorylation. Elife. 11, 79940(2022).
  15. Oki, T., et al. Imaging dynamic mTORC1 pathway activity in vivo reveals marked shifts that support time-specific inhibitor therapy in AML. Nat Commun. 12 (1), 245(2021).
  16. Lee, H. J., Daver, N., Kantarjian, H. M., Verstovsek, S., Ravandi, F. The role of JAK pathway dysregulation in the pathogenesis and treatment of acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res. 19 (2), 327-335 (2013).
  17. Liu, A. C. H., et al. Targeting STAT5 signaling overcomes resistance to IDH Inhibitors in acute myeloid leukemia through suppression of stemness. Cancer Res. 82 (23), 4325-4339 (2022).
  18. Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia. Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).
  19. Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. The regulation of protein translation and its implications for cancer. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).
  20. This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf (2024).
  21. Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi (2021).
  22. Suni, M. A., Maino, V. C. Flow cytometric analysis of cell signaling proteins. Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).
  23. Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications. Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).
  24. Chen, W., Luu, H. S. Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).
  25. Perez, O. D., Nolan, G. P. Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level. Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).

Herprints en machtigingen

Tags

Intracellulaire antilichaamskleuringspectrale flowcytometriebeenmergaspiratiemodulatie van signaalroutesparaformaldehydefixatiemethanolpermeabilisatiemultiparametrisch antilichaampanel
Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.