Methodenartikel

Magneto-reologische elastomeren met micropatroon om veranderingen in de uitlijning van cardiomyocyten te stimuleren

DOI:

10.3791/68271

⸱

10 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een dynamisch en omkeerbaar testplatform voor stijfheid, vervaardigd met behulp van een ultrazacht siliconenelastomeer (polydimethylsiloxaan, PDMS) met ingebedde ijzerdeeltjes. Deze nieuwe test is geschikt voor het bestuderen van opkomende tijdsafhankelijke fysieke veranderingen in celfenotypes, inclusief contactgeleiding. Hier meten we de uitlijning van neonatale ratten in de cardiomyocyten bij matrijping met behulp van magnetisme.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Substraat-geassocieerde signalen, zoals mechanisch en topografisch, hebben een diepgaande invloed op de cellulaire respons. Veel van het fundamentele onderzoek maakt echter gebruik van statische of geïsoleerde effecten. De richting en tijdschaal van deze mechanische effecten op opkomende cellulaire reacties blijven grotendeels onontgonnen. Hulpmiddelen om te onderzoeken hoe in de tijd variërende substraat-geassocieerde stimuli fysiologische en pathologische processen aansturen, kunnen het volgende niveau van mechanobiologisch inzicht ontsluiten. Hier gebruiken we magnetorheologische elastomeren (MRE's) met micropatronen die snel kunnen verstijven en verzachten als reactie op een extern magnetisch veld, waardoor een grondiger onderzoek mogelijk is naar de effecten van mechanische (stijfheid) en contactgeleide (topografische) stimulatie op de oriëntatie en uitlijning van neonatale cardiomyocyten bij ratten. Door dynamische controle van mechanische stijfheid te integreren die tijdelijk kan worden afgestemd en omgekeerd, kunnen we de effecten van belasting rigoureus testen door (1) pre-conditionering onder identieke omstandigheden en (2) acuut in vitro biomechanica te veranderen om klinisch relevante fenomenologie, zoals een hartinfarct, goed na te bootsen. Deze benadering stelt ons in staat om de impact van belasting op cellulaire responsen op een meer realistische en gecontroleerde manier te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van het hart om bloed efficiënt rond te pompen, is afhankelijk van de architectuur en mechanische eigenschappen (stijfheid) van het myocardium, waarbij de precieze organisatie van cellen en weefsel essentieel is voor gecoördineerde contractie en algehele functie. Het myocardium bestaat voornamelijk uit cardiomyocyten (CM's), die bij volwassenen een langwerpige, bijna staafachtige morfologie vertonen met sarcomeren (de contractiele eenheid van de CM's) uitgelijnd over de lengte van de cel. Daarentegen verschillen foetale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide CM's significant van volwassen CM's. Ze hebben meestal een meer afgeronde vorm, een enkele kern, een ongeorganiseerde of niet-uitgelijnde sarcomere structuur en een onregelmatige klopfrequentie. De structurele gelijkenis van de in vivo organisatie van het myocardium zorgt voor synchronie van contractie en krachtoverdracht; Dit is van cruciaal belang en essentieel voor het recapituleren van natuurlijk myocardium door middel van een in vitro model. Om CM's te genereren met structurele kenmerken die vergelijkbaar zijn met volwassen myocardium, hebben eerdere studies succesvolle strategieën aangetoond voor het verbeteren van de rijping, waaronder het manipuleren van substraatstijfheid 1,2, het toepassen van mechanische belasting3, het gebruik van contactgeleiding 4,5 of het gebruik van elektrische stimulatie 6,7.

Het is al lang bekend dat de stijfheid van de extracellulaire omgeving cellen beïnvloedt. In het hele menselijk lichaam bestaat een grote diversiteit aan stijfheid, variërend van honderden pascal (Pa) in de hersenen tot tientallen gigapascal (GPa) in bot 8,9,10. Het is gebleken dat weefsels tijdens de ontwikkeling van stijfheid veranderen, en deze verandering reguleert differentiatie en rijping op cellulair niveau tot de volwassen fenotypes die nodig zijn voor normaal functioneren 11,12,13,14. Veranderingen in stijfheid zijn ook in verband gebracht met ziektetoestanden en de progressie van specifieke pathologieën 15,16,17,18. In het bijzonder verandert de stijfheid van het myocardium met de ontwikkeling en progressie van ziekten; een gezond myocardium heeft bijvoorbeeld een elastische modulus van ~10 kPa in tegenstelling tot een falend hart, dat een elastische modulus heeft van 35-70 kPa of meer19. Bovendien hebben talrijke in vitro studies gemeld dat cardiomyocyten gekweekt op een substraat dat vergelijkbaar is met de natieve myocardstijfheid een betere sarcomeerorganisatie hadden20, optimale contractie genereerden 1,19 en de langste actiepotentiaalduur hadden21.

Bovendien wordt steeds meer erkend dat cellen in vivo worden blootgesteld aan een complexe verscheidenheid aan topografische signalen binnen hun micro-omgeving die vorm en functie bepalen. Deze topografische aanwijzingen zijn er in verschillende maten en geometrieën, van de willekeurige rangschikking van integrines op moleculair niveau tot de uitlijning op micronniveau van cellen in spierweefsels22,23. Net als bij andere mechanische regulatoren is topografie belangrijk voor de celmorfologie, zoals spreiding, rek, uitlijning, beweeglijkheid, differentiatie en apoptose 24,25,26. Met de introductie van synthetische kweeksubstraten zijn methoden ontwikkeld om een gecontroleerde oppervlaktetopografie voor cel- en weefselcultuur te creëren 27,28,29. Er zijn bijvoorbeeld nano- en microgroeven met micropatronen gebruikt om contactgeleiding te bieden voor zoogdiercellen, zodat cellen hun cytoskelet oriënteren en hermodelleren om de topografische structuren van het kweeksubstraat te volgen.

Hier introduceren we een in vitro kweekmethode die zowel structurele (contactcue) als mechanische (stijfheid) geleiding integreert met behulp van een patroon magnetorheologisch elastomeer (MRE) substraat, een afstembaar materiaal dat kan worden verstijfd of verzacht door de sterkte van het magnetische veld aan te passen 17,30,31,32. Door magneten in de buurt van het kweeksubstraat te plaatsen, kan de stijfheid worden verhoogd, waarbij de mate van verstijving kan worden gewijzigd door de afstand tussen het monster en de magneet te variëren. Omgekeerd kan de stijfheid worden verminderd door de magneet helemaal te verwijderen. Deze aanpak biedt een robuuste, dynamische en controleerbare methode om de in vivo-achtige mechanische omstandigheden na te bootsen, terwijl de micropatronen aan het oppervlak anisotropie introduceren, waardoor meer biomimetische 2D-celkweeksubstraten kunnen worden gecreëerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van PDMS-stempel met patroon

OPMERKING: Een PDMS-stempel is essentieel vanwege zijn flexibiliteit, waardoor hij gemakkelijk kan worden gemanipuleerd en nauwkeurig contact kan worden gemaakt bij het voorbereiden van het MRE-oppervlak met patroon. Het flexibele karakter van de stempel maakt het ook mogelijk om de MRE-PDMS-laag moeiteloos te verwijderen zonder het patroon te beschadigen, wat zorgt voor zowel een nauwkeurige patroonoverdracht als het behoud van het MRE-oppervlak.

  1. Bereid 10 g 10:1 (basis: verharder middel) 184 PDMS.
  2. Giet 5 g van de 184 PDMS in een petrischaaltje van 35 mm en ontgas in een exsiccator gedurende ~5-10 min, totdat alle bubbels zijn verdwenen.
  3. Laat 184 PDMS 30 minuten gedeeltelijk uitharden in een oven van 60 °C.
  4. Als er nog 5 minuten over zijn voor de 184 PDMS om gedeeltelijk uit te harden, voeg dan een dunne laag van de extra 184 PDMS toe aan het diffractierooster en ontgas in de exsiccator gedurende ~5 min.
  5. Haal de 35 mm schaal met de gedeeltelijk uitgeharde 184 PDMS uit de oven.
  6. Draai het diffractierooster met PDMS om op de gedeeltelijk uitgeharde 184 PDMS in een schaal van 35 mm.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het diffractierooster naar beneden wijst in de gedeeltelijk uitgeharde 184 PDMS in de 35 mm-schaal.
  7. Druk lichtjes op het diffractierooster totdat een kleine hoeveelheid 184 PDMS het rooster omringt.
  8. Gebruik de resterende niet-uitgeharde 184 PDMS om de schaal rond het rooster op te vullen om ervoor te zorgen dat deze op zijn plaats blijft tijdens het uitharden.
  9. Plaats de schaal met het diffractierooster gedurende 1,5 uur in de oven op 60 °C.
  10. Nadat de 184 PDMS volledig is uitgehard, haalt u de schaal van 35 mm met het diffractierooster uit de oven.
  11. Kerf rond het diffractierooster met een scalpel.
  12. Breng een kleine hoeveelheid isopropylalcohol (IPA) aan om onder het diffractierooster door te dringen.
  13. Trek het rooster van de 184 PDMS in de richting evenwijdig aan de patronen.
  14. Verwijder het overtollige 184 PDMS en laat alleen het gedeelte met het patroon over.
  15. Knip de 184 PDMS-stempel op de gewenste grootte.
    OPMERKING: In deze studie wordt een stempel van 1 cm × 1 cm gebruikt voor de apparaten.

2. Oppervlaktecoating van PDMS-zegel

OPMERKING: Een silaanbehandeling creëert een oppervlaktecoating die ongewenste hechting tussen PDMS-lagen tijdens het stempelen voorkomt, waardoor een soepele scheiding wordt gegarandeerd en de kwaliteit van de patroonoverdracht behouden blijft.

  1. Silaanbehandeling (voorkeursmethode)
    1. Plaats de gefabriceerde 184 PDMS-stempel in een O2 plasmareiniger met het oppervlak met het patroon naar boven. Behandel het PDMS-oppervlak met 45 W O2 plasma gedurende 30 s.
      OPMERKING: Eenmaal verwijderd uit de plasmareiniger, plaatst u onmiddellijk een deksel (of deksel) over de stempels om ervoor te zorgen dat er geen vuil op de gereinigde stempels neerslaat.
    2. Plaats 184 PDMS-stempels in een exsiccator in een zuurkast.
    3. Scheur het deksel van een microcentrifugebuisje af.
    4. Plaats het deksel van het microcentrifugebuisje naast de 184 PDMS-stempels in de exsiccator
    5. Voeg 20 μL trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan toe aan het deksel van de microcentrifugebuis.
      LET OP: Deze chemische stof is gevaarlijk voor de gezondheid en mag daarom alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast.
    6. Sluit de exsiccator en trek een vacuüm.
    7. Laat de silaan de stempels bedekken van 1 uur tot een nacht.

3. Bereiding van magnetorheologische elastomeren

OPMERKING: Om afstembare en omkeerbare MRE's te creëren, maakt een nauwkeurige verhouding van carbonylijzerdeeltjes en elastomeer, gecombineerd met de toepassing van een magnetisch veld, het mogelijk om de stijfheid over een reeks waarden aan te passen. Door de deeltjesfractie, de basiselastomeermodulus en de magnetische veldsterkte te variëren, kan de stijfheid van het materiaal nauwkeurig worden afgestemd op specifieke vereisten.

  1. MRE-voorbereiding met een zachter dynamisch bereik (zie tabel 1 voor bijvoorbeeld gewichten)
    1. Meet de gewenste hoeveelheid siliconenverdunner en Eco elastomeer deel B af en meng 1 minuut op 2500 rpm in een toerenmenger.
    2. Voeg Eco elastomeer deel A en carbonylijzerdeeltjes toe aan de oplossing en meng bij 2500 tpm in een snelheidsmixer gedurende 1 minuut.
      OPMERKING: De volgorde van mengen is van cruciaal belang om de gewenste polymerisatietiming te garanderen.
    3. Voeg met behulp van een transferpipet met afgesneden punt 5 g van de MRE toe aan een nieuw petrischaaltje van 35 mm en ontgas in een exsiccator gedurende ~5 min, laat vervolgens ~10 min gedeeltelijk uitharden in de oven bij 60 °C.
      OPMERKING: Ervoor zorgen dat de oven en exsiccator goed waterpas staan, is essentieel voor het verkrijgen van een plat monster, wat van cruciaal belang is voor het gemak van beeldvorming.
    4. Zodra er nog 5 minuten over zijn, gebruikt u een transferpipet om extra niet-uitgeharde MRE toe te voegen om het oppervlak van de 184 PDMS-stempel te bedekken. Plaats de gecoate stempel in de exsiccator om 5 minuten te ontgassen.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te veel MRE gebruikt, want als het de randen van de stempel bedekt, wordt het moeilijker om de stempel te verwijderen zodra de MRE volledig is uitgehard. Zorg er ook voor dat u bij elke stap de richting van het patroon aangeeft, zodat bij het verwijderen van de stempel van de MRE, deze in de richting evenwijdig aan de patronen kan worden getrokken.
    5. Haal de MRE uit de oven en gebruik een tang om de gecoate stempel voorzichtig te verplaatsen. Draai het met de bedrukte zijde naar beneden op de gedeeltelijk uitgeharde MRE en druk lichtjes aan. Zet de MRE en gecoate stempel nog 25 minuten terug in de oven op 60 °C.
    6. Eenmaal volledig uitgehard, gebruik je een scalpel om de MRE aan de onderkant van de stempel in te kerven, loodrecht op de patronen.
    7. Breng een kleine hoeveelheid IPA aan op het snijgebied rond de stempel.
      OPMERKING: De IPA moet in de snede sijpelen en onder de stempel beginnen te bewegen.
    8. Trek met een tang de stempel van de MRE in de richting evenwijdig aan de patronen.
  2. Stijver dynamisch bereik MRE-voorbereiding (zie tabel voor bijvoorbeeld gewichten)
    1. Bereid 30:1 184 PDMS voor.
      LET OP: Maak extra want een deel blijft aan de mengbeker plakken.
    2. Voeg de gewenste hoeveelheid van 527 PDMS deel A en deel B toe, vervolgens carbonylijzerdeeltjes en 30:1 184 PDMS in verhoudingen op basis van het voorbeeld in de tabel.
    3. Mix het op 2500 tpm in een snelheidsmixer gedurende 1 min.
    4. Voeg met behulp van een transferpipet met afgesneden punt 5 g van de MRE toe aan een nieuwe petrischaal van 35 mm en ontgas deze ~5 minuten in een exsiccator en laat vervolgens ~40 minuten gedeeltelijk uitharden in de oven bij 60 °C.
    5. Zodra er nog 5 minuten over zijn, gebruikt u een transferpipet om extra niet-uitgeharde MRE toe te voegen om het oppervlak van de PDMS-stempel te bedekken. Plaats de gecoate stempel in de exsiccator om 5 minuten te ontgassen.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te veel MRE gebruikt, want als het de randen van de stempel bedekt, wordt het moeilijker om de stempel te verwijderen zodra de MRE volledig is uitgehard. Zorg er ook voor dat u bij elke stap de richting van het patroon aangeeft, zodat bij het verwijderen van de stempel van de MRE, deze in de richting evenwijdig aan de patronen kan worden getrokken.
    6. Haal de MRE uit de oven.
    7. Gebruik een tang om de gecoate stempel voorzichtig te verplaatsen, draai deze met de bedrukte zijde naar beneden op de gedeeltelijk uitgeharde MRE en druk lichtjes aan.
    8. Zet de MRE met de gecoate stempel op het bovenste rek een nacht in de oven op 60 °C.
    9. Eenmaal volledig uitgehard, gebruik je een scalpel om de MRE aan de onderkant van de stempel te snijden, loodrecht op de patronen.
    10. Breng IPA aan op het snijgebied rond de stempel.
      OPMERKING: De IPA moet in de snede sijpelen en onder de stempel beginnen te bewegen.
    11. Trek met een tang de stempel van de MRE in de richting evenwijdig aan de patronen.
Stijfheid bereikMateriaalVoorbeeld gewicht
Zachter10-80 kPaEco (A+B)11,25 g (A)11,25 gr (B)
Siliconen verdunner22,5 gr
IJzerdeeltjes45 gr
Stijver60-120 kPa527 PDMS (A+B)18,75 gr (A)18,75 gr (B)
IJzerdeeltjes37,5 gr
184 PDMS (basis+uitharden)14,5 g (Basis)0,5 g (Uitharden)

Tabel 1: Voorbeeldgewichten van alle materialen voor het vervaardigen van zowel zachtere als stijvere MRE's. De gewichten in de tabel zijn voor het maken van in totaal 90 g MRE-materiaal. Minder bereiden kan worden bereikt door alle bestanddelen in dezelfde verhoudingen te mengen als de voorbeeldgewichten in de tabel.

4. Voorbereiding van de celcultuur

OPMERKING: De voorbereiding van celcultuur omvat het selecteren van de juiste cellijn, het bereiden van kweekmedia met de nodige voedingsstoffen en groeifactoren, en het zorgen voor steriele omstandigheden om besmetting te voorkomen. De cellen worden in kweekvaten geplateerd en onder optimale omstandigheden (gewoonlijk 37 °C met gecontroleerde CO2 geïncubeerd). Regelmatige controle, mediumveranderingen en passaging worden uitgevoerd om een gezonde celgroei te behouden.

  1. Steriliseer het oppervlak van de MRE door het 3 keer te wassen met 70% ethanol en laat de derde wasbeurt 20 minuten intrekken.
  2. Was het MRE-oppervlak 3 keer met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door voldoende volume toe te voegen om de schaal volledig te bedekken, gevolgd door het opzuigen van alle vloeistof.
  3. Smeer het oppervlak van de MRE in met fibronectine (10 μg/ml) in PBS gedurende 1 uur bij 37 °C om de celhechting aan het apparaat te bevorderen.
  4. Was het MRE-oppervlak 3 keer met PBS, vergelijkbaar met stap 4.1.2.
  5. Zaai de cardiomyocyten van de neonatale rat met een dichtheid van 20.000 cellen/cm2.
  6. Voeg magneten tijdelijk toe aan de apparaten om de matrix tijdens de celcultuur te verstijven.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het plaatsen van apparaten met magneten in de couveuse. De apparaten moeten ver uit elkaar worden geplaatst om te garanderen dat de magneten niet met elkaar in contact komen. Deze studie beveelt het gebruik van met roestvrij staal beklede incubators aan in plaats van met koper beklede incubators, omdat er minder interactie is.

5. Kleuring en beeldvorming

  1. Beeldvorming met vaste cellen
    OPMERKING: Beeldvorming van vaste cellen omvat verschillende belangrijke stappen om specifieke cellulaire componenten te visualiseren. Eerst worden cellen gefixeerd om hun structuur te behouden. Vervolgens wordt het celmembraan gepermeabiliseerd om vlekpenetratie mogelijk te maken, gevolgd door een blokkerende stap om te voorkomen dat antilichamen of vlekken niet-specifiek worden gebonden aan onbedoelde plaatsen, zoals andere eiwitten of cellulair afval. Cellen worden vervolgens gekleurd met kleurstoffen of antilichamen die gericht zijn op specifieke moleculen, en overtollige vlekken worden verwijderd door te wassen. Ten slotte worden de gekleurde cellen in beeld gebracht met behulp van fluorescentiemicroscopie voor analyse van cellulaire structuren.
    1. Was eenmaal met 1x PBS door voldoende volume toe te voegen om de schaal volledig te bedekken, gevolgd door het opzuigen van alle vloeistof.
    2. Fixeer cellen door gedurende 10 minuten 4% (v/v) paraformaldehyde te gebruiken.
    3. Was drie keer met 1x PBS (vergelijkbaar met stap 5.1.1).
    4. Voeg 0,1% Triton X toe (in 1x PBS) en incubeer gedurende 5 minuten om te permeabiliseren.
    5. Was drie keer met 1x PBS (vergelijkbaar met stap 5.1.1).
    6. Voeg NH4Cl (50 mM in 1x PBS) toe en incubeer gedurende 15 minuten om te blussen.
    7. Was drie keer met 1x PBS (vergelijkbaar met stap 5.1.1).
    8. Voeg blokkeerbuffer toe (5% BSA in 1x PBS) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
    9. Combineer het primaire anti-α-actinine primaire antilichaam bij 1:200 tot 5% BSA (in 1x PBS).
      OPMERKING: Meng het antilichaam grondig.
    10. Voeg de primaire antilichaamoplossing toe aan het monster.
      OPMERKING: Voeg genoeg toe om het hele monster te bedekken.
    11. Incubeer een nacht bij 4 °C.
      OPMERKING: Overweeg om het monster op een lage snelheid op de tuimelschakelaar te plaatsen om de oplossingen te helpen mengen.
    12. Was drie keer met 1x PBS (vergelijkbaar met stap 5.1.1).
    13. Verdun het secundaire antilichaam (555 Alexa Fluor goat anti-mouse) in 1x PBS (1:2000).
      OPMERKING: De secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig (fluoroforen). Als ze niet direct in gebruik zijn, zorg er dan voor dat ze afgedekt en uit het licht zijn.
    14. Voeg de secundaire antilichaamoplossing toe aan het monster.
    15. Incubeer 2 uur bij RT.
    16. Was drie keer met 1x PBS (vergelijkbaar met stap 5.1.1).
    17. Voeg DAPI toe (1 μg/ml in gesteriliseerd gedeïoniseerd water) en incubeer 5-10 minuten in het donker.
    18. Breng de cellen in beeld met een rechtopstaande microscoop met een 20x dip-in lens.
    19. Maak 50 foto's per apparaat.
    20. Verwerk de afbeeldingen met behulp van een ImageJ-plug-in genaamd Directionality.
      OPMERKING: Richtingsopties: In deze studie werden n = 45 bakken gebruikt, variërend van 0° tot 176° om een wikkeleffect te voorkomen. De gebruikte methode was de lokale gradiëntoriëntatie en de weergavetabel werd geselecteerd. De richtingsuitvoer komt overeen met de gemiddelde vectorhoek (die de uitlijningshoek aangeeft), terwijl de goedheidsuitvoer de gemiddelde vectorlengte vertegenwoordigt (die de mate van uitlijning aangeeft).
  2. Live beeldvorming van cellen
    OPMERKING: Live celbeeldvorming maakt het mogelijk om dynamische cellulaire processen in realtime te volgen, terwijl de cellen in hun natuurlijke, levende staat blijven. Deze techniek omvat het gebruik van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een incubatiekamer om afbeeldingen of video's met een hoge resolutie vast te leggen van cellen terwijl ze groeien, delen of reageren op stimuli. Het mogelijk maken van de studie van cellulair gedrag en interacties in de loop van de tijd en het verschaffen van waardevolle inzichten in cellulaire functie en dynamiek.
    1. Incubeer de cellen met SiR-actine 1:1000 verhouding met kweekmedia gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Zuig de media op en vervang deze door 1:2000 (SiR-actine: Media).
      OPMERKING: Deze verdunning is bedoeld om de celtoxiciteit te verminderen voor uitgebreide live beeldvorming.
    3. Verzamel elke 15 minuten gedurende 5 uur immunofluorescentiebeelden op een rechtopstaande microscoop met een incubatiekamer, geautomatiseerde tafel en 20x dip-in lens.
      OPMERKING: Voor het live cell imaging-experiment werd de magneet toegevoegd zodra de MRE in het live beeldvormingssysteem werd geplaatst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultrazachte magnetorheologische elastomeren (MRE's) op siliconenbasis hebben elastische moduli die nauwkeurig kunnen worden afgesteld door een magnetisch veld aan te leggen. Dit maakt snelle, bidirectionele aanpassingen mogelijk binnen een fysiologisch bereik, met nauwkeurige controle over zowel de snelheid als de omvang van de veranderingen (Figuur 1). De gelmechanica werd geëvalueerd door de elastische modulus te meten zoals eerder beschreven, en de gemidd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze techniek is grondig getest, maar zorgvuldige aandacht voor verschillende stappen is essentieel voor een succesvol experiment.

In dit protocol gebruiken we een commercieel diffractierooster als hoofdmal voor patroonvorming. Alternatieve mallen met patronen, zoals siliconen of SU8 micro-vervaardigde mallen, kunnen echter ook worden gebruikt om een breed scala aan patronen in verschillende maten te maken33,35

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Delaware Center for Musculoskeletal Research COBRE (P20 GM139760), met subsidies van het National Institute of General Medical Science van de National Institutes of Health en de staat Delaware. We willen onze oprechte dank betuigen aan Sagar Doshi van het Center for Composite Materials (CCM) en Ashika Singh van het Dhong-lab aan de Universiteit van Delaware voor hun onschatbare steun om ons in staat te stellen hun laserconfocale microscopen te gebruiken en voor het leveren van de expertise die nodig is voor de oppervlaktekarakterisering van onze materialen. Hun bijdrage heeft de kwaliteit van ons werk aanzienlijk verbeterd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
555 Alexa Fluor goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher ScientificA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
20x dip-in lensZeiss421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
35 mm DishesThermoFisher Scientific130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
Anti-alpha actinin primary antibodyabcamEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
Carbonyl Iron Powder Microsphereschemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
DAPI stainThermoFisher ScientificD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
DesiccatorFisher Scientific08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
Diffraction GratingThor LabsGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
Ecoflex Gel part A & BSmooth OnEcoflex GELhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
Expanded tabletop plasma cleanerSigma AldrichZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
Fibronectin from bovine plasmaSigma AldrichF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer FlacktekDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
Isopropyl AlcoholAmazonhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS
Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8
KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx
uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx
dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW
l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87
5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR
8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7
uIto.V3Vf62Lnprtq2u5PRO
SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU&
dib_tag=se&hvadid=598724400239
&hvdev=c&hvlocphy=9007460&hvn
etw=g&hvqmt=e&hvrand=1609157
209668794739&hvtargid=kwd-3203
62094308&hydadcr=5273_13
227703&keywords=isopropyl+alcohol+
amazon&mcid=9f9d3252906531
3ea89ab7766d9c244c&qid=1740
675756&sr=8-1-spons&sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1
MagnetCMS MagneticsND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
Nikon Eclipse 80i upright microscopeNikonEclipse 80i
OvenFisher Scientific15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
Silicone ThinnerSmooth OnSilicone Thinnerhttps://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
SiR Actin StainCytoskeletonCY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
Sylgard 184 PDMS (Base + Curing agent)Ellsworth Adhesives2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
Sylgard 527 PDMS part A & BEllsworth Adhesives1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
Transfer PipettesFisher Scientific13-711-5AMMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13
-711-5AMMD&searchType=
RAPID&matchedCatNo=13
-711-5AMMD
Trichloro -(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich448931https://www

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
  2. Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D. Substrate stiffness influences structural and functional remodeling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Front Physiol. 12, 710619(2021).
  3. Dou, W., et al. A microdevice platform for characterizing the effect of mechanical strain magnitudes on the maturation of iPSCcardiomyocytes. Biosens Bioelectron. 175, 112875(2021).
  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
  5. Ahn, H., et al. Hierarchical topography with tunable micro and nanoarchitectonics for highly enhanced cardiomyocyte maturation via multiscale mechanotransduction. Adv Healthc Mater. 12 (12), 2202371(2023).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 989-999 (2013).
  7. Hirt, M. N., et al. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. J Mol Cell Cardiol. 74, 151-161 (2014).
  8. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  9. Swift, J., et al. Nuclear laminA scales with tissue stiffness and enhances matrixdirected differentiation. Science. 341 (6149), 1240104(2013).
  10. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear mechanics and mechanotransduction in health and disease. Curr Biol. 23 (24), R1113-R1121 (2013).
  11. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  12. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  13. Hazeltine, L. B., et al. Effects of substrate mechanics on contractility of cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells. Int J Cell Biol. 2012, 508294(2012).
  14. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  15. Deng, B., Zhao, Z., Kong, W., Han, C., Shen, X., Zhou, C. Biological role of matrix stiffness in tumor growth and treatment. J Transl Med. 20 (1), 540(2022).
  16. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 63-73 (2009).
  17. Vite, A., et al. Extracellular stiffness induces contractile dysfunction in adult cardiomyocytes via cellautonomous and microtubuledependent mechanisms. Basic Res Cardiol. 117 (1), 41(2023).
  18. Stowers, R. S., et al. Matrix stiffness induces a tumorigenic phenotype in mammary epithelium through changes in chromatin accessibility. Nat Biomed Eng. 3 (12), 1009-1019 (2019).
  19. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heartlike elasticity: scarlike rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  20. Rodriguez, A. G., Han, S. J., Regnier, M., Sniadecki, N. J. Substrate stiffness increases twitch power of neonatal cardiomyocytes in correlation with changes in myofibril structure and intracellular calcium. Biophys J. 101 (10), 2455-2464 (2011).
  21. Boothe, S. D., et al. The effect of substrate stiffness on cardiomyocyte action potentials. Cell Biochem Biophys. 74 (4), 527-535 (2016).
  22. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  23. Martínez, E., Engel, E., Planell, J. A., Samitier, J. Effects of artificial micro and nanostructured surfaces on cell behaviour. Ann Anat. 191 (1), 126-135 (2009).
  24. Ravichandran, R., Liao, S., Ng, C. C., Chan, C. K., Raghunath, M., Ramakrishna, S. Effects of nanotopography on stem cell phenotypes. World J Stem Cells. 1 (1), 55(2009).
  25. Brunetti, V., et al. Neurons sense nanoscale roughness with nanometer sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14), 6264-6269 (2010).
  26. Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S. G., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: I. Simple step cues. Development. 99 (3), 439-448 (1987).
  27. Nguyen, A. T., Sathe, S. R., Yim, E. K. F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance. J Phys Condens Matter. 28 (18), 183001(2016).
  28. DowellMesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1 (2), 78-90 (2004).
  29. Loesberg, W. A., et al. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28 (27), 3944-3951 (2007).
  30. Corbin, E. A., et al. Tunable and reversible substrate stiffness reveals a dynamic mechanosensitivity of cardiomyocytes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (23), 20603-20614 (2019).
  31. Bouhrira, N., Vite, A., Margulies, K. B. Distinct cytoskeletal regulators of mechanical memory in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 119 (2), 277-289 (2024).
  32. Lee, B. W., et al. Adult human cardiomyocyte mechanics in osteogenesis imperfecta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (4), H814-H821 (2023).
  33. Cao, Z., Ball, J. K., Lateef, A. H., Virgile, C. P., Corbin, E. A. Biomimetic substrate to probe dynamic interplay of topography and stiffness on cardiac fibroblast activation. ACS Omega. 8 (6), 5406-5414 (2023).
  34. Clark, A. T., et al. Magnetic field tuning of mechanical properties of ultrasoft PDMSbased magnetorheological elastomers for biological applications. Multifunct Mater. 4 (3), 035001(2021).
  35. Kim, Y., Kwon, C., Jeon, H. Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves. Materials. 10 (8), 973(2017).
  36. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSCderived engineered cardiac tissues. Methods Mol Biol. 2320, 171-180 (2021).
  37. Dirar, Q., et al. Activation and degranulation of CART cells using engineered antigenpresenting cell surfaces. PLoS One. 15 (9), e0238819(2020).
  38. Kim, C., Kim, H., Park, H., Lee, K. Y. Controlling the porous structure of alginate ferrogel for anticancer drug delivery under magnetic stimulation. Carbohydr Polym. 223, 115045(2019).
  39. Fan, D., et al. Recent advances of magnetic nanomaterials in bone tissue repair. Front Chem. 8, 745(2020).
  40. GonzalezRico, J., et al. Tuning the cell and biological tissue environment through magnetoactive materials. Appl Sci. 11 (18), 8746(2021).
  41. AntmanPassig, M., Shefi, O. Remote magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Lett. 16 (4), 2567-2573 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Magnetoreologische elastomerenmechanische stijfheidmicropatterned substratenneonatale rat cardiomyocytendynamische substraatstijfheidtopografische aanwijzingenmechanisch geheugenPDMS stempelenfibronectine coating

Gerelateerde artikelen