Hoog-doorvoer seriële tomografie met behulp van een geautomatiseerde monsterveranderende robot

Summary

De implementatiedetails en de gegevensverzamelingsprocedure voor synchrotron-gebaseerde röntgentomografie met behulp van de geautomatiseerde monsterveranderende robot bij de Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging beamline worden hier gepresenteerd en besproken. Dit verbetert de doorvoer en de efficiëntie van gegevensverzameling van de bundellijn drastisch.

Abstract

Dit manuscript beschrijft een workflow voor geautomatiseerde gegevensverzameling die een robotarm gebruikt voor het uitwisselen van monsters, wat de efficiëntie van gegevensverzameling aanzienlijk verbetert. De opstelling, geïmplementeerd voor synchrotron röntgenbeeldvorming bij de Diamond Light Source (DLS) I13-2 beeldstraallijn, maakt gebruik van een robot om hoog-doorvoer seriële tomografie (3D) of beeldvorming (2D) te bereiken. Op dit moment is voor veel experimenten de tijd die nodig is voor handmatige monsteruitwisseling en uitlijning vergelijkbaar met, of zelfs langer dan de duur van de tomografie-scan zelf. Om het efficiënte gebruik van de beschikbare bundeltijd te maximaliseren en de experimentele doorvoer te verhogen, is het automatiseren van monsteruitwisseling en uitlijning essentieel. Het gebruik van de robot als samplechanger kan de doorvoer met minstens 4-10 keer verhogen vergeleken met handmatige procedures, afhankelijk van de gekozen pixelgrootte. Met de Diamond II-machine en de I13L-bundellijnen Operando Coherent TOmografie en Ptychographic Imaging (OCTOPI) upgrades, zal de verhoogde röntgenflux de experimentele scantijden verder verkorten, waardoor het systeem nog efficiënter wordt. Bovendien maakt de automatisering het mogelijk om gegevens op afstand te verzamelen, inclusief een optionele mail-in dienst voor gebruikers. Geautomatiseerde monstercentrering maakt volledig onbeheerd scannen mogelijk, dat op afstand kan worden uitgevoerd. Dit vertegenwoordigt een uniek en innovatief kenmerk van het systeem. Dit manuscript beschrijft de volledige procedure, inclusief monstervoorbereiding, montage op gespecialiseerde houders, transport naar de bundellijn en plaatsing op de speciale trays voor robotische monsteruitwisseling. De procedure voor geautomatiseerd monstercentreren en de daaropvolgende tomografie-reconstructie worden gepresenteerd.

Introduction

Automatisering wordt al decennialang veel gebruikt in de zware productie-industrieën. ^1,2,3. Echter, de ontwikkeling van robothardware en -software is voldoende gevorderd zodat het zeer gevoelige taken aankan, zoals genoomsequencing, het uitvoeren van medische operaties in ziekenhuizen of het assisteren bij het uitvoeren van chemische experimenten 4,5,6,7. Automatisering elimineert niet alleen menselijke fouten, maar verbetert ook de doorvoer en efficiëntie⁴.

Een synchrotronröntgenbron genereert extreem heldere en zeer coherente elektromagnetische straling in het brede spectrale bereik van infrarood tot harde röntgenstraling. Deze bronnen maken hoog-doorvoer- en hoogresolutie-beeldvormingsexperimenten mogelijk met zeer korte scantijden en hoge statistieken. De gedeeltelijke coherentie kan worden benut om beter contrast te bereiken voor zwak absorberende zachte materialen zoals polymeren of weefselmonsters ^8,9,10 in vergelijking met laboratoriumgebaseerde röntgenbronnen. Een volledige röntgentomografiedataset – waarmee een object in echte 3D kan worden gevisualiseerd – vereist het verkrijgen van projecties van het monster onder verschillende hoeken. Vooruitgang in bronhelderheid, experimentele hardware en besturing maakt het mogelijk om tijden te verzamelen van data in tientallen seconden tot minuten⁸. Daardoor zijn het laden en uitlijnen van monsters tijdrovender geworden dan de tomografiescan^{zelf 11,12}. Het is belangrijk op te merken dat het handmatig wisselen van monsters in een synchrotrontomografie-experiment aanzienlijk veel tijd kan kosten (vergeleken met scantijd), omdat een stralingsveiligheidsprocedure gevolgd moet worden bij het binnengaan en sluiten van de experimentele hut. Deze procedure duurt meestal enkele minuten. Daarnaast kan het uitlijnen van het monster ook enkele minuten in beslag nemen.

Als dit proces van monsterwisseling en sample-uitlijning wordt geautomatiseerd, wordt er een aanzienlijke hoeveelheid tijd bespaard. Daarom is er een monsterwisselrobot geïmplementeerd bij de I13-2 Imaging beamline van de DLS-synchrotronfaciliteit. Dit manuscript beschrijft het volledige protocol van het uitvoeren van een synchrotron röntgen-microtomografie-experiment met meerdere monsters met behulp van een monsterwisselrobot op de I13-2 Imaging beamline^11,12. Deze implementatie verbetert niet alleen de efficiëntie van de experimentele tijd, maar maakt het ook mogelijk om experimenten op afstand uit te voeren. Het alternatief is handmatig of semi-geautomatiseerd rijden, die beide aanzienlijk langzamer zijn. Hier betekent semi-geautomatiseerd dat de robot alleen wordt gebruikt voor monsteruitwisseling zonder uitlijning van het monster.

Het belang van automatisering wordt benadrukt door automatiseringsprojecten bij andere synchrotronbeeldvormingsbundellijnen, met de meest vergelijkbare projecten bij de 2BM-bundellijn van APS¹³, de SLS TOMCAT-bundellijn¹⁴, de EMBL P14-bundellijn op PETRA III¹⁵, en de IMAGE-bundellijn bij het Karlsruhe Institute of Technology (KIT) Light^{Source 16}. In het 2-BM APS zijn de monsters die met een robot gescand moeten worden gemonteerd op een standaard kinematische bevestiging, die in een sample-changerbak met een maximale capaciteit van 60 monsters tegelijk wordt geplaatst. Een grijparm pakt vervolgens het monster en monteert het op het rotatiepodium. De sample-uitlijning wordt echter offline uitgevoerd met behulp van een stereoscoop. Een vergelijkbaar systeem werd geïnstalleerd in de TOMCAT-bundellijn in SLS, behalve dat het proces hier volledig geautomatiseerd is, wat monsterbelasting-ontlasting, uitlijning, het scannen van een correct interessegebied en reconstructie kan uitvoeren. Het totale aantal monsters dat tegelijk gescand kan worden is 60. Onlangs heeft de P14-bundellijn op PETRA III¹⁵ een monsterveranderingssysteem geïnstalleerd dat zachte biologische monsters van ongeveer 1 mm grootte kan verwerken. Positionering en centrering worden gedaan via de drie-klik-centreringsprocedure. Bij de IMAGE-bundellijn bij KIT maakt een high-throughput beeldvorming/tomografie eindstation het mogelijk om tot 1.500 exemplaren binnen twee dagen^te meten. In tegenstelling tot de hierboven genoemde robotsystemen kan het I13-2 Imaging beamline-systeem momenteel monsters tot 8 mm in diameter verwerken en tot 112 monsters meten binnen een dienst van acht uur, zonder menselijke tussenkomst, inclusief automatische monstercentrering.

De huidige tomografie-opstelling bij I13-2, Diamond-Manchester Imaging beamline, is gerapporteerd in de genoemde^{publicatie 17}. Voor de volledigheid worden hier de belangrijkste aspecten van de tomografie-experimenten samengevat; verwijs ook naar Figuur 1. De tomografie-stage stack bestaat uit een hexapod (PI miCos) voor monstermanipulatie en het uitlijnen van rotatie-askantelen. Een luchtlager-rotatietrap is bovenop de hexapod gemonteerd. De rotatietrap heeft uitstekende wiebelbewegingen (<2,4 μrad) en axiale fouten (<100 nm). Het tomografiedetectorsysteem is uitgerust met vier verschillende vergrotingen (of gezichtsveld). Voor de huidige studie zijn 1,25× (2,6 μm effectieve pixelgrootte met 6,7 mm x 5,6 mm gezichtsveld) en 4× (0,81 μm effectieve pixelgrootte met 2,1 mm x 1,8 mm gezichtsveld) objectieven gebruikt. Het 1,25× objectief had een 500 μm LuAg:Ce scintillator, terwijl het 4x objectief een 100 μm LuAg:Ce scintillator had (Crytur). Een sCMOS-detector (pco.edge 5.5) registreert het vergrote scintillatiescherm via een extra 2x fotooculair (alle microscoopoptica zijn van Olympus). De effectieve pixels variëren van 2,6 μm tot 0,33 μm, met ongeveer 1 μm resolutie bij de hoogste gebruikte vergroting. De detectorchip bestaat uit 2560 x 2160 met een pixelgrootte van 6,5 μm, en de maximale uitleessnelheid van de pixelarray is 100 Hz.

Protocol

OPMERKING: Deze studie gebruikt insectenexemplaren van het Natural History Museum (NHM), Londen, voor vergelijkende fenotypische analyse. Specimens waren verworven door het Natural History Museum, volgens de standaardprocedures om te waarborgen dat specimens legaal waren verzameld en gedoneerd.

1. Planning van het experiment

1. Controleer de haalbaarheid van het uitvoeren van tomografie- of beeldvormingsexperimenten met het monster van belang bij de I13-2 bundellijn door contact op te nemen met het bundellijnpersoneel via de volgende link: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Dien een voorstel in om een tijdslot te verkrijgen voor het uitvoeren van het geplande experiment via de volgende link: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Bespreek de monstervoorbereiding en het meetproces met beamline-medewerkers zodra het voorstel is geaccepteerd en het experiment is ingepland. Experimenten die met de robot worden uitgevoerd, hebben bepaalde vereisten, die worden behandeld in de volgende sectie (sectie 2).
4. Bespreek de afmetingen en samenstelling van het monster met het bundelstafteam om te verifiëren dat het experiment succesvol kan worden uitgevoerd op de bundellijn.
5. Begin ruim van tevoren met de voorbereiding op het experimentele bezoek door de instructies op de website (https://www.diamond.ac.uk/Users.html) te volgen.
6. Voltooi de veiligheidstraining vóór de experimentele sessie.

2. Monstervoorbereiding (voor robotexperimenten)

1. Bereid SPINE-compatibele Sample Bases¹⁸ voor voor samplemontage. Monter elk monster op een SPINE-achtige standaard monsterbasis die is uitgerust met een Data Matrix-barcode om geautomatiseerde monstertracking mogelijk te maken.
2. Bevestig het monster aan de basis met een van twee configuraties. Pinmontage: Bevestig het monster op een SPINE-stijl samplepin (zie Figuur 1C, inzet). Container of directe montage: Plaats het monster in een compatibele container, zoals een microcentrifugebuis/polyimidebuis, of direct op de monsterbasis.
3. Controleer de dimensionale compatibiliteit met de robotgrijper door te controleren of het gemonteerde monster binnen de toegestane afmetingen valt om veilige robotische bediening te garanderen (zie Figuur 2):
   Optie A: Past in een cilinder van 8 mm diameter x 20 mm hoogte.
   Optie B: Past in een cilinder met een diameter van 3,5 mm x 33 mm hoogte.
4. Zorg ervoor dat beide configuraties gecentreerd zijn op de samplebasis. Zorg ervoor dat de totale hoogte (sample + mount + base) niet hoger is dan 27 mm of 40 mm, afhankelijk van de gekozen configuratie.
5. Bij het monteren van monsters op SPINE-sticks, zorg er dan voor dat het monster bovenop de pin wordt geplaatst, zonder dat een deel ervan door de pinas wordt verborgen. Het monster moet verticaal en centraal op de pinbasis worden gemonteerd om contact met de robotgrijper te voorkomen. Dit is vooral belangrijk voor de optie B-montage beschreven in protocolsectie 2.3, evenals voor langgerekte samples die bovenop de samplepinnen zijn gemonteerd.
6. Bij het monteren in containers of buizen, beveilig het monster stevig in de container zodat het niet verschuift tijdens transport of robotische behandeling. Zorg ervoor dat de container zelf verticaal uitgelijnd blijft op de basis van het monster.
7. Bevestig het gekozen bevestigingselement (pin of container) stevig en verticaal op de basis van het monster om positionele stabiliteit gedurende het hele experiment te waarborgen.
8. Gebruik een betrouwbare lijm- of bevestigingsmethode om loslaten tijdens het transport en geautomatiseerde manipulatie te voorkomen, aangezien beide processen mechanische spanningen kunnen veroorzaken.
   OPMERKING: Veelvoorkomende lijmen zijn onder andere cyanoacrylaat (secondelijm), paraffinewas en smeltlijm. Raadpleeg het beamline-personeel als je onzeker bent over materiaalcompatibiliteit.
9. Controleer of alle monsters op een consistente hoogte van de bovenrand van de container of op de monsterpin zijn geplaatst. Voor monsters die in containers zijn gemonteerd, zorg ervoor dat de zijafstand tot de containerwand gelijk is over alle monsters.
   OPMERKING: Consistente positionering is essentieel voor betrouwbare automatische uitlijning. Kleinere monsters ten opzichte van het gezichtsveld zorgen voor meer tolerantie.
10. Documenteer de Data Matrix-code die aan elk monster hoort om correcte monsteridentificatie tijdens de data-analyse te waarborgen.
11. Genereer een samples.csv bestand om elke monsternaam te relateren aan de basisdatamatrixcode en de parameters door te geven die relevant zijn voor het uitvoeren van tomografiescans.

3. Voorbeeldverpakking en bezorging

1. Uiterlijk 15 werkdagen voor de experimentele sessie dien de experimentele risicobeoordeling (ERA) in en meld alle monsters daar. Deze ERA moet worden goedgekeurd door de DLS health and safety (HSE) groep voordat monsters mogen worden verzonden/naar locatie worden gebracht.
2. Gebruik de universele samplebasis met de sample-gemonteerde combinatieopslag en/of verzendcontainer, ook wel Uni-puck genoemd. Dit is vrij belangrijk als je per post verstuurt.
3. Als monsters niet in de monstersleuven van de opslagcontainer zoals genoemd in stap 3.2 passen, maak dan alternatieve montagearrangementen, zoals het gebruik van magnetische beschermkappen die op de monsterbasis passen en de monsters direct meenemen voor metingen.

4. Experimentele opstelling

1. Pas de parameters van de röntgenbron aan om het contrast in het monster te maximaliseren. Om dit te bereiken, verschuiven we het volledige spectrum en/of filteren we het röntgenspectrum.
2. Optimaliseer de camera op de sampleafstand op basis van het röntgenspectrum en de mate van fasecontrast die voor een gegeven monster gewenst is.
3. Selecteer de microscoopvergroting op basis van de steekproefgrootte en het vereiste gezichtsveld, en selecteer het bijbehorende microscoopobjectief.
4. Lijn de horizontale positie van de camera uit (x-as in het laboratorium) ten opzichte van de röntgenbundel.

5. Monsterlading en uitlijning

1. Controleer monsters en montage van monsters grondig aan het begin van elke experimentele sessie op monsters die beschadigd lijken of losjes gemonteerd zijn. Informeer gebruikers over dergelijke voorbeelden.
   OPMERKING: Momenteel is de bundellijn uitgerust met bevestigingen voor maximaal 7 pucks, en elke puck kan tot 16 monsters bevatten. In totaal kunnen 112 monsters worden gemeten tijdens één enkele robotrun. Zie Aanvullende Figuur 2, die illustreert hoe je de puckslot (pin) posities identificeert.
2. Bevestig monsters op de respectievelijke puck- en puck-slots (pinnen) zoals geïdentificeerd in het samples.csv bestand. Voer een proefrun uit van de robotmonsteruitwisseling op enkele monsters om de werking van de robot te testen en om te zorgen dat de monsters binnen de vereiste specificaties vallen.
3. Gebruik een monsterbasis met een monsterpin (zonder monster) om de rotatieas van de rotatietrap in horizontale richting uit te lijnen met het midden van de detector.
4. Verplaats de bovenkant van de pin naar het midden van de röntgencamera (Figuur 3A). Lijn de telescoopcamera (TC), die op 90° ten opzichte van de bundel is geplaatst, zoals te zien is op de afbeelding (Figuur 3), zodat deze in het midden van het gezichtsveld (FOV) staat. Bepaal de coördinaten van deze positie in TC-pixelcoördinaten.
5. Werk de positie van het voorbeelddoel bij in het script dat de uitlijning van het voorbeeld afhandelt.
6. Plaats een representatief monster. Voer het automatische sample alignment-script uit om het monster in het midden van rotatie op de TC te plaatsen. De link naar het script is te vinden in Aanvullend Bestand 1.
7. Controleer of het bemonsteringsgebied van belang (ROI) gecentreerd is in het gezichtsveld (FOV) van de röntgencamera.
8. Als de ROI niet in het FOV is gecentreerd, herhaal dan stappen 5,5 tot 5,7 en verfijn de uitlijning van het monster door de coördinaten voor de doelpositie te wijzigen.
   OPMERKING: Secties 4 en 5 worden uitgevoerd door het lokale contact, behalve sectie 4.2.

6. Opstelling van gegevensverzameling

1. Controleer of de vereiste bestands-/mapstructuur op het DLS-bestandssysteem is gemaakt om ruwe data, metadatabestanden en analyseresultaten op te slaan.
2. Kopieer het samples.csv-bestand naar de map die in stap 6.1 wordt genoemd.
3. Werk de belichtingstijd van de camera en het aantal projecties bij dat in de samples.csv moet worden verworven, gebaseerd op de structuur van het monster en het gewenste contrast.
4. Definieer twee groepen motorposities, genaamd Loading Position (LP) en Scanning Position (SP). LP is de set waarin de stages zijn geoptimaliseerd voor het laden van monsters, en de SP voor tomografie-scanning van het monster.
   OPMERKING: Sectie 6 wordt uitgevoerd door het lokale contact of automatisch aangemaakt door de DLS-systemen.

7. Het uitvoeren van gegevensverzameling

1. Bevestig alle samples op de juiste puck- en pinposities, zoals aangegeven in het samples.csv bestand.
2. Voor het verzamelen van gegevens gebruik je de Generic Data Acquisition (GDA) werkbank, een open-source software ontwikkeld door DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). Het is een Java-gebaseerd systeem dat in DLS wordt gebruikt om experimenten te regelen en gegevens te verzamelen. Een screenshot is opgenomen in aanvullende figuur 1.
3. Gebruik een object genaamd tomomatic in GDA voor automatische monsterwisseling, monsteruitlijning en tomografiemeting.
4. Geef het commando tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) in de GDA-terminal om het bestand te laden. Geef dan de Tomomac uit. scan () om het commando uit te voeren.
5. De robot pakt eerst het monster van de laadbak en brengt het naar de laserbarcodelezer. Zodra de barcode is uitgelezen, wordt het monster naar de tomografiefase verplaatst en gemonteerd. Zorg ervoor dat het hele proces soepel verloopt.
   OPMERKING: Hier wordt een Yaskawa-robot met de in huis ontwikkelde flexure-gripper gebruikt.
6. Zodra het laden van het monster is uitgevoerd, gaan de trappen naar de SP-positie. Vervolgens wordt de autoCentrePin-functie binnen het tomomatische script uitgevoerd, die het monster in het Centrum van Rotatie (COR) plaatst. De röntgentomografiemeting met een robotmonsterwisselaar is nu klaar om uitgevoerd te worden.
   OPMERKING: Controleer alstublieft het Aanvullende Bestand 1 voor de pseudocode van het tomomatische script.
7. Voer de TomoFlyscan-functie uit voor de tomografie-meting. De functie verzamelt eerst 40 projectiebeelden zonder röntgenbundel, aangeduid als een donker beeld (DI), en 40 beelden met röntgenbundel maar zonder monster in de bundel, aangeduid als een vlakveldbeeld (FI). Deze afbeeldingen worden gebruikt voor beeldnormalisatie tijdens de datareconstructie.
8. Verzamel projectiebeelden (PI) met het monster in de bundel op de rotatiehoekintervallen van het monster, zoals aangegeven in het samples.csv bestand. Voor dit geval heeft het 3001 PI-beelden.
   OPMERKING: Alle stappen, van 7,5 tot 7,8, volgen elkaar zonder menselijke tussenkomst.

8. Toegang tot de data en analyse

1. Toegang tot de opgeslagen gegevens door naar het juiste bestandssysteem en de juiste map te bladeren. De gescande gegevens die in de vorige sectie werden genoemd, worden opgeslagen in twee verschillende bestanden, één met *.nxs en een *.hdf bestand waarbij * een numeriek nummer is, bijvoorbeeld: 123456.nxs en 123456.hdf. De NXS bevat de metadata voor de scan, terwijl de HDF alle projectiebeeldgegevens bevat (gekoppelde gegevens van NXS).
2. Gebruik Savu reconstruction pipeline¹⁹ om 2D-slices te genereren uit projectiebeelden.
3. Toegang tot en visualiseer de gereconstrueerde afbeeldingen met behulp van 3D-renderingssoftware, zoals AVIZO/ImageJ.
   OPMERKING: De voltooiing van secties 7 en 8 vereist gecoördineerde acties van zowel gebruikers als lokale contacten, waarbij elk afzonderlijke substappen uitvoert.

Results

Figuur 1 toont de Yaskawa GP7 sample-changer robot geïnstalleerd op de Diamond I13-2 Imaging beamline. Figuur 1A toont de robot (1) en de intern ontworpen flexure-gripper (2). Deze grijper kan een monster met een diameter van ≤ 8 mm vasthouden. Figuur 1B toont de robot (1) en het optiek-/röntgencamerasysteem (4) en (6) die worden gebruikt voor het verzamelen van tomografiegegevens. De robotgrijper pakt het monster uit het monsterbakje (3), dat 7 uni-pucks met 16 monsters op elk kan bevatten, zoals weergegeven in Figuur 1C. Monsters worden gemonteerd op de aluminium deuwel (5), en de tomografiegegevensverzameling wordt uitgevoerd met het detectorsysteem (6). De details van (5) en (6) worden gegeven in de laatste alinea van het inleidingsgedeelte. De rode onderbroken lijn in Figuur 1B geeft de richting van de röntgenbundel aan.

Details van het voorbeeldmontageschema en het ontwerp van de flexuregripper zijn geïllustreerd in Figuur 2. Figuur 2A toont een cilindrisch plastic monster, vervaardigd door 3D-print, gelijmd op de basis van het monster. De rand van het monster vertegenwoordigt de omhulling van de maximale monsterhoogte en de diameter. De rode pijlen geven de positie aan waar de flexure-gripper de monsterbasis vasthoudt om deze van de monstertray naar de tomografiefase te verplaatsen en omgekeerd. Een 3D-ontwerp van de flexure-gripper is weergegeven in Figuur 2B. De vingers van de grijper worden bediend door een pneumatisch aangedreven aandrijfbuis (Figuur 1B, item 2). De centrale ruimte in de grijper heeft een diameter van 8,9 mm, zoals weergegeven in Figuur 2C, waardoor een maximale monstergrootte van 8 mm met een marge van ~1 mm mogelijk is. Figuur 2D toont de afbeelding van de bovenkant van de tomografiefase. Bovenop de twee orthogonale trappen en een magnetische schijf is een aluminium deuwel gemonteerd, die een exacte diameter heeft zodat de uitsparing aan de onderkant van de monsterbasis past. Omdat deze schijf magnetisch is, houdt hij de gemonteerde monsterbasis stevig op zijn plaats tijdens de tomografiemetingen.

Voor dit representatieve experiment zijn 64 insectenmonsters geselecteerd, geleverd door het Natural History Museum (NHM) in Londen. Exemplaren werden geselecteerd om een reeks fenotypes van geleedpotigen te vertegenwoordigen, terwijl ze binnen de groottebeperkingen van de grijper pasten. Omdat geleedpotigen, met name insecten, het overgrote deel van de bekende soortendiversiteit vertegenwoordigen, met meer dan 1 miljoen benoemde soorten, zijn ze bijzonder moeilijk te bemonsteren voor vergelijkende studies van het fenotype. Het huidige monster toont daarom het potentieel van deze aanpak aan door drie klasse-niveau clades van geleedpotigen te bemonsteren: Arachnida, Entognatha en Insecta, evenals fijner te bemonsteren binnen insecten om variatie in zeven orden te vangen, waaronder vier van de meest soortenrijke orden die vandaag de dag leven. Exemplaren werden met lijm op een karton bevestigd. De kaarten werden vervolgens op de samplepinnen gemonteerd. Het direct monteren van monsters (insecten) op de monsterpinnen wordt vermeden, omdat een sterk absorberende structuur in de bundel met lage absorptiemonsters strepenartefacten veroorzaakt tijdens de reconstructies, naast de moeilijkheid om ze stevig op monsterpinnen te monteren. Tabel 1 toont het sjabloonbestand samples.csv dat de gebruiker zal invullen met de vereiste parameters voor de tomografie (kolommen A, B, C, E, F, G, H, K). De beschrijving van elk van de kolommen wordt in de tabel gegeven. De kolommen D, I, J en L in de input_file worden ingevuld na uitlijning en optimalisatie van de tomografieparameters op de bundellijn. Alle 64 monsters werden eerst gemeten met een 1,25x objectief (FOV van 6,7 mm x 5,6 mm) op een geoptimaliseerde röntgenvoortplantingsafstand (van monster naar detector), en later werden dezelfde monsters gemeten met een 4x objectief met eigen geoptimaliseerde parameters. Zodra de monsters op de monstertray zijn geladen en de experimentele hut is vastgezet, wordt de scan gestart met GDA.

Automatische uitlijning van het voorbeeld werd uitgevoerd door een script geschreven in Python (Locatie van het bestand op GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). Aanvankelijk wordt de uitlijning van het monster ingesteld met een combinatie van een sample base en een sample pin zonder het sample. Figuur 3 toont de monsterpin, zoals gezien door de zijtelescoopcamera (camera geplaatst op 90° ten opzichte van de röntgenbundel - Figuur 1B, item 4), die wordt gebruikt als standaard uitlijningsmonster. Het beeld van de telescoopcamera is gebinariseerd zodat het monster vanaf de achtergrond kan worden gedetecteerd. De randen van het monster worden bepaald en gemarkeerd als een witte grens, zoals weergegeven in Figuur 3. De referentiecoördinatenpositie van het monster is de bovenkant van de pin die als witte cirkel is aangegeven in de inzet van Figuur 3A. Als je naar het röntgenbeeld kijkt, wordt de ROI van het monster op de COR gepositioneerd, en wordt de vereiste doelcoördinatenpositie, gemarkeerd als een blauw dubbelpuntig pijlkruis met een rode stip (Figuur 3B), bepaald op de zijcamera. Deze doelpositie-instelling maakt het mogelijk het monster niet alleen op de COR te plaatsen, maar ook een paar millimeter hoger, lager of iets uit het midden, indien nodig. Nadat het monster is geladen op de tomografiefase, wordt de automatische centreringsfunctie uitgevoerd. Het script verplaatst het monster eerst naar de doelpositie (Figuur 3B) en gaat naar 0°. Vervolgens verplaatst het monster naar 90° (Figuur 3C) en bepaalt hoeveel monster verplaatst moet worden om het monster in het rotatiecentrum (COR) te plaatsen. Dit duurt meestal zo'n 15-20 seconden. Het monster bevindt zich nu op de COR (Figuur 2D), en de COR is al uitgelijnd met het midden van de camera. Het systeem is nu klaar voor tomografie-opname.

In deze NHM-insectenstudie werden 128 tomografiescans uitgevoerd zonder menselijke interventie. De meting duurde in totaal 17 uur. Elke scan duurde ongeveer 8 minuten. Zo'n experiment zonder gebruik van de robot zou ongeveer 20 tot 25 minuten per tomografie-scan hebben geduurd. Dit impliceert dat tomografiescans met robots 3-4 keer sneller zijn dan handmatig scannen voor het huidige geval. Tabel 2 toont een typisch logbestand dat aan het einde van een robotbatch-scan wordt gegenereerd, inclusief de parameters die nodig zijn om elk scannummer aan het bijbehorende monster te koppelen. Aanvullende details zijn te vinden in de legende van Tabel 2 .

Figuur 4 toont genormaliseerde projectiebeelden van een van de monsters, een insect (Klasse – Insecten, orde – Coleoptera), afgebeeld tijdens het hierboven genoemde tomografie-experiment met 1,25x en 4x vergroting. De bovenste rij, Figuur 4A-C, toont een steekproef afgebeeld met 1,25x, en vervolgens werd dezelfde steekproef met 4x gefotografeerd, oftewel Figuur 4D-F. Figuur 4 A–F toont de projectiebeelden die zijn gemaakt op 0°, 90° en 180°. De gele rechthoek toont het gezichtsveld van de ingezoomde projectiebeelden die met een 4x-objectief zijn gemaakt. Het is belangrijk op te merken dat zodra de monsters op de tray in Figuur 1C waren geladen, alle processen zonder menselijke tussenkomst verliepen. Let op: deze twee scans zijn met ~8,5 uur uit elkaar genomen. Dit geeft de stabiliteit en reproduceerbaarheid van de opstelling aan.

Figuur 5 toont horizontale of transversale sneden uit de set tomografie-reconstructiesneden van het monster dat in Figuur 4 wordt genoemd. Zowel de 1,25x (Figuur 5A) als de 4x (Figuur 5B) sneden worden uitgezet zonder de afbeeldingen bij te snijden en hebben 2510 x 2510 pixels. De sneden zijn goed gecentreerd binnen het gezichtsveld, wat aantoont dat inzoomen op een gebied met hogere vergroting mogelijk is zonder fysieke ingreep.

De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat het implementeren van een robotsysteem voor monsteruitwisseling in synchrotron-microtomografie-experimenten verschillende belangrijke voordelen biedt. Deze omvatten een verhoogde doorvoersnelheid, verbeterde operationele efficiëntie en de mogelijkheid om scans met meerdere vergrotingen (inzoomen) uit te voeren zonder menselijke tussenkomst te vereisen. Gezien het aantal monsters dat gescand moet worden, zoals in de hier gepresenteerde NHM-studie, zou het onmogelijk zijn om statistisch robuuste en consistente conclusies te verkrijgen via handmatig scannen.

Figuur 1: Foto van de robot en de tomografie-experimentele opstelling geïnstalleerd in de I13-2 bundellijn. (A) De robot (1) met een intern ontworpen flexure-gripper (2). (B) De laadtray voor het monster (3) en de tomografiefase (5). De optische camera (telescoopcamera), aangeduid als (4), wordt gebruikt om de monsters uit te lijnen op de COR. Het detectorsysteem (6) dat voor metingen wordt gebruikt, bevat meerdere gemotoriseerde objectieven om het gezichtsveld automatisch te veranderen, en een pco.edge 5.5 detector. De rood gestippelde pijl geeft de richting van de röntgenbundel weer aan. (C) Afbeelding van de laadtray voor het monster met 7 pucks, en elke puck kan tot 16 monsters bevatten, gemonteerd op een combinatie van monsterbasis en samplepinnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Details van het montageschema van het monster en het ontwerp van de flexure-gripper. (A) Afbeelding van een 3D-geprint plastic dummymonster gemonteerd op een monsterbasis, die de maximale sampleomhulling weergeeft die door de flexuregripper kan worden verwerkt. De rode pijlen geven de positie aan waar de grijper de monsterbasis vasthoudt. (B) 3D-ontwerp van de flexure-gripper. De vingers van de gripper worden aangedreven om de samplebasis vast te houden of los te laten. (C) Verticale doorsnedtekening van de grijper met afmetingen. De maximale opening in het midden is 8,9 mm; daarom is de maximaal toegestane steekproefgrootte ≤ 8 mm. (D) Afbeelding van de bovenkant van de tomografiefase. Een aluminium deuvel (aangegeven door de blauwe pijl) is bovenaan de twee orthogonale trappen gemonteerd. Een magnetische schijf wordt aan de bovenkant van de deuvel bevestigd waarop de monsterbasis (met het monster) door de grijper wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Snapshots van de videografiek van de COR-uitlijningsprocedure met de zijtelescoopcamera. (A) Foto van de uitlijnpin net voordat de uitlijningsroutine begint. Het blauwe dubbelkoppige kruis met een centrale rode stip is de doelpositie, die samenvalt met de COR van de tomografie-rotatiefase. De inset toont het ingezoomde beeld van de bovenkant van de pin met het gedetecteerde monstercentrum, zowel in hoogte als breedte. (B) Pin op 0° afgestemd op de doelpositie. (C) Pin gedraaid naar 90° en hij is niet op de juiste positie. (D) Pin uitgelijnd op de doelpositie op 90°. Nu is de pin in beide orthogonale richtingen uitgelijnd; daarom zal het monster in het midden van de camera draaien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Genormaliseerde projectiebeelden van een insect verzameld met een 1,25x en een 4x objectief. Het insect behoorde tot de klasse Insecta, orde Coleoptera. Dit is twee van de 128 tomografiescans. Het insect werd op papier geplakt en aan de monsterpin bevestigd. Projectiebeelden met een 1,25x objectief bevinden zich op (A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, en met 4x op (D) 0°, (E) 90° en (F) 180°. De set van 1,25x en 4x tomografiescans werd in één sessie verzameld zonder menselijke tussenkomst. Een set afbeeldingen met 1,25x geeft een volledig beeld van het monster, en een set van 4x beelden toont zoommogelijkheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Vergelijking van een identieke tomografische snede verkregen met behulp van twee verschillende gezichtsvelden. Een enkele gereconstrueerde snit uit tomografie van de projectiebeelden die in Figuur 4 worden getoond voor (A) 1,25x en (B) 4x vergrotingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Typisch samples.csv bestand dat de gebruiker verstrekt en tomografieparameters bevat. Dit bestand wordt gelezen door het tomomatiese Python-script dat wordt gebruikt voor gegevensacquisitie. De kolommen A (beschrijving van het monster), B (puck-ID), C (slot in de puck), E (tomografie-rotatiestap), F (aantal FI), G (aantal DI), H (te gebruiken vergroting) en K (slotprioriteit) worden door de gebruiker ingevuld. De kolommen D (belichtingstijd), I (röntgenpropagatieafstand tussen monster en camera), J (camerabeweging over de bundel om de COR naar het midden van de camera te plaatsen) en L (barcode van de monsterbasis) worden ingevuld na de uitlijning en voorlopige optimalisatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Typisch uitvoerlogbestand opgeslagen als Output_file.txt nadat alle monsters zijn gescand. Het bestand rapporteert alle invoerparameters en daarnaast levert het de barcode van het gescande monster (kolom M), het pad naar de gescande metadata en afbeeldingsbestanden (kolom N), en de positie van de motor die wordt gebruikt voor het verzamelen van FI (kolom O). In feite levert dit uitvoerbestand de benodigde informatie voor datareconstructie en analyse. Omdat er geen invoer werd gegeven in kolom A van het invoerbestand, wordt deze kolom gevuld met het huidige aantal scans, samen met puck- en pincodes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Supplementair bestand 1: Pseudocode die het script beschrijft waarmee de robot als sample-changer wordt bediend. Het bestand beschrijft de routine voor automatische monstermontage, het lezen van Data Matrix-code, automatische uitlijning van het monster en het uitvoeren van een tomografiescan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 1: Screenshot van de generieke GUI voor gegevensverwerving. Deze interface maakt het mogelijk om basiscameraparameters aan te passen, live visualisatie van het monster te maken en tomografie-opnames te starten. Scans kunnen worden gestart met de knop op het scherm (alleen handmatig scannen) of via de commandoregelinterface, aangegeven door de gele rechthoek onderaan in het midden van de screenshot. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Foto van de SPINE-standaard Puck (links) en de Puckpet (rechts). De pinposities, rood weergegeven, waarop monsterbases zijn gemonteerd, zijn genummerd vanaf de positie tegenover de inkeping op de centrale houerpost. Het nummer 7267 (gemarkeerd in wit) is het puckidentificatienummer. De Puck Cap kan op de puck worden gemonteerd om monsters te beschermen tijdens transport of opslag. Zorg er alstublieft voor dat de monstergroottes compatibel zijn voordat u probeert de dop te monteren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Monstervoorbereiding en uitlijning van monsters zijn twee cruciale stappen voor de automatische monsterwisselaarrobot om correct en effectief te werken¹¹. De steekproefgrootte en de montagevereisten zijn gegeven in Sectie 2 (Protocol). In principe moet de monsterdiameter 8 mm of minder zijn en goed gecentreerd zijn op de monsterbasis¹². Deze beperking wordt bepaald door de dimensies van de grijper. Ook moeten alle monsters in één meting op dezelfde hoogte liggen, zodat de positie van de monsters in het rotatiecentrum consistent is over alle monsters. Als de robot voor een experiment is uitgelijnd, is het uitvoeren van een nieuw experiment met de monsterveranderaarrobot volledig geautomatiseerd, behalve het instellen van het interessegebied voor het monster. Dit wordt uitgelegd in de sectie over representatieve resultaten, Figuur 3. Het is ook belangrijk op te merken dat dit deel uitmaakt van het uitlijningsproces dat door het beamline-personeel (lokaal contact) wordt uitgevoerd. Zodra dit is ingesteld, worden alle monstermetingen uitgevoerd zonder menselijke tussenkomst. Vanuit het perspectief van de gebruiker zijn metingen volledig geautomatiseerd. Tot op heden worden alleen monsterbases en monsterpinnen van Molecular Dimensions Ltd gebruikt; er zijn echter ook andere aanbieders, zoals MiTeGen en Hampton Research, die de SPINE-stijl monsterbases en samplepins produceren.

Grotere monstergripers, ontworpen om monsters tot 12 mm in diameter te bevatten, zijn momenteel in ontwikkeling en test. Hierdoor kan de robot grotere monsters verwerken, zoals die in microcentrifugebuizen zijn geplaatst en op een monsterbasis zijn gemonteerd. Een verbeterd gripperontwerp zou een mechanisme kunnen omvatten dat het monster van opzij benadert, waardoor de huidige beperkingen op de monstergrootte worden opgeheven. Bovendien zal het upgraden van de straallijn de doorvoersnelheid met een orde van grootte verhogen, waardoor meer dan 3.000 monsters per dag kunnen worden gescand. Dit maakt op zijn beurt het mogelijk om statistisch significante datasets van ongeveer 30.000 monsters binnen 10 dagen na de bundeltijd te verzamelen. In de nabije toekomst zullen we een nieuwe pijplijn voor tomografie-reconstructie implementeren, genaamd HTTomo.

Het moet worden opgemerkt dat parameters zoals de voortplantingsafstand van de bundel (afstand van monster tot detector), belichtingstijd, aantal projecties, enzovoort, vooraf geoptimaliseerd moeten worden, zoals bij elk ander synchrotron röntgentomografie-experiment. Een andere beperking is dat de fasen die in het experiment betrokken zijn, zoals 6-assige monstermanipulatie, tomografiefasen en cameramanipulatiefasen, zich op een bepaalde gedefinieerde positie moesten bevinden voor het laden en lossen van het monster. Dit betekent dat de fasen heen en weer moeten worden verplaatst wanneer het laden en lossen van het monster plaatsvindt.

Samenvattend kan high-throughput tomografie worden uitgevoerd met behulp van de monsterveranderrobot, waardoor het proces minstens 4-10 keer sneller wordt en dode tijd wordt verminderd of geëlimineerd in vergelijking met handmatige bediening. Experimentele automatisering met robots stelt ons ook in staat personeel efficiënter in te zetten, omdat er minder mensen nodig zijn voor de metingen. Het meten van statistisch significante datasets is belangrijk voor veel wetenschappelijke vakgebieden waar een betrouwbare en voldoende hoeveelheid data nodig is om het wetenschappelijke geval te behandelen. Het gebruik van een robot kan bij dergelijke taken enorm helpen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotatiestandaard	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Tomografie rotatiestandaard
AVIZO	ThermoFisher scientific		Commerciële software voor gegevensvisualisatie en -analyse
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Alternatieve CryoCap leverancier
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Alternatieve CryoCap leverancier
Cryocaps( MD7-401) en Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Gebaat voor monstermontage
Detector Optica	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Objectief en Foto-oculaire
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Generische gegevensverzameling software
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	6-assige standaard voor tomografie-uitlijning en monstermanipulatie
ImageJ	Ontwikkeld bij de National Institutes of Health, University of Wisconsin	https://imagej.net/ij/	Open source beeldverwerkings- en visualisatiesoftware
pco.edge 5.5 sCMOS-camera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Röntgencamera gebruikt voor de tomografie-beeldvorming
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Tomografie reconstructie pijplijn
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Scintillator optica
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	Monsters worden op Uni-puck gemonteerd voor robot om op te halen