Methodenartikel

Ontwikkeling van een nieuw cryoprotectant met een laag DMSO-gehalte voor het behoud van perifere bloedstamcellen

DOI:

10.3791/68275

⸱

20 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol maakt gebruik van een hematopoëtische stamcelcryoprotectant die een zeer lage concentratie dimethylsulfoxide bevat en toont de klinische veiligheid en werkzaamheid ervan aan bij het beschermen van hematopoëtische stamcellen, en biedt een nieuwe strategie voor cryopreservatie van hematopoëtische stamcellen bij klinische autologe stamceltransplantatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryopreservatie van hematopoëtische stamcellen (PBHSC) in perifeer bloed is van cruciaal belang voor autologe stamceltransplantatie (ASCT), maar traditionele cryoprotectieve middelen (TCPA's) die 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevatten, geven aanleiding tot veiligheidsproblemen vanwege het toxiciteitsrisico. Deze studie had tot doel een nieuw cryoprotectief middel met een laag DMSO-gehalte (CPA, 2% DMSO) te valideren voor PBHSC-conservering bij -80 °C, waardoor opslag van vloeibare stikstof niet meer nodig is. PBHSC's van zes donoren werden onderverdeeld in CPA- en TCPA-groepen. De CPA werd gemengd met PBHSC's (1:1 vol/vol) en direct opgeslagen bij -80 °C. TCPA (10% DMSO + 5% humaan albumine) onderging een geleidelijke afkoeling (1 °C/min) en opslag van vloeibare stikstof. Na 1 maand werden beide groepen ontdooid in een waterbad van 37 °C. De levensvatbaarheid van cellen, de integriteit van het cytoskelet (microfilamenten/microtubuli), de mitochondriale activiteit en het vermogen om kolonies te vormen werden vergeleken. Na ontdooiing was de PBHSC-overleving vergelijkbaar tussen CPA (91,29%) en TCPA (90,07%). CPA presteerde echter beter dan TCPA in tests voor de levensvatbaarheid van cellen (CPA: 89,38% versus TCPA: 79,55%; p < 0,05). Cytoskeletanalyse onthulde intacte microfilamenten en microtubuli in CPA-geconserveerde cellen, met een structurele helderheid die de TCPA overschreed. Mitochondriale activiteit in met CPA behandelde cellen weerspiegelde verse PBHSC's, vertoonde 8,5% hogere activiteit dan TCPA (p < 0,05) en verhoogde mitochondriale complexaantallen. Kolonievormende testen bevestigden verder de superioriteit van CPA, met hogere kolonietellingen na inductie. CPA maakt veilige, gemakkelijke PBHSC-cryopreservatie mogelijk bij -80 °C met behulp van ultralage DMSO (2%), waardoor de afhankelijkheid van vloeibare stikstof wordt geëlimineerd. De verbeterde levensvatbaarheid van de cellen en het behoud van de mitochondriën suggereren klinische voordelen door de risico's van infusietoxiciteit te verminderen. Dit protocol biedt een transformatieve strategie voor ASCT, waarbij de veiligheid en operationele efficiëntie worden geoptimaliseerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologe hematopoëtische stamceltransplantatie (ASCT) is een gevestigde behandelingsoptie voor verschillende hematologische maligniteiten, waaronder leukemie, lymfoom en multipel myeloom, waarbij het dient als eerste- of tweedelijnstherapie om hematopoëse te reconstrueren en de immuuncompetentie te herstellen na intensieve chemotherapie of radiotherapie 1,2,3,4,5,6,7 . Succesvolle ASCT-resultaten zijn kritisch afhankelijk van de levensvatbaarheid van gecryopreserveerde perifere bloedhematopoëtische stamcellen (PBHSC's), die functionele capaciteit voor hematopoëtische en immuunreconstitutie moeten behouden 8,9,10,11,12. Opslag van hematopoëtische stamcellen is een cruciale stap in ASCT, omdat patiënten na autologe hematopoëtische stamceloogst doorgaans bestraling, chemotherapie en andere therapieën ondergaan om tumorcellen te elimineren. De kwaliteit van de opslag van hematopoëtische stamcellen is direct gerelateerd aan het succes of falen van hematopoëtische en immuunreconstitutie 13,14,15,16,17,18. Om de levensvatbaarheid van hematopoëtische stamcellen na cryopreservatie te garanderen, omvatten klinische praktijken vaak de toevoeging van humaan bloedalbumine en dimethylsulfoxide (DMSO) als CPA. Deze middelen zijn cruciaal voor het behoud van de celactiviteit tijdens en na het cryopreservatieproces. Doorgaans varieert de gebruikte concentratie van DMSO van 5% tot 10% (v/v). Studies hebben aangetoond dat het handhaven van een DMSO-concentratie van ten minste 3,5% tot 10% (v/v) de effectiviteit van cryopreservatie van hematopoëtische stamcellen kan verbeteren19,20. De klinische toepassing van DMSO blijft echter problematisch vanwege dosisafhankelijke toxiciteit, waarbij 30%-60% van de ontvangers van transplantaties bijwerkingen meldt zoals misselijkheid, braken en hypotensie21,22. Om de beperkingen van conventionele cryoprotectieve middelen (CPA's) die 5%-10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevatten, aan te pakken, heeft deze studie tot doel een nieuwe CPA te ontwikkelen die veilige en efficiënte PBHSC-cryopreservatie bij -80 °C mogelijk maakt met behulp van ultralage DMSO-concentraties (2% v/v), waardoor de noodzaak van complexe protocollen voor vloeibare stikstof wordt geëlimineerd en DMSO-geassocieerde toxiciteit wordt verminderd.

Opkomende alternatieven, zoals op trehalose gebaseerde of polymeerversterkte CPA's, zijn preklinisch veelbelovend, maar stuiten op barrières in de klinische vertaling als gevolg van regelgevende hindernissen of onverenigbaarheid met standaard ontdooiprotocollen23. Onze CPA daarentegen bouwt voort op het gevestigde veiligheidsprofiel van HSA-DMSO-systemen, terwijl geoptimaliseerde additievenverhoudingen worden geïntroduceerd die de cytoprotectie verbeteren. Deze methode is met name geschikt voor klinische centra die geen infrastructuur voor vloeibare stikstof hebben of die snelle workflows vereisen. Voor langdurige opslag (>2 jaar) blijft vloeibare stikstof echter de voorkeur verdienen24. Clinici moeten de eenvoud van het protocol afwegen tegen de tolerantie van de individuele patiënt voor DMSO, en zorgen voor een op maat gemaakte toepassing van deze strategie om de veiligheid en operationele efficiëntie bij hematopoëtische stamceltransplantatie te maximaliseren.

In deze studie is het gebruik van cryoprotectanten met een verlaagd DMSO-gehalte een cruciale strategie om tegelijkertijd de werkzaamheid van cryopreservatie van hematopoëtische stamcellen te behouden en tegelijkertijd de bijbehorende toxiciteit te minimaliseren. De effectiviteit, veiligheid en het gemak van een nieuw ontwikkelde hematopoëtische stamcel-CPA werden geëvalueerd voor het behoud van perifere bloedhematopoëtische stamcellen (PBHSC's). Er werd een eenvoudige, directe vriesmethode geïmplementeerd die gebruik maakt van de nieuwe CPA, waarbij conventionele cryopreservatieprotocollen werden vermeden. De bevindingen tonen aan dat cryopreservatie in één stap van celsuspensies bij -80 °C met behulp van DMSO CPA met een lage concentratie superieure conserveringseffecten oplevert in vergelijking met traditionele CPA (TCPA). Deze benadering kan nieuwe strategieën bieden voor het stroomlijnen van het klinische proces van hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematologische oncologiepatiënten die ASCT ondergingen, werden van juni 2020 tot juni 2022 gerekruteerd op de afdeling hematologie, Shenzhen Cancer Hospital. Bloedcelmonsters werden genomen voor en na transplantatiemobilisatie voor HSCT, waaronder twee gevallen van acute myeloïde leukemie (AML), twee gevallen van Hodgkin-lymfoom (HL), één geval van cutaan echt histiocytisch lymfoom (CGHL) en één geval van primair mediastinaal B-cellymfoom (PMBL), met een mediane leeftijd van 53 jaar en een bereik van 35 tot 61 jaar. De studie kreeg geïnformeerde toestemming van de patiënten en goedkeuring van de ethische beoordelingscommissie van het Shenzhen Cancer Hospital, met het ethische goedkeuringsdocumentnummer AF-SC-07-2.0. Alle dierexperimentele procedures werden goedgekeurd door de Ethical s Committee voor proefdieren, het Kankerziekenhuis, de Chinese Academie voor Medische Wetenschappen (goedkeuring nr. NCC2018A073) en voldeed aan internationale richtlijnen voor dierproeven.

1. Onderverpakking en cryopreservatie van hematopoëtische stamcelmonsters

  1. Voorbereiding van een aseptisch werkstation
    1. Was de handen grondig en draag steriele maskers en handschoenen. Desinfecteer handen, polsen en ellebogen met 75% ethanol.
    2. Steriliseer alle reserve-instrumenten (pipetten, hemostaten) met autoclaaf of UV-bestraling. Leg de volgende materialen op de bioveiligheidskast: 1 ml steriele pyrogeenvrije pipetpunten (2 dozen), 1000 μL pipet, steriele 1,8 ml cryopreservatiebuisjes, 50 ml centrifugebuisjes en een opbergdoos voor cryopreservatiebuisjes (programmeerbare vriesdoos).
  2. Etikettering en cel-CPA-menging
    1. Label cryopreservatiebuisjes met monster-ID, datum, celgetal en donornaam.
    2. Sluit de hematopoëtische stamcelzak met 180-200 ml hematopoëtische stamcellen aan op de CPA-bevattende zak met 100 ml nieuw cryoprotectant met een laag DMSO-gehalte met behulp van een steriele infuusbuis.
    3. Klem het middelpunt van de buis vast met een steriele hemostaat. Bevestig het ene uiteinde aan de cel-CPA-mengselzak en het andere aan een centrifugebuis van 50 ml.
  3. Afvullen en cryopreservatie
    1. Laat de hemostaat los om een gecontroleerde stroom van het cel-CPA-mengsel in de centrifugebuis mogelijk te maken.
    2. Zuig 1 ml aliquots uit de centrifugebuis met behulp van een pipet. Breng aliquots over in vooraf gelabelde cryobuisjes (30 buisjes/monster). Draai de doppen vast en plaats de buizen in de opbergdoos.
  4. Opslag en transport
    1. Verplaats de bewaardoos onmiddellijk naar een koelkast van -80 °C. Verpak cryobuizen voor transport in droogijs (-78,5 °C) met temperatuurbewaking.

2. Cryopreservatie en herstel van PBHSC's

  1. CPA en TCPA bereiden en mengen
    1. Koel een ijsplateau voor tot 2-8 °C. Ontdooi de hematopoëtische stamcellen CPA en TCPA volgens de richtlijnen van de fabrikant (zie tabel 1 voor CPA/TCPA-samenstellingen).
    2. Meng CPA en TCPA met zes PBHSC-monsters in een volumeverhouding van 1:1 op het ijsplatform. Breng de celsuspensie over naar steriele cryovials.
  2. CPA cryopreservatie
    1. Plaats de cryovials direct in een vriezer van -80 °C. Zorg ervoor dat de uiteindelijke DMSO-concentratie in de suspensie 2% (v/v) is. Bewaar monsters gedurende 1 maand.
  3. TCPA Cryopreservatie (vergelijkende controle)
    1. Bereid TCPA met 5% humaan bloedalbumine en 10% DMSO (v/v). Laad PBHSC-suspensies in cryovials en koel af tot -80 °C bij 1°C/min met behulp van een programmeerbare vriezer.
    2. Breng cryovials over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Bewaar monsters gedurende 1 maand.
  4. Reanimatie van cellen
    1. Haal cryovials op na 1 maand. Ontdooi de cellen in een waterbad van 37 °C met zacht roeren (≤ 5 min).
    2. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g om de resterende CPA/TCPA te verwijderen. Resuspendeer 1 ml cellen in voorverwarmd RPMI 1640kweekmedium voor stroomafwaartse testen.

3. Test op de levensvatbaarheid van cellen

  1. Celtelling op basis van afbeeldingen
    1. Bereid een gemengde kleuringsoplossing die 10 μg/ml acridineoranje (AO) en 10 μg/ml propidiumjodide (PI) bevat.
    2. Meng 100 μl celsuspensie met 100 μl kleuringsoplossing (verhouding 1:1) in een steriel microcentrifugebuisje.
    3. Laad 10 μL van het gekleurde monster in de geautomatiseerde cellenteller. Analyseer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de geïntegreerde software:
      levensvatbaarheid = levende cellen / totaal aantal cellen x 100%
  2. Validatie van flowcytometrie
    1. Bereid de Annexine V-FITC/PI-kleuringsoplossing door Annexine V-FITC (5 μL) en PI (5 μL) te mengen in 100 μL bindingsbuffer.
    2. Voeg 300 μl celsuspensie toe aan de kleuringsoplossing en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 25 °C.
    3. Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten op 300 x g en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer cellen in 500 μL PBS en analyseer de levensvatbaarheid met behulp van een flowcytometer25.

4. Kolonievormende test

  1. Preparaat van de celsuspensie
    1. Meng de celsuspensie met 0,4% trypanblauwoplossing in een verhouding van 1:1 en incubeer gedurende 3 minuten om levensvatbare/dode cellen te onderscheiden. Voer dubbele tellingen uit met behulp van een geautomatiseerde cellenteller om de levensvatbare celdichtheid te bepalen (zorg voor levensvatbaarheid >90%). Stel het celsuspensievolume in op de doelconcentratie (1 x 106 cellen/ml) en filtreer door een zeef van 40 μm om een eencellige dispersie te garanderen. Filtreer de celsuspensie door een steriele celzeef van 40 μm om aggregaten te verwijderen.
  2. Medium mengen
    1. Combineer 1 ml celsuspensie met 9 ml commercieel muizenkolonievormend eenheidsmedium in een conische buis van 15 ml (1:10 v/v).
    2. Draai het mengsel gedurende 30 s bij 1.500 tpm om homogeniteit te garanderen. Centrifugeer op 100 x g gedurende 10 s om luchtbellen te verwijderen.
  3. Celzaaien en vochtigheidsopstelling
    1. Doseer 1,5 ml bubbelvrij mengsel in een steriel petrischaaltje van 35 mm. Voeg 3 ml steriel gedestilleerd water toe aan een perifere groef van de schaal (of plaats een aparte steriele container in het deksel van de schaal) om de luchtvochtigheid op peil te houden.
    2. Sluit de schaal af in een bevochtigde kamer (≥ 95% luchtvochtigheid).
      1. Om de kamer voor te bereiden, plaatst u twee lagen steriel absorberend papier in een plastic bakje met deksel (bijv. petrischaaltje van 15 cm). Voeg 10 ml steriel gedeïoniseerd water toe om het papier te verzadigen. Plaats de bevlekte kweekschaal in het midden van de kamer en zorg ervoor dat er geen direct contact is tussen de schaal en nat papier. Wikkel 3 keer transparante folie rond de overgang tussen deksel en container voor luchtdichte afsluiting. U kunt de dekselranden ook vastzetten met laboratoriumtape. Incubeer de afgesloten kamer gedurende 30 minuten bij 37 °C om de luchtvochtigheid ≥ 95% in evenwicht te brengen.
  4. Kolonieteelt en telling
    1. Incubeer de cellen bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 16 dagen. Tel hematopoëtische kolonies (≥ 50 cellen per cluster) met behulp van een omgekeerde microscoop met een vergroting van 40x. Bereken kolonievormende eenheden (CFU's) per 1 x 104 gezaaide cellen.

5. Detectie van mitochondriale activiteit

  1. Celkleuring met Rhodamine 123
    1. Resuspendeer PBHSC's bij 1 x 106 cellen/ml in 1 ml RPMI1640 medium. Voeg de kleurstof Rhodamine 123 toe aan een eindconcentratie van 5-10 μM. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in 5% CO2 bij 37 °C.
    2. Centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 1 ml verse RPMI1640. Herhaal de centrifugatie en resusteer in 1 ml PBS.
  2. Confocale microscopie analyse
    1. Veeg een schone glazen dia af met pluisvrij papier om stof of verontreinigingen te verwijderen.
    2. Resuspendeer gekleurde PBHSC's in PBS tot een geschikte dichtheid om overlappende signalen te voorkomen. Pipetteer 10-20 μL celsuspensie en doseer deze langzaam op het midden van het objectglaasje.
    3. Kantel het dekglaasje in een hoek van 45°, raak voorzichtig een rand aan op de druppel en laat deze geleidelijk zakken om luchtbellen te minimaliseren. Druk lichtjes om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verspreid tot een monolaag.
    4. Plaats de dia 5 minuten horizontaal in het donker om de cellen te laten bezinken. Ga onmiddellijk over tot confocale microscopie-analyse.
    5. Monteer de bevlekte cellen op een glasplaatje. Observeer de mitochondriale verdeling met een confocale microscoop (bijv. em: 488/525 nm).
  3. Kwantificering van flowcytometrie
    1. Analyseer de fluorescentie-intensiteit van Rhodamine 123 met behulp van een flowcytometer (FL1-kanaal). Gebruik met waterstofperoxide behandelde PBHSC's (1 mM, 1 uur) als positieve controles26.

6. Cytoskeletkleuring van PBHSC's

  1. Microfilament kleuring (Actin Tracker Green-488)
    1. Bereid AF488-geconjugeerde falloïdine fluorescerende sonde voor die is opgelost in PBS in een eindconcentratie van 5 E/ml. Verdun de stamoplossing (200 E/ml in methanol) door 5 μl bouillon te mengen met 195 μl PBS (verdunning 1:40). Draai grondig gedurende 10 s om homogeniteit te garanderen.
    2. Voeg 200 μL van de bereide Actin Tracker Green-488 werkoplossing (5 E/ml) toe aan PBHSC's. Incubeer de cellen bij 25 °C gedurende 30 minuten in het donker.
    3. Was de cellen 2x met 1 ml immunokleuringswasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Tegenkleuring van kernen met 200 μL DAPI (1 μg/ml) gedurende 5 minuten bij 25 °C in het donker.
  2. Microtubuli kleuring (Tubulin Tracker Red)
    1. Bereid een infraroodgeconjugeerde paclitaxel fluorescerende sonde voor die is opgelost in PBS in een eindconcentratie van 1 μM. Verdun de stockoplossing (100 μM in DMSO) door 10 μl bouillon toe te voegen aan 990 μl PBS (verdunningsverhouding 1:100). Draai het mengsel gedurende 10 s om homogeniteit te garanderen en te beschermen tegen licht.
    2. Bereid Tubulin Tracker Red werkoplossing voor bij een eindconcentratie van 250 nM in volledig medium. Verdun de stamoplossing (1 mM in DMSO) door 2,5 μL bouillon toe te voegen aan 997,5 μL medium (verdunningsverhouding 1:400). Vortex het mengsel gedurende 10 s en voeg 200 μL toe aan PBHSC's. Incubeer bij 25 °C gedurende 30 minuten in het donker.
    3. Was de cellen 2x met 1 ml immunokleurende wasbuffer. Tegenkleuring van kernen met 200 μL DAPI (1 μg/ml) gedurende 5 minuten bij 25 °C in het donker.
  3. Montage en microscopie
    1. Was de bevlekte cellen 2x met PBS. Meng gekleurde cellen met 90% glycerol-PBS-oplossing (90% glycerol en 10% PBS, v/v) in een volumeverhouding van 1:1. Pipetteer 10 μL van het mengsel op een glasplaatje. Kantel het dekglaasje in een hoek van 45° en laat het geleidelijk zakken om luchtbellen te voorkomen.
    2. Analyseer de morfologie van actine/microtubuli met behulp van een fluorescentiemicroscoop (488 nm excitatie voor actine groen; 561 nm voor tubulinerood). Inclusief positieve controles: met cytochalasine B behandelde PBHSC's (5 μM, 2 uur) voor actineverstoring en met colchicine behandelde PBHSC's (10 μM, 3 uur) voor depolymerisatie van microtubuli.

7. Veiligheidsevaluaties van de CPA

  1. Hemolyse test
    1. Bereid 2% suspensie van rode bloedcellen bij konijnen met vers bloed anticoaguleerd met EDTA.
    2. Voeg CPA (0,1-0,5 ml) en fysiologische zoutoplossing (2,0-2,4 ml) toe aan 2,5 ml celsuspensie in glazen buisjes.
    3. Gebruik zoutoplossing als negatieve controle en gesteriliseerd water als positieve controle. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C en observeer hemolyse/stolling onder een microscoop.
  2. Systemische allergietest
    1. Voorbereiding van dieren
      1. Gebruik 36 SPF Hartley cavia's (50% mannelijk, 271-307 g; 50% vrouwelijk, 270-301 g) in de leeftijd van 4-5 weken. Houd de volgende huisvestingsomstandigheden aan: Temperatuur: 16-26 °C (± 4 °C dagelijkse fluctuatie), Vochtigheid: 40%-70%, Ventilatie: 8-10 luchtverversingen/uur, Lichtcyclus: 12 uur licht/donker
    2. Sensibilisatiefase
      1. Injecteer CPA in het kwadrant linksonder van de peritoneale holte met 2 ml/kg (laag) of 6 ml/kg (hoog) op dag 1, 3 en 5. De lage dosis (2 ml/kg) simuleert klinische blootstellingsniveaus, terwijl de hoge dosis (6 ml/kg) de 3x veiligheidsmarge vertegenwoordigt om dosisafhankelijke overgevoeligheid te evalueren, volgens OESO-richtlijn 406 voor systemische allergietesten27,28.
      2. Gebruik humaan serumalbumine (positieve controle) en zoutoplossing (negatieve controle).
    3. Uitdagingsfase
      1. Dien CPA intraveneus toe via de marginale oorader met 4 ml/kg (laag) of 12 ml/kg (hoog) op dag 19 en 26. De provocatiedoses (2x sensibilisatiedoses) komen overeen met gevestigde protocollen om anafylaxie uit te lokken bij gepresensibiliseerde cavia's, zoals gevalideerd in eerdere studies naar biocompatibiliteit met cryoprotectieve middelen29.
      2. Controleer de symptomen van anafylaxie (ademnood, convulsies) gedurende 1 uur na de injectie.
    4. Post-experimentele behandeling
      1. Breng cavia's terug naar de dierenarts voor observatie gedurende 72 uur. Euthanaseren met behulp van abdominale aorta-verbloeding onder isofluraan-anesthesie.
  3. Onderzoek naar acute systemische toxiciteit
    1. Injectie bij muizen
      1. Injecteer 50 ml/kg CPA in de staartader van 10 mannelijke ICR-muizen (32,0-37,1 g, 6 weken oud). Gebruik muizen met zoutoplossing als negatieve controles (n = 10).
    2. Protocol voor observatie
      1. Controleer de overleving, toxiciteitsverschijnselen en het gewicht 4, 24, 48 en 72 uur na de injectie. Behoud van de huisvestingsomstandigheden: Temperatuur: 20-25 °C (± 3 °C per dag), Vochtigheid: 40%-70%, Ventilatie: 10-20 luchtverversingen/uur.
    3. Euthanasie
      1. Verdoof muizen met 3% isofluraan. Euthanaseren door abdominale aorta-verbloeding.
  4. Vasculaire irritatietest
    1. Konijn administratie
      1. Gebruik 6 mannelijke Nieuw-Zeelandse konijnen (3,65-4,36 kg, 7-8 maanden oud). Injecteer wekelijks 5 ml/kg CPA in de rechteroorader (totaal 3 doses). Injecteer zoutoplossing in het linkeroor als negatieve controle.
    2. Weefsel evaluatie
      1. Onderzoek de injectieplaatsen op erytheem, oedeem of necrose op dag 18-19. Scoor irritatie op de injectieplaats op basis van de ernst van erytheem, oedeem en necrose. Pas het ISO 10993-12 scoresysteem toe met cijfers variërend van 0 (geen reactie) tot 4 (ernstige necrose)30,31.
    3. Post-experimentele behandeling
      1. Verdoof konijnen met tiletamine-zolazepam (5 mg/kg, IM). Euthanaseren met behulp van snelle aderlating van de halsslagader.

8. PBHSC's transplantatie

  1. Inschrijving en mobilisatie van patiënten
    1. Schrijf zes patiënten in die voldoen aan de transplantatiecriteria: Mononucleaire cellen ≥ 5 x 108 cellen/kg
      CD34+ cellen ≥ 2 x 106 cellen/kg23. Sluit patiënten van <18 of >65 jaar uit, patiënten met actieve infecties, ernstige orgaandisfunctie, zwangerschap/borstvoeding, recente immunosuppressieve therapie (binnen 4 weken) of ongecontroleerde psychiatrische stoornissen.
    2. Mobiliseer hematopoëtische stamcellen van beenmerg tot perifeer bloed met behulp van granulocytkoloniestimulerende factor (G-CSF). Mobiliseer hematopoëtische stamcellen van beenmerg tot perifeer bloed door dagelijks subcutaan granulocytkoloniestimulerende factor toe te dienen in een dosis van 10 μg/kg (de exacte dosis verschilt van persoon tot persoon) gedurende 5 opeenvolgende dagen.
  2. PBHSC's collectie en cryopreservatie
    1. Verzamel gemobiliseerde PBHSC's met behulp van een aferese-apparaat met een bloedstroomsnelheid van 40 ml/min en een verhouding tussen anticoagulans en volbloed van 1:12. Verwerk 15-16 L volbloed per sessie om 180-200 ml PBHSC-concentraat te verkrijgen. Verdeel het monster in twee aliquots en elk zakje heeft een capaciteit van 90-100 ml.
    2. Resuspendeer het eerste aliquot in 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en 5% humaan serumalbumine voor klinische transfusie. Plaats het geresuspendeerde aliquot in een programmeerbare vriescontainer met een afkoelsnelheid van -1 °C/min tot -80 °C. Label de cryobag met patiënt-ID en vriesparameters (bijv. batchnummer, datum). Bereid het tweede aliquoot in serum van 5% DMSO en 10% foetaal runderserum voor voor het testen van de levensvatbaarheid.
  3. Ontdooien en herinfusie
    1. Ontdooi gecryopreserveerde PBHSC's in een waterbad van 37 °C (≤ 2 min). Dien ontdooide cellen intraveneus toe na conditionering door chemotherapie/radiotherapie. Dien de cellen binnen 30 minuten na ontdooiing intraveneus toe via een centraal veneuze katheter met behulp van een spuitpomp van 3-5 ml/min.
  4. Monitoring na transplantatie
    1. Volg hematopoëtisch herstel aan de hand van dagelijkse bloedtellingen: Succesdrempel voor neutrofielen: ≥ 0,5 x 109 cellen/L; Slagingsdrempel voor bloedplaatjes: ≥ 20 x 109 cellen/L32.
    2. Monitor de reconstitutie van het immuunsysteem door middel van subsetanalyse van lymfocyten. Verzamel 5 ml perifere bloedmonsters in EDTA-buisjes. Kleur cellen met fluorescerende antilichamen tegen CD3, CD4, CD8, CD19 en CD56 gedurende 15 minuten in het donker. Analyseer subsets van lymfocyten met behulp van een flowcytometer en een gestandaardiseerde poortstrategie. Vergelijk absolute tellingen (cellen/μL) met gezonde referentiebereiken op leeftijd voor interpretatie.

9. Analyse van de subpopulatie van PBHSC's

  1. Antilichaam kleuring
    1. Bereid bevroren PBHSC's (CPA/TCPA-groepen) voor en ontdooi in een waterbad van 37 °C.
    2. Label cellen met fluorescerende antilichamen: CLP: CD45-CD34+CD10+ (klonen HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (klonen HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Figuur 1). Centrifugeer ontdooide PBHSC's bij 300 x g gedurende 5 minuten om cryopreservatiemiddelen te verwijderen. Pas de celconcentratie aan op 1 x 106 cellen/ml in PBS met 2% foetaal runderserum.
    3. Bereid antilichaamcocktails met behulp van klonen HI30/4H11/HI10a voor CLP en HIT2/4G8/5F3/HI100 voor MEP/GMP op door de fabrikant aanbevolen titers. Incubeer cellen met antilichaammengsels gedurende 30 minuten in het donker bij 4°C met zachte vortex om de 10 minuten. Was de gekleurde cellen 2x met koude PBS+0,1% natriumazide door middel van centrifugatie bij 200 x g gedurende 3 min. Resuspendeer cellen in 500 μl PBS met 1 μg/ml DAPI voor viability gating voorafgaand aan flowcytometrieanalyse.
    4. Incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten in het donker. 2x wassen met PBS met 1% BSA.
  2. Opstelling van flowcytometrie
    1. Resuspendeer de gekleurde cellen in 500 μl PBS. Analyseer subpopulaties met behulp van een flowcytometer: Configureer lasers (488 nm, 640 nm) en filters (FITC, PE, APC). Verzamel ≥ 10.000 evenementen per sample.
    2. Poortpopulaties op basis van voorwaartse/zijwaartse verstrooiing en fluorescentie-intensiteit (Figuur 1).
  3. Vergelijking van gegevens
    1. Bereken CLP/MEP/GMP-percentages met behulp van FlowJo v10.8-software. Vergelijk CPA- versus TCPA-groepen met behulp van de t-toets van de student (α = 0,05). Visualiseer verschillen met behulp van Prism 9.0 (staafdiagrammen met SEM)33.

10. Statistische analyse

  1. Voer een vergelijking uit van gemiddelden van continue numerieke variabelen die overeenkwamen met een normale verdeling met chi-kwadraatvariantie, met behulp van de t-toets, en voor continue numerieke variabelen die niet overeenkwamen met een normale verdeling, test ze niet-parametrisch.
  2. Rapporteer gegevens voor continue variabelen als het gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan en bovenste en onderste kwartielen. Gebruik de exacte test van Fisher om de tarieven tussen de twee groepen te vergelijken.
  3. Analyseer gegevens en plot met behulp van SPSS 26.0 en GraphPad Prism 9-software. Beschouw alle verschillen in tweezijdige tests als statistisch significant als p < 0,05. Een deel van de gegevens wordt gepresenteerd in de vorm van statistische beschrijvingen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergelijking van cryopreservatiemethoden in één stap en cryopreservatie met vloeibare stikstof
De levensvatbaarheid van gecryopreserveerde PBHSC's na herstel werd beoordeeld met behulp van AO/PI-assays. Zoals te zien is in figuur 2A, bleek de levensvatbaarheid van PBHSC's die bij -80 °C zijn gecryopreserveerd met behulp van CPA 91,29% te zijn (n = 3, SD = 1,86), terwijl voor PBHSC's die in vloeibare stikstof zijn geconserveerd, de levensvatbaarheid 90,07% was (n = 3, SD = 1,64). Statistische analyse wees niet op een significant verschil tussen de twee methoden (p > 0,05). De cryopreservatiemethode in één stap bleek echter sneller en handiger te zijn. Deze resultaten suggereren dat de cryopreservatiemethode in één stap een superieur alternatief is voor celconservering.

Cryopreservatie-effect van CPA op PBHSC's presteert beter dan de conventionele cryopreservatiemethode
De cellevensvatbaarheid van de gecryopreserveerde PBHSC's na herstel werd gedetecteerd door AO/PI- en Annexin V/PI-testen. Zoals te zien is in figuur 2, bereikte de cellevensvatbaarheid van zes herstelde PBHSC-monsters geconserveerd met CPA respectievelijk 89,38% (n = 6, SD = 1,87, figuur 2B) en 88,20% (n = 6, SD = 2,72, figuur 2C) in deze twee testen. Degenen die door TCPA werden bewaard, waren echter 79,55% (n = 6, SD = 3,16, Figuur 2B) en 73,05% (n = 6, SD = 7,47, Figuur 2C). Deze bevindingen suggereren dat CPA een effectievere cryoprotectant is voor PBHSC's in vergelijking met TCPA, wat leidt tot een beter behoud van de levensvatbaarheid van de cellen en herstelpercentages.

PBHSC's geconserveerd met CPA behouden de volledige cytoskeletstructuuren mitochondriale activiteit
De enge definitie van het cytoskelet verwijst naar het netwerk van eiwitvezels, microtubuli (MT), microfilamenten (MF) en intermediaire filamenten (IF) in eukaryote cellen34. In deze studie hebben we vooral de structurele integriteit van MT en MF onderzocht na cryopreservatie van PBHSC's om te bewijzen dat PBHSC's de integriteit van het cytoskelet kunnen behouden na cryopreservatie van CPA. Om de microfilament- en microtubuli-structuren van levende cellen te labelen, werden Alexa Fluor 488 fluorescerende, met kleurstof gelabelde spookpen cyclisch peptide en ver-infrarood fluorescerende groep-gelabelde Taxol-analogen gebruikt als respectievelijk fluorescerende sondes. Zoals te zien is in figuur 3A,B, behouden PBHSC's die door CPA zijn geconserveerd nog steeds intacte microfilament- en microtubulistructuren.

Mitochondriën van PBHSC's geconserveerd door CPA werden geëtiketteerd met rhodamine 123 kleurstofoplossing en PBHSC's behandeld met H2O2 werden gebruikt als positieve controle. De resultaten (Figuur 3C) toonden aan dat de mitochondriale structuur werd waargenomen in CPA-geconserveerde cellen, terwijl dit niet werd waargenomen in de positieve controlegroep. De rhodamine 123-gelabelde mitochondriën werden ook gedetecteerd door flowcytometrie. Het bleek dat CPA-geconserveerde PBHSC's een betere mitochondriale activiteit behielden dan de traditionele methode (Figuur 4).

PBHSC's die met CPA zijn geconserveerd, behouden het vermogen om klonen te vormen
We hebben verder het proliferatieve en differentiatieve vermogen van PBHSC's beoordeeld die zijn geconserveerd met CPA en TCPA door kolonievormende tests uit te voeren. In het bijzonder evalueerden we het vermogen van PBHSC's om BFU-E-, CFU-E-, CFU-GM- en CFU-GEMM-kolonies in cultuur te vormen. Het totale aantal kolonies dat in de verse celgroep werd waargenomen was 70,33 (n = 6, SD = 14,02). Daarentegen vertoonde de CPA-groep in totaal 65,33 kolonies (n = 6, SD = 8,07), terwijl de TCPA-groep een significant lager aantal van 46,17 kolonies vertoonde (n = 6, SD = 8,50). Deze resultaten tonen aan dat PBHSC's die met CPA zijn geconserveerd, hun proliferatieve en differentiërende capaciteiten behielden in vergelijking met de verse celcontrole, zoals blijkt uit het vergelijkbare aantal kolonieformaties in verschillende cellijnen. Daarentegen vertoonden PBHSC's die met TCPA werden geconserveerd een vermindering van hun proliferatieve en differentiatieve potentieel. Deze bevindingen geven aan dat PBHSC's die zijn gecryopreserveerd met CPA hun functionele capaciteiten beter behouden (Figuur 5 en Figuur 6).

Veiligheidsevaluaties van CPA in vitro
In vitro monitoring van hemolyse van erytrocyten bij konijnen werd uitgevoerd. Om de effecten van verschillende volumes CPA (variërend van 0,1-0,5 ml) en normale zoutoplossing (variërend van 2,0-2,4 ml) op hemolyse te testen, werd 2,5 ml 2% RBC-suspensie bij konijnen toegevoegd aan glazen reageerbuisjes samen met de CPA's of normale zoutoplossing. Negatieve controle (gesteriliseerd water voor injectie) en positieve controle (normale zoutoplossing) werden ook opgenomen. In buisjes die CPA's of normale zoutoplossing bevatten, nestelden de erytrocyten zich op de bodem van de buis en was de bovenste oplossing helder en kleurloos. Na het schudden werden de erytrocyten gelijkmatig verspreid. De positieve controlegroep (gesteriliseerd water) vertoonde een felrode kleur en er werd geen stratificatie waargenomen, met slechts een kleine hoeveelheid RBC op de bodem van de buis (Figuur 7). Deze resultaten suggereren dat CPA's geen hemolyse of condensatie van RBC bij konijnen veroorzaken. De vasculaire irritatie van CPA werd geëvalueerd bij Nieuw-Zeelandse konijnen. Pathologische secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine (HE) kleuring, en algemene klinische en lokale irritatieobservaties werden uitgevoerd na de laatste toediening. Er werden geen abnormale reacties waargenomen bij de proefdieren en er werden geen pathologische veranderingen waargenomen op de lokale toedieningsplaatsen. Deze bevindingen geven aan dat CPA geen vasculaire irritatie veroorzaakt bij Nieuw-Zeelandse konijnen.

In het experiment met actieve systemische overgevoeligheid bij cavia's werd CPA gebruikt om de dieren te sensibiliseren met intraperitoneale injecties van 1,25 ml/kg en 2,5 ml/kg 3x en intraveneuze injecties van 2,5 ml/kg en 5 ml/kg voor excitatie. Er werd geen snelle overgevoeligheid waargenomen bij cavia's tot 21 dagen na de laatste sensibilisatie, wat aangeeft dat CPA geen snelle anafylaxie veroorzaakt bij cavia's (Tabel 2).

Acute systemische toxiciteit werd geëvalueerd bij ICR-muizen. Vijf experimentele muizen en vijf controlemuizen werden geïnjecteerd met CPA en normale zoutoplossing in een dosis van 50 ml/kg lichaamsgewicht. De reacties van de experimentele groep waren niet groter dan die van de controlegroep. Epileptische aanvallen of met het gezicht naar beneden liggen werden in geen van beide groepen waargenomen en er werden geen andere abnormale symptomen waargenomen. Bovendien was er in geen van beide groepen sprake van significant gewichtsverlies. Deze resultaten suggereren dat CPA's geen acute systemische toxiciteit vertonen voor ICR-muizen (Tabel 3 en Tabel 4).

Evaluatie van autotransplantatie van PBHSC's geconserveerd met CPA
Om de werkzaamheid te evalueren van transplantatie van PBHSC's geconserveerd met CPA voor de behandeling van bloedziekten, werden zes patiënten gerekruteerd en PBHSC's geconserveerd met CPA werden getransplanteerd naar vijf patiënten. De transplantatie was succesvol bij alle patiënten, op één na, die nog een allogene transplantatie kregen vanwege het terugkeren van de ziekte. Het aantal neutrofielen ≥ 0,5 x 109 cellen/L en het aantal bloedplaatjes ≥ 20 x 109 cellen/L werden gebruikt als markers voor succesvolle transplantatie.

Monsters b, c en e werden getransplanteerd in de overeenkomstige lymfoompatiënten en de functionele reconstructiecyclus was respectievelijk 9 dagen, 9 dagen en 10 dagen. Monsters a en f werden getransplanteerd bij patiënten met acute myeloïde leukemie en de functionele reconstructiecyclus was respectievelijk 36 dagen en 16 dagen. Monsters d patiënt kreeg een andere behandeling vanwege recidief van de ziekte. Exclusief gegevens met betrekking tot hematopoëtische en immuunreconstitutie verstoord door infectie in de cyclus van 36 dagen, was de gemiddelde tijd tot succesvolle transplantatie in vijf gevallen 11 dagen, waarbij zowel het aantal neutrofielen als het aantal bloedplaatjes aan de vereiste normen voldeed. Deze duur is korter dan de 12,5 dagen durende hematopoëtische reconstitutiecyclus die in eerdere literatuur is gerapporteerd19. In onze studie was de uiteindelijke concentratie van DMSO in de CPA-formulering onder vergelijkbare reconstitutieperioden slechts 2%, aanzienlijk lager dan de 3,5%-concentratie die doorgaans wordt genoemd20. Wat nog belangrijker is, er werden geen bijwerkingen waargenomen bij de patiënten, wat de veiligheid en werkzaamheid van onze hematopoëtische stamcelconserveringsmethode in klinische toepassingen verder bevestigt (Tabel 5).

Subpopulatieanalyse van PBHSC's toonde aan dat de celsubpopulatie van gemeenschappelijke lymfoïde voorlopercellen (CLP) en megakaryocyt/erytrocyt-voorlopers (MEP) in PBHSC's die met CPA waren geconserveerd, hoger was dan die in het traditionele regime. De celsubpopulatie van granulocyt/macrofaagvoorlopers (GMP) was echter niet significant verschillend. Deze bevindingen kunnen de snellere hematopoëtische en immuunreconstitutie verklaren die bij de behandelde patiënten werd waargenomen (Figuur 8A-C).

figure-results-1
Figuur 1: Modellen van hematopoëtische hiërarchie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Cellevensvatbaarheid van PBHSC's. (A) De levensvatbaarheid van PBHSC's geconserveerd door de eenstapsmethode met CPA was 91,29% (SD = 1,86), en die geconserveerd door de vloeibare stikstofmethode was 90,07% (SD = 1,64), p > 0,05 met betrekking tot de eenstaps cryopreservatiemethode en de cryopreservatiemethode met vloeibare stikstof. (B) Het herstelpercentage van PBHSC's die met CPA waren opgeslagen, was 89,38% (n = 6, SD = 1,87), wat significant hoger was dan het herstelpercentage van 79,55% van de PBHSC's die waren opgeslagen met TCPA (n = 6, SD = 3,16), zoals gemeten door AO/PI-detectie. (C) De levensvatbaarheid van het herstel van PBHSC's die met CPA zijn geconserveerd, was 88,20% (n = 6, SD = 2,72), wat significant hoger was dan de herstellevensvatbaarheid van 73,05% van de PBHSC's die met TCPA zijn geconserveerd (n = 6, SD = 7,47), zoals gemeten door Annexin V/PI-detectie na herstel. P<0,01 (T-toets) met betrekking tot CPA en TCPA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Structurele analyse van PBHSC's bewaard door CPA en TCPA. (A) Microfilamentstructuur van PBHSC's, inclusief de verse celgroep, CPA-groep, TCPA-groep en positieve controlegroep, zoals gevisualiseerd door Alexa Fluor 488 fluorescerende, kleurstof-gelabelde ghost pen cyclisch peptide. (B) Microtubuli-structuur van PBHSC's, inclusief de verse celgroep, CPA-groep, TCPA-groep en positieve controlegroep, zoals gevisualiseerd door ver-infrarood fluorescerende groep-gelabelde Taxol-analogen. (C) Mitochondriale activiteit van PBHSC's gelabeld met rhodamine 123 (inclusief verse celgroep, CPA-groep, TCPA-groep en positieve controlegroep) werd gedetecteerd door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Functionele analyse van PBHSC's geconserveerd door CPA en TCPA. Mitochondriale activiteit van PBHSC's, waaronder de verse celgroep, CPA-groep, TCPA-groep en positieve controlegroep, zoals gedetecteerd door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Kolonievormende potentiaaltest. Kolonievormend potentieel van PBHSC's geconserveerd met CPA, TCPA, inclusief CFU-E, BFU-E, CFU-GM en CFU-GEMM, in vergelijking met nieuwe PBHSC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Totaal aantal kolonies. Het totale aantal kolonies in de verse celgroep was 70,33 (n = 6, SD = 14,02), het totale aantal kolonies in de CPA-groep was 65,33 (n = 6, SD = 8,07) en het totale aantal kolonies in de TCPA-groep was 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Veiligheidsevaluatie van CPA door middel van dierproeven. Representatieve foto's gemaakt met een resolutie van 10x worden weergegeven in A1-B2. (EEN, TER) Evaluatie van vasculaire irritatie van CPA bij het Nieuw-Zeelandse konijn. A1 en B1 waren de pathologieweefseldoorsnedeschema's van de negatieve controlegroep, opgesteld na respectievelijk 72 uur en 14 dagen na de laatste toediening. A2 en B2 waren de pathologieweefseldoorsnedeschema's van de CPA-groep die respectievelijk 72 uur en 14 dagen na de laatste toediening werden opgesteld. (C) In vitro monitoring van hemolyse van erytrocyten bij konijnen. Buizen met het label a-e vertegenwoordigden de CPA-groep, buizen met het label f waren de negatieve controlegroep en buizen met het label g waren de positieve controlegroep. Er trad geen hemolyse op in de CPA-groep en de negatieve controlegroep, terwijl hemolyse plaatsvond in de positieve controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Analyse van subpopulaties van PBHSC's. (A) CLP, (B) MEP en (C) van 6 patiënten geconserveerd met CPA en TCPA. (A) De gemiddelde CLP-ratio's voor CPA en TCPA waren 16,38% (n = 6, SD = 13,53) en 8,97% (n = 6, SD = 7,88), de subpopulatie van CLP in PBHSC's bevroren in CPA was hoger dan die in TCPA. p > 0,05 (T-toets) met betrekking tot CPA en TCPA. (B) De gemiddelde MEP-ratio's voor CPA en TCPA waren 61,07% (n = 6, SD = 12,85) en 55,4% (n = 6, SD = 11,37), de subpopulatie van MEP in PBHSC's bevroren in CPA was hoger dan die in TCPA. p > 0,05 (T-toets) met betrekking tot CPA en TCPA. (C) De gemiddelde GMP-ratio's voor CPA en TCPA waren 62,68% (n = 6, SD = 8,20) en 64,70% (n = 6, SD = 11,66), de subpopulatie van GMP in PBHSC's bevroren in CPA was hoger dan die in TCPA. p > 0,05 (T-toets) met betrekking tot CPA en TCPA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Onderdelen van CPAConcentratieverhoudingComponenten van TCPAConcentratieverhouding
Dimethylsulfoxide4% (v/v)Dimethylsulfoxide10% (v/v)
Menselijk albumine5% (m/v)Menselijk albumine5% (m/v)
Glucose2% (m/v)--
Dextran 402% (m/v)--
Natriumglycerofosfaat0,5% (m/v)--

Tabel 1: Componenten en concentratieverhouding van CPA en TCPA.

GroepDiernummerAantal dieren met verschillende gradaties van overgevoeligheid
NegatiefZwak positiefPositiefSterk PositiefExtreem sterk positief
Negatieve controle880000
Positieve controle800053
CPA lage dosering880000
CPA hoge dosering880000

Tabel 2: Overgevoeligheidsreacties bij cavia's na behandeling met CPA. De negatieve controlegroep, de CPA-groep met lage dosis en de CPA-groep met hoge dosis vertoonden allemaal negatieve overgevoeligheidsreacties. Daarentegen vertoonden alle cavia's in de positieve controlegroep sterke positieve overgevoeligheidsreacties, waarbij drie cavia's anafylaxie ervoeren.

GroepNummeringToediening dosering (ml)Gewicht (g)
0 uur24 uur48 uur72 uur
Negatieve controle11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Experimentele groep21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Tabel 3: Samenvatting van het gewicht van de muis in het acute toxiciteitsexperiment. De negatieve controlegroep en de experimentele groep vertoonden geen significant gewichtsverlies na toediening van het geneesmiddel. Het gewicht van alle proefdieren nam geleidelijk toe binnen een redelijk bereik na conventionele voeding gedurende 24 uur, 48 uur en 72 uur na toediening.

GroepNummeringToediening dosering (ml)Observatie tijd
4 uur24 uur48 uur72 uur
Negatieve controle11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Experimentele groep21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Tabel 4: Waarneming van acute systemische toxiciteit bij muizen. In de tabel wordt verstaan onder - geen acute systemische toxiciteitsreacties. De negatieve controlegroep en de experimentele groep vertoonden geen acute systemische toxiciteitsreacties na toediening gedurende 4 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur na toediening.

Patiënt kenmerkenOns onderzoekGerapporteerd in de literatuur
N652
Leeftijd53 (35-61)55 (21-66)
MM024
HL223
AML20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL10
Ander ziektetype05
Op basis van radiotherapie234
Op basis van chemotherapie318
Nee. getransplanteerde CD34+ cellen (106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0,5×109 /L herstel (mediane dag, bereik, de abnormale gegevens zijn uitgesloten)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L herstel (mediane dag, bereik, de abnormale gegevens waren uitgesloten)11 (9-16)12.5 (0-19)
Misselijkheid015
Braken04
Duizeligheid01
Elke complicatie020

Tabel 5: Statistieken van HSCT-gegevens. Kenmerken van de patiënt en hematopoëtisch herstel na ASCT.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie evalueerden we een nieuwe CPA voor cryopreservatie van PBHSC's. De resultaten tonen aan dat CPA de levensvatbaarheid van PBHSC's verbetert in vergelijking met TCPA. Met name de levensvatbaarheid van het herstel van PBHSC's die met CPA zijn geconserveerd, overtrof die van TCPA met meer dan 10%. In stamcellen is de integriteit van het cytoskelet de basisvereiste voor het behoud van de activiteit en differentiatiefunctie van stamcellen35,36. Op cellulair niveau zagen we dat zowel microfilament- als microtubuli-structuren in PBHSC's geconserveerd met CPA meer intact waren dan in de TCPA-groep, met opmerkelijk duidelijkere microtubuli-structuren. Mitochondriën zijn de energiefabriek van cellen. Mitochondriën zijn direct betrokken bij de celademhaling, het metabolisme en andere levensactiviteiten, die essentiële organellen zijn om de celactiviteit in stand te houden37. Mitochondriale activiteit is een cruciale indicator van de hematopoëtische stamcelfunctie na cryopreservatie en herstel. In termen van mitochondriale activiteit vertoonde de CPA-groep overeenkomsten met verse PBHSC's. Directe observatie van mitochondriale complexen toonde aan dat hun aantal in de CPA-groep dat in de TCPA-groep overtrof. Bovendien werd flowcytometrie gebruikt om de behouden mitochondriale activiteit in elke groep kwantitatief te beoordelen. De resultaten toonden geen significant verschil tussen de CPA- en verse celgroepen, maar de activiteit was 8,5% hoger in de CPA-groep in vergelijking met de TCPA-groep. Deze vergelijking van gegevens over mitochondriale activiteit bevestigt de bevindingen van de levensvatbaarheid van celherstel. Bovendien gaven kolonievormingstesten aan dat PBHSC's die met CPA waren geconserveerd, hun differentiatiepotentieel behielden. De CPA-groep vertoonde een hoger aantal kolonies na inductie, wat de superieure conserveringswerkzaamheid van CPA verder onderbouwt.

Het doel van deze studie was om CPA toe te passen op klinische HSCT om de activiteit van PBHSC's na conservering te verbeteren en het slagingspercentage van transplantatie te garanderen. Alvorens CPA toe te passen op klinische proeven, werden veiligheidsevaluaties uitgevoerd bij proefdieren, die gegevensondersteuning boden voor de veiligheid van CPA in klinische toepassing. Eerdere studies hebben aangetoond dat sommige nieuwe CPA's zijn geïdentificeerd als de beste cryopreservatietechnologie voor endotheelcellen (MHECT-5) en embryo's38,39. In de klinische toepassing van een CPA voor het behoud van PBHSC's hebben we met succes PBHSC's van zes patiënten gecryopreserveerd voor HSCT. Met name de eenstaps cryopreservatiemethode met behulp van CPA stroomlijnde het conserveringsproces van monsters aanzienlijk. Deze methode, vergeleken met eerder gerapporteerde cryopreservatietechnieken in één stap voor hematopoëtische stamcellen, maakte gebruik van een lagere concentratie DMSO, wat een belangrijke vooruitgang is voor klinische toepassingen. Van de zes patiënten ondergingen er vijf met succes een transplantatie. De overige patiënt kreeg een alternatieve behandeling vanwege het terugkeren van de ziekte. We voerden een statistische evaluatie uit van de functionele reconstructiecyclus voor de vijf patiënten die de transplantatie hadden voltooid. Afgezien van één geval waarin de reconstructiecyclus werd verlengd als gevolg van infectie, was de gemiddelde tijd voor de reconstitutie van hematopoëtische en immuunfuncties 11 dagen, wat sneller is dan de 12,5 dagen die in eerdere literatuur werden genoemd. Cruciaal was dat er geen toxiciteit werd waargenomen tijdens het transplantatieproces. Deze uitkomst is vooral opmerkelijk als men bedenkt dat de uiteindelijke concentratie van DMSO in de CPA-methode slechts 2% was, vergeleken met de concentratie van 10% (v/v) die in de TCPA-methode werd gebruikt. Dit succesvolle gebruik van een lagere DMSO-concentratie in CPA om bijwerkingen te minimaliseren, valideert onze strategie en is van vitaal belang voor de klinische werkzaamheid.

In het licht van de versnelde functionele reconstitutie die in onze studie werd waargenomen, hebben we de mogelijke verschillen in het aantal getransfundeerde CD34+-cellen verder onderzocht. Uit de statistische analyse bleek dat het aantal getransfundeerde CD34+-cellen gemiddeld 2,4 x 106 cellen/kg bedroeg, wat lager is dan de cijfers die in eerdere literatuur zijn gerapporteerd40. Dit bracht ons tot de hypothese dat de CPA superieure bescherming zou kunnen bieden aan specifieke subpopulaties binnen PBHSC's die cruciaal zijn voor hematopoëtische en immuunreconstitutie. Om deze hypothese te onderzoeken, hebben we een gedetailleerde analyse uitgevoerd van de subpopulaties van CLP, GMP en MEP in PBHSC's die bewaard zijn gebleven met zowel CPA als TCPA. Het resultaat toonde aan dat de subpopulaties van CLP en MEP in PBHSC's die met CPA zijn geconserveerd, toenamen in vergelijking met die met TCPA, terwijl er geen significant verschil was in de subpopulatie van GMP. CLP kan differentiëren in T-cellen, B-cellen en NK-cellen in het menselijk lichaam; een verhoogde dosis CLP kan de reconstitutie van het immuunsysteem versnellen33. MEP kan differentiëren in erytrocyten en bloedplaatjes41. Natriumglycerofosfaat in CPA verbetert de mitochondriale ATP-synthese via de glycerofosfaatshuttle, waardoor energietekorten veroorzaakt door cryopreservatie worden aangepakt. Dit is van cruciaal belang voor CLP-cellen, die afhankelijk zijn van glycolyse voor lymfoïde differentiatie42. Bovendien was de hoge standaarddeviatie van de levensvatbaarheid van TCPA hoger dan die van de CPA (7,47 versus 2,72, figuur 3), wat wijst op de variabiliteit van de TCPA-resultaten, die te wijten kan zijn aan onstabiele vriesomstandigheden. Daarom stellen we voor dat het verbeterde behoud van CLP en MEP een kritische factor kan zijn bij het verkorten van de hersteltijd voor hematopoëtische en immuunfunctie. De superieure beschermende effecten van de CPA op CLP- en MEP-subgroepen lijken een snellere functionele reconstructie tijdens klinische transfusietherapieën mogelijk te maken. Dit verbetert niet alleen de therapeutische resultaten, maar vermindert ook de duur en kosten van de behandeling voor patiënten die een transplantatie ondergaan. In wezen biedt onze methode een meer economische benadering voor HSCT, waarbij zowel de klinische als de economische aspecten van patiëntenzorg worden geoptimaliseerd.

Ondanks lopende onderzoeksinspanningen om stoffen te identificeren die DMSO zouden kunnen vervangen, blijft de zoektocht naar alternatieven een uitdaging. Hoewel er meldingen zijn gedaan van nieuwe technologieën en stoffen die op dit gebied opkomen43,44, ontbreken er nog steeds rigoureuze in-vitroveiligheidsdemonstraties voor deze nieuwe verbindingen. Evenzo is er onvoldoende bewijs om hun veiligheid en werkzaamheid voor klinisch gebruik te bevestigen, met name met betrekking tot de studie van onzuiverheden. Daarom moeten deze opkomende stoffen uitgebreid worden gevalideerd voordat ze in klinische omgevingen kunnen worden toegepast. In deze context zijn wij van mening dat het optimaliseren van het gebruik van DMSO, terwijl effectieve celconservering wordt gegarandeerd, de meest haalbare strategie blijft voor klinische toepassingen. Eerdere studies hebben de rol van glycerofosfaatpendeling bij de ATP-productie en mitochondriale activiteitsregulatie in cellen benadrukt 45,46. Op basis van dit inzicht stellen we voor dat het opnemen van natriumglycerofosfaat in de CPA zou kunnen dienen als een effectieve strategie om een aanzienlijk deel van DMSO te vervangen dat traditioneel in TCPA wordt gebruikt als osmotisch beschermend middel. Er wordt geen melding gemaakt van recent onderzoek naar alternatieven met een laag dimethylsulfoxidegehalte, wat wijst op enige nieuwigheid in deze methode.

Over het algemeen omvatten de cruciale stappen in ons cryopreservatieprotocol: (i) nauwkeurige DMSO-concentratieregeling bij 2% (v/v), (ii) een gecontroleerde afkoelsnelheid van -1 °C/min, en (iii) snel ontdooien in een waterbad van 37 °C. Deze stappen zorgen voor minimale osmotische stress en ijskristalvorming. Met name de verlaagde DMSO-concentratie pakt direct de cytotoxiciteitsproblemen aan die verband houden met traditionele 10% DMSO-oplossingen47. Gecontroleerde koeling voorkomt intracellulaire ijsschade, zoals gevalideerd in cryopreservatie van mesenchymale stamcellen48, terwijl snel ontdooien de mitochondriale functie behoudt, een kritische factor voor de levensvatbaarheid na dooi49. We hebben drie aspecten geoptimaliseerd: (i) Mengmethode: de eerste proeven toonden celaggregatie aan tijdens CPA-toevoeging; Door over te schakelen op druppelsgewijs mengen met vortexing bij 500 tpm werd klonteren geëlimineerd. (ii) Kleuringsprotocol: Voorwascellen met PBS dat 0,05% Tween-20 bevat, verbeterde de penetratie-efficiëntie van antilichamen met 18%. (iii) Consistentie van ontdooien: Het implementeren van een gestandaardiseerd ontdooivenster van 120 s voorkwam variabiliteit in herstelpercentages (± 2% versus ± 7% in pilotstudies). Voor veelvoorkomende problemen zoals een laag aantal kolonies loste het verhogen van het MethoCult-mediumvolume tot 2 ml/gerecht en vochtigheidsregeling (>95%) dit probleem op, in overeenstemming met de hematopoëtische voorloperteeltnormen50. Twee beperkingen verdienen aandacht: (i) Subpopulatiebias: Hoewel CPA CLP- en MEP-subsets effectief behoudt, vertonen zeldzame populaties zoals CD34+CD38-CD90+ HSC's op lange termijn 12% minder herstel dan nieuwe controles (p = 0,03). (ii) Voor de beoordeling van de integriteit van het cytoskelet, die gebaseerd is op kwalitatieve beelden, moeten sommige kwantitatieve maatstaven (bijv. fluorescentie-intensiteit, structurele scores) worden opgenomen in betrouwbaardere analyses. Onze CPA-methode bevordert de huidige praktijken door: (i) Verbetering van de veiligheid: Het hemolysepercentage daalde van 8,2% (TCPA) naar 1,5% (CPA) 24 uur na de dooi (p < 0,001). (ii) Functionele superioriteit: CPA-geconserveerde cellen vertoonden 23% hogere CFU-GEMM-kolonievorming versus TCPA, cruciaal voor implantatie met meerdere lijnen51. (iii) Klinische efficiëntie: Transplantatiesucces met 2,4 x 106 CD34+ cellen/kg (versus literatuurstandaard ≥ 4 x 106) suggereert verbeterde potentie. Deze technologie is veelbelovend voor: (i) Gen-gemodificeerde HSC-opslag: de mitochondriale bescherming van CPA kan CRISPR-bewerkte cellen stabiliseren tijdens cryopreservatie52. (ii) Organoïde bankieren: Voorlopige gegevens tonen 89% levensvatbaarheid aan in CPA-geconserveerde darmorganoïden versus 54% in TCPA (n=3). (iii) Wereldwijde distributienetwerken: Een lager DMSO-gehalte maakt proeven met omgevingstemperatuurtransport mogelijk met behulp van faseveranderingsmaterialen53.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een mogelijk belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het Nanshan District Medical Key Discipline Construction Financial Support Project, Shenzhen Nanshan District Health System Science and Technology Major Project (nr. NSZD2023018), en het NHC Key Laboratory of Nuclear Technology Medical Transformation (Mianyang Central Hospital; Subsidie nr. 2023HYX033).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 - mm cell culture dishLABSELECT12111
Acridine Orange/PROPIDIUM IODIDECountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Benchtop Automatic Image CytometerCountstarRigel-S2
Cell Preservation Solution XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.YB020050 YB020100
ColchicineBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM880
Cytochalasin BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
DAPI Staining KitBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Flow CytometerBDFACSLSRFortessa
Glycerol  AMRESCO854
Human albuminSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Hydrogen peroxideSigma-AldrichH1009
Immunostaining Wash BufferBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Inverted MicroscopeNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Physiological salineBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Propidium IodideBDBDB556463
Rhodamine 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific371
Vortex MixerNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

perifere bloedstamcellencryopreservatie van stamcellenautologe stamceltransplantatiecelviabiliteitsassaymitochondri le activiteitcolony forming assaycytoskeletale integriteitinvriezen in vloeibare stikstofdimethylsulfoxide toxiciteit
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen