Methodenartikel

Blauw licht-induceerbare semi-willekeurige mutagenese op specifiek exogeen DNA in Escherichia coli BL21-stam

692 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68283

⸱

20 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

Het geschetste protocol beschrijft gestroomlijnde methoden voor het herkennen van exogeen DNA en het genereren van mutaties alleen op die exogene DNA's in Escherichia coli.

Samenvatting

Mutagenesetechnologieën worden veel gebruikt bij het kweken van variaties, gerichte evolutie en eiwitengineering. De meeste methoden kunnen echter alleen willekeurige genomische DNA-mutaties induceren die oncontroleerbaar zijn, wat leidt tot misvormingen of zelfs dodelijke effecten. Hier, door gebruik te maken van de fusie van drie systemen: cytosine-base editor (CBE), blauwlicht-induceerbare p-Mag/n-Mag-elementen en gesplitst T7 RNA-polymerase, bevat deze geschetste methode een blauw-licht-controleerbaar, DNA-regiospecifiek, semi-willekeurig mutagenesesysteem.

Dit systeem kan cytosine muteren tot thymine op DNA's, beginnend bij de T7-promotor en eindigend in de T7-terminator. Elk exogeen gen stroomafwaarts van de T7-promotor kan mogelijk worden gemuteerd. Deze tools zijn ook in twee delen ontworpen om het systeem blauwlichtcontroleerbaar te maken. Het eerste deel is gemaakt door CBE te fuseren met n-Mag en het N-terminal-T7 RNA-polymerasegen. Het tweede deel betrof het fuseren van p-Mag met het C-terminal-T7 RNA-polymerase. Onder blauw licht werden deze twee delen samengevoegd om te functioneren als een mutatiegenerator op DNA's tussen de T7-promotor en de T7-terminator. Zonder blauw licht wordt p-Mag losgekoppeld van n-Mag, waardoor de CBE het DNA niet meer kan bewerken.

Het doel van dit protocol is om regiospecifieke willekeurige mutaties in Escherichia coli met blauwlichtcontrole te genereren en de gemuteerde plasmiden verder te valideren. Het systeem kan worden aangepast aan een in vivo evolutiesysteem waarbij de functie van het gen van belang kan worden geselecteerd en de gewenste mutaties kunnen worden verzameld voor verder onderzoek.

Inleiding

Willekeurige mutatie en natuurlijke selectie zijn de belangrijkste krachten die de evolutie aandrijven, die een grote genetische variatie tussen soorten heeft gegenereerd. Het evolutionaire proces is gebruikt als een krachtig hulpmiddel om eiwitten te ontwikkelen met geoptimaliseerde of nieuwe functies1. Natuurlijke mutatiesnelheden van DNA-replicatie worden geschat op ongeveer één op 109 basen per celdeling in meerdere prokaryoten en eukaryoten2. Lage natuurlijke mutatiesnelheden maken het onpraktisch om grote genetische diversiteit in laboratoria te genereren. Studies hebben zich gericht op het ontwikkelen van methoden die de mutatiesnelheden verhogen om binnen een redelijke tijd zoveel mogelijk plaatsen in een bepaald gen te bestrijken.

Er zijn meerdere systemen ontwikkeld om hogere mutatiesnelheden te bereiken in laboratoriumevolutiestudies 3,4,5,6,7,8,9,10. In-vitro-evolutiesystemen maken gebruik van foutgevoelige PCR, plaatsgerichte verzadigingsmutagenese of computationeel bibliotheekontwerp om mutaties in interessante genen te introduceren1. De DNA-bibliotheken worden omgezet in gastheercellen waar de eiwitproducten worden gescreend of geselecteerd. De mutagenese- en selectiestappen in in vitro evolutie zijn niet gekoppeld, waardoor de efficiëntie en schaal van populaties die kunnen worden gegenereerd worden beperkt11. In vivo evolutiesystemen hebben de beperkingen overwonnen door mutatiesystemen in cellen te introduceren en de mutagenese- en selectiestappen te koppelen om continue evolutie mogelijk te maken. Eerdere in vivo mutagenesemethoden maakten gebruik van chemische mutagene stoffen 3,4 en mutatorstammen 5,6. Deze methoden lijden echter aan lage mutatiesnelheden, gebrek aan controle en een smal of ongelijk mutatiespectrum12. Recente studies hebben nieuwe en verbeterde in vivo evolutiesystemen ontwikkeld, vertegenwoordigd door OrthoRep, een orthogonaal foutgevoelig DNA-replicatiesysteem 7,8; MutaT7, een fusie van cytidinedeaminase tot T7 RNA-polymerase9; en EvolvR, een fusie van nickase Cas9 tot foutgevoelig DNA-polymerase10. Deze methoden hebben verschillende gastheercellen, doelcontext en gemak van implementatie.

T7 RNA-polymerase (T7 RNAP), een belangrijk onderdeel van het MutaT7-systeem, is uitgebreid bestudeerd en ontwikkeld op het gebied van synthetische biologie. Fragmenten van T7 RNAP zijn op verschillende niveaus op verschillende tijdstippen tot expressie gebracht om een resource allocator13 te bouwen. Een gesplitste T7 RNAP met C-terminale fragmenten van verschillende promotorspecificiteit is gebouwd om AND logic gate14 te creëren. Het vermogen van T7 RNAP-fragmenten om te assembleren om een functioneel polymerase te reconstrueren, heeft geleid tot de ontwikkeling van door licht en kleine moleculen geactiveerde biosensoren, waarbij dimerisatie van interactiepartners gefuseerd met elk van de N- en C-terminals van T7 RNAP transcriptionele output genereert15. De gesplitste T7 RNAP is ook gefuseerd met n-Mag- en p-Mag-domeinen om lichtinduceerbare genexpressiecontrole op te bouwen in Escherichia coli16. Bij activering van blauw licht dimeren de magneetdomeinen, waardoor twee domeinen van de gesplitste T7 RNAP ruimtelijk dichtbij komen om de polymerasefunctie uit te voeren. Dit systeem maakt nauwkeurige spatiotemporele controle van genexpressie mogelijk met lage basale expressie en een groot dynamisch bereik.

Dit artikel presenteert een protocol om een in vivo controleerbaar semi-willekeurig mutagenesesysteem te bouwen dat door blauw licht kan worden gecontroleerd (Figuur 1). Het is gebouwd op rAPOBEC1 deaminase gefuseerd met n-Mag-N-T7 RNAP. Co-expressie van p-Mag-C-T7 RNAP uit hetzelfde plasmide maakt blauwlichtregeling van de polymerase- en basebewerkingsactiviteiten mogelijk. Het systeem combineert de basisbewerkingscapaciteit van rAPOBEC1 met de lichtgestuurde split T7 RNAP. Het is gevalideerd in E. coli met behulp van groen fluorescerend eiwit (GFP) als het doelgen waarvan de intensiteit wordt geselecteerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Vergeleken met het oorspronkelijke MutaT7-systeem introduceert ons blauwlichtgestuurde systeem semi-willekeurige mutaties in het doelgen door het lichtinterval te moduleren. In plaats van alle cytosine om te zetten in uracilbasen in het doelgen, genereert het een groter mutatieprofiel door een subset van de nucleotiden te bewerken via lichtcontrole. Het systeem kan gemakkelijk worden aangepast aan een in vivo evolutiesysteem waarbij de GFP kan worden vervangen door andere interessante genen en de functie kan worden geselecteerd op basis van celfitness of overleving.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het volgende protocol schetst hoe exogene DNA-mutagenese moet worden ontworpen met behulp van het CBE-Mag-T7-polymerasemutagenesesysteem (stap 1). Zodra het exogene DNA-plasmide is geconstrueerd, worden stappen voor transformatie van de twee plasmiden beschreven voor het tot expressie brengen van CBE-Mag-T7-polymerasemutagenese in de E. coli BL21-stam door toevoeging van isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en gevolgd door bestraling met blauw licht om de mutagenese te initiëren (stappen 2-9.2). De kwaliteitscontrolestappen voor het evalueren van het aantal mutaties dat werd gegenereerd op GFP of exogeen DNA werden uitgevoerd met behulp van Sanger-sequencing (stappen 9.3-11.2).

1. Ontwerp exogeen DNA en construeer het CBE-Mag-T7 polymerasemutagenesesysteem

  1. Vind de exogene DNA- of cDNA-sequencing met behulp van online tools (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene of https://www.uniprot.org/).
    OPMERKING: Hier hebben we de GFP-sequentie gebruikt als exogeen DNA voor cytosinemutagenese.
  2. Vervang het gfp-DNA door het DNA van interesse met behulp van een geschikte kloonkit.
    OPMERKING: We gebruiken NheI om het gfp-DNA in het originele plasmide in de DNA-kolonie-assemblagekit te verwijderen. Een alternatief is om samen te werken met bedrijven voor de DNA-synthese. Zie aanvullend bestand 1 voor de plasmide-sequentie.
  3. Synthese van alle genen samen met het CBE-Mag-T7-polymerasemutagenesesysteem en neem ze op in de pET-11a-ruggengraat met ampicillineresistentie.
    OPMERKING: We hebben samengewerkt met een DNA-synthesebedrijf om dit plasmide te bouwen en we hebben glycerolvoorraadbacteriën verkregen die ons doelplasmide bevatten.

2. Activering van bacteriële stammen

  1. Pipetteer 10 μL van de glycerolvoorraadbacteriën op de rand van een LB-agarplaat met 100 μg/ml ampicilline. Streep de bacteriën vanaf deze plek over de plaat met behulp van een steriele lus.
  2. Incubeer de plaat een nacht ondersteboven bij 37 °C in een bacteriebroedmachine.

3. Plasmide-amplificatie

  1. Pluk een enkele kolonie van de plaat en inoculeer deze in een conische buis van 50 ml met 15 ml LB-medium dat 100 μg/ml ampicilline bevat.
  2. Plaats de cultuur in een schudbroedmachine bij 37 °C, 180 tpm gedurende 14-16 uur.

4. Plasmide-extractie

  1. Neem 5-15 ml van de nachtelijke bacteriecultuur en breng deze over in een centrifugebuis. Centrifugeer op 18.894 × g gedurende 1 min.
  2. Verzamel de bacteriële korrel en verwijder voorzichtig al het overval. Resuspendeer de bacteriële pellet in 500 μL resuspensiebuffer door middel van vortexen of pipetteren.
  3. Voeg 500 μL lysisbuffer toe aan de buis, meng voorzichtig door de buis 8-10x om te keren en laat deze 5 minuten op kamertemperatuur staan om de cellen te lyseren.
    NOTITIE: Bevestig de volledige lysis door ervoor te zorgen dat er geen zichtbaar wit vlokkig materiaal achterblijft.
  4. Voeg 200 μL evenwichtsbuffer toe aan de spinkolom die in een verzamelbuis is geplaatst. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 18.894 × g en gooi de doorstroming weg. Plaats de kolom terug in de opvangbuis.
  5. Voeg 500 μL neutralisatiebuffer toe aan het bacteriële lysaat, meng voorzichtig door de buis 8-10x om te keren tot er een wit neerslag verschijnt en laat het 5 minuten op kamertemperatuur staan.
  6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 18.894 × g en breng het bovenstaande over in een filterkolom. Centrifugeer 1 minuut bij 18.894 × g om de oplossing te filtreren.
  7. Voeg 0,3x het volume isopropanol toe aan de gefilterde oplossing, meng door om te keren. Breng het mengsel over naar de in evenwicht gebrachte draaikolom.
  8. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 18.894 × g , gooi de doorstroming weg en plaats de kolom terug in de opvangbuis.
  9. Was de kolom met 750 μL wasbuffer, centrifugeer op 18.894 × g gedurende 1 minuut en gooi de doorstroom weg.
  10. Centrifugeer de kolom opnieuw op 18.894 × g gedurende 1 minuut om de resterende wasbuffer te verwijderen.
  11. Plaats de spinkolom in een nieuwe centrifugebuis. Voeg 100-200 μL elutiebuffer toe aan het midden van het kolommembraan. Laat het 2-5 minuten op kamertemperatuur staan en centrifugeer 2 minuten op 18.894 × g . Bewaar het plasmide-DNA bij -20 °C.

5. Plasmidetransformatie (E. coli BL21 chemisch competente cellen)

  1. Neem 50 μL ontdooide BL21 chemisch competente cellen op ijs. Voeg 2 μL plasmide-DNA uit stap 4.11 toe en meng voorzichtig. Incubeer 30 minuten op ijs.
  2. Hitteschok bij 42 °C gedurende 45 s, breng de buis vervolgens onmiddellijk terug naar ijs gedurende 2 minuten.
  3. Voeg 500 μL steriel LB-medium toe aan elke buis. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C, 180 tpm om herstel mogelijk te maken.
  4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 × g , gooi het overtollige supernatant weg en laat ongeveer 100 μl over. Resuspendeer de cellen en de plaat op LB-agar die 100 μg/ml ampicilline bevat. Incubeer ondersteboven bij 37 °C gedurende de nacht.

6. Tot expressie brengen van CBE-Mag-T7 polymerase mutatiegenerator (inactieve vorm)

  1. Volg stap 5.1-5.4. Voordat de cellen worden verspreid, moet u 1 mM IPTG gelijkmatig met ampicilline op het oppervlak van de LB-agar aanbrengen. Gebruik gedeïoniseerd water als controle om te vergelijken met IPTG-behandelde groepen.
  2. Nadat alle kolonies zijn gekweekt, plukt u 10-20 kolonies om te kweken in 5 ml LB-medium met 1 mM IPTG in glazen buizen van 100 ml met ronde bodem en fenolische schroefdop en rubberen voering bij 16 °C, 180 tpm gedurende 8 uur.
    OPMERKING: Alle volken kunnen bij 4 °C worden bewaard voor kortstondige opslag voordat wordt overgegaan tot stap 7.

7. Activeer de CBE-Mag-T7 polymerase mutatie generator

  1. Verzamel de bacteriën in glazen buizen van 100 ml met ronde bodem en fenolische schroefdop en rubberen voering en centrifugeer gedurende 2 minuten op 18.894 × g .
  2. Verander het medium in LB-medium zonder IPTG.
    OPMERKING: Deze stap is belangrijk om ervoor te zorgen dat de CBE-Mag-T7-polymerasemutatiegenerator zichzelf niet kan bewerken. We hebben het lacI/O-systeem ontworpen om de CBE-Mag-T7-polymerasegenclusters te beschermen.
  3. Bestraal de plaat met één blauwlichtstraler (470 nm, 4 mW/cm2) tijdens de teelt bij 37 °C gedurende de vooraf bepaalde tijd. Voer Sanger-sequencing uit om de mutaties te verifiëren en controleer of langere blootstelling de mutatiefrequentie verhoogt.
    OPMERKING: Hier stellen we de blootstelling aan blauw licht in op 0, 8, 16 en 24 uur.

8. Selectie van mutaties voor een verhoogde eiwitfunctie en voortgezette mutagenese

OPMERKING: Hier gebruiken we het gfp-gen als exogeen DNA voor mutagenese en zijn we op zoek naar mutaties die de fluorescerende intensiteit van het GFP-eiwit kunnen verbeteren.

  1. Pluk de kolonies, label de positie op een bord en inoculeer de verzamelde kolonies in 100 μL ddH2O.
  2. Breng de 100 μL bacteriële suspensie over op een plaat met 96 putjes en lees de GFP-intensiteit af bij Ex/Em = 488/510 nm.
  3. Herhaal stap 6.3 tot 9.2 totdat enkele voor de hand liggende kolonies kunnen worden geïdentificeerd.

9. Stop de mutagenese en verifieer de mutaties

  1. Na enkele uren bestraling met blauw licht te hebben uitgevoerd, verplaats je alle bacteriën nog 15 minuten terug naar een donkere plaats bij 4 °C.
  2. Volg dezelfde stappen voor de extractie van plasmide als beschreven in stap 4.
  3. Ontwerp de voorwaartse en achterwaartse primers voor Sanger-sequencing.
    OPMERKING: Hier gebruiken we ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT als een voorwaartse primer en TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG als een omgekeerde primer voor Sanger-sequencing.

10. Gegevensanalyse en berekening van de mutatiefrequentie

  1. Bekijk de mutatie door het .ab1 bestand te openen en controleer de pieken handmatig.
  2. Analyseer de mutatiefrequentie met behulp van online tools (bijv. Mutation Surveyor-tool).
  3. Upload het Sanger-gegevensbestand naar de online tool en start de analyse van de mutatiesnelheid.

11. Bacteriële glycerol bouillon bereiding

  1. Inoculeer een enkele kolonie in een buisje met 5 ml LB-medium met 100 μg/ml ampicilline. Incubeer bij 37 °C, 180 tpm gedurende 12-16 uur.
  2. Meng de bacteriecultuur met 50% glycerol in een verhouding van 1:1. Aliquot in centrifugebuisjes van 1,5 ml. Bewaren bij -80 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn voor het creëren van mutaties op exogeen DNA met behulp van een gesplitste CBE-Mag-T7 RNA-polymerasemutatiegenerator. Genen voor het bouwen van het CBE-Mag-T7 RNA-polymerasemutatiesysteem en het doelwitgen voor mutagenese zijn allemaal opgenomen in de pET-11a-plasmide-ruggengraat. Succesvolle transformatie en bestraling met blauw licht werden uitgevoerd zonder enige schade aan het bacteriële genomische DNA, aangetoond door normale e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De polymerasegeleide basisbewerkingstool werd voor het eerst gemaakt door Cravens et al. in 2021, met behulp van een eiwitfusiestrategie17. Mutaties op vier DNA-nucleotiden werden met succes opgenomen met snelheden van meer dan 10-4 mutaties per bp. Aangezien er echter continu mutaties werden geïntroduceerd tussen T7-promotor en terminator zonder aanvullende controle door onderzoekers18, konden "goede" mutaties niet worden bewaar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50 mL Conical Centrifuge TubesFalconCLS352070
AmpicillinThermo Scientific ChemicalsJ60977.14
Blue-light irradiatorThorlabsLIU470A
DNA Assembly Cloning Kit NEBE5520S
DNA/Prmers synthesisBGI Genomics
EndoFree Plasmid Midi Kit CWBIOCW2106SBuffer P1: resuspensiebuffer, Buffer P2: lysebuffer, Buffer E3: equilibratiebuffer, Buffer PS: neutralisatiebuffer, Buffer PW: wasbuffer,Endo-Free Buffer EB: DNA-zuiveringsbuffer,RNase A Endo-Remover FM: endotoxin-verwijderingsbuffer, Spin Columns DM met Collectiebuizen
GlycerolFisher ChemicalG33-4
Incubated ShakerThermo ScientificSK2001CPKG
IPTG (isopropylthio-β-galactoside)Invitrogen15529019
Microplate ReaderThermo ScientificVarioskan LUX
Microscope LeicaDMI 4000B
Multiskan FCThermo Scientific Chemicals
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coliInvitrogenC600003
PureLink Fast Low-Endotoxin Midi Plasmid Purification KitInvitrogenA36227
Pyrex heavy-duty round-bottom centrifuge tubes, with phenolic screw cap and rubber linerCorning 8422CLS8422100

Referenties

  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Blauw licht mutagenesecytosine base editorT7 promotorsysteemexogene DNA mutatieeiwitengineeringgerichte evolutieregio specifieke mutagenesein vivo evolutie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen