Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van de expressie en complexassemblage van de mitochondriale respiratoire keteneiwitten in de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68336

⸱

2 mei 2025

 ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory for Pathogens and Ecosystems, College of Life Sciences, Nanjing Normal University

In dit artikel

Samenvatting

De splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe is in opkomst als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van mitochondriën. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van de overvloed en assemblage van de mitochondriale ademhalingscomplexen in S. pombe. Dit maakt de karakterisering mogelijk van de nieuwe functies van geconserveerde genen in de mitochondriale ademhalingsketen.

Samenvatting

De mitochondriale ademhalingsketen is cruciaal voor het cellulaire energiemetabolisme en dient als de kern van oxidatieve fosforylering. De mitochondriale ademhalingsketen bestaat uit vijf enzymcomplexen en hun op elkaar inwerkende supercomplexen. Analyse van de expressie en complexassemblage van deze eiwitten is van vitaal belang voor het begrijpen van de mitochondriale functie. Dit kan worden bestudeerd door biochemische en genetische methoden te combineren in een uitstekend modelorganisme splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), dat een compensatiesysteem biedt aan ontluikende gist voor studies van mitochondriale biologie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van S. pombe mitochondriën en analyse van expressieniveaus en complexen assemblage van de mitochondriale respiratoire eiwitten door SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en blue native-PAGE (BN-PAGE). In het kort worden mitochondriën van de wild-type en genmutanten gezuiverd, en vervolgens worden hun complexen opgelost en onderworpen aan SDS-PAGE/BN-PAGE en immunoblotting. Deze methode maakt de karakterisering mogelijk van de nieuwe functie van een gen in de mitochondriale ademhalingsketen.

Inleiding

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in diverse biologische processen, zoals cellulaire ademhaling voor energie, voedingsmetabolisme en celdood1. Het slecht functioneren van mitochondriën houdt verband met hersen-, spier- en ontwikkelingsziekten 2,3. Daarom zijn studies naar mitochondriën van vitaal belang om de veroudering en gezondheid van de mens te verbeteren.

De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) wordt al lang gebruikt om de functies van genen in mitochondriënte bestuderen 4 omdat gistmutanten met een defect aan de ademhaling nog steeds energie kunnen produceren om te overleven door fermentatie. Het is echter klein-positief en kan zich vermenigvuldigen zonder mitochondriaal DNA (mtDNA). Bijgevolg verliezen de genmutanten die defect zijn in mitochondriale genexpressie vaak hun mtDNA, wat verder onderzoek bemoeilijkt. Daarentegen is de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), die evolutionair ver verwijderd is van S. cerevisiae, een klein-negatieve gist die mtDNA nodig heeft om te overleven. Bovendien is de organisatie van mtDNA en mitochondriaal mRNA van S. pombe vergelijkbaar met die van hogere eukaryoten5. Veel (96) essentiële genen in S. pombe, vergeleken met slechts zes essentiële genen in S. cerevisiae, zijn nodig voor mitochondriale genexpressie6. Zo komt S. pombe naar voren als een aantrekkelijk model om nieuwe functies van genen in mitochondriën te bestuderen. Het aantal publicaties dat mitochondriën in S. cerevisiae bestudeert, is echter ongeveer 100 keer meer dan dat in S. pombe, en de gerapporteerde methoden en protocollen die mitochondriën in S. pombe bestuderen, zijn ook schaars7.

De mitochondriale ademhalingsketen is cruciaal voor de cellulaire energieproductie en dient als een kern van mitochondriën8. Het omvat ademhalingsketencomplexen I-V, zoals NADH-ubiquinonoxidoreductase (Complex I), succinaatdehydrogenase (Complex II), ubiquinon-cytochroom c-oxidoreductase of cytochroom bc1-complex (Complex III), cytochroom c-oxidase (Complex IV) en ATP-synthase (Complex V), samen met twee intermediaire substraten die elektronen vervoeren, ubiquinon (CoQ) en cytochroom c (Cyt c)9. Ze interageren ook en vormen supercomplexen van hogere orde, waarvan de assemblagemechanismen grotendeels onduidelijk blijven10,11. S. pombe mist echter complex I, dat kan worden vervangen door externe NADH-dehydrogenases Nde1 en interne Ndi1 12,13,14. Het mitochondriaal genoom in S. pombe codeert voor een subeenheid van complex III (Cob1), drie subeenheden van complex IV (Cox1, Cox2, Cox3) en drie subeenheden van complex V (Atp6, Atp8, Atp9)15,16. We hebben onlangs gemeld dat de expressie en complexassemblage van deze eiwitten worden beïnvloed door de deletie van respectievelijk RNA-helicase Mss116 (Δmss116)16 en assemblagefactor Shy1 (Δshy1)15 in S. pombe. Om de ontdekking van nieuwe functies van meer genen in de mitochondriale ademhalingsketen met behulp van deze methoden te vergemakkelijken, bieden we hier een gedetailleerd protocol voor SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) analyse van de expressieniveaus en blue native-PAGE (BN-PAGE) analyse van complexen assemblage van de mitochondriale ademhalingsketeneiwitten in S. pombe.

De grondgedachte achter de isolatie van mitochondriën uit S. pombe is gebaseerd op de methoden die zijn vastgesteld in S. cerevisiae17. De sferoplasten worden eerst bereid door gistcelwanden te verteren. Ze worden mechanisch gehomogeniseerd en de mitochondriën worden gefractioneerd door differentiële centrifugatie18. Vervolgens worden de eiwitten van de mitochondriale ademhalingsketen opgelost en immuungedept volgens SDS-PAGE en BN-PAGE. De BN-PAGE-techniek is oorspronkelijk ontwikkeld voor de scheiding van mitochondriale membraaneiwitten zoals ademhalingsketencomplexen 19,20,21. De membraaneiwitten met geconserveerde intacte complexen worden opgelost door milde niet-ionische detergenten en geladen met anionische kleurstof Coomassie G-250. Eiwitcomplexen worden dus gescheiden op basis van hun massa in een gradiënt native-PAGE gel22. Deze methode is veel gebruikt voor het bestuderen van mitochondriale ademhalingsketencomplexen in S. cerevisiae23 en zoogdiercellen24,25; het is echter niet op grote schaal toegepast op S. pombe mitochondriën.

Gezamenlijk presenteren we hier een methode waarbij mitochondriën worden geïsoleerd uit S. pombe-cellen en de eiwitten van de mitochondriale ademhalingsketen worden onderworpen aan SDS-PAGE en BN-PAGE, gevolgd door immunoblotting. Het experimentele stroomschema wordt geïllustreerd in figuur 1. Met hoogwaardige mitochondriën en antilichamen kan deze methode beschreven in S. pombe ook worden toegepast op andere organismen om meer genen te identificeren met functies in de expressie en/of complexassemblage van mitochondriale respiratoire keteneiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Preparaat van S. pombe sferoplasten

  1. Kweek 1 L S. pombe-cellen in het gistextract met supplementen (YES) media (tabel 1) voor een bepaalde stam (WT of Δshy1) van OD600 = 0,05 tot OD600 = 1,0.
    OPMERKING: Laat de S. pombe-cellen met OD600 niet meer dan 2.0 groeien, omdat ze moeilijk te verteren zijn door lytische enzymen om sferoplasten te vormen. Zowel wild-type (WT) als genmutante stammen kunnen parallel worden gekweekt om vergelijkbare resultaten te verkrijgen.
  2. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 500 ml ddH2O en de pelletcellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C. Cellen 1x wassen.
  3. Meet het natte gewicht van de celpellet (ongeveer 2 g voor 1.000 OD600 cellen). Resuspendeer cellen in 8 ml 1x S-buffer (tabel 2; 4 ml S-buffer/g-cellen). Voeg dithiothreitol (DTT) toe aan 10 mM en fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) aan 1 mM vers.
  4. Voeg lytische enzymen toe aan de celsuspensie om de celwand van S. pombe te verteren. Draai in een shaker bij 30 °C gedurende de tijd die afhankelijk is van het gebruikte lytische enzym.
    OPMERKING: De juiste vertering van de celwand is een cruciale stap voor het isoleren van mitochondriën van hoge kwaliteit.
    1. Voeg voor het lysing-enzym 100 mg poeder per g nat gewicht van de cellen toe en incubeer gedurende ongeveer 2 uur. Voeg voor de Lyticase 10 mg poeder per g nat gewicht toe en incubeer gedurende ongeveer 1 uur. Voeg voor de Zymolyase-20T/100T 5 mg/1 mg poeder per g nat gewicht toe en incubeer gedurende ongeveer 1 uur. Voeg voor de Lallzyme MMX 1 g poeder per g nat gewicht toe en incubeer gedurende ongeveer 0,5 uur. Voeg voor het enzym Vinotaste 1 g poeder per g nat gewicht toe en incubeer gedurende ongeveer 2 uur.
  5. Observeer de vorming van sferoplasten door middel van microscopie (40x objectief). Neem 20 μL celsuspensie in S-buffer en voeg toe aan 1 ml ddH2O, zorg ervoor dat de meeste cellen kapot zijn (Figuur 2C).
    OPMERKING: De normale S. pombe-cellen hebben staafvormen (Figuur 2A). Meer dan 80% van de sferoplasten in de S-buffer zou na efficiënte vertering rond moeten worden (Figuur 2B).
  6. Pelletsferoplasten door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C. Resuspendeer sferoplasten in 8 ml ijskoude 1x S buffer en was 2x. Resuspendeer sferoplasten voorzichtig met behulp van pipetten met afgesneden punten.

2. Mechanische homogenisatie van S. pombe sferoplasten

  1. Resuspendeer sferoplasten in 8 ml ijskoude 1x homogenisatiebuffer (Tabel 3; 4 ml homogenisatiebuffer/g-cellen) met 1x proteaseremmers. Breng de cellen over naar een voorgekoelde glazen homogenisator (Dounce tissue grinder met een stamper en een reageerbuis).
  2. Homogeniseer cellen mechanisch door ongeveer 15 slagen op en neer te maken met de nauwsluitende stamper. Om te voorkomen dat mitochondriale eiwitten worden afgebroken, vermijdt u bellen tijdens beroertes en broedt u de homogenisatiebuffer en homogenisator altijd op ijs.
    OPMERKING: Er zijn twee soorten stampers die goed en los in de reageerbuis passen. Als een losse stamper wordt gebruikt, kunnen tot 25 slagen nodig zijn. Het aantal slagen moet worden geoptimaliseerd omdat te veel slagen de mitochondriale membranen kunnen beschadigen en te weinig slagen de mitochondriale opbrengst verminderen.
  3. Controleer het kapotte celmembraan in sferoplasten met een microscoop (40x objectief).
    OPMERKING: De meeste sferoplasten verliezen hun brekingsvorm en worden spookcellen in een homogenisatiebuffer. De mitochondriën zijn nog intact.

3. Isolatie van de mitochondriën van S. pombe door centrifugeren

  1. Breng de gehomogeniseerde suspensie over naar centrifugebuisjes en pellets ongebroken cellen en puin door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C.
  2. Centrifugeer het resulterende supernatans gedurende 5 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C en pelletkernen. Herhaal deze stap 1x totdat er geen pelletvorming meer is.
  3. Breng het bovenstaande over in nieuwe centrifugebuisjes en pelletmitochondriën en andere verontreinigde organellen door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
  4. Decanteer supernatans en suspendeer de pellet in 1 ml ijskoude 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) buffer (Tabel 4). Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C om de mitochondriën te wassen.
  5. Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude 1x SEM-buffer en verdeel de mitochondriën voor toekomstige experimenten.
    LET OP: Deze pellet bevat ruwe mitochondriën. Het kan worden opgeslagen bij -80 °C voor SDS-PAGE- en BN-PAGE-experimenten later. De ruwe mitochondriën kunnen ook worden gezuiverd door ultracentrifugatie van de sucrosedichtheidsgradiënt voor andere experimentele doeleinden.

4. SDS-PAGE en immunoblotting van eiwitten van de mitochondriale ademhalingsketen

  1. Meet de totale eiwitconcentratie van een mitochondriaal aliquot met behulp van een BCA-eiwitkwantificeringskit door de mitochondriënsuspensie ongeveer 25-voudig te verdunnen.
  2. Voeg SDS-PAGE laadbuffer toe aan 40 μL mitochondriale totale eiwitten. Denatureer eiwitten door gedurende de aangegeven tijd op de juiste temperatuur te incuberen.
    1. Om S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 en Atp6 te detecteren, denatureert u mitochondriale eiwitten bij 45 °C gedurende 3 minuten. Om S. pombe Cox2 en Hsp60 te detecteren, denatureren mitochondriale eiwitten bij 90 °C gedurende 5 minuten.
  3. Laad ongeveer 20 μg (ongeveer 4 μL) mitochondriale eiwitten in de 12% SDS-PAGE-gel. Voer immunoblotting uit van eiwitten van de mitochondriale ademhalingsketen met de juiste antilichamen zoals beschreven in stap 615.
    OPMERKING: S. pombe Cob1-, Cox1-, Cox2-, Cox3- en Atp6-eiwitten worden gecodeerd door mtDNA, wat moeilijk te bewerken is zoals taggen met een gemeenschappelijke epitoop, zelfs in S. pombe. Er zijn dus specifieke antilichamen nodig om deze eiwitten te detecteren. Om de zuiverheid en integriteit van de geïsoleerde mitochondriën te verifiëren, kunnen deze eiwitten van de ademhalingsketen tegelijkertijd worden getest in het supernatant, dat cytoplasmatische en nucleaire eiwitten moet bevatten. Omgekeerd kunnen de representatieve cytoplasmatische en nucleaire eiwitten zoals actine en histon H3 in het mitochondriënmonster worden getest.

5. Voorbereiding van mitochondriaal monster voor BN-PAGE

  1. Pelletmitochondriën uit eerdere aliquots in stap 3.5 door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C. Gebruik 2 mg mitochondriale eiwitten (ongeveer 400 μL mitochondriale aliquots) voor BN-PAGE-analyse.
  2. Resuspendeer de mitochondriën in 200 μL 3x BN-PAGE gelbuffer (1,5 M 6-Aminocaproice zuur; 150 mM Bis-Tris, pH 7,0, aangepast met HCl). Voeg 2 μL 100x PMSF en 1 μL 1 M MgCl2 toe. Centrifugeer de suspensie gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
  3. Resuspendeer de mitochondriënpellet in 160 μl 5% (m/v) digitonine (DG) of 64 μl 5% (m/v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). Incubeer 30 minuten op ijs en meng voorzichtig om de 10 minuten.
    1. Voor de eerste proeven in S. pombe, voeg 4 mg DG detergent per mg mitochondriale eiwitten toe om mitochondriale membranen op te lossen om supercomplexen van de ademhalingsketen te behouden. Voeg 1,6 mg DDM-wasmiddel per mg mitochondriale eiwitten toe om de afzonderlijke mitochondriale ademhalingsketencomplexen te scheiden. Pas de concentratie van DG- en DDM-behandeling aan door 2-voudig te verhogen of te verlagen, afhankelijk van de eerste resultaten van verschillende eiwitcomplexen in BN-PAGE.
  4. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 20.000 x g bij 4 °C. Breng het bovenstaande over en meet de opgeloste eiwitconcentratie met de BCA-kwantificeringskit.
  5. Voeg 80 μL (1/2 wasmiddelvolume) 3x BN-PAGE-monsterbuffer (Tabel 5) toe aan ongeveer 160 μL DG-behandeld supernatans of voeg 32 μL (1/2 wasmiddelvolume) 3x BN-PAGE-monsterbuffer toe aan ongeveer 64 μL DDM-behandeld supernatant.
    OPMERKING: In tegenstelling tot SDS-PAGE kunnen de eiwitmonsters voor BN-PAGE niet worden gedenatureerd door koken.

6. BN-PAGE en immunoblotting van mitochondriale ademhalingsketencomplexen

  1. Monteer de geprefabriceerde inheemse Bis-Tris-gel (3%-12% gradiënt). U kunt ook de handgemaakte inheemse Bis-Tris-gel (3%-12% gradiënt) bereiden door 3% en 12% BN-PAGE-gel (tabel 6) te mengen in een gradiëntmixer.
  2. Laad DG- of DDM-behandelde eiwitmonsters en de eiwitmarker met hoog moleculair gewicht voor native PAGE.
    1. In totaal zijn 100 μg opgeloste mitochondriale eiwitten nodig voor BN-PAGE-analyse van mitochondriale ademhalingsketencomplexen. Laad ongeveer 12 μL DG-behandeld eiwitmonster of 5 μL DDM-behandeld eiwitmonster in de BN-PAGE-gel. Pas het laadvolume aan om ervoor te zorgen dat de intensiteit van de belastingscontrole, zoals mitochondriaal matrixeiwit Mcp60 (Hsp60), gelijk is aan alle monsters na de laatste belichting15.
  3. Laat de gel ongeveer 30 minuten draaien op een constante spanning/stroom van 80 V/6 mA met behulp van een kathodebuffer met 0,02% (w/v) Coomassie G-250. Vervang vervolgens de blauwe kathodebuffer door de kathodebuffer zonder Coomassie G-250 en blijf ongeveer 3 uur met een constante stroom van 10 mA draaien totdat het blauwe kleurstoffront van de Coomassie G-250 de gelbodem bereikt.
    1. Om te voorkomen dat mitochondriale ademhalingsketencomplexen afbreken of uit elkaar vallen, laat u de gel met voorgekoelde buffers op 4 °C lopen. Gebruik voor de prefab gel de prefab loopbuffer. Gebruik voor de handgemaakte gel de 1x BN-PAGE anode running buffer (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, aangepast met HCl) en 1x BN-PAGE kathode running buffer (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, aangepast met HCl; 50 mM Tricine).
  4. Snijd de gelbaan af die beladen is met eiwitmarker. Bevlek de marker met Coomassie R-250 buffer gedurende 15 min. Vlekken verwijderen totdat de markering zichtbaar is.
    OPMERKING: De eiwitmarker met hoog moleculair gewicht voor native PAGE is niet voorgekleurd. Het zal zichtbaar zijn na kleuring met Coomassie R-250.
  5. Dompel het andere deel van de gel onder in de 1x BN-PAGE overdrachtsbuffer (Tabel 7) voor het balanceren van 30 min. Spoel het PVDF-vlekmembraan van 0,45 μm van dezelfde grootte af met 100% methanol en dompel het 10 minuten onder in de BN-PAGE-overdrachtsbuffer voor balancering. Breng eiwitten in de gel over op een PVDF-blotmembraan van 0,45 μm onder een constante stroom van 300 mA gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Het nitrocellulose (NC) membraan wordt niet aanbevolen, omdat het NC-membraan de Coomassie G-250-kleurstof zeer stevig bindt.
  6. Spoel het PVDF-membraan af met 100% methanol om de blauwe kleurstof Coomassie G-250 uit te wassen. Incubeer het PVDF-membraan in de 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, aangepast met HCl; 150 mM NaCl) gebaseerde blokkeerbuffer met 5% (w/v) magere melk gedurende 1 uur bij 25 °C.
  7. Incubeer het PVDF-membraan met de geïndiceerde primaire antilichamen tegen S. pombe mitochondriale ademhalingsketencomplexen 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: De concentratie van Cob1-antilichaam voor het detecteren van complex III is 1: 1.000. De concentratie van Cox1-antilichaam voor het detecteren van complex IV is 1: 2.000. De concentratie van Atp6-antilichaam voor het detecteren van complex V is 1: 200.
  8. Was het PVDF-membraan met 1x TBST-buffer (Tabel 8). Incubeer het PVDF-membraan met het secundaire antilichaam in een concentratie van 1: 10.000 gedurende 1 uur bij 25 °C.
  9. Was het PVDF-membraan met 1x TBST-buffer. Belicht en scan het PVDF-membraan. Lijn het belichte beeld van de BN-PAGE-gel uit met het beeld van de natieve eiwitmarker om het molecuulgewicht van mitochondriale ademhalingsketencomplexen en supercomplexen te schatten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We gebruikten dit protocol eerder om de effecten te onderzoeken van de deletie van shy1, de S. pombe-homoloog van humaan SURF1, op de expressie van mtDNA-gecodeerde respiratoire keteneiwitten en de assemblage van mitochondriale respiratoire ketencomplexen. We ontdekten dat de steady-state niveaus van Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 en Atp6 significant waren verlaagd in de Δshy1-stam (Figuur 3), wat aangeeft dat Shy1 nodig is voor d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van S. pombe-mitochondriën en het uitvoeren van SDS-PAGE en BN-PAGE om de expressie en complexassemblage van mitochondriale respiratoire keteneiwitten te analyseren.

Co-immunoprecipitatie (co-IP) wordt vaak gebruikt om de assemblage van eiwitcomplexen te detecteren; het is echter een uitdaging voor co-IP om de assemblage van mitochondriale membraaneiwitten te detecteren. In pla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Ying Huang en Dr. Ying Luo voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door subsidies (32270048 aan J.S. en 31900403 aan G.F.) van de National Natural Science Foundation of China.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6-Aminocaproic acidSangonA430196
Acrylamide/Bis (37.5: 1) 40% BiolabGS1374
Ammonium persulfateSangonA100486
Anti-Atp6 antibodyBioworldin-houseIB: 1:200
Anti-Cob1 antibodyBioworldin-houseIB: 1:1000
Anti-Cox1 antibodyBioworldin-houseIB: 1:2000
Anti-Cox2 antibodyBioworldin-houseIB: 1:1000
Anti-Cox3 antibodyBioworldin-houseIB: 1:200
Anti-Hsp60 antibodyBioworldin-houseIB: 1:3000
BCA Protein Quantification KitLEAGENEPT0001
Bis-TrisYEASEN60105ES25
Coomassie Brilliant Blue G-250SERVA17524.01
Coomassie Brilliant Blue R-250SangonA100472
DigitoninSigmaD141
D-SorbitolSangonA100691
EDTASolarbioE8030
Gradient mixerMillet scientificMGM-50
HEPESSolarbioH8090
High molecular weight protein marker for native PAGEReal TimesRTD6142
IgG-Alexa Fluor Plus 800 (anti-rabbit secondary antibody)Thermo FisherA32735IB: 1:10000
Immobilon-FL 0.45 μm PVDF membraneMilliporeIPFL00005
Kimble Kontes Dounce tissue grinderThermo FisherK8853000015
KOHSangonA610441
Lallzyme MMXLallemandN.A.
Lysing enzymeSigmaL3768
LyticaseSigmaL4025
MgCl2SangonA601336
MOPSSangonA421333
Native Bis-Tris Gels (precast)SolarbioPG41510-N
PMSFSangonA610425
Precast Gel Running buffer for Native-PAGESolarbioPG00020-N
Protease inhibitor cocktail for yeast extractsBeyotimeP1020
SucroseSangonA610498 
TEMEDSigmaT9281
TricineSigmaT0377
Tween-20SolarbioT8220
VinotasteNovozymesN.A.
ZymolyaseMP Biomedicals320921

Referenties

  1. Schatz, G. Getting mitochondria to center stage. Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).
  2. Schapira, A. H. Mitochondrial disease. Lancet. 368 (9529), 70-82 (2006).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: an overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Res. 18 (5), (2018).
  5. Kühl, I., Dujeancourt, L., Gaisne, M., Herbert, C. J., Bonnefoy, N. A genome wide study in fission yeast reveals nine PPR proteins that regulate mitochondrial gene expression. Nucl Acid Res. 39 (18), 8029-8041 (2011).
  6. Uehara, L., et al. Multiple nutritional phenotypes of fission yeast mutants defective in genes encoding essential mitochondrial proteins. Open Biol. 11 (4), 200369(2021).
  7. Mori, A., et al. In fission yeast, 65 non-essential mitochondrial proteins related to respiration and stress become essential in low-glucose conditions. Rl Soc Open Sci. 10 (10), 230404(2023).
  8. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  9. Rich, P. R., Maréchal, A. The mitochondrial respiratory chain. Essays Biochem. 47, 1-23 (2010).
  10. Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Semin Cell Dev Biol. 76, 179-190 (2018).
  11. Guan, S., Zhao, L., Peng, R. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes: From Structure to Function. Int J Mol Sci. 23 (22), 13880(2022).
  12. Luttik, M. A. H., et al. The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 Genes Encode Separate Mitochondrial NADH Dehydrogenases Catalyzing the Oxidation of Cytosolic NADH. J Biol Chem. 273 (38), 24529-24534 (1998).
  13. Li, W., et al. Yeast AMID Homologue Ndi1p Displays Respiration-restricted Apoptotic Activity and Is Involved in Chronological Aging. Mol Biol Cell. 17 (4), 1802-1811 (2006).
  14. Malecki, M., Bähler, J. Identifying genes required for respiratory growth of fission yeast. Wellcome Open Rese. 1, 12(2016).
  15. Luo, Y., Xu, Y., Ahmad, F., Feng, G., Huang, Y. Characterization of Shy1, the Schizosaccharomyces pombe homolog of human SURF1. Sci Rep. 14 (1), 21678(2024).
  16. Wang, Y., Feng, G., Huang, Y. The Schizosaccharomyces pombe DEAD-box protein Mss116 is required for mitoribosome assembly and mitochondrial translation. Mitochondrion. 76, 101881(2024).
  17. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of Mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Meth Mol Biol. 1567, 33-42 (2017).
  18. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of Mitochondria from Yeast Cells. J Vis Exp. (30), e1417(2009).
  19. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  20. Schägger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Meth Enzymol. 260 (C), 190-202 (1995).
  21. Schägger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Meth Cell Biol. (65), 231-244 (2001).
  22. Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  23. Lemaire, C., Dujardin, G. Preparation of respiratory chain complexes from Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutant mitochondria activity measurement and subunit composition analysis. Meth Mol Biol. 432, 65-81 (2008).
  24. Konovalova, S. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting. J Vis Exp. (144), e59269(2019).
  25. Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J Vis Exp. (48), e2164(2011).
  26. Flor-Parra, I., Zhurinsky, J., Bernal, M., Gallardo, P., Daga, R. R. A Lallzyme MMX-based rapid method for fission yeast protoplast preparation. Yeast. 31 (2), 61-66 (2014).
  27. Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina. Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Mitochondriële eiwitexpressieBlue Native PAGESDS-PAGEisolatie van mitochondriënsupercomplexen van de ademhalingsketenimmunoblottingmitochondriën van splijtende gist
Analyse van de expressie en complexassemblage van de mitochondriale respiratoire keteneiwitten in de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.