Dit is deel één van een uitgebreid Xenopus-bemonsteringsprotocol . De bemonsterde weefsels zijn de hartventrikel, de arteriële stam, de linker leverkwab, de galblaas, de long, de alvleesklier, de milt, het strottenhoofd, de slokdarm, de maag, de darmen, de teelballen, de vetlichamen, de eileider, de gepaarde nieren, de ischiasplex, de huid, de thymus en het hele oog.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte technieken voor uitgebreide bemonstering van toegankelijke weefsels bij volwassen Xenopus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Xenopus is al lang een cruciaal modelorganisme voor het onderzoeken van de ontwikkeling en ziekte van gewervelde dieren, en biedt diepgaande inzichten in cellulaire processen en genfunctie. Ondanks de schat aan informatie over embryonale Xenopus, blijft er een aanzienlijke kloof bestaan in gestandaardiseerde methoden voor weefselbemonstering bij volwassenen, vooral voor moderne benaderingen zoals kwantitatieve proteomics. Deze studie introduceert een uitgebreid protocol voor snelle, nauwkeurige en efficiënte bemonstering van meerdere weefsels bij volwassen Xenopus. Het protocol pakt de uitdagingen aan die verband houden met de subtiele anatomische verschillen in vergelijking met andere anuranen, en zorgt voor reproduceerbaarheid, zelfs voor mensen met beperkte ervaring in kikkerdissectie. Dit protocol is geoptimaliseerd voor hoogwaardige biochemische analyses door prioriteit te geven aan de versheid van het monster. We faciliteren de snelle afname van maximaal 18 weefsels binnen een uur. Bovendien zijn de methoden van toepassing op geperfuseerde en niet-geperfuseerde omstandigheden, waardoor flexibiliteit wordt geboden voor een reeks experimentele behoeften. Dit werk vult niet alleen een kritieke methodologische leemte voor Xenopus laevis en tropicalis , maar dient ook als een waardevolle bron voor onderzoekers die technieken aanpassen aan vergelijkbare amfibieënmodellen, waardoor de reikwijdte en betrouwbaarheid van vergelijkende biologische en evolutionaire studies wordt vergroot.
Inleiding
Xenopus biedt unieke voordelen ten opzichte van muizen, zebravissen en andere modelorganismen voor het bestuderen van ziekten bij de mens, met name in ontwikkelings- en evolutionaire contexten. De externe embryonale ontwikkeling en grote, gemakkelijk manipuleerbare embryo's maken real-time observatie en experimentele interventies mogelijk (bijv. weefseltransplantatie, genbewerking) die uitdagend zijn bij muizen, die zich intern ontwikkelen en invasieve procedures vereisen. Bovendien bieden de driekamerige hart- en tetrapod-ledematen van Xenopus een meer directe evolutionaire brug voor het bestuderen van aangeboren afwijkingen1, regeneratie van ledematen2 en hartontwikkeling3. In tegenstelling tot muizen kunnen Xenopus-kikkervisjes ledematen en organen regenereren, waarbij regeneratieve processen worden gemodelleerd die afwezig zijn bij zoogdieren, terwijl hun aquatische levensfase niet-invasieve studie van milieu- of toxine-effecten mogelijk maakt. Gecombineerd met snellere kweek, lagere kosten en minder ethische beperkingen, is Xenopus superieur voor high-throughput, mechanistische studies van organogenese en stressreacties die moeilijk te repliceren zijn in zoogdiersystemen.
Dit artikel heeft tot doel duidelijke richtlijnen te bieden voor nauwkeurige en reproduceerbare orgaanbemonstering van volwassen Xenopus-weefsels, zoals beschikbaar is voor Xenopus-kikkervisjes 4. Hoewel er een "digitale dissectie"5 en "micro-CT-beeldvorming"6 van volwassen Xenopus beschikbaar is, blijft het moeilijk om consistente orgaan- en weefselbemonstering te bereiken bij volwassen Xenopus zonder de gedetailleerde instructies voor andere volwassen modellen, zoals muizen 7,8,9.
Hoewel er een monstergids voor zes cruciale weefsels beschikbaar is10, is er momenteel geen specifieke en uitgebreide dissectie- en bemonsteringsgids voor Xenopus beschikbaar. Er bestaat een uitgebreide dissectiegids voor Rana sp.11 en er zijn verschillende dissectiehandleidingen in de klas beschikbaar voor andere anuranen12, maar voor personen die geen ervaring hebben met bemonsteringstechnieken of de anatomie van amfibieën, maken de subtiele verschillen tussen Xenopus en andere anuranen de bestaande middelen ontoereikend voor consistente en reproduceerbare weefselbemonstering.
Deze gids is ontwikkeld om prioriteit te geven aan weefselversheid voor proteomics en immunochemie. Voor een ervaren gebruiker kunnen alle weefsels in minder dan een uur bij één persoon worden verzameld. Het wordt aanbevolen dat als een gebruiker geen ervaring heeft, hij dit protocol probeert op exemplaren die om andere redenen zijn geëuthanaseerd voordat hij een dier offert dat moeilijker te vervangen is.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten zijn goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3). Als perfusieprotocol13 wordt gevolgd voorafgaand aan de bemonstering, ga dan verder met stap 2.3.
1. Bereiding (zonder perfusie)
- Zorg ervoor dat de onderzoeksinstelling de euthanasietechniek die in dit protocol wordt beschreven, heeft goedgekeurd.
- Bereid een oplossing van 5 g/l MS-222 (tricaïne methaansulfonaat) en 5 g/l natriumbicarbonaat (zie materiaaltabel). Controleer de pH om er zeker van te zijn dat deze ≥7 is.
OPMERKING: Het volume moet groter zijn dan het volume dat nodig is om de dieren die worden geëuthanaseerd volledig te bedekken. - Voer primaire euthanasie uit door de Xenopus in de MS-222-oplossing te plaatsen (vanaf stap 1.2), waarbij het dier in totaal 1 uuren 14 uur onder water blijft.
- Plaats het dissectieoppervlak (bak of schuimplaat) op een helling in een secundaire container of plaats deze op een andere manier om de bloedafvoer te vergemakkelijken.
- Zodra de kikker 1 uur in de oplossing heeft gelegen, is de primaire euthanasie voltooid. Verwijder de kikker en controleer het verlies van de pijnrespons door een voetknijp uit te voeren.
- Noteer de leeftijd (indien bekend), het geslacht en de gezondheidstoestand van het dier dat wordt bemonsterd, en of het geperfundeerd is. Weeg de Xenopus af en voer eventuele aanvullende metingen uit voordat u de bemonstering uitvoert.
- Leg de kikker op zijn rug en speld de voorpoten proximaal van het lichaam vast (Figuur 1A).
- Knip met een dissectieschaar door de huid, langs de middellijn en vervolgens zijwaarts, maak twee flappen.
- Identificeer de linea alba (Figuur 1B). Gebruik een tang om de linea alba vast te pakken en weg te trekken van de coelomische holte. Gebruik voorzichtig een schaar om naar het hoofd te knippen, door de spieren. Maak twee flappen uit de spouwmuur en knip of speld alle flappen uit de weg.
- Identificeer het hart, dat nog steeds moet kloppen. Als het hart niet gemakkelijk toegankelijk is, gebruik dan een ontleedschaar om de coracoïde botten te verkleinen (Figuur 1B).
OPMERKING: Als het hart is gestopt met kloppen voordat de bemonstering is genomen, is de versheid van het monster aangetast. - Vul desgewenst het snelle perfusieprotocol9 in.
2. Bemonstering
OPMERKING: Als het dier een perfusie heeft gekregen, ga dan verder met stap 2.3. Alle marges moeten ongeveer 25 mm groot zijn. Pincet en schaar moeten tussen de monsters worden schoongeveegd of vervangen. Alle weefsels moeten binnen 1 uur na euthanasie worden bemonsterd, voor maximale versheid.
- Spoel met behulp van een transferpipet de coelomische holte met gekoelde PBS of 0,7x PBS15 om het bloed te klaren en het zicht te behouden.
- Identificeer het dunne hartzakje (Figuur 2A) en trek het strak met een weefseltang. Perforeer deze voorzichtig met de punt van de iridectomieschaar en zorg ervoor dat u de onderliggende weefsels niet doorsnijdt. Trek het hartzakje los, weg van de drie kamers van het hart (Figuur 2B).
- Knip de oorschelpen weg door ze af te snijden waar ze de ventrikel en de arteriële stam raken.
- Gebruik een tang om het ventrikel bij de top vast te pakken en snijd het af tot onder waar het de arteriële stam raakt, waarbij er een marge overblijft (Figuur 2C).
- Inspecteer het ventrikel visueel onder vergroting om er zeker van te zijn dat er geen ongewenste weefsels zijn bevestigd.
OPMERKING: Het midden van de ventrikel kan lichtgekleurd spiraalvormig klepweefsel bevatten; Dit mag bewaard worden. Bij niet-geperfundeerde dieren kan het verwijderen van het ventrikel kwalificeren als secundaire euthanasie (ook wel terminale anesthesie genoemd). - Spoel de weefselmonsters onmiddellijk na bemonstering af in gekoelde PBS of 0,7x PBS, afhankelijk van de experimentele behoeften15.
OPMERKING: Bij geperfuseerde dieren wordt verwacht dat alle weefsels, met uitzondering van de lever, schoon worden gespoeld. Als dit niet het geval is, moet er een aantekening worden gemaakt. In niet-geperfundeerde weefsels zijn alle spoelmedia verzadigd met bloed. Stappen 2.5-2.6 moeten worden gevolgd nadat elk weefsel is bemonsterd. - Merk op dat de arteriële stam zich splitst in twee aortastammen (ook wel laterale aortae genoemd) en dat elk zich splitst in drie arteriële bogen (Figuur 2D). Trek de arteriële stam strak en snijd de aortastammen onmiddellijk door waar deze bogen splitsen.
- Observeer de drie lobben van de lever (Figuur 3A). Pak de lip van de linkerkwab (rechts van de kijker) vast en til deze voorzichtig op zodat de lever- en cystische kanalen zichtbaar zijn. Bemonster de onderste 2/3 van de lob, onder deze hulpstukken (Figuur 3B).
- Identificeer de galblaas, die drastisch in kleur kan variëren. Pak de galblaas vast, trek deze weg van de rechterkwab van de lever en verbreek de aanhechting (Figuur 3C). Als het niet barst, scheur het dan met een iridectomieschaar.
- Pak de top van de long vast en trek deze strak. Let op de textuur van de longblaasjes en bepaal waar die textuur eindigt en de bronchiën beginnen. Snijd in deze marge (Figuur 3D). Als de long is versmolten met het buikvlies, maak deze dan voorzichtig los.
- Identificeer de eierstok, die is omhuld door een laag visceraal peritoneum die het kiemepitheel wordt genoemd. Verschuif de lobben voorzichtig totdat ze zich aan hun respectievelijke zijden bevinden om het bevestigingsgebied zichtbaar te maken (Figuur 4A); Deze aanhechtingen bevinden zich direct ventrale van de gepaarde nier. Verwijder met een schaar de eierstokken zo dicht mogelijk bij de nieren, zonder ze te beschadigen (Figuur 4B). Als er tijdens dit proces eicellen uitlekken, bemonster ze dan en spoel ze vervolgens af.
OPMERKING: Het verwijderen van de eierstok is nuttig om betere toegang te krijgen tot de weefsels van een vrouwelijke kikker. - Inspecteer de voorkwab (ook wel de mediane kwab genoemd) van de lever en merk op hoe deze via het mesenterium verbonden is met de maag en de twaalfvingerige darm (Figuur 3A en Figuur 4C). Snijd het mesenterium en het hepatoduodenale ligament door met behulp van een iridectomieschaar. De resterende vlezige massa is de alvleesklier en de gemeenschappelijke galwegen.
- Verbreek de verbinding van de alvleesklier en de gemeenschappelijke galwegen met de voorkwab van de lever, zodat er een marge overblijft. Pak de maag vast met een getande tang en het ene uiteinde van de alvleesklier met een weefseltang. Plaag onder vergroting de alvleesklier voorzichtig van de maag (Figuur 4D).
- Mocht de alvleesklier niet netjes loskomen, verwijder dan het resterende pancreasweefsel. U kunt de alvleesklier ook methodisch losmaken met behulp van een iridectomieschaar en een weefseltang.
OPMERKING: Naast de gemeenschappelijke galwegen wordt verwacht dat er wat mesenterium en de ductus pancreaticus in dit monster zullen worden opgenomen.
- Mocht de alvleesklier niet netjes loskomen, verwijder dan het resterende pancreasweefsel. U kunt de alvleesklier ook methodisch losmaken met behulp van een iridectomieschaar en een weefseltang.
- Identificeer de milt en bemonster deze door de aanhechting aan het peritoneum door te knippen (Figuur 4E).
- Verwijder het resterende leverweefsel en gooi het weg.
- Verwijder de andere long en de resterende bronchiën waar ze aan het strottenhoofd hechten. Pak het strottenhoofd bij het onderste uiteinde vast en begin het uit de holte te tillen en snijd duidelijke aanhechtingen door zodra ze duidelijk worden.
- Naarmate het strottenhoofd wordt opgetild, zal de aanhechting aan de slokdarm merkbaar worden. Schil en knip het slokdarmweefsel voorzichtig weg van het strottenhoofd met behulp van een gebogen iridectomieschaar (Figuur 5A). Trek vervolgens het strottenhoofd naar beneden en knip het weg van de mondholte. Knip alle doorzichtige hulpstukken die zichtbaar worden.
- Let op de kromming van de maag, die deze onderscheidt van de slokdarm, evenals de pylorusbeperking die de maag van de darmen onderscheidt (Figuur 5B). Snijd het spijsverteringskanaal direct voor de kromming van de maag door en scheidt het van de slokdarm.
- Open de mond en identificeer de gedeelde opening van de buis van Eustachius op het dak16. Trek met de mond open aan de slokdarm om de aanhechting op te merken (Figuur 5C). Til de slokdarm uit de holte en snijd onderweg doorzichtige aanhechtingen door. Snijd de slokdarm af van de mondholte direct onder de opening van Eustachius.
- Pak de maag vast en snijd deze door waar deze de twaalfvingerige darm raakt, bij de pylorusbeperking (Figuur 5A,B).
- Trek de dikke darm strak en snijd deze zo dicht mogelijk bij de cloaca af (Figuur 5D). Trek de darmen eruit en verbreek alle doorzichtige peritoneale aanhechtingen.
- Als de kikker een mannetje is, identificeer dan de teelballen en verwijder er een met een iridectomieschaar, waarbij u ervoor zorgt dat u de onderliggende nier niet beschadigt (Figuur 6A).
- Plaag de dikke lichamen uit elkaar zodat ze op hun respectievelijke kanten liggen; Het gebied boven de nier, waar het vetlichaam aansluit op het buikvlies, zal zichtbaar zijn. Pak de basis van een van beide vetlichamen vast en gebruik een schaar om deze weg te knippen van het buikvlies, zodat er een marge overblijft (Figuur 6B).
- Identificeer en verwijder de urineblaas en snijd zo dicht mogelijk bij de cloaca (Figuur 6C).
- Als de kikker een vrouwtje is of een duidelijke rudimentaire eileider heeft, pak dan het onderste uiteinde van de eileider vast, trek het weg van de cloaca en snijd het zo dicht mogelijk bij de cloaca af (Figuur 6D). Trek de eileider uit de coelomische holte en verbreek alle peritoneale aanhechtingen zodra ze zichtbaar worden (Figuur 6E).
- Verwijder en gooi de resterende vetlichamen en teelballen of eileider weg.
- Gebruik een tang om de nieren aan hun onderste basis vast te pakken en merk op dat ze bedekt zijn door het heldere peritoneum (retroperitoneaal)17. Snijd het buikvlies aan de basis van de nier door (Figuur 7A) en til vervolgens de nieren uit de coelomische holte (Figuur 7B), waarbij u het buikvlies indien nodig met een schaar doorsnijdt.
- Snijd onder vergroting het overtollige buikvlies en eventueel achtergebleven vetlichaam, eierstok of teelbalweefsel weg.
- Observeer de bundel perifere zenuwen die het eindpunt van de wervelkolom aan elk been bevestigen; Dit is de plexus ischias. Pak de zenuwbundel vast met een tang en snijd ze door waar ze de coelomische holte verlaten (Figuur 7C). Til de bundel uit de holte en snijd deze door waar de zenuwen de wervelkolom verlaten (Figuur 7D).
- Verwijder de pinnen van het dier, draai het op zijn ventrum en speld de ledematen van het dier opnieuw vast. Selecteer een van de achterpoten om van te bemonsteren en speld de voet van die ledemaat vast.
- Verwijder een amandelvormige huidflap van over de gastrocnemius/tibiofibula (Figuur 8A,B).
- Pak de huid van de rug vast en snijd zijwaarts door, zodat er een doorlopende snede is rond het middengedeelte van het dier (Figuur 8C).
- Verwijder de pinnen, zet de poten in één hand vast en pak de voorste dorsale huid vast met een getande tang. Onthuid het dier door de rughuid met kracht omhoog te trekken over het hoofd en de armen (Figuur 8D).
- Identificeer de vetmassa die het kaakgewricht bedekt, snijd de achterste rand van de massa af van waar deze is versmolten met roze spierweefsel en gebruik vervolgens een iridectomieschaar om deze weg te knippen van het onderliggende bot (Figuur 9A). Afhankelijk van de leeftijd en volwassenheid van het dier zal een cluster van melanoforen zichtbaar worden (Figuur 9B). Knip de massa af zodat er geen spieraanhechtingen of kraakbeen vastzitten.
- Herkauw het dier en selecteer een oog. Steek een gebogen iridectomieschaar in de baan rond de kromming van het oog (Figuur 9C). Snijd voorzichtig rond het oog en snijd de spieraanhechtingen door.
- Schuif de schaar dieper in de oogkas en maak de oogzenuw los, achter het oog. Gebruik deze schaar om het oog uit de baan te halen en vervolgens eventuele spieraanhechtingen verder te verminderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door alle stappen van dit protocol te volgen, werden de hartventrikel, de arteriële romp, de linker leverkwab, de galblaas, de long, de alvleesklier, de milt, het strottenhoofd, de slokdarm, de maag, de darmen, de teelballen, de vetlichamen, de eileider, de gepaarde nieren, de heupplex, de huid, de thymus en het hele oog binnen een uur na euthanasie netjes weggesneden (zie Figuur 1, Figuur 2, Figuur ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen om flexibiliteit te bieden aan gebruikers op verschillende ervaringsniveaus en tegelijkertijd te zorgen voor het tijdig en efficiënt verzamelen van essentiële weefsels. Nieuwe gebruikers wordt geadviseerd om elke stap in het protocol te volgen zoals beschreven om de systematische verzameling van weefsels te garanderen. Meer ervaren gebruikers kunnen er echter voor kiezen om bepaalde stappen over te slaan en alleen de weefsels te bemonsteren d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de OD R24-subsidie van NIH ODO31956. We willen ook Samantha Jalbert en Jill Ralston bedanken voor hun hulp en steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 5x Vergrootglas met LED-licht en standaard | amazon.com | B08QJ6J8P1 | licht mag geen hitte produceren |
| Veelvoudige transferpipetten | VWR | 414004-036 | |
| Dissectietang met fijne punt | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Dissectie schaar met scherpe punt, recht 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissectielade | Fisher Scientific | 14-370-284 | Styrofoam platen zijn een acceptabel alternatief |
| Euthanasie container | US Plastic | Item 2860 | alternatieve ondoorzichtige containers zijn acceptabel |
| Euthanasie container deksel | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomieschaar 6" | VWR | 470018-938 | iris schaar is een acceptabel alternatief |
| MS-222: Syncaine (voorheen tricaïne) | Pentair AES | TRS1 | |
| Rattentandweefseltang 5,5 inch, roestvrij staal | Fisher Scientific | S08100 | |
| Natriumbicarbonaat, poeder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimentang, gekarteld | VWR | 82027-442 | |
| T-spelden voor dissectief | Fisher Scinetific | S99385 |
Referenties
- Duncan, A. R., Khokha, M. K. Xenopus as a model organism for birth defects—Congenital heart disease and heterotaxy. Semin Cell Biol. 51, 73(2016).
- Kawasumi-Kita, A., et al. hoxc12/c13 as key regulators for rebooting the developmental program in Xenopus limb regeneration. Nat Commun. 15, 3340(2024).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), (2017).
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Laznovsky, J., et al. Unveiling vertebrate development dynamics in frog Xenopus laevis using micro-CT imaging. Gigascience. 13, giae037(2024).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult Xenopus. J Vis Exp. (204), (2024).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a frog (Rana sp.). Atlas of animal anatomy and histology. , Springer. Cham. 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. J Vis Exp. (195), e65287(2023).
- AVMA guidelines for the euthanasia of animals. 37, 2020 edition, AVMA Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cell line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Mason, M., Wang, M., Narins, P. Structure and function of the middle ear apparatus of the aquatic frog, Xenopus laevis. Proc Inst Acoust. 31, 13-21 (2009).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Adamson, R. H. Permeability of frog mesenteric capillaries after partial pronase digestion of the endothelial glycocalyx. J Physiol. 428, 1-13 (1990).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio Protoc. 6 (4), e1733(2016).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetology: An Introductory Biology of Amphibians and Reptiles. , Academic Press. 35-81 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
