Methodenartikel

Toediening van Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) bij adolescente en volwassen muizen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68358

⸱

1 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Irvine, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) is het bedwelmende bestanddeel van cannabis en een gereguleerde stof in de Verenigde Staten. Dit artikel schetst standaardprocedures voor het verkrijgen, bewaren en toedienen van THC aan muizen die voldoen aan de huidige wettelijke voorschriften en introduceert in het kort een methode om de farmacodynamische basiseffecten van THC bij knaagdieren te beoordelen.

Samenvatting

Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) is verantwoordelijk voor de bedwelmende (psychotrope) effecten van cannabis en van cannabis afgeleide producten die momenteel verkrijgbaar zijn op de legale en illegale markten. De psychotrope effecten van THC worden geproduceerd door activering van CB 1-cannabinoïdereceptoren in de hersenen, die normaal gesproken worden ingeschakeld door endogene cannabinoïde (endocannabinoïde) stoffen. Buiten de hersenen draagt THC bij aan de regulatie van een breed scala aan fysiologische processen door CB1- en CB2-receptoren te activeren. De fysiologische functies van endocannabinoïde stoffen en cannabinoïde-receptoren - gezamenlijk bekend als het endocannabinoïde systeem - veranderen aanzienlijk gedurende het hele leven, waarbij de adolescentie een periode is van verhoogde gevoeligheid voor de bijdragen van dit signaalcomplex. Dit artikel beschrijft een protocol voor het bereiden van THC voor parenterale toediening en het beoordelen van de acute farmacodynamische effecten bij muizen van beide geslachten in twee ontwikkelingsstadia: adolescentie en jonge volwassenheid. Aan de hand van drie doses die veel worden gebruikt in de literatuur (1, 5 en 10 mg/kg) en de intraperitoneale route, worden de bekende effecten van THC-katalepsie-inductie, remming van de locomotorische activiteit en onderdrukking van nociceptie geïllustreerd. Gezien de status van THC als gereguleerde stof in de Verenigde Staten, worden bovendien de procedures voor het verkrijgen en bewaren ervan in overeenstemming met de huidige wetgeving kort geschetst.

Inleiding

De prevalentie van cannabisgebruik onder de volwassen bevolking van de Verenigde Staten is de afgelopen decennia voortdurend gestegen en bleef hoog in 2023. Van de volwassenen van 19 tot 30 jaar gaf ongeveer 42% aan het afgelopen jaar cannabis te hebben gebruikt, 29% in de afgelopen maand en 10% meldde dagelijks of quasi-dagelijks gebruik (20 of meer keer in de afgelopen 30 dagen)1. Voor volwassenen van 35 tot 50 jaar zijn de cijfers respectievelijk 29%, 19% en 8%. Hoewel deze schattingen statistisch niet verschillen van die van 2022, wijzen ze op stijgingen in de afgelopen 5 en 10 jaar voor beide demografische groepen1. Belangrijk is dat uit de huidige gegevens blijkt dat ongeveer 9% van de mensen die cannabis gebruiken tolerantie voor en afhankelijkheid van de drug ontwikkelen - een aandoening die bekend staat als cannabisgebruiksstoornis (SUD)2 en een potentieel gezondheidsrisico3.

Net als bij andere psychoactieve drugs, begint het cannabisgebruik meestal in de vroege tienerjaren en neemt het geleidelijk toe tijdens de adolescentie. In 2023 meldde 8% van de8e klassers in de Verenigde Staten, 18% van de10e klassers en 29% van de12e klassers dat ze het medicijn minstens één keer hadden gebruikt4. Hoewel ze de afgelopen jaren relatief stabiel zijn gebleven, zelfs in het licht van een verminderde risicoperceptie 5,6, blijven deze cijfers te hoog. Naast het wijdverbreide niet-medische gebruik, heeft cannabis therapeutisch potentieel getoond bij een reeks medische aandoeningen 7,8. Een synthetische vorm van het bedwelmende (psychotrope) bestanddeel, Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) (Figuur 1), wordt al meer dan 40 jaar gebruikt als voorgeschreven medicijn voor de behandeling van misselijkheid en verlies van eetlust bij HIV- en kankerpatiënten die chemotherapie ondergaan 9,10. Zowel THC als zijn analoge cannabidiol (CBD) (Figuur 1), die niet psychotroop is, zijn betrokken bij de behandeling van pijn, ontsteking en verschillende neurologische aandoeningen11,12. Daarom zorgt de snelle verspreiding van van medicinale cannabis afgeleide producten - bijvoorbeeld bij epilepsie en autisme bij kinderen - er ook voor dat nieuwe groepen jongeren aan de drug wennen. Deze ontwikkelingen zijn vooral zorgwekkend in een sociale context waarin wetswijzigingen en een bredere acceptatie financiële belangen aanwakkeren die voorrang kunnen hebben op de bezorgdheid over de volksgezondheid en veiligheid13.

THC-bevattende cannabis ('marihuana') wordt in verschillende vormen geconsumeerd, waaronder roken, verdampen, eetwaren, tincturen en oliën. Eenmaal ingenomen, verspreidt THC zich door het lichaam en komt het de hersenen binnen, waar het euforie, ontspanning, veranderde zintuiglijke waarneming en verhoogde eetlust veroorzaakt, hoewel het bij sommige mensen ook angst en paranoia kan veroorzaken14,15. THC interageert met het endocannabinoïde (ECB) systeem door twee soorten cannabinoïde (CB) receptoren te activeren die zich zowel binnen als buiten de hersenen bevinden15,16. In de hersenen, waar CB1-receptoren het meest voorkomen, beïnvloedt hun activering onder andere de stemming, pijnperceptie, eetlust en cognitie. THC activeert ook CB1- en CB2-receptoren in perifere organen en beïnvloedt het systemische energiemetabolisme - inclusief de inname, opname en opslag van voedingsstoffen - evenals het initiëren van pijn, ontsteking en immuniteit17,18.

THC heeft zowel acute als aanhoudende effecten, en aanvullend preklinisch en klinisch onderzoek naar de langetermijngevolgen van cannabisgebruik is nog steeds nodig. Speciale nadruk moet worden gelegd op de mogelijke bijwerkingen van hoge doses THC, aangezien de gemiddelde THC-concentratie in de cannabis die in de Verenigde Staten wordt verkocht, de afgelopen decennia is gestegen van 8,9% in 2008 tot 17,1% in 201719 en zelfs hoger in de afgelopen jaren. 'Krachtige cannabisproducten' (producten die hoge concentraties THC bevatten) zijn gebruikelijk op veel legale markten in de Verenigde Staten, waar het gemiddelde THC-gehalte in cannabisbloem 20-35% is, waarbij sommige extractieve producten tot 90% THC kunnen bereiken. Bij deze hoge doseringen kan THC kwalitatief andere effecten hebben dan die van de traditionele 'low-potentie cannabis' die in de jaren 1970 en 1980 werd gebruikt, die 6% THC of minder20 bevatte. Het begrijpen van de farmacologie van krachtige cannabisproducten is dus van cruciaal belang om preventieve strategieën te informeren en het regelgevende en fiscale beleid te sturen. Bovendien kan het begrijpen van hoe factoren zoals leeftijd, genetica en reeds bestaande aandoeningen individuele reacties op THC beïnvloeden, helpen om preventie en behandeling af te stemmen op specifieke populaties. Met name de gevolgen van cannabisgebruik door tieners en aanstaande moeders of moeders die borstvoeding geven, moeten verder worden onderzocht, aangezien blootstelling aan cannabinoïden tijdens prenatale/perinatale en adolescente perioden, waarin het ECB-systeem een belangrijke rol speelt in de neurologische ontwikkeling, kan leiden tot aanhoudende negatieve gevolgen21. Er is ook meer onderzoek nodig om te begrijpen hoe THC interageert met andere medicijnen of stoffen. Uitgebreide gegevens over de veiligheid en werkzaamheid van THC kunnen worden gebruikt als basis voor regelgevende beslissingen en volksgezondheidsbeleid, waardoor veilig gebruik in zowel medische als niet-medische contexten wordt gegarandeerd.

Hier schetsen we standaardprocedures voor het verkrijgen, bewaren en toedienen van THC in een laboratoriumomgeving in overeenstemming met de huidige wetgeving van de Verenigde Staten (de Controlled Substance Act van 1971). Aan de hand van drie THC-doses die in de wetenschappelijke literatuur veel worden gebruikt (1, 5 en 10 mg/kg)22 en de intraperitoneale (i.p.) toedieningsweg, werden drie klassieke effecten op THC geïllustreerd: inductie van catalepsie, remming van locomotorische activiteit en antinociceptie. Dit protocol kan ook worden gebruikt na meerdere THC-injecties om de gevolgen van chronisch THC-gebruik te bestuderen, wat leidt tot tolerantie en een reeks gevolgen voor de geestelijke gezondheid die doorgaans niet worden waargenomen bij acute toediening bij mensen.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de IACUC van de University of California, Irvine, en werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Procedures voor het verkrijgen en bewaren van THC

OPMERKING: In de Verenigde Staten vereist het gebruik van THC in een academische onderzoeksomgeving het volgen van verschillende stappen die worden vereist door de wettelijke status van cannabis. Zowel cannabis als van cannabis afgeleide THC worden geclassificeerd als Schedule I-gereguleerde stoffen. Om deze reden moeten onderzoekers, voordat cannabis of THC kan worden gekocht, een vergunning verkrijgen van de Drug Enforcement Administration (DEA). Hieronder vindt u een overzicht van dit proces, dat tot 6 maanden of langer kan duren.

  1. Bepalen van de reikwijdte van het onderzoek: Definieer het doel en de doelstellingen van het onderzoeksproces en geef aan waarom THC nodig is. Ontwikkel een onderzoeksprotocol waarin de benodigde hoeveelheden THC worden beschreven, de commerciële bron en hoe het zal worden behandeld en bewaard. Voeg zoveel mogelijk relevante details toe.
  2. Goedkeuring van de regelgevende instanties van de instelling ontvangen: Dien het onderzoeksvoorstel in bij de Animal Care and Use Committee (IACUC) (voor preklinisch werk) of de Institutional Review Board (IRB) (voor klinisch werk) van de lokale instelling. Deze beoordelingsstap beschermt de rechten van proefpersonen en zorgt ervoor dat het onderzoek voldoet aan ethische normen.
  3. Naleving van staatsvoorschriften: Houd rekening met eventuele staatsspecifieke voorschriften met betrekking tot cannabisonderzoek, aangezien deze aanzienlijk kunnen variëren. Verkrijg bijvoorbeeld in Californië goedkeuring van het Research Advisory Panel of California (RAPC)23.
  4. THC verkrijgen: Koop cannabis en THC van telers of fabrikanten die hiervoor een vergunning hebben.
    OPMERKING: Een lijst van erkende telers is beschikbaar op de website van de DEA. Het National Institute on Drug Abuse (NIDA) levert THC via het NIDA Drug Supply Program24. Om voor dit programma in aanmerking te komen, moet informatie worden verstrekt over een instelling, een gedetailleerd onderzoeksprotocol en documentatie van institutionele voorschriften zoals IACUC- of IRB-goedkeuringsbrieven. Voltooiing van DEA-formulier 222, het formulier van één pagina dat specifiek is aangewezen voor elk DEA-registratienummer, is vereist voor de aankoop of overdracht van gereguleerde stoffen van Schedule 1.
  5. THC ontvangen en bewaren
    1. Bewaar THC in een goed afgesloten kluis of kluis die een ontwerp volgt dat is goedgekeurd door de DEA. De toegang tot de onderzoeksruimte moet worden gecontroleerd (bijvoorbeeld de deuren van het gebouw en/of het lab moeten op slot zijn). Alleen geautoriseerd personeel mag toegang hebben tot THC.
    2. Bereid een lijst voor en stel deze in van personen die er toegang toe hebben, en houd de lijst up-to-date. Etiketteer THC-containers duidelijk met naam, concentratie, datum van ontvangst en gevarenwaarschuwingen.
    3. Volg de vastgestelde verwijderingsprocedures, die specifieke documentatie en naleving van federale en staatsvoorschriften vereisen. Houd THC op of onder -20 °C.
  6. Voorraadbeheer:
    1. Implementeer een robuust inventarisatiesysteem om de hoeveelheid, het gebruik en de locatie van de THC bij te houden. Bereid een bindmiddel voor gereguleerde stoffen voor, inclusief een Schedule 1-licentie, geautoriseerde personeelsinformatie, gegevens over alle ontvangstbewijzen, verwijderingen en elk middelengebruik (Figuur 2).
    2. Voer regelmatig audits uit van de inventaris- en opslagpraktijken door het halfjaarlijkse inventarisatielogboek in te vullen om ervoor te zorgen dat aan de wettelijke vereisten wordt voldaan. Controleer regelmatig toegangslogboeken en inventarisgegevens.
  7. Training en protocollen: Er moet training worden gegeven aan al het personeel dat met THC omgaat. Er moeten duidelijke protocollen worden opgesteld voor de opslag, behandeling en verwijdering van het medicijn.
    OPMERKING: Door deze praktijken te implementeren, kunnen academische laboratoria ervoor zorgen dat ze voldoen aan de wettelijke vereisten en een veilige onderzoeksomgeving behouden.

2. Procedures voor het toedienen van THC aan muizen door middel van i.p. injectie

OPMERKING: Bij het hanteren van THC is het essentieel om de temperatuur te regelen en de verbinding te beschermen tegen licht om de stabiliteit te behouden. THC is gevoelig voor hitte en moet worden bewaard bij of onder -20 °C voor langdurige opslag. Voor kortstondige opslag kan THC enkele uren bij kamertemperatuur worden bewaard of in de koelkast bij 4 °C. THC is ook gevoelig voor ultraviolet (UV) en zichtbaar licht, dat degradatie door oxidatie kan veroorzaken. Om dit te voorkomen, moet THC worden bewaard in luchtdichte amberkleurige glazen containers of doorzichtige containers verpakt in aluminiumfolie en in het donker worden bewaard. Het wordt aanbevolen om alle monsters te labelen met datums en opslagcondities om een goede tracking en stabiliteit te garanderen.

  1. Materiaal
    1. Bereid alle oplossingen voor met behulp van ultrapuur water en reagentia van analytische kwaliteit. Verkrijg THC van Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) of RTI International (Research Triangle Park, NC) of via het NIDA Drug Supply Program24.
  2. Apparatuur en benodigdheden
    1. Zorg ervoor dat de items in de materiaaltabel gereed zijn voordat u met de procedure begint.
      OPMERKING: Het is essentieel om glazen flesjes (8 ml of vergelijkbaar) en containers te gebruiken bij het werken met THC. Kunststoffen kunnen reageren met of hydrofobe moleculen zoals THC absorberen, wat kan leiden tot monsterverlies of inconsistente concentraties. Glas is chemisch stabiel en niet-reactief, wat ongewenste interacties met hydrofobe moleculen helpt voorkomen.
  3. Procedures voor toediening van THC bij muizen
    1. Haal het THC-bakje uit het kluisje in de vriezer.
    2. Houd de container op ijs, zuig een geschikte hoeveelheid THC op met behulp van een pipet en voeg het voorzichtig toe aan de bodem van een glazen flesje van 8 ml. Bereken het volume op basis van de dosis (mg/kg) en het lichaamsgewicht van de muizen (g).
    3. Verplaats de injectieflacon naar een chemische zuurkast en verdamp het oplosmiddel voorzichtig tot droogte met een zachte stroom stikstofgas. Zorg ervoor dat de THC-houdende oplossing niet op de zijkanten van de injectieflacon spat, omdat dit tot ernstig verlies zal leiden. Dit proces duurt ongeveer 5-10 minuten.
    4. Noteer in het gebruikslogboek van de gereguleerde stof in het bindmiddel met gereguleerde stoffen hoeveel THC er uit de injectieflacon is gehaald die momenteel wordt gebruikt.
    5. Wanneer het oplosmiddel volledig is opgedroogd, voegt u een geschikt volume Tween-80 toe. Dit is het volume Tween-80 dat nodig is om een uiteindelijke concentratie van 5% Tween-80 in zoutoplossing te verkrijgen, zoals weergegeven in stap 2.3.8.
    6. Verwarm de injectieflacon in een bekerglas met heet water tot 60 °C of minder. Draai de injectieflacon om THC volledig op te lossen en herhaal indien nodig.
    7. Voeg geleidelijk steriele zoutoplossing toe in kleine stappen: bijvoorbeeld 200 μL, 300 μL, 500 μL en 1 ml. Draaikolk en warm op.
    8. Herhaal stap 2.3.6 en 2.3.7 totdat het totale volume zoutoplossing is toegevoegd dat nodig is om een uiteindelijke THC-oplossing te maken in 5% Tween-80 en 95% zoutoplossing en de oplossing volledig is opgelost.
    9. (OPTIONEEL) Sonificeer de injectieflacon in een ultrasoon waterbad dat is ingesteld op ongeveer 100% vermogen bij 40 kHz en 37 °C gedurende 5 minuten. Controleer of de oplossing helder is en vrij van onopgeloste stoffen. De kleur van de vloeistof kan variëren, afhankelijk van het gebruikte voertuig.
    10. Weeg de muis en bepaal de juiste hoeveelheid om te injecteren. Het injectievolume moet 10 ml/kg per muis zijn.
    11. Ga verder met de intraperitoneale (i.p.) injecties. Zorg ervoor dat THC-oplossingen op de dag van gebruik vers worden bereid.

3. Procedures voor het beoordelen van de farmacologische effecten van THC

  1. Dieren
    1. Gebruik muizen van beide geslachten voor dit onderzoek.
      OPMERKING: In deze studie werden adolescente (postnatale dag, PND, 30-35) en volwassen (PND 70-75) C57BL/6J-muizen van beide geslachten van Jackson Laboratories (Farmington, CT) gebruikt.
      De procedure is van toepassing op andere muizenstammen.
    2. Huisvest de muizen in geventileerde kooien (4-5 per kooi) met voedsel en water ad libitum beschikbaar. Wijs dieren van dezelfde leeftijd en gewicht willekeurig toe aan behandelingsgroepen en laat ze ten minste 1 week vóór de experimenten acclimatiseren.
    3. Houd de woonruimtes op een 12-uurs licht/12-uurs donkercyclus (lichten aan om 6.30 uur) met een constante temperatuur (20 ± 2 °C) en relatieve vochtigheid (55%-60%).
  2. Experimentele groepen
    1. Verdeel elke leeftijds- en geslachtsgroep in vier behandelingsgroepen: één mediumcontrolegroep en drie THC-behandelingsgroepen voor doses van 1, 5 en 10 mg/kg.
  3. Toediening van geneesmiddelen
    1. Vers bereide THC zoals hierboven beschreven in een vehiculum van 95% zoutoplossing met 5% Tween-80 en toegediend door middel van i.p. injectie.
  4. Gedragstesten
    OPMERKING: In dit voorbeeld onderging elk dier de hieronder beschreven tests om de effecten van THC te volgen22. De drie gedragstesten werden achtereenvolgens uitgevoerd op hetzelfde cohort dieren. De volgorde van de procedures was: voortbeweging (30 minuten na THC), catalepsie (45 minuten na THC) en onderdompeling van de staart (60-, 180- en 300 minuten na THC) (Figuur 3). Voor de experimenten met adolescente vrouwen gebruikten we dezelfde met vehiculum behandelde groep en dienden vervolgens 1 mg/kg of 10 mg/kg THC toe aan hetzelfde cohort om de katalepsie- en staartonderdompelingstests uit te voeren. Deze aanpak stelde ons in staat om voldoende statistische power te bereiken en tegelijkertijd het aantal gebruikte dieren te minimaliseren, in overeenstemming met ethische richtlijnen. Gedrag werd opgenomen met behulp van een camcorder en filmbestanden werden geanalyseerd met behulp van software voor het volgen van gedrag.
    1. Catalepsie test
      OPMERKING: Catalepsie bij muizen is een (patho)fysiologische toestand die wordt gekenmerkt door een gebrek aan vrijwillige beweging, stijfheid van houding en weerstand tegen extern veroorzaakte veranderingen in de lichaamshouding. Het wordt beschouwd als een van de vier standaardeffecten van THC, samen met locomotorische remming, antinociceptie en verlaagde lichaamstemperatuur. In dit voorbeeld werd het cataleptische gedrag beoordeeld op basis van vastgestelde procedures22, zoals hieronder beschreven:
      1. Opstelling: Bereid een horizontale balk voor (7 cm lang) die 4 cm boven het oppervlak van een schone laboratoriumtafel uitsteekt met normale omgevingsverlichting (160 lux). Plaats een elektronische timer in de buurt die klaar is voor gebruik.
      2. Breng de muis over van de huisvesting naar het testlaboratorium en acclimatiseer hem 60 minuten in de kooi voordat u gaat testen. Draag een schone laboratoriumjas en geen parfum.
      3. Haal de muis met schone latexhandschoenen voorzichtig uit zijn kooi, dien veilig een geschikte hoeveelheid THC of vehiculum toe en plaats hem terug in de kooi.
      4. Haal de muis op een geschikt moment na de THC-injectie (in dit geval 45 minuten) uit de kooi en plaats de voorpoten voorzichtig op de horizontale balk.
      5. Registreer de immobiliteitstijd met behulp van de elektronische timer.
        OPMERKING: Immobiliteitstijd wordt gedefinieerd als de tijd die verstrijkt vanaf het moment dat de muis op de stang wordt geplaatst tot het moment dat hij een of beide poten verwijdert.
      6. Stop de timer wanneer de muis een of beide poten van de stang verwijdert of wanneer de cutoff-tijd van 10 s is bereikt.
      7. Herhaal de test twee keer voor elke muis, met een rustinterval van 2 minuten tussen de proeven.
      8. Gebruik het gemiddelde van de twee immobiliteitstijden voor de uiteindelijke gegevensanalyse.
      9. Uitkomstmaat: Gebruik de immobiliteitstijd (in seconden) als indicator voor catalepsie.
    2. Praktijktest (locomotorische activiteit in een nieuwe omgeving)
      OPMERKING: Door THC geïnduceerde hypo-voortbeweging wordt beoordeeld met behulp van de openveldtest en volgens een vastgesteld protocol25.
      1. Opstelling: Gebruik voor deze test een open veld arena die is uitgerust met videotrackingapparatuur. Zorg ervoor dat de arena in het open veld schoon is en vrij van geursignalen van eerdere experimenten.
        OPMERKING: Effectief opruimen kan worden gedaan met behulp van in de handel verkrijgbare producten die worden beschreven in de Tabel voor materialen.
      2. Breng de muis over van de huisvesting naar het testlaboratorium en acclimatiseer hem 60 minuten in zijn kooi voordat u gaat testen. Zorg ervoor dat de testruimte een verlichting met lage intensiteit (10 lux)25 heeft. Draag een schone laboratoriumjas en gebruik geen parfum.
      3. Haal de muis met schone handschoenen voorzichtig uit zijn kooi, dien veilig een geschikte hoeveelheid THC of voertuig toe en plaats de muis terug in de kooi.
      4. Plaats de muis op een geschikt moment na de THC-injectie (30 minuten in dit geval) voorzichtig in het midden van de arena, waarbij u ervoor zorgt dat de hanteringsstress tot een minimum wordt beperkt.
      5. Neem sessies van 10 minuten op met behulp van een camcorder en software voor het volgen van gedrag.
      6. Breng de muis na de test terug naar zijn thuiskooi en maak de arena grondig schoon met de hierboven beschreven reinigingsoplossing.
      7. Uitkomstmaat: Bereken de totale afgelegde afstand, gemeten in meters, als de primaire parameter om de locomotorische activiteit te kwantificeren.
    3. Onderdompelingstest in de staart (nociceptieve drempels, ook wel de warmwaterstaartontwenningstest genoemd)
      OPMERKING: Nociceptie wordt geëvalueerd met behulp van de staartonderdompelingstest, zoals eerder beschreven26. Deze test wordt gebruikt om de effectiviteit van mogelijke pijnstillers te evalueren en om de tolerantie voor hun effecten te beoordelen. Tijdens de test wordt warmte op de staart van een muis toegepast als een pijnlijke stimulus en wordt de tijd gemeten om de staart terug te trekken van de warmtebron.
      1. Opstelling: Bereid een waterbad voor dat op 54 °C wordt gehouden bij normale omgevingsverlichting (160 lux). Plaats een elektronische timer in de buurt die klaar is voor gebruik.
      2. Houd de muis voorzichtig in bedwang met behulp van een zak met zacht weefsel die is gemaakt van trainingspads voor huisdieren (Glad), zodat de staart toegankelijk blijft.
      3. Dompel het distale eenderde deel van de staart onder in het waterbad en start tegelijkertijd de timer.
      4. Registreer de latentie tot het terugtrekken van de staart (in seconden), gedefinieerd als het reflexieve tikken van de staart.
      5. Stel een maximale cutoff-tijd van 10 s in om weefselbeschadiging en ongemak te voorkomen.
      6. Herhaal de meting twee keer voor elke muis op elk tijdstip (in dit geval 60, 180 en 300 minuten na de injectie met THC), met een interval van 5 minuten tussen de proeven.
      7. Neem het gemiddelde van de twee latentiemetingen voor gegevensanalyse.
      8. Uitkomstmaat: Bereken de latentie tot terugtrekking van de staart, gemeten in seconden, als de primaire uitkomstvariabele om antinociceptieve effecten te evalueren.
  5. Statistische analyses
    1. Druk resultaten uit als gemiddelden ± SEM. Bepaal de significantie met behulp van tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Šídák of drieweg-ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. Beschouw de verschillen als significant als P < 0,05.
      OPMERKING: GraphPad Prism versie 10.4 is gebruikt om de analyse uit te voeren.

Resultaten

Om het hierboven beschreven protocol te illustreren, presenteren we resultaten over de acute farmacologische effecten van THC. Vier groepen muizen (8 per groep), adolescente man, volwassen man, adolescente vrouw en volwassen vrouw, kregen drie doses THC - 1, 5 en 10 mg/kg - samen met een vehiculum als controlemiddel. Vervolgens werden catalepsie, locomotorische activiteit en nociceptie beoordeeld, met de nadruk op de dosisafhankelijkheid van de effecten en verschillen tussen geslachten en leeftijden.

Ten eerste, voor de acute cataleptische effecten, produceerde THC dosisafhankelijke catalepsie bij adolescente en volwassen mannelijke muizen (Figuur 4A en Tabel 1). De duur van de respons was dosisafhankelijk (P<0,0001, tweerichtings-ANOVA), waarbij 5 en 10 mg/kg statistisch significante effecten opleverden in beide leeftijdsgroepen, vergeleken met voertuigcontroles in elke groep (P < 0,0001 volgens de meervoudige vergelijkingstest van Šídák). Bij de dosis van 10 mg/kg produceerde THC catalepsie bij zowel adolescente als volwassen vrouwelijke muizen (Figuur 4B en Tabel 2), waarbij volwassen vrouwtjes een minder uitgesproken respons vertoonden in vergelijking met adolescente vrouwtjes (P < 0,0001 volgens de meervoudige vergelijkingstest van Šídák). De datasets werden verder geanalyseerd om te bepalen of geslacht invloed had op door THC geïnduceerde catalepsie. Een bescheiden maar significante seksueel dimorfe respons werd waargenomen bij vrouwelijke adolescenten in vergelijking met mannen (P = 0,0204) (Figuur 4C en Tabel 3). Een aanzienlijk sterker effect van seks werd gevonden bij volwassen vrouwen, die significant minder gevoelig waren voor de cataleptische effecten van THC in vergelijking met volwassen mannelijke muizen (P < 0,0001) (Figuur 4D en Tabel 4).

Ten tweede, voor de acute locomotorische effecten, verminderde THC de locomotorische activiteit bij mannelijke muizen (Figuur 5A en Tabel 5). Dit effect was zowel afhankelijk van de THC-dosis als de leeftijd van het dier (respectievelijk P < 0,0001 en P = 0,0042), waarbij adolescente muizen gevoeliger waren voor het effect van THC in vergelijking met volwassen muizen. Post-hoc meervoudige vergelijkingstests gaven aan dat adolescente muizen bij een dosis van 5 mg/kg THC significant minder bewogen dan volwassen muizen (P < 0,0001). THC verminderde de locomotorische activiteit ook bij vrouwelijke muizen (Figuur 5B en Tabel 6). Two-way ANOVA vertoonde significante effecten van zowel dosis als leeftijd, ook bij vrouwelijke muizen (respectievelijk P < 0,0001 en P = 0,0103) (Figuur 5B en Tabel 6). Post-hoc meervoudige vergelijkingstests toonden echter geen statistisch significante verschillen aan tussen adolescente en volwassen vrouwelijke muizen bij doses van 0 of 10 mg/kg THC (Figuur 5B). Deze datasets werden verder geanalyseerd om te bepalen of geslacht invloed had op door THC geïnduceerde hypo-voortbeweging. Seksueel dimorfisme werd niet waargenomen bij adolescente muizen (Figuur 5C en Tabel 7); volwassen muizen vertoonden echter statistisch significant seksueel dimorfisme (P = 0,0046), waarbij volwassen vrouwtjes significant meer beweging vertoonden in vergelijking met volwassen mannetjes. Desalniettemin onthulden post-hoc meervoudige vergelijkingstests geen statistisch significante verschillen tussen geslachten bij doses van 0 of 10 mg/kg THC (Figuur 5D en Tabel 8).

Ten derde, voor de acute antinociceptieve effecten, verminderde THC de nociceptie van de onderdompeling in de staart bij mannelijke muizen ( adolescenten, Figuur 6A en Tabel 9; volwassenen, Figuur 6C en Tabel 11). Bij adolescente mannen produceerde THC significante antinociceptieve effecten bij 5 en 10 mg/kg, getest op 60, 180 en 360 minuten na toediening (P < 0,0001 volgens de meervoudige vergelijkingstest van Šídák, in verhouding tot de latentie van de staartbeweging van voertuigcontrolemuizen) (Figuur 6A en Tabel 9). Two-way ANOVA bevestigde de sterke effecten van de THC-dosis op de latentie van tail flick (P < 0,0001) en toonde een tijdsafhankelijke afname van antinociceptieve effecten, vooral bij de hoogste dosis (P = 0,0133) (Figuur 6A en Tabel 9). Een vergelijkbaar THC-dosisafhankelijk effect, maar niet het effect van tijd, werd waargenomen bij vrouwelijke adolescente muizen (respectievelijk P < 0,0001 en P = 0,9923) (Figuur 6B en Tabel 10). Bij volwassen mannen produceerde THC alleen significante antinociceptieve effecten bij de hoogste dosis (10 mg/kg) en het vroegste tijdstip (60 minuten na toediening) (P < 0,0001 volgens de meervoudige vergelijkingstest van Šídák, vergeleken met voertuigcontroles) (Figuur 6C en Tabel 11). Tweerichtings-ANOVA vertoonde een significant effect van zowel de dosis als de tijd (dosis, P < 0,0001; tijd, P = 0,0007) (Tabel 11). Bij volwassen vrouwen werd een significant antinociceptief effect alleen waargenomen bij de hoogste dosis (10 mg/kg) en het vroegste tijdstip (60 minuten na toediening) (P < 0,0012 door de meervoudige vergelijkingstest van Šídák, in vergelijking met voertuigcontroles) (Figuur 6D en Tabel 12). Met betrekking tot de effecten van geslacht en leeftijd op door THC geïnduceerde antinociceptie, onthulde two-way ANOVA dat de effecten van THC op de latentie van tail flick werden beïnvloed door zowel leeftijd als geslacht (Figuur 6E, F, Tabel 13 en Tabel14). Het sterkste effect werd waargenomen bij adolescente mannetjes 60 minuten na toediening van THC, hoewel alle vier de groepen muizen significante THC-geïnduceerde antinociceptie vertoonden in vergelijking met de juiste mediumcontroles op dit tijdstip (Figuur 6E). Interessant is dat een significant effect van seks werd waargenomen bij adolescente maar niet bij volwassen muizen op het tijdstip van 60 minuten na THC (adolescenten, P = 0,0083; volwassenen, P = 0,9919 volgens de meervoudige vergelijkingstest van Šídák) (Figuur 6E en Tabel 13). Op het tijdstip van 300 minuten na THC werden significante antinociceptieve effecten alleen gevonden bij adolescente muizen, zowel mannelijke als vrouwelijke, maar niet bij volwassen muizen (Figuur 6F en Tabel 14). Three-way ANOVA testte de drie variabelen, dosis, leeftijd en geslacht, tegelijkertijd en onthulde significante effecten van zowel de tijd en dosis (P = 0,0007 en P < 0,0001, respectievelijk) als de significante interactie tussen tijd en dosis (P = 0,0022) (Tabel 15).

figure-results-1
Figuur 1: Chemische structuren van fytocannabinoïden, THC en CBD, en endocannabinoïden, anandamide en 2-AG. Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) wordt geproduceerd in de bloeiwijze van de vrouwelijke cannabisplant en is verantwoordelijk voor de psychotrope effecten; THC werkt door zich te binden aan G-eiwitgekoppelde CB1- en CB2-receptoren in de hersenen en andere weefsels van het lichaam. Cannabidiol (CBD) is een niet-psychotrope cannabinoïde met anti-epileptische en mogelijk antipsychotische en ontstekingsremmende eigenschappen. Twee belangrijke endogene activatoren van CB-receptoren, anandamide en 2-arachidonoyl-sn-glycerol (2-AG), zijn van lipiden afgeleide boodschappers in de hersenen en perifere weefsels, die op verzoek worden geproduceerd, en zijn betrokken bij verschillende signaleringsprocessen op korte afstand, zoals het verfijnen van synaptische plasticiteit in het CZS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbeeld van een gebruikslogboek van een gereguleerde stof I. Elk gebruik van THC moet worden geregistreerd in een ad-hoc Controlled Substance I Usage Log, dat wordt bewaard in de Controlled Substance Binder die wordt bewaard in een afgesloten kast of een beveiligde kantoorruimte. Dit formulier moet de naam en affiliatie bevatten van de hoofdonderzoeker die moet zijn geregistreerd voor een Schedule 1-licentie, informatie over het geplande medicijn en de exacte batch, het protocolnummer, de geautoriseerde persoon die het medicijn gebruikt met de hoeveelheid en het saldo voor elk gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Schema met de volgorde van gedragstestexperimenten. De volgorde van de procedures was: voortbeweging (30 minuten na THC), catalepsie (45 minuten na THC) en onderdompeling in de staart (60-, 180- en 300 minuten na THC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: THC-geïnduceerde acute catalepsie bij muizen. THC produceert catalepsie bij adolescente en volwassen (A) mannelijke en (B) vrouwelijke muizen. De respons werd beoordeeld met behulp van de staaftest na i.p. injectie van THC in de aangegeven dosis. Dezelfde dataset werd geanalyseerd voor de effecten van seks op THC-geïnduceerde catalepsie bij (C) adolescente en (D) volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM. De significantie werd bepaald met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Šídák. Verschillen werden als significant beschouwd als P < 0,05. P < 0,0001 vergeleken met de voertuigcontrole, ##P < 0,01 en ####P < 0,0001 vergeleken met de adolescente 10 mg/kg-groep in panel B of mannelijke 10 mg/kg-groep in panels C en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Door THC geïnduceerde acute hypo-motorbeweging bij muizen. THC vermindert de spontane locomotorische activiteit bij adolescente en volwassen (A) mannelijke en (B) vrouwelijke muizen. De respons werd beoordeeld met behulp van de open veldtest na i.p. injectie van THC in de aangegeven dosis. Dezelfde dataset werd geanalyseerd voor de effecten van seks op THC-geïnduceerde hypolocomotie bij (C) adolescente en (D) volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM. De significantie werd bepaald met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Šídák. Verschillen werden als significant beschouwd als P < 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001 in vergelijking met de voertuigcontrole, en ####P < 0,0001 in vergelijking met de adolescente groep van 5 mg/kg in panel A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: THC-geïnduceerde acute analgesie bij muizen. Acute antinociceptieve effecten van THC werden gemeten met behulp van de staartonderdompelingstest bij (A) adolescente mannen, (B) adolescente vrouwen, (C) volwassen mannen en (D) volwassen vrouwelijke muizen na 60, 180 of 300 minuten na de i.p. injectie van THC in de aangegeven dosis. Dezelfde dataset werd geanalyseerd op de effecten van leeftijd en geslacht op THC-geïnduceerde antinociceptie na (E) 60 minuten of (F) 300 minuten na de THC-toediening. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM. De significantie werd bepaald met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Šídák. Verschillen werden als significant beschouwd als P < 0,05. *P < 0,05, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001 in vergelijking met de voertuigbesturing, en ##P < 0,01 tussen de 10 mg/kg adolescente mannelijke en adolescente vrouwelijke groep, en @P < 0,05 en @@P < 0,01 vergeleken met respectievelijk de 10 mg/kg volwassen mannelijke en volwassen vrouwelijke groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC bij het produceren van catalepsie bij adolescente en volwassen mannelijke muizen (gerelateerd aan figuur 4A) (n = 7-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC bij het produceren van catalepsie bij adolescente en volwassen vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 4B) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC bij het produceren van catalepsie bij adolescente mannelijke en vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 4C) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC bij het produceren van catalepsie bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 4D) (n = 7-10 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC op de voortbeweging bij adolescente en volwassen mannelijke muizen (gerelateerd aan figuur 5A) (n = 7-9 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC op de voortbeweging bij adolescente en volwassen vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 5B) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC op de voortbeweging bij adolescente mannelijke en vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 5C) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 8: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute effecten van THC op de voortbeweging bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 5D) (n = 7-9 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 9: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute pijnstillende effecten van THC bij adolescente mannelijke muizen (gerelateerd aan figuur 6A) (n = 7-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 10: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute pijnstillende effecten van THC bij adolescente vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 6B) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 11: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute pijnstillende effecten van THC bij volwassen mannelijke muizen (gerelateerd aan figuur 6C) (n = 6-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 12: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute pijnstillende effecten van THC bij volwassen vrouwelijke muizen (gerelateerd aan figuur 6D) (n = 7-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 13: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute pijnstillende effecten van THC bij adolescente en volwassen, mannelijke en vrouwelijke muizen, getest na 60 minuten na de injectie van 10 mg/kg THC (gerelateerd aan figuur 6E) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 14: Tweezijdige ANOVA-analyse van de acute pijnstillende effecten van THC bij adolescente en volwassen, mannelijke en vrouwelijke muizen, getest na 300 minuten na de injectie van 10 mg/kg THC (gerelateerd aan figuur 6F) (n = 5-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 15: Drieweg ANOVA-analyse naar de acute pijnstillende effecten van THC bij adolescente en volwassen, mannelijke en vrouwelijke muizen, getest na 60, 180 en 300 minuten na injectie van 10 mg/kg THC (gerelateerd aan figuur 6E en 6F) (n = 7-8 per groep). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Dit artikel geeft een overzicht van de procedures voor het verkrijgen en bewaren van THC in overeenstemming met de huidige Amerikaanse regelgeving en schetst een protocol voor het bereiden van THC voor intraperitoneale injectie en het toedienen ervan aan adolescente (PND 30-35) en jongvolwassen muizen (PND 70-75). Het is van cruciaal belang om THC uit een legitieme bron te verkrijgen en te voldoen aan alle toepasselijke regelgeving. In de Verenigde Staten moeten onderzoekers voldoen aan zowel federale als nationale regelgevende vereisten, zelfs in staten waar cannabis legaal is voor zowel medisch als niet-medisch gebruik. Het gebruik van een gecertificeerde bron zorgt voor toegang tot THC van onderzoekskwaliteit, die onder strikte controle wordt vervaardigd en een consistente potentie en zuiverheid garandeert. Het gebruik van een niet-gereguleerde of niet-geautoriseerde bron brengt daarentegen de wetenschappelijke integriteit in gevaar, introduceert een risico van afleiding en stelt onderzoekers bloot aan juridische gevolgen.

We hebben drie standaard farmacologische reacties op THC onderzocht: catalepsie, verminderde voortbeweging en analgesie. We hebben uitgebreide literatuurgegevens gereproduceerd (zie bijvoorbeeld referenties 27,28,29) waaruit blijkt dat THC deze reacties op een dosisafhankelijke manier beïnvloedt. Deze tests worden gebruikt in preklinisch onderzoek om de farmacologische eigenschappen van cannabinoïde-receptoragonisten te beoordelen, hoewel hun relevantie voor de menselijke ervaring kan variëren. Catalepsie verwijst naar een toestand waarin de proefpersoon een verminderd vermogen ervaart om te bewegen of normale motorische functies uit te voeren. Dit manifesteert zich als een fysieke immobilisatie of stijfheid, waarbij de proefpersoon ongebruikelijke houdingen aanneemt. Verminderde voortbeweging (of hypo-voortbeweging) verwijst naar een afname van het algehele niveau van horizontale motorische activiteit, die zich manifesteert als vertraagde of minder frequente beweging. Dit kan te wijten zijn aan sedatie, motorische stoornissen of gewoon een gebrek aan motivatie om te bewegen. In dierstudies wordt dit vaak waargenomen als een vermindering van verkennend gedrag of algemene activiteitsniveaus in een nieuwe omgeving. De derde test, antinociceptie, verwijst naar het vermogen van THC om de latentie van het terugtrekken van de staart te verhogen in een staartonderdompelingstest. In diermodellen - waar het beoordelen van de subjectieve component van analgesie gespecialiseerde tests vereist - biedt antinociceptie onder onderdompeling in de staart een nuttige, zij het beperkte, kijk op hoe geneesmiddelen de nociceptieve functie beïnvloeden.

De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat THC-dosisafhankelijk catalepsie induceert, ongeacht geslacht en leeftijd, met name bij de doses van 5 mg/kg en 10 mg/kg. Een leeftijds- en geslachtsspecifiek effect werd waargenomen bij volwassen vrouwelijke muizen, die een significant afgestompte productie van catalepsie vertoonden in vergelijking met mannelijke of adolescente vrouwelijke muizen. Door THC geïnduceerde hypomotoriek in een nieuwe omgeving was sterker bij adolescente muizen in vergelijking met volwassen muizen, ongeacht het geslacht. Dit leeftijdsgebonden verschil was te onderscheiden van volwassen-selectieve hypolocomotorische effecten van THC in hun thuiskooi, een vertrouwde omgeving30. Met betrekking tot de acute antinociceptieve werking van THC werden statistisch significante effecten gevonden bij zowel 5 mg/kg als 10 mg/kg doses bij adolescente mannelijke muizen, maar bij volwassen mannelijke muizen was alleen de dosis van 10 mg/kg effectief. Van de drie tijdstippen die hier werden getest, waren de antinociceptieve effecten van THC het hoogst 60 minuten na THC en vervaagden ze daarna. Adolescente mannen waren het meest gevoelig voor de antinociceptieve effecten van THC in de vier leeftijdsgroepen, en een significant verschil tussen de geslachten werd waargenomen in de adolescente muizengroepen na 60 minuten na de injectie van 10 mg/kg THC. Na 300 minuten toediening van THC werd een duidelijk effect van leeftijd gevonden, waarbij significante antinociceptieve effecten werden waargenomen bij adolescenten, maar niet bij volwassen muizen, ongeacht het geslacht. Over het algemeen vertoonden adolescente muizen een verhoogde gevoeligheid voor THC in vergelijking met volwassenen, vooral in metingen van voortbeweging en nociceptie. Al met al geven deze resultaten aan dat de adolescentie een gevoelige periode is voor de acute farmacologische effecten van THC, hoewel dit testafhankelijk kan zijn30. De resultaten hier identificeren ook de impact van zowel leeftijd als geslacht op de effecten van THC, wat suggereert dat volwassen vrouwen het minst gevoelig zijn voor THC.

Blootstelling aan THC tijdens de adolescentie - vooral wanneer het frequent en in hoge doses is - kan de functie van het endocannabinoïdesysteem door het hele lichaam, inclusief de hersenen, verstoren31. Deze verstoring kan leiden tot langdurige effecten op zowel de mentale als de fysieke gezondheid 32,33,34. Epidemiologische studies in de afgelopen drie decennia hebben consequent associaties aangetoond tussen cannabisgebruik door adolescenten en langdurige stoornissen in cognitie, stemming en psychosociaal functioneren, waarbij deze effecten zich mogelijk uitstrekken tot in de volwassenheid, zelfs na stopzetting van het gebruik 32,33,34,35,36. Bovendien zijn langdurige veranderingen in lichaamsgewicht, metabolisme en immuunfunctie gemeld. Hoewel deze associaties goed gedocumenteerd zijn, is het van cruciaal belang om een oorzakelijk verband vast te stellen tussen cannabisgebruik en de mogelijke gevolgen voor de gezondheid. Verschillende methoden, waaronder discordante tweelinganalyse, Mendeliaanse randomisatie en quasi-experimentele interventies, kunnen worden gebruikt om causaliteit in menselijke populaties te beoordelen. Proefdierproeven spelen echter ook een cruciale rol bij het ophelderen van het oorzakelijk verband37. Bevindingen van ons laboratorium, gefinancierd door het National Institute on Drug Abuse, met behulp van een knaagdiermodel van matige maar frequente blootstelling aan THC tijdens de adolescentie, ondersteunen de hypothese dat de adolescentie een kwetsbare periode is voor blootstelling aan THC 17,18,25,38,39,40. Zelfs matige doses van het medicijn tijdens deze kritieke ontwikkelingsperiode kunnen blijvende effecten hebben op verschillende componenten van het endocannabinoïdesysteem voor volwassenen. Deze effecten houden verband met neurologische gedragsveranderingen, evenals stoornissen in immuunresponsen en het vermogen om met psychosociale stress om te gaan. Ons eerdere onderzoek bracht ook onverwachte veranderingen in de functie van vetweefsel aan het licht, wat een mogelijke moleculaire verklaring biedt voor de metabolische veranderingen op de lange termijn die worden waargenomen bij regelmatige cannabisgebruikers18. Door CB 1-receptoren in de hersenen op ongepaste wijze te activeren tijdens belangrijke neurologische ontwikkelingsperioden zoals de adolescentie, kan THC de balans verstoren die nodig is voor de rijping van de hersenen, wat leidt tot structurele en functionele veranderingen die tot in de volwassenheid kunnen aanhouden.

Bij mensen zijn roken en vapen de meest voorkomende methoden van cannabisconsumptie in alle leeftijdsgroepen. Ons huidige protocol beschrijft de toediening van THC via de intraperitoneale (i.p.) route, die praktisch en reproduceerbaar is en farmacokinetische en farmacodynamische reacties bij knaagdieren veroorzaakt die in verschillende opzichten lijken op die waargenomen bij menselijke cannabisgebruikers. Zo is aangetoond dat een i.p. dosis van 5 mg/kg THC bij adolescente en volwassen mannelijke muizen piekbloedconcentraties produceert die vergelijkbaar zijn met die gerapporteerd bij volwassen menselijke gebruikers. Aerosolafgifte van THC (in de volksmond 'damp' genoemd) wordt onderzocht als aanvulling op i.p.-injectie. Deze benadering is gebaseerd op het uitgangspunt dat passieve inhalatie van vernevelde THC, zoals roken of vapen, leidt tot pulmonale absorptie, wat resulteert in een sneller begin van effecten, verminderd first-pass levermetabolisme en mogelijk verschillende psychoactieve resultaten in vergelijking met parenterale toediening. Eerdere studies hebben met name aangetoond dat ratten zelf cannabisextracten in aerosolvorm of THC/cannabidiol-mengsels toedienen in operante gedragsparadigma's, wat het potentieel van deze methode voor het bestuderen van de versterkende eigenschappen van THC benadrukt.

Concluderend bouwt dit protocol voort op gevestigde methoden voor het beoordelen van door cannabinoïden geïnduceerd tetradgedrag41,42, die afhankelijk zijn van de activering van neuronale CB1-receptoren 43, door verschillende belangrijke updates en verfijningen aan te bieden. Eerst beschrijven we procedures die aansluiten bij de huidige DEA- en institutionele regelgeving voor het verkrijgen, hanteren en toedienen van THC-kritische overwegingen voor iedereen zonder praktijkervaring. Ten tweede passen we het tetrad-paradigma toe op adolescente (PND 30-35) en jongvolwassen (PND 70-75) muizen, twee ontwikkelingsstadia die zeer relevant zijn voor blootstelling aan cannabis in het vroege leven en in opkomst bij volwassenen, maar die ondervertegenwoordigd blijven in preklinisch onderzoek. De bevindingen van deze studie recapituleren bekende dosisafhankelijke effecten van THC op catalepsie, voortbeweging en analgesie en onthullen een verhoogde gevoeligheid voor THC bij adolescente muizen, met name in nociceptieve en locomotorische domeinen. Dit leeftijdsspecifieke inzicht en de afstemming van de regelgeving maken dit protocol vooral waardevol voor nieuwkomers in het onderzoek naar cannabinoïden en voor onderzoekers die de ontwikkelingsimpact van cannabinoïden onderzoeken.

Openbaarmakingen

De auteurs rapporteren geen biomedische financiële belangen of mogelijke belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes on Drug Abuse (Grant No. 2P50DA044118 [aan DP]).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL TB SpuitjesBD309659200/doos; Steriele, eenmalig gebruik.
8 mL glazen injectieflaconsFisher Scientific W224584144/doos, gebruikt voor het bereiden van THC-injectieoplossing.
ANY-maze softwareANY-maze6000Wordt gebruikt om video's van gedragstests op te nemen en elementen van de tests te kwantificeren voor gegevensanalyse.
C57BL/6J MuizenJackson Laboratories#000664Wild type muizen gebruikt voor alle experimenten; Exacte leeftijd en geslacht kunnen worden opgegeven.
Compass CX SchaalOhausCR221Wordt gebruikt om muizen te wegen om de hoeveelheid THC te bepalen die moet worden geïnjecteerd; Maximaal 220 g, d = 0,1 g.
Corning Pyroceram Hot PlateFisher Scientific11500151Wordt gebruikt om het waterbad op te warmen voor de Tail Flick test.
Delta-9-tetrahydrocannabinolCayman Chemical 12068Opgeslagen in de veilig opgesloten kluis voor Schedule 1 drugs in een -30 ºC vriezer.
Fisherbrand Nitrile HandschoenenFisher Scientific19-181-610100/pak; Enkelvoudig gebruik, latexvrije handschoenen gebruikt voor de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
GraphPad Prism v10.4GraphPadn/aStatistische analysesoftware gebruikt om experimentele gegevens te analyseren en statistische tests uit te voeren.
Heavy Duty BekerFisher ScientificS81280Wordt gebruikt om heet water te houden voor de Tail Flick test.
High-Purity StikstofgasAirgasUN1066 Wordt gebruikt om ethanol te verdampen uit THC-basisoplossing.
Logitech C920 WebcameraLogitech960-001055Wordt gebruikt om gedragstests bij dieren op te nemen; Carl Zeiss 1080p/30 fps HD USB.
Open Field BoxStoelting Co60101Box met ondoorzichtige zijden om open veldtests uit te voeren; Zijden zijn gemakkelijk te verwijderen voor reiniging.
Pet Training PadsGladB088G1N2H885/pak; 22 in. ´ 22 in.; gebruikt om muizen te wikkelen en vast te houden voor Tail Flick test.
PrecisionGlide NaaldenBD305109100/doos; 0,4 mm ´ 13 mm; Steriele, eenmalig gebruik.
SoulineFisher Scientific (Cytiva)Z13771 L flessen, USP Steriele kwaliteit.
SCOE 1xBioFOGR-SKReinigingsoplossing gebruikt om gedragstestmaterialen schoon te maken.
Tween-80Sigma AldrichP8074-500MLBioXtra, stroperige vloeistof; CAS # 9005-65-6.
Ultrasoon WaterbadFisher Scientific (Branson)CPX2800Temperatuuromvormer; Digitale ultrsoonreiniger.
Vortex MixerFisher Scientific2215365Wordt gebruikt om de inhoud van de THC-injectieoplossing te mengen terwijl deze wordt bereid.
```

Referenties

  1. Patrick, M. E., Miech, R. A., Johnston, L. D., O'Malley, P. M. Monitoring the future panel study annual report: National data on substance use among adults ages 19 to 65, 1976-2023. , At. https://monitoringthefuture.org/wp-content/uploads/2024/07/mtfpanel2024.pdf (2024).
  2. Lopez-Quintero, C., et al. Probability and predictors of transition from first use to dependence on nicotine, alcohol, cannabis, and cocaine: Results of the National Epidemiologic Survey on Alcohol and Related Conditions (NESARC). Drug Alcohol Depend. 115 (1-2), 120-130 (2011).
  3. Cerda, M., et al. Association between recreational marijuana legalization in the United States and changes in marijuana use and cannabis use disorder from 2008 to 2016. JAMA Psychiatry. 77 (2), 165-171 (2020).
  4. Miech, R. A., et al. Monitoring the future national survey results on drug use, 1975-2023: Secondary school students. , https://archive.org/details/mtf2023 (2023).
  5. Pacek, L. R., Mauro, P. M., Martins, S. S. Perceived risk of regular cannabis use in the United States from 2002 to 2012: Differences by sex, age, and race/ethnicity. Drug Alcohol Depend. 149, 232-244 (2015).
  6. Hammond, C. J., Chaney, A., Hendrickson, B., Sharma, P. Cannabis use among U.S. adolescents in the era of marijuana legalization: A review of changing use patterns, comorbidity, and health correlates. Int Rev Psychiatry. 32 (3), 221-234 (2020).
  7. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. The health effects of cannabis and cannabinoids: The current state of evidence and recommendations for research. , Natl Acad Press. (2017).
  8. Health effects of cannabis and cannabinoids and barriers to research: Report to Congress pursuant to requirements of the Medical Marijuana and Cannabidiol Research Expansion Act. Dept Health Hum Serv. , National Institutes of Health. (2023).
  9. Maccarrone, M., et al. Goods and bads of the endocannabinoid system as a therapeutic target: Lessons learned after 30 years. Pharmacol Rev. 75 (5), 885-958 (2023).
  10. Whiting, P. F., et al. Cannabinoids for medical use: A systematic review and meta-analysis. JAMA. 313 (24), 2456-2473 (2015).
  11. Montagner, P., et al. Charting the therapeutic landscape: A comprehensive evidence map on medical cannabis for health outcomes. Front Pharmacol. 15, 1494492(2024).
  12. Manzoni, O. J., Manduca, A., Trezza, V. Therapeutic potential of cannabidiol polypharmacology in neuropsychiatric disorders. Trends Pharmacol Sci. 46 (2), 145-162 (2025).
  13. Kalant, H. Cannabis control policy: No rational basis yet for legalization. Clin Pharmacol Ther. 97 (6), 538-540 (2015).
  14. Huestis, M. A. Pharmacokinetics and metabolism of the plant cannabinoids, delta9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and cannabinol. Handb Exp Pharmacol. 168, 657-690 (2005).
  15. Grotenhermen, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of cannabinoids. Clin Pharmacokinet. 42 (4), 327-360 (2003).
  16. Jung, K. M., Piomelli, D. Cannabinoids and Endocannabinoids. Neuroscience in the 21st Century. , Springer. New York. (2016).
  17. Jung, K. M., Lin, L., Piomelli, D. Overactivation of the endocannabinoid system in adolescence disrupts adult adipose organ function in mice. Cells. 13 (5), 461(2024).
  18. Lin, L., et al. Adolescent exposure to low-dose THC disrupts energy balance and adipose organ homeostasis in adulthood. Cell Metab. 35 (7), 1227-1241.e7 (2023).
  19. Chandra, S., et al. New trends in cannabis potency in USA and Europe during the last decade (2008-2017). Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 269 (1), 5-15 (2019).
  20. Petrilli, K., et al. Association of cannabis potency with mental ill health and addiction: A systematic review. Lancet Psychiatry. 9 (9), 736-750 (2022).
  21. Bara, A., et al. Cannabis and synaptic reprogramming of the developing brain. Nat Rev Neurosci. 22 (7), 423-438 (2021).
  22. Mabou Tagne, A., et al. Delta(9)-tetrahydrocannabinol alleviates hyperalgesia in a humanized mouse model of sickle cell disease. J Pharmacol Exp Ther. 391 (9), 174-181 (2024).
  23. Research advisory panel. , Office of the Attorney General, State of California. At https://oag.ca.gov/research (2024).
  24. NIDA drug supply program. , National Institute on Drug Abuse. At https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program (2024).
  25. Lee, H. L., et al. Frequent low-impact exposure to THC during adolescence causes persistent sexually dimorphic alterations in the response to viral infection in mice. Pharmacol Res. 199, 107049(2024).
  26. Mabou Tagne, A., et al. Persistent exposure to delta(9)-tetrahydrocannabinol during adolescence does not affect nociceptive responding in adult mice. J Pharmacol Exp Ther. 378 (3), 215-221 (2021).
  27. Martin, B. R., et al. molecular modeling evaluations of cannabinoid analogs. Pharmacol Biochem Behav. 40 (3), 471-478 (1991).
  28. Fride, E., Mechoulam, R. Pharmacological activity of the cannabinoid receptor agonist, anandamide, a brain constituent. Eur J Pharmacol. 231 (2), 313-314 (1993).
  29. Pertwee, R. G. The central neuropharmacology of psychotropic cannabinoids. Pharmacol Ther. 36 (2-3), 189-261 (1988).
  30. Torrens, A., et al. Comparative pharmacokinetics of delta(9)-tetrahydrocannabinol in adolescent and adult male mice. J Pharmacol Exp Ther. 374 (1), 151-160 (2020).
  31. Rubino, T., Parolaro, D. Long lasting consequences of cannabis exposure in adolescence. Mol Cell Endocrinol. 286 (1-2 Suppl 1), S108-S113 (2008).
  32. Schneider, M. Puberty as a highly vulnerable developmental period for the consequences of cannabis exposure. Addict Biol. 13 (2), 253-263 (2008).
  33. Chadwick, B., Miller, M. L., Hurd, Y. L. Cannabis use during adolescent development: Susceptibility to psychiatric illness. Front Psychiatry. 4, 129(2013).
  34. Renard, J., et al. Long-term consequences of adolescent cannabinoid exposure in adult psychopathology. Front Neurosci. 8, 361(2014).
  35. Albaugh, M. D., et al. Association of cannabis use during adolescence with neurodevelopment. JAMA Psychiatry. 78 (9), 1-11 (2021).
  36. Schweinsburg, A. D., Brown, S. A., Tapert, S. F. The influence of marijuana use on neurocognitive functioning in adolescents. Curr Drug Abuse Rev. 1 (1), 99-111 (2008).
  37. Rubino, T., Parolaro, D. The impact of exposure to cannabinoids in adolescence: Insights from animal models. Biol Psychiatry. 79 (7), 578-585 (2016).
  38. Lee, H. L., et al. Frequent low-dose delta(9)-tetrahydrocannabinol in adolescence disrupts microglia homeostasis and disables responses to microbial infection and social stress in young adulthood. Biol Psychiatry. 92 (11), 845-860 (2022).
  39. Lim, J., et al. Adolescent exposure to low-dose delta9-tetrahydrocannabinol depletes the ovarian reserve in female mice. Toxicol Sci. 193 (1), 31-47 (2023).
  40. Torrens, A., et al. Comparative pharmacokinetics of delta9-tetrahydrocannabinol in adolescent and adult female mice. Cannabis Cannabinoid Res. 9 (6), 1537-1542 (2024).
  41. Fride, E., et al. Behavioral methods in cannabinoid research. Methods Mol Med. 123, 269-290 (2006).
  42. Metna-Laurent, M., et al. Cannabinoid-induced tetrad in mice. Curr Protoc Neurosci. 80, 9.59.1-9.59.10 (2017).
  43. Monory, K., et al. Genetic dissection of behavioural and autonomic effects of delta(9)-tetrahydrocannabinol in mice. PLoS Biol. 5 (9), e269(2007).

Herprints en machtigingen

Tags

THC toedieningadolescente muizenendocannabino desysteemintraperitoneale injectiecatalepsietestlocomotorische activiteittail immersion testdosis responssekseverschillen
Toediening van Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) bij adolescente en volwassen muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.