Methodenartikel

Reproduceerbare productie van SPOT als een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer

DOI:

10.3791/68405

⸱

29 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol documenteert de fabricage en assemblage van SPOT, een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer, in formaten met 96 en 384 putjes. Het beschrijft ook het zaaiproces voor SPOT, zowel handmatig als met behulp van een in de handel verkrijgbare vloeistofverwerker.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) worden steeds vaker gebruikt in kankeronderzoek om tumoren te modelleren. Ze combineren de voordelen van in vivo en traditionele in vitro modellen, waarbij de complexiteit en heterogeniteit van het weefsel worden samengevat terwijl ze nog steeds uit menselijke cellen bestaan. De opkomst van fysiologisch representatieve PDO-modellen heeft geleid tot een behoefte aan apparaten die een eenvoudige analyse van het gedrag van organoïden mogelijk maken. In dit protocol wordt uitgelegd hoe het door Scaffold ondersteunde Platform for Organoid-based Tissues (SPOT), een driedimensionaal (3D) organoïde-cultuurapparaat met hoge doorvoer moet worden samengesteld en gebruikt. Dit platform elimineert de meniscus die doorgaans wordt gevormd door gezaaide hydrogels om nauwkeurige, snelle beeldvorming mogelijk te maken, vergelijkbaar met het beeldvormingsproces voor tweedimensionale (2D) culturen. Als gevolg hiervan kunnen organoïden en co-culturen die in SPOT zijn gezaaid, eenvoudig in beeld worden gebracht met behulp van high-throughput microscopie. SPOT is ontworpen voor kant-en-klaar gebruik en is toegankelijk voor onderzoekers met basiservaring in weefselkweek en is compatibel met zowel handmatige als geautomatiseerde zaaiworkflows. Dit protocol beschrijft de fabricage van SPOT in formaten met 96 en 384 putjes, inclusief stapsgewijze instructies voor montage, zaaien, kwaliteitscontrole en probleemoplossing. Hoewel de fabricage 3-4 uur duurt, exclusief stilstand, kunnen meerdere platen tegelijkertijd worden geproduceerd, waardoor de schaalbaarheid wordt verbeterd. Door de BOB-cultuur en -analyse te stroomlijnen, biedt SPOT een robuust hulpmiddel voor high-throughput screening van geneesmiddelen en translationeel kankeronderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de vooruitgang in biomedisch onderzoek blijft het ontwikkelen van fysiologisch relevante in-vitrotests een uitdaging. Een ideale test moet geschikt zijn voor een breed scala aan celtypen, behandelingsformuleringen, tijdschema's, commerciële instrumentatie en analytische uitlezingen om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in verschillende disciplines. Vanwege het gebrek aan geschikte hulpmiddelen vertrouwen onderzoekers echter vaak op simplistische modellen, zoals 2D-monolagen van onsterfelijke cellijnen, die er niet in slagen de complexiteit en klinische relevantie samen te vatten, met name in kankeronderzoek 1,2. Om dit aan te pakken, hebben grootschalige biobanken voor tumoren en samenwerking tussen clinici geleid tot de ontwikkeling van high-fidelity in-vitromodellen zoals patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's), die meer patiëntspecifieke genetische en therapeutische profielen behouden in vergelijking met cellijnen 3,4,5. Ondertussen vraagt de vooruitgang op het gebied van laboratoriumautomatisering en het ontdekken van geneesmiddelen om platforms die naadloos kunnen worden geïntegreerd in workflows met een hoge doorvoer. Hoewel bestaande platforms zich richten op biologische getrouwheid of schaalbaarheid, zijn er maar weinigen in staat geweest om beide uitdagingen tegelijkertijd op te lossen 6,7,8. Het ontwikkelen van geautomatiseerde modellen met een hoge doorvoer die belangrijke ziektekenmerken repliceren, is cruciaal voor het bevorderen van biomedisch onderzoek en het versnellen van het genereren van gegevens voor translationele toepassingen.

Talrijke opkomende modellen zijn bedoeld om de uitdagingen aan te pakken die gepaard gaan met het kweken van gespecialiseerde celtypen, zoals BOB's, met een hoge doorvoer (Figuur 1). Standaardplatforms, waar organoïden worden gemengd met hydrogel in platen met 96 of 384 putjes, hebben verschillende beperkingen: (i) een hoog celgelvolume leidt tot inconsistente toegang tot voedingsstoffen, (ii) de kromming van de goed meniscus creëert beeldvormingsartefacten en cellulaire gradiënten, (iii) hydrogelzaaien mist uniformiteit tussen batches en personeel, (iv) onverenigbaarheid met geautomatiseerde fabricage en geautomatiseerde microscopie, en (v) het gebruik van extracellulaire matrix (ECM) die doorgaans zacht en kwetsbaar is, riskeert monster vernietiging bij fysiologische weefseldichtheden of incorporatie van contractiele celtypen 1,9. Momenteel worden de meeste PDO-onderzoeken op basis van platen uitgevoerd door de celgel handmatig in de plaat te zaaien10,11, of een gel-overlay-methode, waarbij de hydrogel wordt verdund met een minder stroperig medium en cellen naar de putbodem worden gecentrifugeerd om ze in het juiste optische vlak te plaatsen12,13. Beide benaderingen bieden geen mechanische ondersteuning voor cultuur op de lange termijn. Op basis van onze eerdere waarnemingen (niet-gepubliceerde gegevens) trekt commerciële hydrogel gemengd met cellen in standaard putplaten gedurende 9 van de 12 putten gedurende 12 dagen samen van de oppervlakken van de put, terwijl de gel-overlay-methode geen fysiologische cel-matrixinteracties heeft. Bovendien kunnen de resulterende culturen niet gedurende lange perioden worden gehandhaafd vanwege ruimtebeperkingen in de put en zijn ze onverenigbaar met tests die een hoge reagens-tot-cel-mediumverhouding vereisen 14,15,16. Deze praktische barrières belemmeren de acceptatie van 3D-modellen en beperken de experimentele reproduceerbaarheid in het hele veld.

figure-introduction-1
Figuur 1: Beoordeling van cultuurmodellen op basis van schaalbaarheid en biologische relevantie. De relatieve positionering van verschillende in vitro en in vivo kweeksystemen langs schaalbaarheid (y-as), gedefinieerd door plaatdoorvoer en biologische relevantie (x-as), waarbij de afwegingen tussen doorvoerpotentieel en fysiologische getrouwheid worden benadrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gemotiveerd door deze uitdagingen, werden de hoge porositeit en mechanische versterking van een dunne cellulosesteiger gebruikt om het door steigers ondersteunde platform voor organoïde-gebaseerde weefsels (SPOT) te ontwikkelen, beschikbaar in zowel 96- als 384-well formaten. SPOT bevat een steiger met een voorpatroon van polymeer met behulp van een eerder ontwikkelde infiltratiemethode17 die overeenkomt met de plaatlay-out, waardoor een nauwkeurige plaatsing van de celgeldruppel mogelijk is en structurele ondersteuning biedt voor de hydrogelfase (Figuur 2A). Capillaire afvoer in de steiger geleidt de cel-geloplossing en vormt een mechanisch versterkt biocomposietnetwerk (Figuur 2B). Door de poreuze structuur van de steiger infiltreert de celgel en vormt een dunne laag (ongeveer 70 μm dik), waardoor er tienmaal minder celgel nodig is om de bodem van de put te bedekken14. De compatibiliteit van SPOT met zaaiende pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) PDO's werd ook aangetoond door hun groei te beoordelen met behulp van metabole assays en op beelden gebaseerde metingen. Sinds de ontwikkeling heeft SPOT een aanzienlijke veelzijdigheid en bruikbaarheid aangetoond voor onderzoekers die zich bezighouden met organoïdecultuur. Bovendien biedt het ontwerp van SPOT gebruiksvriendelijke schaalbaarheid, met verminderde reagensvolumes en verbeterde beeldvormingsmogelijkheden door de platte, meniscusvrije microgelgeometrie, die zorgt voor een uniforme lichtpenetratie en nauwkeurige beeldvorming met hoge inhoud14 (Figuur 2C,D). SPOT ondersteunt ook co-cultuur met andere relevante celtypen, zoals fibroblasten, om de micro-omgeving van de tumor beter te recapituleren18.

figure-introduction-2
Figuur 2: Overzicht van het 96-SPOT-apparaat en de workflow voor beeldanalyse. (A) Schematische weergave van de fabricage van SPOT-platen: het apparaat wordt geassembleerd door een commerciële bodemloze putplaat (boven), een steiger met PMMA-patroon (weergegeven in blauw) en polycarbonaatfilm (onder) te verzamelen met behulp van lagen dubbelzijdige polyacryllijm (weergegeven in geel). (B) Cellen uitzaaien in een steigerput: cellen worden gesuspendeerd in een niet-gepolymeriseerde hydrogel (weergegeven in roze) en in elk putje gepipetteerd waar het de steiger infiltreert. De hydrogel wordt vervolgens gegeleerd om de cellen in te kapselen in de door de steiger ondersteunde hydrogel. (C) Microscopie: het resulterende microweefsel kan in beeld worden gebracht met behulp van geautomatiseerde breedveldmicroscopie. (D) Beeldgebaseerde analyse: Verkregen beelden van fluorescerende cellen (groen) gesuspendeerd in gel kunnen worden geanalyseerd met behulp van standaard beeldanalysepijplijnen. Representatief epifluorescentiemicroscopiebeeld van KP4-cellen die GFP tot expressie brengen in één 96-SPOT-putje. Schaalbalk is 500 μm. Dit cijfer is gewijzigd van14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een ander voordeel van SPOT is dat het systeem kan worden geïntegreerd met een open-source vloeistofverwerker, waardoor geautomatiseerde, reproduceerbare fabricage van BOB-culturen mogelijk is. Deze vooruitgang vermindert de variabiliteit van gebruikers en ondersteunt complexe experimentele ontwerpen, waaronder high-throughput screening van geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen18. Eerder werd ook aangetoond dat SPOT compatibel is met single-cell-based gemultiplexte karakterisering van cellulaire fenotypes in heterogene tumoromgevingen en het ophalen van de cellen op verzoek van SPOT door spijsvertering18. Deze kenmerken positioneren SPOT als een veelzijdig hulpmiddel voor screeningtoepassingen, waarbij longitudinale gegevens met hoge resolutie essentieel zijn voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen en cellulair gedrag onder fysiologisch relevante omstandigheden14,18. Door deze technische innovaties te combineren, pakt SPOT kritieke beperkingen in traditionele 3D-cultuursystemen aan.

Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor het fabriceren van SPOT-componenten, het assembleren van platen en zaaimethoden voor robuuste en reproduceerbare 3D-organoïde culturen. Het bevat gedetailleerde instructies voor het handmatig zaaien van platen met behulp van een micropipet en geautomatiseerde zaaiworkflows met een vloeistofverwerker, die zowel 96- als 384-wells formaten ondersteunt. Bovendien schetst dit protocol essentiële kwaliteitscontrolemaatregelen, zoals het verifiëren van een uniforme gelverdeling en de integriteit van de steigers, om hoge experimentele normen te handhaven. Er worden ook strategieën voor probleemoplossing geboden om veelvoorkomende problemen aan te pakken, zoals onvolledige gelinfiltratie, verdamping tijdens het zaaien en het losraken van steigers, waardoor onderzoekers praktische oplossingen krijgen om hun workflows te optimaliseren en betrouwbare resultaten te bereiken.

SPOT is ontworpen om de hiaten op te vullen waarmee traditionele organoïde-assays worden geconfronteerd, inclusief uitdagingen met betrekking tot het uitvoeren van assays en mediaverandering met behoud van de gelintegriteit 10,11,12,13. Het algemene doel van deze methode is het vervaardigen van een steigerondersteund platform dat de organoïdecultuur gedurende een periode van 12 dagen ondersteunt. Bovendien omvat deze methode ook het genereren van weefselarrays in SPOT door middel van handmatig zaaien of door een vloeistofverwerker geassisteerd, zodat gebruikers eventuele stroomafwaartse verstoringen kunnen uitvoeren, inclusief IC50-tests voor geneesmiddelen en screening van kleine moleculen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werden organoïden van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) als voorbeeld gebruikt. Die organoïden zijn vastgesteld bij PDAC-patiënten, gekocht bij de UHN Biobank in het Princess Margaret Cancer Center (PMLB-identificatie PPTO.46 van het University Health Network, Canada) onder een protocol in overeenstemming met de richtlijnen van de University of Toronto Research Ethics Board (protocol #36107). Zie alle benodigde materialen, reagentia en apparatuur in de materiaaltabel.

1. PMMA-acetonoplossing maken (timing: 20 min + ~8-16 uur inactief)

OPMERKING: Polymethylmethacrylaat (PMMA)-acetonoplossing wordt in SPOT gebruikt om putten af te bakenen en lekkage tussen putten te voorkomen. De algemene procedure is om vast PMMA op te lossen in aceton. Voorheen werd een PMMA-acetonoplossing gebruikt om een soortgelijke papieren steiger te vormen om media en gasuitwisseling te blokkeren om hypoxie te bereiken in een ander 3D-cultuurmodel17. Hier wordt de PMMA-acetonformule aangepast om PMMA-geïnfiltreerde steigers te genereren voor de fabricage van SPOT.

  1. Voeg in een geëtiketteerde conische centrifugebuis van 50 ml 1,75 g PMMA-poeder toe. Voeg vervolgens in een zuurkast 7,84 ml aceton toe en sluit de buis goed af om verdamping van oplosmiddel te voorkomen.
  2. Als visualisatie van het polymeerpatroon nodig is, voeg dan 5-10 druppels nagellak toe aan de oplossing. Sluit de centrifugebuis goed af. Schud de tube handmatig om te beginnen met het mengen van de nagellak met de PMMA-acetonoplossing.
    OPMERKING: Om consistent te zijn in meerdere plotbatches, verdunt u een bekende hoeveelheid nagellak in aceton en pipett u deze oplossing vervolgens als de 7.84 ml aceton.
  3. Plaats de PMMA-acetonoplossing een nacht op de vortexmixer om ervoor te zorgen dat de oplossing oplost. Bewaar de PMMA-acetonoplossing maximaal 2 weken bij 4 °C, indien ongeopend.

2. Maken van PMMA-geïnfiltreerde steigers

(timing: voor 96-SPOT-patronen: 15 minuten opstelling + 6 minuten per steiger; voor 384-SPOT-patronen: 15 minuten opstelling + 10 minuten per steiger)

OPMERKING: De fabricage van PMMA-geïnfiltreerde steigers voor 96-/384-SPOT wordt uitsluitend uitgevoerd op een werkbank (niet-steriele omgeving). Om 96/384-SPOT-steigers te maken, moet u ervoor zorgen dat de betreffende plottersoftware voor het bewerken van afbeeldingen of de besturingsbibliotheek voor vectorplotters is geïnstalleerd. Houd er rekening mee dat sommige subsecties van de procedure van toepassing zijn op zowel 96-SPOT als 384-SPOT, terwijl andere specifiek zijn voor één plaatformaat. In het laatste geval worden opties A (voor 96-SPOT) en B (voor 384-SPOT) gepresenteerd. Voor het (A) 96-SPOT-patroon zijn er drie lagen; ten eerste zorgen de aanzuiglijnen voor een consistente stroom van de PMMA-acetonoplossing; ten tweede, de reeks van 96 cirkels; ten slotte brengt een patroon van reizende verkopers (TSP) de ruimtes tussen de putten in kaart. Voor het (B) 384-SPOT-patroon bevat de eerste module priming-lijnen; ten tweede, de rand rond de putplaat; Ten slotte wordt een raster uitgezet zodat er 384 regio's overblijven. Voor beide patronen kan de grootte van de putten worden gecontroleerd door de broncode te wijzigen, zoals aangetoond door Li et al.14.

  1. Opstelling voor het infiltratieproces van steigers
    1. Laat de PMMA-acetonoplossing (bewaard bij 4 °C) 10 minuten schudden bij kamertemperatuur. Laat de buishouder staan totdat het plotten begint.
    2. Sluit de plotter aan op stroom met behulp van de stroomkabel. Een groen knipperend lampje geeft aan dat het apparaat is ingeschakeld. Sluit de USB-kabel van de plotter aan op de daarvoor bestemde computer om te plotten.
    3. Bedek de clipezel met een stuk bakpapier. Zorg ervoor dat het hele oppervlak van de ezel bedekt is.
      1. Om het plotten van 96-/384-SPOT-patronen te begeleiden, bereidt u een 96-/384-SPOT-sjabloon voor op een vel printerpapier. Voer de stappen 2.2-2.3 uit met een pen in plaats van een spuit en printerpapier in plaats van het perkamentpapier en het theefilter. Zodra het sjabloon klaar is, plaatst u het op de Clip Easel en beplakt u het met bakpapier. Ga door naar stap 2.2 en volg het protocol om 96-/384-SPOT steigers te maken.
    4. Klem het perkamentpapier op de ezel met behulp van ringbandklemmen (Figuur 3A). Neem een vel steiger (d.w.z. theefilterpapier) en knip langs de zijkanten waar de twee lagen zijn samengesmolten (Figuur 3B).
    5. Plaats het gesneden theefilter - hierna papieren steiger genoemd - op de clipezel, met de gladde kant (buitenkant van het theefilter) naar boven. Klem het aan drie kanten vast. Zorg ervoor dat de papiersteiger volledig plat ligt op de clipezel; Er mogen geen rimpels in het plotgebied zijn.
  2. Het 96/384-SPOT-patroon uitzetten
    1. Om de plottersoftware en het bestand voor 96-SPOT in te stellen, volgt u optie 2.2.2; om de software en het bestand voor 384-SPOT in te stellen, volgt u optie 2.2.3.
    2. Instellen van de plottersoftware en het 96-SPOT-plotbestand
      1. Open in de software-app het SVG-bestand voor 96-SPOT (aanvullend bestand 1; Figuur 4A). Navigeer op de menubalk naar Extensies > plotterbesturing (Afbeelding 4B).
      2. Wanneer het nieuwe venster verschijnt, past u de instellingen aan zodat ze overeenkomen met Aanvullende Afbeelding 1. Keer terug naar het tabblad Plot van het venster Plotterbesturingsextensie. Laat dit open voor later.
    3. Instellen van de API van de vectorplotterbesturingsbibliotheek en het 384-SPOT-plotbestand
      1. Open het opdrachtpromptvenster (Windows) of Terminal (Mac). Voer de opdracht in om de aangewezen interactieve computernotebook te starten. Zorg ervoor dat het notitieblok in een browser wordt geopend.
      2. Selecteer het 384-SPOT-codebestand (aanvullend bestand 2) om te openen. Gebruik een 20G-tip (of 16G-tip voor het 384-SPOT-patroon) om 1 ml PMMA-acetonoplossing op te zuigen met de 3 ml-plotspuit (Figuur 3C).
        OPMERKING: De debietregelklep tussen de 10 ml vulspuit en de EVA-slang moet open zijn (parallel aan het vat). Aangezien het infiltratieproces door zwaartekracht wordt aangedreven, moet u ervoor zorgen dat de plotspuit van 3 ml altijd tussen de markering van 0,5-1,5 ml wordt gevuld om een consistent doseervolume tijdens het plotten te behouden.
    4. Terwijl de punt van de plotspuit van 3 ml zich nog in de PMMA-acetonoplossing bevindt, sluit u de stroomregelklep tussen de laadspuit van 10 ml en de EVA-slang (breng deze loodrecht op het vat).
    5. Sluit snel de tube PMMA-acetonoplossing. Plaats de spuit van 3 ml op de pennenhouder. Pas de hoogte van de spuit ten opzichte van de houder aan om de volgende uitlijning te bereiken (Afbeelding 3D).
    6. Pas de positie van de clipezel zo aan dat de punt van de spuit van 3 ml rust op de oorsprong van het geplotte patroon (d.w.z. de donkere stip linksboven in het sjabloonpatroon). Til de plotterpenhouder met de spuit erop op om de Clip Easel eronder te schuiven.
    7. Koppel de spuit van 10 ml snel los van de slang om de atmosferische druk druk te laten uitoefenen op de PMMA-acetonoplossing die is opgeslagen in de plotspuit van 3 ml. Open de debietregelklep.
    8. Om te beginnen met het uitzetten van het 96-SPOT-patroon, volgt u stap 2.2.9; om te beginnen met het plotten van 384-SPOT, volgt u stap 2.2.10.
    9. Start het plotten van 96-SPOT in de aangewezen plotter zoals hieronder beschreven.
      1. Klik in de software op Toepassen op de plotter Control Extensions. De plotter begint nu te draaien en zet het PMMA-patroon uit. Er zijn geen verdere acties nodig totdat het plotten is voltooid en de plotterpennenhouder terugkeert naar zijn uitgangspositie.
      2. Om de plotter tijdens het plotten te pauzeren, drukt u op de kleine zilveren knop aan de linkerkant van de plotter. Kies vervolgens via het tabblad Plotterbesturingsextensies > tabblad Hervatten in de grafische software om het plotten te hervatten vanaf het punt waar het stopte of om de penhouder terug te brengen naar de uitgangspositie (aanvullende afbeelding 1C(iii)).
    10. Start het plotten van 384-SPOT in de aangewezen computerinterface zoals hieronder beschreven.
      1. Klik in de interface op Kernel opnieuw opstarten en opnieuw uitvoeren (dubbele pijl op de werkbalk). De code begint nu te lopen en zet het PMMA-patroon uit. Er zijn geen verdere acties nodig totdat het patroon klaar is met plotten en de penhouder terugkeert naar zijn uitgangspositie.
      2. Als u de plotter tijdens het plotten wilt pauzeren, drukt u op de Small Silver-knop aan de linkerkant van de plotter. Beweeg de printkop handmatig helemaal naar achteren en naar links, zodat deze zijn uitgangspositie bereikt. Sluit de plotter weer aan op een stopcontact. In tegenstelling tot het plotten van 96-SPOT, is er geen manier om het plotten voor 384-SPOT te hervatten vanaf het punt waar het was gepauzeerd; Vervang een papieren steiger en begin de code vanaf het begin.
  3. Spuit uitladen en opruimen
    1. Zodra het plotten is voltooid, bevestigt u de spuit van 10 ml weer aan de slang. Haal de spuit van 3 ml uit de plotterpenhouder en breng de resterende PMMA-acetonoplossing terug in de voorraadflacon of gooi deze weg als er tijdens de voorgaande stappen aanzienlijke verdamping is opgetreden.
    2. Was het vat van de spuit van 3 ml door in aceton te pipetteren. Laat het spuitslangsysteem aan de lucht drogen voordat u het terugplaatst op de opslagplaats.
    3. Maak de SPOT-steiger voorzichtig los van de Clip Easel.
    4. Inspecteer de SPOT-steigers die zijn uitgezet om er zeker van te zijn dat ze kunnen worden gebruikt voor experimenten (Figuur 3E,F). Raadpleeg Tabel 1 voor probleemoplossing en Tabel 2 en Tabel 3 voor kwaliteitsborging en -beheersing voor richtlijnen.
    5. Bewaar alle steigers met PMMA-patroon in een gripzak op een koele, droge plaats.

3. 96/384-well tape snijden

(timing: voor 96-SPOT-patronen: 15 minuten per 5 stuks tape; voor 384-SPOT-patronen: 30 minuten per 5 stuks tape)

OPMERKING: Dit is een van de meest efficiënte manieren om tapes nauwkeurig en efficiënt te snijden, met name voor 384-well tapepatronen. Deze methode biedt ook de mogelijkheid om één laag van de tape (topcover plastic) met een laser te graveren om de bruikbaarheid tijdens het assemblageproces te verbeteren. Als alternatief kunnen de tapes ook langzamer worden gesneden met papiersnijders zonder het graveerproces.

  1. Open het lasersnijbestand met 96-/384 putjes met tapepatroon (aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4) en laad het afdrukpatroon gecodeerd met drie verschillende kleuren in de lasersnijsoftware door op Plot te klikken met de volgende instellingen in aanvullende afbeelding 2A.
  2. Laad een stuk tape op het oppervlak van de lasersnijder en zorg ervoor dat de tape soepel op het oppervlak wordt afgevlakt. Gebruik papieren tapes of zware gewichten om tapes vast te houden tijdens het snijden.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de tape plat op het oppervlak van de lasersnijder ligt. Elke hobbel kan de kwaliteit van gesneden tapes beïnvloeden, met name 384-well tapes.
  3. Pas de locatie van het afdrukpatroon aan zodat deze is uitgelijnd met de locatie van de tape op basis van de handleiding van de lasersnijder.
  4. Snijd beide tapes met 96/384 putjes met dezelfde lasersnijderinstelling zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 2B. De volgorde van lijnen met specifieke kleuren is belangrijk. Knip eerst de rode lijn af voor de groene lijn. Knip het blauw aan het uiteinde.
    Rode lijn: Rast/Vest-modus met 45% laservermogen, 80% snelheid, 1000 PPI en 0,50 mm Z-as.
    Groene lijn: Rast/Vest-modus met 7% laservermogen, 100% snelheid, 1000 PPI en 0,50 mm Z-as.
    Blauwe lijn: Rast/Vest-modus met 50% laservermogen, 80% snelheid, 1000 PPI en 0,50 mm Z-as.
  5. Bewaar tapes met patronen op de juiste manier totdat ze op de SPOT zijn gemonteerd.

4. 96/384-SPOT Montage (timing: 1 uur)

OPMERKING: In dit gedeelte wordt de procedure beschreven voor het monteren van 96-/384-SPOT-apparaten in een steriele omgeving, zoals een bioveiligheidskast (BSC). Als alternatief kunnen de 96-/384-SPOT-apparaten worden voorgemonteerd in een niet-steriele omgeving en vervolgens worden gesteriliseerd via een ethyleengassterilisatieproces.

  1. Voorbereiding van de SPOT-steiger voor montage
    1. Neem een steiger met PMMA-patroon voor 96- of 384-SPOT. Knip het overtollige papier rond het blauwe gebied van de steiger. Laat 5 mm witruimte rond de omtrek van het blauwe gebied. De resulterende plaat zal ongeveer 760 mm x 1300 mm zijn.
      OPMERKING: Snijd de grondlijn niet af. Het is nuttig om te bepalen welke kant van de steiger ruw/glad is (Figuur 3E,F).
    2. Om een 96-SPOT steiger klaar te maken voor montage, volgt u stap 4.1.3. Om een 384-SPOT steiger voor te bereiden, volgt u stap 4.1.4.
    3. Voer perforatie uit van ruimtes tussen de putten op de 96-SPOT steiger.
      1. Leg een stuk polyethyleenfolie (1000 mm x 1500 mm) op een stijve acryllaag (2700 mm x 2700 mm). Plaats de met polyethyleenfolie bedekte steun op het werkblad en leg de steiger over de polyethyleenfolie (Figuur 5A).
      2. Lijn een rand van de liniaal uit tussen de eerste twee rijen, zodat het overtrekken langs deze rand niet in een put terechtkomt.
      3. Plaats het overtrekwiel tegen de liniaal aan de onderkant van de steiger. Rol het volgwiel omhoog naar de bovenkant van de steiger en gebruik de liniaal om het pad van het blad te geleiden. Herhaal dit voor alle ruimtes tussen de rijen op de steiger (d.w.z. 7x).
      4. Herhaal stap 4.1.3.2 en 4.1.3.3 voor elke andere ruimte tussen de kolommen, te beginnen met de ruimte tussen de eerste twee kolommen.
    4. Voer geen perforatie uit van de ruimtes tussen de putten op de 384-SPOT steiger door de onderstaande stappen te volgen.
      1. Perforeer de tussenruimten van de 384-SPOT steiger niet. Ga direct door naar stap 4.2.
  2. Steriliseren van SPOT-materialen en montageapparatuur
    1. Plaats de bedrukte steiger, twee tapes met 96 putjes (of tapes met 384 putjes), een bodemloze plaat met 96 putjes (of een bodemloze plaat met 384 putjes), de plaatafdekking met 96 putjes (of de plaatafdekking met 384 putjes), de polycarbonaatfolie, de polydimethylsiloxaan (PDMS)-plaat, de hersluitbare plastic zak, het pincet en het precisiemes in de BSC, UV gedurende 20 minuten aan één kant (Figuur 5B).
    2. Draai alle materialen en montageapparatuur op de andere kant en UV nog 20 minuten.
  3. Bevestiging van de steiger aan de eerste 96/384-well tape
    1. Leg de steiger met de ruwe kant naar boven (Figuur 3F) op de PDMS-plaat, zodat de rijen horizontaal lopen. Gebruik de grondlijn om te bepalen welke kant ruw is (de rechts uitgelijnde grondlijn geeft de ruwe kant naar boven aan).
    2. Strijk de steiger glad op de PDMS-plaat zodat er geen rimpels of luchtbellen op (of onder) de steiger zijn. Verwijder de beschermlaag van de niet-gegraveerde kant van de dubbelzijdige tape. Gesp het midden van de tape lichtjes vast en lijn de middelste twee kolommen van de tape uit met de steiger.
    3. Eenmaal uitgelijnd, drukt u het midden van de tape naar beneden. Strijk de tape glad op de steiger, beginnend vanuit het midden en naar buiten toe.
      OPMERKING: Een onjuist uitgelijnde steiger heeft een duidelijk PMMA-patroon dat overlapt in het goed zaaigebied.
    4. Gebruik het pincet om de steiger voorzichtig van de PDMS-plaat te verwijderen en bewaar de plaat voor toekomstige fabricages.
  4. Bevestiging van steiger aan tweede band met 96/384 putjes
    1. Plaats de steiger op de werkbank. Draai de steiger om zodat de gladde kant (niet-getapete kant) naar boven wijst.
    2. Verwijder de middelste beschermlaag van de gegraveerde zijde van de tweede tape. Zorg ervoor dat de twee middelste kolommen van de tape zichtbaar zijn. Als het niet-gegraveerde tape-ontwerp wordt gebruikt, verwijder dan de beschermlaag aan één kant volledig.
    3. Gesp het midden van de tape lichtjes vast en lijn de middelste twee kolommen van de tape uit met de steiger.
    4. Zodra de tape is uitgelijnd met de steiger, drukt u het midden van de tape naar beneden. Als het ontwerp van de gegraveerde tape wordt gebruikt, verwijdert u de andere twee beschermlagen naast het blootgestelde middengedeelte van de tape. Strijk de tape glad op de steiger, beginnend vanuit het midden en naar buiten toe.
  5. Bevestiging van de steiger aan de bodemloze plaat
    1. Verwijder de beschermlaag van de tape van de ruwe kant van de steiger. Als u het gegraveerde tape-ontwerp gebruikt, verwijdert u alleen de middelste beschermlaag.
    2. Lijn de steiger uit met de onderkant van de bodemloze plaat (met een deksel). Eenmaal uitgelijnd, drukt u het midden van de steiger op de onderkant van de plaat. Als u het gegraveerde ontwerp gebruikt, verwijdert u de beschermlagen naast het blootgestelde midden. Strijk de steiger vanuit het midden naar buiten glad op de plaat.
  6. Bevestiging van de steiger aan de polycarbonaatfilm
    1. Maak met een pincet voorzichtig de beschermlaag van de polycarbonaatfilm los. Eenmaal los, pelt u langzaam de beschermlaag van de film. Maak geen inkepingen in de film, omdat dit de optische eigenschappen voor microscopische beeldvorming beïnvloedt.
    2. Herhaal stap 4.6.1 met de andere kant van de polycarbonaatfilm. Zodra beide beschermlagen zijn verwijderd, legt u de film opzij op de werkbank.
    3. Verwijder de beschermlaag van de tape die aan de onderkant van de plaat is bevestigd. Druk de polycarbonaatfilm op de steiger, beginnend vanuit het midden naar buiten.
    4. Druk de polycarbonaatfilm stevig op de bodem van de plaat, zodat alle putjes een goed uitgesproken rand krijgen.
    5. Snijd met een precisiemes voorzichtig het overtollige materiaal van de plaatbodem af.
      NOTITIE: Let er extra op dat u niet in de plaat of een van de putjes snijdt. Als het mes niet gemakkelijk doorsnijdt, controleer dan of het in de plaat snijdt.
  7. Opslag van 96/384-SPOT na montage
    1. Nadat u 96-SPOT volledig in elkaar hebt gezet, plaatst u het in een doorzichtige hersluitbare plastic zak. Neem de tas mee buiten de BSC.
    2. Plaats een stijve acrylsteun aan de onderkant van de plaat. Klem de acrylsteun op de plaat op tegenoverliggende hoeken (Figuur 5C). Houd voor gebruik minimaal 30 minuten op elke hoek geklemd.
    3. Bewaar de plaat tot gebruik in een schone, droge ruimte.

5. 96/384-SPOT zaaien (timing: 2 uur en 45 min)

OPMERKING: In dit gedeelte wordt de procedure beschreven voor het zaaien van 96-/384-SPOT-apparaten om uniforme 3D-microweefsels te maken. Het zaaiproces omvat het zorgvuldig doseren van een bepaald celgelvolume (bijv. 5 μL voor 96-SPOT of 2 μL voor 384-SPOT) op de voorgemonteerde SPOT-steiger. Om een gelijkmatige infiltratie en gelverdeling te garanderen, wordt de celgeldruppel door middel van capillaire afvoer langs de poreuze structuur van de steiger geleid. Deze stap kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een micropipet of worden geautomatiseerd met vloeistofbehandeling. Na het zaaien worden de platen bij 37 °C geïncubeerd om gelpolymerisatie en celinkapseling mogelijk te maken.

  1. Voorbereiding van de 96/384-SPOT plaat
    1. Maak 96-/384-SPOT los en verwijder de acrylsteun van de onderkant.
    2. Verwijder in een BSC SPOT uit de plastic zak. Zet de UV aan om de binnenkant van de plaat te steriliseren en dek 20 minuten af voordat u het deksel sluit en naar de bodem van de plaat draait voor nog eens 20 minuten UV-behandeling.
    3. Pipetteer 70 μL PBS in elke ruimte tussen de openingen van de 96-SPOT-plaat. Pipetteer PBS niet in de 384-SPOT-plaat. Koel de plaat voor het zaaien minimaal 30 minuten af op 4 °C.
  2. Preparaat van cellen
    1. Maak cellen los van kweekkolven of organoïden van gelkoepels op basis van de aanbevolen behandeling en tel de celhoeveelheid met behulp van de hemocytometer volgens de instructies van de fabrikant. Noteer de celdichtheid van de celsuspensie (d.w.z. het aantal cellen per ml) om het celsuspensievolume te berekenen dat nodig is voor de stappen 5.4.1-5.4.2 op basis van de gewenste zaaidichtheid.
  3. Bereiding van de gel
    1. Volg de eerder geoptimaliseerde instructies voor de hydrogelbereiding 17,19,20,21 en maak de hydrogel door 1 ml 3 mg/ml type 1 rundercollageen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml te doseren.
      OPMERKING: De componenten en het resulterende mengsel moeten gedurende de bereidingstijd op ijs worden bewaard.
    2. Doseer 125 μL 10x geconcentreerd minimaal essentieel medium (MEM) in het rundercollageen. Pipetdruk langzaam op en neer om te mengen tot het mengsel van roze naar geel verandert.
    3. Doseer 8 μl 0,8 M natriumbicarbonaat in het collageenmengsel van runderen. Pipette langzaam op en neer om te mengen tot het mengsel lichtroze wordt. Gebruik de gemengde oplossing binnen 30 minuten na de bereiding om een consistente geleerling in meerdere experimenten te garanderen.
      OPMERKING: Als het mengsel geel blijft, titreer de oplossing dan tot pH 7 door 0,8 M in 0,5 μL aliquots toe te voegen tot een lichtroze kleur is bereikt. OPTIONEEL: Volgens dezelfde procedure kan de gel worden bereid voor culturen die een hogere collageenconcentratie vereisen. Gebruik voor het kweken van organoïden de hydrogelmix die wordt gekenmerkt door Landon-Brace et al.17.
  4. Suspensie van cellen in gel
    1. Doseer het volume celsuspensie dat nodig is voor de beoogde celgeldichtheid in een microcentrifugebuisje en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g .
    2. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de celpellet in gel (volume varieert afhankelijk van de doelconcentratie)
  5. 96-/384-SPOT plaat handmatig zaaien
    1. Plaats de 96-/384-SPOT-plaat op een bevroren ijspak. Volg stap 5.5.2 om 96-SPOT te zaaien. Volg stap 5.5.3 om 384-SPOT te zaaien.
    2. Handmatig zaaien 96-SPOT
      1. Smeer een pipetpunt van 10 μL voor met het cel-gelmengsel. Zuig 5 μL gel op met behulp van een pipet van 20 μL en werp uit tot de eerste stop totdat er zich een druppel vormt aan de punt. Raak de druppel aan op het midden van een putje.
        OPMERKING: Als u de gel uitwerpt door de pipet tot de tweede stop te drukken, kunnen er luchtbellen ontstaan. Alle putjes moeten binnen 5 minuten worden gezaaid voor een consistente geleerling tussen de putjes.
      2. Na het zaaien van alle gewenste putjes, dek de plaat af en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten volgens de instructies van de fabrikant om de gel te polymeriseren. Doseer 200 μL media in elke gezaaide put en incubeer minimaal 1 ononderbroken uur voordat er enige vereiste beeldvorming of verstoring optreedt.
    3. Handmatig zaaien 384-SPOT
      1. Smeer een pipetpunt van 10 μL voor met het cel-gelmengsel. Zuig 2 μL gel op met behulp van een pipet van 10 μL en werp uit tot de eerste stop totdat er zich een druppel vormt aan de punt.
        OPMERKING: Een meerkanaals pipet van 10 μL wordt sterk aanbevolen.
      2. Raak de druppel aan op het midden van een putje. Na het zaaien van alle gewenste putjes, dek de plaat af en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten volgens de instructies van de fabrikant om de gel te polymeriseren.
      3. Doseer 60 μL media in elke gezaaide put en incubeer gedurende minimaal 1 uur ononderbroken voordat de beeldvorming of verstoring vereist is.
    4. Zaaien van 96/384-SPOT met behulp van een liquid handler
      1. Zet tijdens de bereiding van het cel-gelmengsel de vloeistofverwerker en de HEPA-filtermodule op hoog. Spuit voorzichtig 70% ethanol in de vloeistofverwerker en veeg het af met met ethanol doordrenkte papieren handdoeken.
      2. Laad het 96-SPOT- of 384-SPOT-zaaiprotocol (aanvullend bestand 5 of aanvullend bestand 6) voordat u de pipetkopkalibratie uitvoert. Installeer temperatuurmodules in sleuven 1 en 4 (Figuur 6A).
      3. Gebruik voor kalibratiedoeleinden de aangewezen dozen met P20- en P200-filtertips. Laad ze in respectievelijk sleuf 5 en 6 (Afbeelding 6B). Kalibreer de pipetkop op basis van de aanwijzingen die in de software worden weergegeven. Schakel na de kalibratie over naar de steriele P20- en P200-filtertipbox voor zaaien op de sleuven 5 en 6. Spuit het oppervlak opnieuw met 70% ethanol en sluit de deur tot het zaaien.
        OPMERKING: Het is essentieel om de tips nauwkeurig te kalibreren tot aan de bovenkant van de 96-/384-SPOT-plaat. Het wordt aanbevolen om plaatafdichtingstape te gebruiken om de z-as van de uiteinden ten opzichte van de bovenkant van de plaat te visualiseren. De ideale positie is wanneer de uiteinden op de meerkanaalskop allemaal de plaatafdichtingstape raken en een klein deukje veroorzaken.
    5. Zet beide temperatuurmodules aan en stel ze in op 4 °C terwijl de cellen zich op de laatste draaistap bevinden tijdens de bereiding van het cel-gelmengsel. Na voltooiing van stap 5.4 laadt u de gewenste hoeveelheid cel-gelmengsel in elk buisje van de 8-strip 0.2 ml PCR-buisjes in de BSC.
      OPMERKING: Het minimale volume cel-gelmengsel dat in elke buis moet worden geladen is: 96-SPOT: 5 μL vermenigvuldigd met het aantal kolommen dat moest worden gezaaid plus het dode volume; 384-SPOT: 2 maal 2 μL vermenigvuldigd met het aantal kolommen dat gezaaid moest worden en dan plus het dode volume. Het dode volume wordt aanbevolen om ongeveer 10 - 20 μL per buis te zijn om luchtbellen en onvolledige kolommen tegen het einde te voorkomen.
    6. Sluit de 8-strip 0,2 ml PCR-buisjes met behulp van de 8-strip platte doppen voordat u het cel-gelmengsel uit de BSC op ijs overbrengt.
    7. Laad de voorgekoelde SPOT-plaat op de temperatuurmodule op sleuf 4 met het formaatblok van de vlakke bodemplaat (Figuur 6B).
    8. Laad de 8-strip PCR-buisjes van 0.2 ml met cel-gelmengsel op de temperatuurmodule op sleuf 3 met het blok met 96 putjes.
    9. Open de platte doppen en het deksel van de SPOT-plaat en bewaar ze in de vloeistofverwerker, maar uit de buurt van de gebruikte sleuven. Open het deksel van de P20 en P200 filtertipbox.
    10. Voer het protocol uit. Na het zaaien van alle gewenste putjes, dek de plaat af en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten volgens de instructies van de fabrikant om de gel te polymeriseren.
    11. Doseer 200 μL of 60 μL (96-/384-SPOT) media in elke gezaaide put en incubeer minimaal 1 uur ononderbroken voordat de beeldvorming of verstoring vereist is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PMMA-patronen van de papieren steiger dienen als een fysieke barrière om inhoudsuitwisseling tussen putten te voorkomen. Dit ontwerp is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat aangrenzende putten chemisch en biologisch geïsoleerd blijven, waardoor onbedoelde diffusie van media, medicijnen, uitgescheiden factoren of zelfs cellen14 wordt voorkomen. De integratie van PMMA zorgt voor een nauwkeurige compartimentering, waardoor SPOT een betrouwbaar platform is voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol wordt een gedetailleerde handleiding gegeven voor de fabricage en het gebruik van SPOT met 96 en 384 putjes, die betrekking heeft op assemblage, handmatige en door vloeistofverwerker ondersteunde celgelzaaiing. In tegenstelling tot traditionele hydrogelplugsystemen, elimineert SPOT meniscusgerelateerde artefacten, waardoor niet-destructieve, in situ beeldvorming van organoïden mogelijk wordt, zoals eerder beschreven 14,16,22.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de hulp van Jennifer Lam bij het verwerven van afbeeldingen. Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 7A zijn gemaakt met BioRender.com. Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery grant (grant #RGPIN-2021-03488) aan A.P.M.; het Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions-programma aan APM; de NSERC Canada Graduate Scholarships - Doctoraatsprogramma aan RC; de Peterborough KM Hunter Charitable Foundation Award aan RC; de National Research Council (NRC) CRAFT Fellowship toegekend aan N.T.L.; de NSERC CREATE TOeP naar N.T.L.; de NSERC Undergraduate Student Research Award voor Z.K.; en de University of Toronto Excellence Award voor CMT

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2mL PCR-buisjes (stroken van 8) Sarstedt72.985.002
1.5mL centrifugebuisjeFroggaBioLMCT1.7B
1000-μL pipette tipsEclipse4-1019-260-000
10-mL serologische pipettenFroggaBio394010
10-mL spuitBD, Canada302995
10x minimaal essentieel medium (MEM 10x)Gibco11430030
150-mm schaalCorning430599
16-gauge doseertips met Luer-lock aansluitingMcMaster-Carr, Illinois, USA6699A2
20µL filter tips racksOpentrons999-00099
200µL filter tips racksOpentrons999-00081
200-μL pipette tipsEclipse4-1030-260-000
20-gauge doseertips met Luer-lock aansluitingMcMaster-Carr, Illinois, USA6699A4
384-well no-bottom well plate (zwart)Greiner82051-544
3-mL spuit BD, Canada309657
50-mL polypropyleen conische centrifugebuisVWRCA21008-940
50-mL polypropyleen conische centrifugebuisVWRCA21008-940
96-well no-bottom well plate (zwart)Greiner82050-714
AcetonFisher ScientificA18-1
Analytische weegschaalN/AN/A
AxiDraw-extensie voor Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)N/AN/A
AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) N/AN/A
AxiDraw V3 High Performance Personal Writing and Drawing MachineEvil Mad Scientists, USAN/A
Bovine collageen (PureCol 3 mg/ml)Advanced BioMatrix5005
Cellijn naar keuzeN/AN/A
Clip Easel (inbegrepen in AxiDraw V3-pakket)Evil Mad Scientists, USAN/A
Kweekmedium naar keuzeN/AN/A
Dirt-Trapping Protection Tape3M6851 PN36851
Dubbelzijdige polyacrylische kleefband (800 mm x 1200 mm)Adhesive Research, ARcare90106NB
Fetaal bovien serum (FBS)Gibco12483-020
Finum theefilters XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Duitsland420.69.00
Vlakke doppen voor 0.2mL PCR-buisjes (stroken van 8)Sarstedt65.989.002
Zware plastic veerklemmenBENCHMARK1024-554
HEPA-module – 110-130V 60Hz modelOpentrons999-00109
IJszak (bevroren, 1400 mm x 1800 mm)N/AN/A
Inkscape-softwareN/AN/A
LasersnijderUniversal Laser SystemVLS3.75
Miniatuur ethyl vinylacetaat (EVA) slang met een buitendiameter van 0,07 inchMcMaster-Carr, Illinois, USA1883T3
Multi-kanaals elektronische pipet P20 (Gen2)Opentrons999-00005
Multi-kanaals elektronische pipet P300 (Gen2)Opentrons999-00006
NagellakSally HansenSBS-006861Optioneel, voor pigmentatie van PMMA-inkt
Opentrons OT-2Opentrons999-00111
P1000 pipetGilsonFA10006M
P200 8-kanaals pipetGilsonF144072
P200 pipetGilsonFA10005M
PapierhanddoekenN/AN/A
ParafilmBemis Company, Inc.52859-079
Bakpapier  N/AN/A
Pasteur-pipettenVWR14672-380
Penicilline-streptomycine (P/S)Sigma-AldrichP4333
Poly(methylmethacrylaat) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Polycarbonaatfolie (760 mm x 1300 mm)McMaster-Carr85585K102
Polydimethylsiloxaanmonomeer en cross-linker (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Ellsworth Adhesives4019862
PrecisiemesN/AN/A
Stijve acrylsteun (maat afgestemd op de bodem van de well plate)McMaster-Carr8560K239
Stijve kartonnen steunN/AN/A
LinialenN/AN/A
Scharen N/AN/A
Natriumbicarbonaat (0,8M in gedistilleerd water)Sigma-AldrichS6014
Temperatuur deck met aluminium blokken (Gen2)Opentrons999-00097
Traceerwiel HEEPDD (Amazon)B07YQWB284
Transparante tape N/AN/A
TrypanblauwGibco15250-061

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Pati ntafgeleide organo denOrgano dkweekplatformHigh throughputscreeningHydrogelplatformGeautomatiseerde vloeistofafhandelingWeefseltechnologieModellering van kankerziektenOrgano de imaging3D celkweek

Gerelateerde artikelen