Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Summary

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Abstract

Genetisch gecodeerde biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen voor informatieverwerking met hoge doorvoer, waardoor omgevings- of chemische invoersignalen kunnen worden omgezet in een verscheidenheid aan outputs. Dit maakt dynamische detectie, directe controle en verfijnde regulatie van genexpressie mogelijk in een breed scala aan biotechnologische toepassingen, waaronder enzymoptimalisatie, stamontwikkeling en microbiële procescontrole. Om ze geschikt te maken voor het beoogde doel, kunnen de prestaties van biosensoren worden verfijnd door de stoichiometrie van biosensorcircuitcomponenten (bijv. transporters, invoer- en uitvoermodules) aan te passen en/of de bijbehorende gastheer-biosensor intermoleculaire interacties af te stemmen (bijv. DNA-eiwit, eiwit-eiwit). Hier creëert het enorme aantal mogelijke biosensorpermutaties echter een complexe combinatorische ontwerpruimte, die een zorgvuldige optimalisatie van screeningstrategieën vereist om configuraties te identificeren die de gewenste fenotypische prestaties leveren. Deze complexiteit wordt nog verergerd door prestatiekenmerken van biosensoren, zoals afstembaarheid, die effectortitratieanalyse vereisen onder monoklonale screeningsomstandigheden. De noodzaak om diverse sequenties en experimentele ruimte te verkennen, maakt fractionele bemonsteringsmethoden dan ook bijzonder geschikt voor dit doel. Aan de basis van deze workflow liggen Design of Experiment (DoE)-algoritmen, die goed gepositioneerd zijn om efficiënte, statistisch onderbouwde gestructureerde mapping en fractionele bemonstering van deze combinatorische experimentele ontwerpruimte mogelijk te maken.

Hierin wordt een gecombineerde high-throughput automatisering en computationele benadering gerapporteerd om de ontwerpruimte van op allosterische transcriptiefactoren gebaseerde biosensoren efficiënt te bemonsteren om verschillende configuraties met zowel digitale als analoge dosis-responscurven mogelijk te maken. Het protocol begint met het maken en automatisch selecteren van bibliotheken met promotor- en ribosoombindingssites. Deze bibliotheken, en de bijbehorende expressiegegevens, worden getransformeerd in gestructureerde dimensieloze inputs, waardoor computationele mapping van de volledige experimentele ontwerpruimte mogelijk is. Fractionele bemonstering wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van een DoE-algoritme en gekoppeld aan effectortitratieanalyse met behulp van een automatiseringsplatform met hoge doorvoer. Deze workflow biedt een agnostisch kader voor de ontwikkeling en optimalisatie van toekomstige biosensorsystemen en genetische circuits, en biedt een regelgevende toolkit voor de gemeenschap van synthetische biologie.

Introduction

Het vermogen om de expressie van genen te reguleren is een essentiële functie in alle levensvormen en vergemakkelijkt dynamische, real-time reacties op zowel interne als externe invloeden, variërend van chemische effectoren tot biofysische stimuli¹. Het talloze transcriptionele regulerende systemen dat in de natuur wordt aangetroffen, heeft een enorm potentieel voor de vergroting en versnelling van metabole engineering en biotechnologisch onderzoek dat mogelijk wordt gemaakt door synthetische biologie. In prokaryoten wordt een groot deel van de regulatie die in de cel plaatsvindt gecontroleerd door middel van één-component regulerende mechanismen die worden aangedreven door de interacties van allosterische transcriptiefactoren (aTF's) met een aantal kleine molecuuleffectoren². Doorgaans bestaande uit een effectorbindingsdomein (EBD) en DNA-bindend domein (DBD), fungeren aTF's als moleculaire schakelaars bij binding aan specifieke kleine molecuuleffectoren, waarbij de affiniteit van hun DBD voor specifieke DNA-operatorsequenties in de promotorregio's van het genoom wordt gemoduleerd, wat resulteert in activering of onderdrukking van transcriptie³. Dit bedrieglijk eenvoudige mechanisme heeft geleid tot een aantal uiteenlopende reguleringsstrategieën, variërend van repressie-/de-repressiesystemen tot activatoren die in staat zijn om een duizelingwekkend aantal effectoren met kleine moleculen of omgevingsstimuli te detecteren en erop te reageren⁴. Bijgevolg heeft de synthetische biologie deze diversiteit benut om genetisch gecodeerde biosensoren te construeren die in staat zijn om een overvloed aan invoersignalen te koppelen aan op maat gemaakte outputs, d.w.z. de productie van fluorescerende reportereiwitten en de regulering van synthetische routes. Wanneer dergelijke systemen worden toegepast in biotechnologische workflows, maken ze het mogelijk om in realtime de intracellulaire concentraties van metabolieten te monitoren, dynamische regulatie van routes en gemakkelijke uitlezingen te maken, wat helpt bij de ontwikkeling van efficiëntere routes, stammen en bioprocessen 5,6,7,8.

In wezen worden biosensoren gekarakteriseerd op basis van een aantal parameters, waaronder specificiteit, operationeel bereik, dynamisch bereik, gevoeligheid en helling, waarbij de dosisresponscurve van een biosensor deze parameters beschrijft via het uitgangssignaal als functie van de ligandconcentratie (Figuur 1)9,10,11,12 . De Hill-vergelijking kan worden gebruikt om te passen bij de prestatiekenmerken van een biosensor, waarbij semi-empirisch bewijs wordt geleverd voor elk van de hierboven beschreven parameters, waardoor het biosensorsysteem kan worden gekarakteriseerd en tegelijkertijd kan worden beoordeeld welke inspanningen nodig zijn om het systeem af te stemmen op toepassingsgerichte resultaten. Specificiteit kan worden gedefinieerd als de relatieve verschillen in signaaloutput die door één effector worden geïnduceerd in vergelijking met een reeks andere potentiële effectormoleculen en worden doorgaans gemoduleerd op het EBD-niveau van de aTF. Operationeel bereik wordt gedefinieerd als het bereik van ligandconcentraties dat de biosensor kan detecteren, waarbij het concentratiebereik wordt bepaald waarop de biosensor kan reageren. Dynamisch bereik daarentegen beschrijft de verhouding tussen de hoogst meetbare activeringstoestand (AAN) en de geïnactiveerde (UIT) toestand en is een belangrijke parameter om ervoor te zorgen dat de biosensor effectorconcentraties boven achtergrondautofluorescentie¹⁰ betrouwbaar rapporteert. Gevoeligheid voor het effectormolecuul wordt beschreven als de concentratie die nodig is om een bepaald uitgangssignaal op te wekken, gemeten aan de hand van de halve maximale concentratie (EC₅₀) van de effector¹³. Ten slotte wordt de helling van de curve aangeduid door de coöperatie (n_H) van de aTF voor de locatie van de operator bij de promotor en resulteert in een meer digitaal of analoog responsuitgangsprofiel. Coöperatie komt voort uit eiwit-eiwitinteracties tussen ligandgebonden aTF's die multimere complexen vormen die de affiniteit voor de operatorlocatie versterken, wat resulteert in een sterke toename van het reactievermogen van het circuit met verzadigende ligandconcentraties en een meer digitaal responsprofiel¹⁴.

De dosisresponskarakteristieken van een biosensor kunnen de geschiktheid van zijn toepassingen aanzienlijk beïnvloeden en zijn vaak een 'make or break'-punt voor elke conceptuele toepassing. De prestaties van biosensoren kunnen enorm variëren van systeem tot systeem, waarbij het operationele bereik doorgaans varieert van 0,1 nM-10 mM¹³, terwijl het dynamische bereik kan variëren van 1,4-2000 keer¹⁵. Bovendien, hoewel het aantal effectorverbindingen dat voor aTF's wordt gerapporteerd breed is (metabole producten, aminozuren, metalen, antibiotica, quorum sensing, enz.)¹¹, het is niet allesomvattend en vormt een uitdaging voor onderzoekers wanneer er nog geen geschikte biosensor voor hun effector in de literatuur bestaat. Synthetische biologie maakte de engineering mogelijk van biosensoren die dergelijke uitdagingen aanpakken, waardoor de reikwijdte van de effector en de dosis-responskenmerken beter kunnen worden afgestemd op de onderzoeksresultaten van de toepassing, en is gebruikt om beide bovengenoemde problemen aan te pakken, respectievelijk^16,17. Twee belangrijke gebieden voor engineering zijn te bereiken via synthetische biologie, het promotorgebied van de biosensor en de aTF zelf, die hun effecten op transcriptie- en eiwitniveau mediëren. Benaderingen die zich richten op de genetische elementen van de biosensor om de prestaties op promotorniveau te moduleren, omvatten engineering van de RBS, operatorlocaties en -35, -10 (hexboxen) om de gevoeligheid, operationele en dynamische bereiken af te stemmen, en zijn de focus van de methodologie die in dit manuscript wordt beschreven (Figuur 1). Als alternatief kan het wijzigen van de selectiviteit en gevoeligheid van de biosensor door analyse van het effectorbindingsdomein en de mutatie van residuen die betrokken zijn bij effectorcoördinatie (met behulp van sequentiehomologie en/of structurele biologie) de respons op een verwante effector moduleren ^18,19,20 of volledig veranderen in de richting van een niet-verwante effector van belang 16,17,21. Dergelijke afstemmingsinspanningen kunnen biosensoren vervolgens naar specifieke toepassingen leiden, waarbij dit gewoonlijk metabole controllers zijn (feedbacklussen, controlecircuits), primaire screeningsinstrumenten (ontdekking van enzymen of stammen), secundaire screeningsinstrumenten (screening van enzymvarianten, metabole engineering) en bioprospectie van transporters 22,23,24. Een voorbeeld hiervan is het gebruik van een muconzuur-responsieve aTF, CatM, gecombineerd met een gemanipuleerde promotorsequentie om het dynamische en operationele bereik te verbeteren. Dit systeem werd geïntegreerd met fluorescentie-geactiveerde celsortering om de meest effectieve muconzuurproductiestammen te isoleren op basis van GFP-fluorescentie volgens adaptieve laboratoriumevolutie²⁵.

Hoewel het succes van de hierboven geschetste technische strategieën vanzelfsprekend is, kunnen de onderlinge afhankelijkheden van de hefbomen die een synthetisch bioloog ter beschikking staan om biosensoren af te stemmen, het ontwerpproces bemoeilijken en de periode die wordt besteed aan de ontwikkeling van biosensoren verlengen, wat sommige onderzoekers ervan kan weerhouden biosensoren in hun eigen workflows te implementeren. Zoals geïllustreerd in figuur 1, kunnen pogingen om een biosensor af te stemmen op een bepaald resultaat door de hexboxen aan te passen, onbedoeld andere parameters verzwakken, waarbij deze onderlinge afhankelijkheid een erkende uitdaging is in de biosensortechniek¹². Gebruikelijke benaderingen van biosensorafstemming bestaan uit rationeel ontwerp en gerichte evolutie-engineering, waarbij de eerste vertrouwt op a priori begrip van de structurele en mechanistische kenmerken van het systeem om experimenten te concentreren op componenten met een grote kans op succes; terwijl de laatste vertrouwt op gerandomiseerde mutagenese en natuurlijke evolutie in combinatie met een screening met hoge doorvoer om te selecteren op varianten met geoptimaliseerde kenmerken 26,27,28,29,30. Hoewel beide technieken effectief zijn, hebben ze ook enkele nadelen: gerichte engineering, bijvoorbeeld door de focus op specifieke structurele of functionele elementen, is vatbaar voor beperkte verkenning van de volledige experimentele ruimte en kan allosterische of secundaire effecten negeren³⁰. Ongericht genereren en screenen van bibliotheken is weliswaar ideaal voor het optimaliseren van ontwerpen op een onbegeleide manier, omdat er weinig ontwerpwerk vooraf nodig is (d.w.z. bibliotheekontwerp en -generatie), maar vereist wel een voorkeur voor nuttige mutatie. Zonder een dergelijke vertekening wordt verwacht dat een veel groter percentage van de mutaties schadelijk kan zijn, waardoor meer screening nodig is³¹. Als zodanig zijn holistische benaderingen die niet alleen rekening houden met het primaire effect van samenstellende delen van de biosensor (aTF, RBS, operatorlocaties en hexboxen), maar ook met hoe deze componenten met elkaar interageren om biosensorparameters te beïnvloeden, zeer aantrekkelijk.

Gestructureerde multivariate experimenten en statistische modelleringsmethoden zijn op grote schaal toegepast in procestechnische workflows om de multidimensionale experimentele ruimte te ondervragen met behulp van een zo klein mogelijk aantal experimenten. Deze benadering, die experimenteren en modelleren combineert, ook wel design of experiments (DoE) genoemd, stelt onderzoekers van cruciaal belang om complexe multivariabele processen te optimaliseren voor gedefinieerde resultaten zonder dat er uitgebreide a priori kennis nodig is^23,30. Hoewel het doorgaans wordt toegepast op de optimalisatie van continue variabelen waarvoor gestructureerde experimentele verkenning gemakkelijker is, is DoE ook gebruikt bij de optimalisatie van metabole routes op genetisch niveau 31,32,33. Dit omvat een eerste screeningsstap waarin de factoren worden geselecteerd die het belangrijkst worden geacht voor het gewenste resultaat, gevolgd door een optimalisatiestap waarbij de geselecteerde factoren worden aangepast om de gewenste output te verkrijgen, in dit geval om specifieke biosensorparameters te optimaliseren om hun toepassingsgebied te vergroten. Van cruciaal belang is dat deze techniek kan worden gekoppeld aan geautomatiseerde vloeistofbehandelingsplatforms om de screeningdoorvoer te verhogen tot middelgrote bibliotheken van 10³ - 10⁴ om de biosensorprestaties wereldwijd te optimaliseren op een datagestuurde basis²³. Hieronder beschrijven we een protocol voor de implementatie van een DoE-gestuurde benadering van biosensoroptimalisatie, ondersteund door robotica voor vloeistofverwerking om het genereren, screenen en verzamelen van gegevens van bibliotheken te stroomlijnen voor de wereldwijde optimalisatie van de gevoeligheid van biosensoren.

Protocol

1. Het ontwerp van het rbs/promotordeel

1. Identificeer biosensorspecifieke regulerende elementen die systematisch kunnen worden afgestemd als continue variabelen in het DoE-proces. Groepeer deze regelgevende elementen in afzonderlijke modules. Dit kunnen modules zijn die effectortransport, transcriptiefactorexpressie en/of outputgenexpressie reguleren. Zorg ervoor dat elke module op transcriptioneel en/of translationeel niveau kan worden aangepast door een promotor of RBS (bijv. RBS_trans, P_reg, RBS_out en P_out, respectievelijk).
2. Bepaal de belangrijkste functionele sites binnen geselecteerde promotor- en RBS-regio's, zoals hex-boxen, operatorsites en RBS-sequenties.
   OPMERKING: Er zijn veel gekarakteriseerde promotors en RBS'en in de literatuur om bibliotheken te creëren van 34,35,36. Voor niet-gekarakteriseerde promotorsequenties (meestal de P_reg-promotor), zie hieronder voor verdere stappen om afstembare genetische sequentie-elementen te lokaliseren als die niet beschikbaar zijn in de literatuur.
   1. Lokaliseer andere operonen die de biosensorsequenties van belang bevatten via BlastP-zoekopdrachten van de aTF met de gewenste detectie-invoer. Extraheer het intergene gebied van de aTF en zijn gereguleerde genen om promotorsequenties te verkrijgen.
      OPMERKING: De locatie en het aantal promotorsequenties zijn afhankelijk van de gebruikte klasse van aTF.
3. Gebruik meerdere hulpmiddelen voor het uitlijnen van sequenties en andere motiefsoftware om de vermeende promotors te doorzoeken op geconserveerde motieven, zoals hexboxen en operatorsites. Selecteer op basis van promotorsequensequentieanalyse nucleotidesequenties voor randomisatie met gedegenereerde basen, bijv. N = alles, R = elke purine, Y = elke pyrimidine, enz.
   OPMERKING: Lezers worden doorverwezen naar de bronpublicatie voor meer informatie over promotoranalyse en basisrandomisatie²³.

2. Samenstellen en valideren van deelbibliotheken

1. Ontwerp en bestel primers die specifiek de gewenste expressievector versterken om het invoegen van promotor/RBS-sequentievarianten stroomopwaarts van een fluorescerende marker (bijv. GFP) mogelijk te maken. Verdun gelyofiliseerde primers bij aankomst tot een eindconcentratie van 100 μM in steriel gedeïoniseerd H₂O.
   1. Monteer het PCR-reactiemengsel op ijs in PCR-buisjes volgens de parameters van het specifieke polymerase. Zorg ervoor dat een high-fidelity polymerase wordt gebruikt om overdracht van mutaties naar de ruggengraat van de expressievector te voorkomen. Pas de gloeitemperatuur en verlengingstijd aan op basis van de behoeften van de primers en de lengte van het gewenste PCR-product.
   2. Analyseer het PCR-product via gelelektroforese en zuiver de gelineariseerde vector met behulp van PCR-zuivering of een gelextractiekit. Meet de concentratie van gelineariseerd vector-DNA en bewaar bij -20 °C.
2. Bestel de ontworpen variantbibliotheken (RBS of promotors) voor insertie in de gelineariseerde vector als enkelstrengs gedegenereerde oligonucleotiden met 30 bp plasmidehomologie-armen aan zowel de 5′ als de 3′ uiteinden voor gerichte homologe recombinatie in de expressievector.
   1. Bij aankomst worden de gelyofiliseerde oligonucleotiden geresuspendeerd tot een eindconcentratie van 100 ng/μl in steriel gedeïoniseerd H₂O.
3. Bepaal volumes voor equimolaire hoeveelheden van de gelineariseerde vector- en variantbibliotheek met behulp van online rekenmachines. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van de reactie 20 μL bedraagt en dat een molaire verhouding van 2:1 tussen insert en vector wordt gebruikt.
   1. Ontdooi een hoeveelheid commerciële Gibson-assemblagemastermix (X2) op ijs en monteer de reactie in een PCR-buisje volgens de volumes die door de gekozen rekenmachine worden verstrekt.
      LET OP: Gibson master mix kan ook in het lab gemaakt worden^37,38.
   2. Voeg 10 μL 2x Gibson master mix toe aan de DNA-fragmenten en incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C in een thermocycler of iets dergelijks.
   3. Breng alle 20 μl ligatieproduct aan op 200 μl competente E. coli in een microcentrifugebuisje. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs, gevolgd door een hitteschok gedurende 45 s bij 42 °C.
   4. Zet de cellen 2 minuten op ijs, voeg 800 μL superoptimale bouillon met katabolietrepressie (SOC) media toe aan de tube en laat de cellen 1 uur herstellen bij 37 °C in een schudbroedmachine.
   5. Verdeel 50 μL getransformeerde cellen op meerdere 60 mm Luria-Bertani (LB) agar petriplaten met relevante antibioticaselectie. Incubeer de platen gedurende 18 uur bij 37 °C.
4. Controleer de platen op transformatoren, bereken het aantal kolonies dat 3x de theoretische bibliotheekdiversiteit vertegenwoordigt om voldoende vertegenwoordiging van elke variant vast te leggen. Optimaliseer de isotherme assemblage als het aantal kolonies laag/nul is.
   OPMERKING: Oversampling is vereist bij het overwegen van een ideale bibliotheek die is gegenereerd op basis van high-fidelity reagentia of synthese. Dit is doorgaans 3x groter dan de totale grootte van de bibliotheek. Bijvoorbeeld, 4 posities van degeneratie (NNNN) = 4⁴ = 256 unieke sequenties. Schraap daarom ~768 kolonies af.
   1. Schraap het vereiste aantal kolonies in een enkele steriele kolf van 125 ml met 25 ml LB-media aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer de kolf gedurende 18 uur bij 37 °C in een schudbroedmachine (180 tpm) en zorg ervoor dat de cultuur na deze tijd zichtbaar dicht is.
   2. Gebruik een plasmid midi-prep zuiveringskit om de variantenbibliotheek te zuiveren van de geprepareerde transformantcultuur. Bepaal de concentratie van het DNA van de plasmidebibliotheek; 1-10 μg is nodig voor stroomafwaartse stappen. Zorg ervoor dat het DNA van de bibliotheek wordt geëlueerd met behulp van steriel gedeïoniseerd H₂O.
      OPMERKING: Stappen voorbij dit punt zullen zich richten op het klonen en valideren van variantbibliotheken in de Pseudomonas putida (P. putida) expressiehost; Aanpassing van het protocol aan andere gastheren kan aanpassing van incubatietijden, incubatietemperaturen en transformatiemethoden vereisen.
5. Bereid een LB-agarplaat van de gewenste expressiegastheer P. putida door een glycerolvoorraad te verwijderen en de plaat gedurende 18 uur bij 30 °C te incuberen.
   1. Pluk een enkele kolonie P. putida van de LB-agarplaat, inoculeer 10 ml LB-media en kweek gedurende 18 uur bij 30 °C, bij 180 tpm schudden.
   2. Bereid de cellen voor op elektrocompetentie door de gekweekte cultuur gedurende 2 minuten te centrifugeren bij 4000 x g bij 18 °C. Giet het supernatant af, resuspendeer in 1 ml steriel gedeïoniseerd H₂O en breng de geresuspendeerde cellen over in een steriele microcentrifugebuis.
      OPMERKING: P. putida-cellen moeten roze lijken wanneer ze worden gepelleteerd.
   3. Centrifugeer de cellen gedurende 1 minuut bij 4 x g in een microcentrifuge, giet het supernatant af en suspendeer opnieuw in 1 ml steriel gedeïoniseerde H₂O. Herhaal de centrifugeer- en resuspensiestappen nog 4 keer.
      OPMERKING: Celverlies kan optreden bij het afgieten van supernatant tijdens het wassen; Dit is normaal en zou geen invloed moeten hebben op de opbrengst.
   4. Breng 100 μL gewassen cellen over naar een elektroporatiecuvet van 0,2 cm, voeg 1-10 μg plasmidebibliotheek-DNA toe aan de cuvet en meng.
   5. Schakel de elektroporator in, zorg ervoor dat de spanning is ingesteld op 2,5 kV voor de cuvet van 0,2 cm, steek de cuvet in de elektroporatiekamer en pulseer.
   6. Voeg 900 μL SOC-media toe aan de cuvet, meng en breng de cellen over naar een steriele microcentrifugebuis. Laat de cellen 2 uur bij 30 °C herstellen in een schudbroedmachine.
6. Verdeel 50 μl getransformeerde cellen over grote vierkante petriplaten (230 mm) LB-agar aangevuld met een relevant antibioticum en incubeer gedurende 18 uur bij 30 °C.
   OPMERKING: Zorg voor een matige koloniedichtheid op bibliotheekplaten (2-3 CFU/cm²). Dit is afhankelijk van de bacteriële competentie en het platingvolume. Als het te laag is, kan optimalisatie van de transformatie, of opeenvolgende transformatierondes, worden gebruikt om het aantal kolonies te vergroten.
7. Selecteer tussen 25-50 kolonies uit alle transformatorplaten voor sequentievalidatie. Gebruik primers die de gedegenereerde sequentie versterken, de regio versterken door middel van PCR en deze verzenden voor Sanger-sequencing om de sequentiediversiteit en polyklonaliteit te evalueren.
   OPMERKING: Als polyklonaliteit problematisch wordt, kan het verspreiden van transformaties over meerdere batches cuvetten met 1 μg DNA helpen om dit effect te verminderen.

3. Deel bibliotheek klonale screening - automatisering

1. Opstelling van de vloeistofverwerker
   1. Creëer 7 programma's op een liquid handler-platform om ervoor te zorgen dat pipetteerintensieve stappen worden gebagatelliseerd.
   2. Maak een "MTP Liquid Transfer"-programma, zorg ervoor dat de vloeistofverwerker is ingesteld om een instelbaar volume van een voorbereid reservoir te pipetteren in lege microtiterplaten (MTP) in de lay-out.
   3. Maak een programma "Glycerol toevoegen aan MTP", zorg ervoor dat de vloeistofverwerker is geprogrammeerd om 100 μL volume van 50% glycerol in platen te pipetteren, zorg ervoor dat de dosering en aspiratiesnelheid 5-20 μL/s is.
      OPMERKING: Er is een apart programma gemaakt om rekening te houden met de hogere viscositeit van 50% glycerol, wat kan leiden tot belvorming, onvolledige aspiratie of kruisbesmetting van naburige putten als gevolg van spatten als het niet wordt gecontroleerd.
   4. Maak een "DWB Liquid Transfer"-programma, stel de vloeistofverwerker in om te pipetteren in deepwell-blokken (DWB) met een instelbare volume-instelling, en zorg ervoor dat de vloeistofverwerker pipetten uit een voorgevuld reservoir.
   5. Maak een programma "Inoculeren van ontdooid MTP", zorg ervoor dat de vloeistofverwerker is geprogrammeerd om 5 μL op te zuigen van ontdooid MTP met de geselecteerde kolonies en breng dit over naar de overeenkomstige DWB-platen in de lay-out.
      OPMERKING: Let goed op de MTP- en DWB-opstelling in de lay-out en zorg voor een logische volgorde van gebeurtenissen om onbedoelde dubbele inoculatie of gemiste platen te voorkomen.
   6. Maak een "Transfer to Assay DWB"-programma, zorg ervoor dat de vloeistofhandler is ingesteld om 5 μL cellen van de ene DWB-plaatpositie naar een andere DWB-plaatpositie over te brengen. Het programma moet deze actie vervolgens 4 keer herhalen bij elke overdracht waarbij een andere plaatpositie wordt geëoculeerd, d.w.z. P1 -> P2, P1 -> P3, enz.
      OPMERKING: Dit programma zorgt voor de naadloze subcultuur van 96 varianten in verschillende testconcentraties.
   7. Maak een "Assay Setup - PBS Resuspension (DWB)"-programma, zorg ervoor dat de vloeistofverwerker elke DWB in de lay-out pipeteert met 500 μL PBS, het programma moet ook een mengstap bevatten om ervoor te zorgen dat celpellets correct worden geresuspendeerd.
   8. Maak een "Assay Setup - Cells and PBS Addition (MTP)"-programma, zorg ervoor dat dit programma een stap bevat om 200 μL van de geresuspendeerde cellen over te brengen van één DWB-plaatpositie naar een lege MTP-positie.
      OPMERKING: Voor alle stappen van 3.1 zullen de lay-outs van programmeren en liquid handler variëren; Onderzoekers moeten de handleidingen van specifieke commerciële vloeistofverwerkers raadplegen om de bovenstaande programma's aan te passen aan de capaciteit en behoeften van het experiment.
2. Variant bibliotheek cultiveren en barcoderen
   1. Bepaal de theoretische bibliotheekgrootte en bereken het aantal afzonderlijke varianten om > bibliotheekdekking van 95% te garanderen (3x de aanbevolen bibliotheekgrootte) (zie de opmerking bij stap 2.5.).
   2. Bereken het benodigde volume aan met antibiotica gesupplementeerde LB-media op basis van het aantal te screenen kolonies (200 μL per kolonie + 10% meer).
   3. Open de software voor vloeistofbehandeling en klik op Uitvoeren naast het MTP Liquid Transfer-programma (zie aanvullend bestand 1). Plaats de voorbereide media in de overeenkomstige reservoirpositie en vul het dek met lege MTP's volgens de lay-out. Stel het programma in op het afgeven van 200 μL media. Klik op OK om te bevestigen dat het programma is gestart.
      NOTITIE: Zorg er altijd voor dat reservoirs en tips voldoende worden toegevoerd aan het vloeistofbehandelingsplatform voordat u de start van het programma bevestigt om onderbreking te voorkomen.
   4. Herhaal het programma zo vaak als nodig, sluit de gevulde MTP's af met een ademend membraan om de steriliteit te behouden.
   5. Breng gevulde MTP-platen over naar een koloniekiezerplatform en ontzegel, breng ook de vierkante platen van P. putida die zijn getransformeerd met plasmidevariantbibliotheek-DNA over naar het koloniekiezerplatform. Gebruik de koloniekiezer om elk van de voorgevulde microtiterplaatputjes te inoculeren met een enkele kolonie uit de transformatorbibliotheekplaten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de minimale diepte van de agar 25 ml is om beschadiging van de kop van de kolonieplukker te voorkomen.
   6. Sluit de geënte platen opnieuw af en breng ze over naar een schuddende offline incubator bij 30 °C (800 tpm), waarbij ervoor wordt gezorgd dat de vochtigheidsregeling op 75% is ingeschakeld om verdamping van de cultuur te voorkomen. Laat deze 16 uur groeien.
      OPMERKING: Na incubatie zullen de culturen zichtbaar dicht lijken voor het oog, als dit niet het geval is, controleer dan de media en antibioticavereisten opnieuw.
   7. Na 16 uur groei plaatst u de gegroeide platen terug op het platform van de vloeistofverwerker en verwijdert u de afdichting. Klik op Uitvoeren naast het protocol Glycerol toevoegen aan MTP (zie Aanvullend bestand 1), zorg ervoor dat de plaatlay-out op het scherm overeenkomt met die van het dock voor vloeistofverhandeling. Klik op OK en laat het protocol uitvoeren.
   8. Als u klaar bent, sluit u de platen weer af en mengt u kort in een offline schudbroedmachine (800 tpm) gedurende 5 minuten alvorens te barcoderen en op te slaan bij -80 °C.
   9. Herhaal stap 3.2.7. en 3.2.8. totdat aan alle MTP's glycerol is toegevoegd, is gemengd, van een barcode is voorzien en bij -80 °C is bewaard.
      OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd om u voor te bereiden op de onderstaande karakteriseringsstappen. Bovendien kan het blokkeren van de platen in verschillende experimentele runs worden gepland om te voldoen aan de capaciteit van het gebruikte vloeistofbehandelingsplatform of om de werklast in één keer te verminderen.
3. Screening van de variantbibliotheek
   1. Bereken het benodigde volume aan met antibiotica gesupplementeerde media voor het aantal DWB dat moet worden gevuld (~495 μL per putje + 10% over).
   2. Klik op Uitvoeren naast het DWB Liquid Transfer-programma (zie Aanvullend bestand 1), zorg ervoor dat media in de programmalay-out aan het juiste reservoir worden toegevoegd. Zorg ervoor dat lege DWB wordt toegevoegd aan de overeenkomstige lay-outposities en dat er voldoende voorraad tips beschikbaar is. Stel het programma in om 495 μL media af te geven. Als u klaar bent, klikt u op OK om het programma te starten.
   3. Sluit de gevulde DWB's af met een ademend membraan en breng ze over naar tijdelijke opslag bij 4 °C, herhaal stap 3.3.2. totdat het vereiste aantal DWB's is gevuld met media.
   4. Klik op Uitvoeren naast het Incoculate from Thawed MTP-programma (zie aanvullend bestand 1), zorg ervoor dat MTP-cryovoorraden en gevulde DWB's worden overgebracht naar het vloeistofbehandelingsplatform volgens de lay-out. Zorg ervoor dat er voldoende fooien zijn. Klik op OK om het programma te initialiseren.
      OPMERKING: Ontdooi voorraadplaten 30 minuten op ijs, alleen als de vereiste programma's en platen zijn voorbereid om een optimale levensvatbaarheid van de cellen te garanderen.
   5. Wanneer het programma is afgelopen, sluit u de geënte DWB's 's nachts af met een ademend membraan en brengt u ze over naar een offline plate shaker-incubator met 75% vochtigheidsregeling en laat u ze 's nachts 16 uur groeien bij 30 °C (180 tpm).
   6. Verzegel, meng en breng cryostock MTP's terug naar de vriezer van -80 °C volgens stap 3.2.8.
   7. Herhaal stap 3.3.4. tot 3.3.6. zo vaak mogelijk zijn totdat het vereiste aantal nachtelijke DWB's is ingeënt en naar de couveuse is overgebracht.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te registreren wanneer elke batch platen aan de incubator wordt toegevoegd om rekening te houden met het tijdsverloop tussen runs tijdens de inoculatie en om dezelfde volgorde te gebruiken voor stroomafwaartse stappen.
   8. Bereken het benodigde volume media aangevuld met verschillende concentraties effector en antibioticum op basis van het aantal DWB dat 's nachts moet worden gescreend (495 μL per putje + 10% over). Elke effectorconcentratie vereist een eigen afzonderlijk reservoir in de vloeistofverwerker.
      OPMERKING: Voor initiële karakterisering, zoals AAN/UIT-screening, zijn twee effectorconcentraties voldoende (bijv. 0 en 1000 μM eindconcentratie). Om dosis-responsgegevens te genereren voor een robuustere karakterisering, wordt dit bereik verhoogd tot minimaal vier concentraties (bijv. 0, 1, 25 en 1000 μM eindconcentratie). Repressorsystemen vereisen geen toevoeging van een effector om de functie vast te stellen, terwijl voor activatoren, zoals het geschetste systeem, een effector vereist is.
   9. Klik op Uitvoeren naast het DWB Liquid Transfer-programma (zie Aanvullend bestand 1). Zorg ervoor dat reservoirs met met effector aangevulde media zich op de juiste posities bevinden, afhankelijk van de lay-out. Voeg lege DWB's toe aan het vloeistofbehandelingsplatform. Zorg ervoor dat er voldoende tips beschikbaar zijn voor het platform. Wanneer u klaar bent, klikt u op OK om het protocol te starten om de test-DWB's te genereren.
   10. Sluit na het vullen de test-DWB's af met een ademend membraan en breng ze over naar tijdelijke opslag bij 4 °C, en vul het vloeistofbehandelingsplatform opnieuw met meer lege platen.
   11. Herhaal stap 3.3.9 en 3.3.10 zo vaak als nodig is totdat het vereiste aantal DWB's is gevuld.
   12. Klik op Uitvoeren naast het DWB-programma Transfer to Assay (zie Aanvullend bestand 1). Zorg ervoor dat niet-verzegelde test-DWB's die met effector aangevulde media bevatten, worden toegevoegd aan de juiste locaties in de lay-out van de vloeistofverwerker.
   13. Breng de DWB's 's nachts met gekweekte P. putida die in stap 3.3.4 zijn geëoculeerd over en verwijder de afdichting. naar het liquid handler-platform, waarbij er opnieuw voor wordt gezorgd dat de lay-out strikt wordt nageleefd. Zorg ervoor dat er voldoende tips beschikbaar zijn voor het platform. Als u klaar bent, klikt u op OK om het protocol te starten.
       OPMERKING: Het overbrengen en rangschikken van subculturen in de testplaten moet doorgaans in batches worden gedaan, afhankelijk van de grootte van het vloeistofbehandelingsplatform.
   14. Nadat het programma is afgelopen, brengt u afdichtingen aan en brengt u de testplaten over naar een offline incubator bij 30 °C, met een luchtvochtigheid van 75% gedurende 16 uur (180 tpm), het uiteindelijke analysevolume zal in dit stadium 500 μL zijn.
   15. Gooi de nachtelijke DWB's na inoculatie weg en herhaal de stappen 3.3.12 tot 3.3.14 zoals vereist totdat alle vereiste test-DWB's zijn geïnoculeerd en groeien in offline incubators.
   16. Haal de DWB's uit de broedmachine, breng ze over naar een centrifuge en pelletcellen bij 4000 x g, 18° C gedurende 5 min. Giet het bovenstaande af en plaats de gecentrifugeerde DWB's op het vloeistofbehandelingsplatform.
       OPMERKING: Het volume van de celpellets kan variëren, afhankelijk van de effectorconcentratie of variant, bovendien kunnen sommige pellets zichtbaarder fluorescerend lijken voor het oog dan andere.
   17. Bereken het benodigde volume van 1x PBS op basis van het aantal te screenen DWB (500 μL per putje + 10% over).
   18. Klik op Uitvoeren naast het Assay Setup - PBS Resuspension (DWB) -programma (zie aanvullend bestand 1), stel het doseervolume in op 500 μL, zorg ervoor dat 1x PBS aan het juiste reservoir wordt toegevoegd en rangschik vervolgens de gecentrifugeerde platen volgens de lay-out van de vloeistofverwerker. Zorg ervoor dat er voldoende fooien beschikbaar zijn. Klik op OK om het programma te starten.
       OPMERKING: Het wassen van de cellen wordt uitgevoerd om resterende groeimedia te verwijderen, die enige autofluorescentie kunnen produceren.
   19. Sluit de opnieuw gesuspendeerde platen opnieuw af en verwijder deze van de vloeistofverbeteraar. Zorg ervoor dat de pellets volledig opnieuw worden gesuspendeerd door de onderkant van de plaat te controleren. Ga door met het overbrengen van gepelleteerde DWB's naar de vloeistofbehandelingskast en herhaal stap 3.3.18. totdat alle platen weer in suspensie zijn gebracht.
   20. Klik op Uitvoeren naast het programma Assay Setup - Cells and PBS addition (MTP) (zie Aanvullend bestand 1). Breng de geresuspendeerde DWB's uit stap 3.3.18 over. in de vloeistofhandler volgens de voorgestelde lay-out. Breng lege MTP's over in de vloeistofverwerker volgens de lay-out. Zorg ervoor dat het doseervolume is ingesteld op 200 μl en dat er voldoende tips beschikbaar zijn. Klik op OK om het programma te starten.
   21. Breng gevulde MTP's (eindanalysevolume 200 μL) over naar een offline multimode plaatlezer, meet de relatieve fluorescentie bij een geschikte excitatie-emissiegolflengte (bijv. sfGFP lEx/lEm = 488/520) en OD₆₀₀ voor elk putje in de plaat.
       OPMERKING: De instellingen van de excitatie-emissiegolflengte zijn afhankelijk van de keuze van het fluorescerende gen dat in de expressievector is gecodeerd. Zorg ervoor dat de versterkingsinstellingen op de plaatlezer overal consistent zijn en maak onderscheid mogelijk tussen lage en hoge varianten zonder de detector te verzadigen.
   22. Herhaal stap 3.3.20. en 3.3.21. totdat alle DWP's van de test zijn overgebracht naar MTP's en zijn gemeten.

4. Gegevensverwerking/-transformatie en differentiële rangschikking

1. Voer een normalisatie uit van de verzamelde gegevens door de geregistreerde GFP-fluorescentie (RFU) te delen door de geregistreerde OD_600-meting voor elke variant voor elk van de beoordeelde effectorconcentraties (0 en 1000 μM).
   OPMERKING: De meeste plaatlezers kunnen worden geprogrammeerd om de fluorescentie automatisch te normaliseren met OD₆₀₀ tijdens het verzamelen van gegevens.
2. Bereken AAN/UIT om het dynamisch bereik van elke variant te verkrijgen door de RFU/OD₆₀₀ bij 1000 μM (AAN) te delen door de RFU/OD₆₀₀ bij 0 μM (UIT). Plot alle variant AAN/UIT-waarden als een spreidingsdiagram met behulp van de AAN/UIT van de basisbiosensorconstructie om varianten te bepalen die activiteit boven het basisniveau vertonen.
   OPMERKING: De AAN/UIT van het initiële biosensorconstruct dat in het protocol werd gebruikt, werd bepaald als 3,6-voudig op basis van de initiële karakterisering van de wildtype-sequentie²³.
3. Voor een diepgaande karakterisering past u de dosis-responsgegevens aan met behulp van een Hill-functie met een variabele helling om EC50- en/of Hill-hellingswaarden te extraheren met behulp van analytische software.
   OPMERKING: Om de gevoeligheid en EC₅₀ te schatten, verzamelt u ten minste vier gegevenspunten die het bereik bestrijken waar de respons overgaat van lage naar hoge activering, meestal het steilste deel van de curve. Hoewel meer gegevenspunten de resolutie en nauwkeurigheid verbeteren, zijn vier punten voldoende om de gevoeligheidsclassificatie te schatten.
4. Selecteer uit de volledige set varianten een subset van varianten (bijv. N = 100) die zorgt voor een evenwichtige dekking van de gewenste rangschikking, in dit geval EC₅₀. Om dit te doen, identificeert u varianten die een breed scala bestrijken in EC₅₀, en zorgt u ervoor dat hoog gerangschikte en laag gerangschikte varianten proportioneel vertegenwoordigd zijn. Verwijder varianten die overbodig zijn (bijv. varianten met een vergelijkbare ranglijst en een minimale impact op de distributiedekking).
5. Nadat u de uiteindelijke voorbeeldbibliotheek voor varianten hebt geselecteerd (bijv. N = 100), transformeert u de gegevens met behulp van de volgende lineair-logaritmische (lin-log) transformatievergelijking (Eq.1).
   Eq.1:
   
   waar
   
   
   
6. Wijs voor EC50-waarden +1 toe voor de hoogste (minst gevoelige) en -1 voor de laagste (meest gevoelige). Een geometrisch gemiddelde van 0 komt overeen met tussenliggende expressieniveaus.

5. Definitieve generatie van screeningsontwerp/ DoE

1. Om de ontwerpruimte voor biosensoren systematisch te verkennen, gebruikt u een Definitive Screening Design (DSD). Dit ontwerp heeft de voorkeur vanwege het vermogen om de ontwerpruimte efficiënt te verkennen en tegelijkertijd de studie af te stemmen op specifieke systeembehoeften.
2. Klik op de categorie DOE en selecteer vervolgens de knop Definitief screeningsontwerp in de statistische software (zie aanvullend bestand 2).
3. Definieer de experimentele factoren (bijv. RBS_trans , P_reg , RBS_out en P_out) als continue variabelen door op de knop Continu te klikken en ze een naam te geven, waarbij u ervoor zorgt dat de waarden op +1 en -1 worden gezet (zie aanvullend bestand 3).
4. Definieer de gewenste antwoorden (bijv. AAN, UIT, AAN/UIT, EC50, Helling) door op de knop Antwoord toevoegen te klikken en de naam aan te passen (zie Aanvullend bestand 4).
   OPMERKING: Stel het doel van de reactie in door op de vervolgkeuzelijst voor het doel te klikken, selecteer Geen of Maximaliseren , afhankelijk van het doel van het ontwerp (bijv. exploratie versus optimalisatie).
5. Zodra de factoren en antwoorden zijn gedefinieerd, klikt u op Doorgaan om het tabblad ontwerpopties te openen. Selecteer Geen blokken vereist en klik vervolgens op de knop Ontwerp maken (zie Aanvullend bestand 5).
   OPMERKING: Blokken kunnen worden toegevoegd om het ontwerp te isoleren tegen hinderlijke factoren (factoren die niet van primair belang zijn). Dit kan experimenten complexer maken; Het wordt echter gebruikt naar goeddunken van de onderzoeker.
6. De software genereert een experimentele ontwerptabel met de specifieke combinaties van te testen factoren. De genetische delen van de corresponderende lin-log getransformeerde bibliotheken zullen worden gebruikt om de corresponderende 17 constructen te genereren. Sla de ontwerptabel op en exporteer deze door op Tabel maken te klikken (zie Aanvullend bestand 6).

6. Herhaal stap 2 - Ontwerp en assemblage van DoE-geïnformeerde genetische ontwerpen

1. Begin met het bouwen van de multivariabele plasmiden volgens het Definitive Screening Design (DSD) -plan.
   1. Identificeer een initiële variabele (bijv. promotor, RBS, enz.). Ontwerp en bestel primers om de expressievector te lineariseren, zorg ervoor dat de primers het beoogde variabele gebied flankeren, zodat eventuele reeds bestaande sequentie-elementen worden verwijderd.
   2. Ontwerp en bestel primers die specifiek variantsequenties versterken die overeenkomen met de vooraf gedefinieerde bibliotheekniveaus (bijv. -1, 0, +1) voor elk regulatoir knooppunt (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). Zorg ervoor dat elke primer 30 bp homologiearmen bevat die complementair zijn aan de insertieplaats van de expressievector.
   3. Zuiver plasmide-DNA uit de relevante cryo-stockcultuur die overeenkomt met de +1, 0 en -1 bibliotheekniveaus voor de geïdentificeerde variabele via miniprep.
2. Stel de PCR-reacties voor de gelineariseerde expressievector en bibliotheekfragmenten op ijs in en bepaal de concentratie van het product zoals beschreven in de stappen 2.1.1 en 2.1.2.
   1. Herhaal stap 2.3 tot en met 2.4 van het protocol om Gibson-assemblage van de gelineariseerde expressievector en bibliotheekfragmenten uit te voeren. Zorg ervoor dat in dit stadium petrischaaltjes van standaardformaat worden gebruikt.
   2. Zeef kolonies met behulp van Sanger-sequencing om de juiste constructie-assemblage voor elk van de voorgestelde DSD-ontwerpen te bevestigen en ga vervolgens verder met de transformatie van P. putida (stappen 2.5 - 2.6).
   3. Bevestig met behulp van PCR de aanwezigheid van het juiste plasmide in getransformeerde kolonies. Kies bevestigde transformatoren en inoculeer ze in 10 ml LB aangevuld met antibioticum voor nachtelijke groei bij 30 °C gedurende 18 uur (180 tpm). Maak cryovoorraden (25% glycerol definitief) en bewaar bij -80 °C.

7. Screening en rationalisatie van de gegevens

1. Streep de P. putida die met het relevante DSD-ontwerp is getransformeerd uit cryo-voorraden op LB-agar aangevuld met antibiotica, en broedt gedurende 18 uur 's nachts bij 30 °C om kolonies te laten groeien.
   1. Pluk drie afzonderlijke kolonies van elke plaat die overeenkomen met de voorgestelde DSD-ontwerpen en kweek 's nachts in 10 ml LB-media aangevuld met een antibioticum bij 30 °C gedurende 18 uur.
   2. Laad de volgende dag een DWB met een concentratiegradiënt van de effector variërend van 0 mM tot 1 mM (eindconcentratie) per rij tot een totaal volume van 50 μL per putje. Verdun de nachtculturen 1/100 tot verse LB en voeg 450 μL cultuur toe aan de DWB over de concentratiegradiënt.
   3. Herhaal stap 3.3.14 en 3.3.16 handmatig om volwassen DWB's te verkrijgen, ga dan verder en voer stap 3.3.18, 3.3.20 handmatig uit. en 3.3.21. om RFU/OD-gegevens te verkrijgen voor elke voorgestelde variant.
2. Pas de dosisresponsgegevens (RFU/OD) aan met behulp van een heuvelfunctie (met variabele helling), waarbij de juiste parameters (factoren) voor optimalisatie worden geëxtraheerd, zoals EC₅₀, heuvelhelling, dynamisch bereik of operationeel bereik. Transformeer de resulterende gegevens naar log10 en voer de geëxtraheerde parameters in de DSD-tabel in voor elk van de geteste ontwerpen.
   1. Voer een screeningsanalyse op twee niveaus uit om significante factoren te identificeren die van invloed zijn op de prestaties van de biosensor. Gebruik de t-ratio van Lenth en de halfnormale plotanalyse^{23, 30} om te bepalen welke factor afwijkt van de verwachte verdeling en om in het model te behouden. Behoud het effect van erfelijkheid en zorg ervoor dat elke factor die alleen in interactie van belang is, ook afzonderlijk wordt opgenomen.
   2. Voer standaard kleinste-kwadratenregressie (SLSR)-modellering³⁰ uit voor elke responsvariabele, waarbij alleen de geïdentificeerde significante factoren worden opgenomen. Beoordeel de diagnostiek van het regressiemodel, inclusief restplots, lack-of-fit-tests en R²-waarden, om ervoor te zorgen dat de gegevens goed worden aangepast.
   3. Gebruik een response profiler om optimale factorinstellingen te bepalen op basis van de gewenste biosensorkenmerken. Definieer objectieve functies voor elke respons (bijv. het maximaliseren van het dynamisch bereik en het minimaliseren van EC₅₀) om factorinstellingen te genereren die de beste balans bereiken tussen alle reacties, rekening houdend met systeembeperkingen en compromissen.
3. Keer terug naar de variantbibliotheken en bouw de geoptimaliseerde biosensor volgens de modules die worden voorgesteld door de response profiler, volgens de stappen 6.1 tot 6.2 van het protocol. Valideer de prestaties van het geoptimaliseerde construct via dosis-responskarakterisering.

Results

In eerste instantie moeten modules waarvan wordt gedacht dat ze de biosensorfunctie beïnvloeden, worden geselecteerd voor variatie; dit kan de regulatie van transporteiwitten omvatten, die de intracellulaire concentratie van liganden en dus de output van biosensoren kunnen beïnvloeden, maar omvat ook relatieve transcriptie- en translatieniveaus van de aTF zelf, evenals de fluorescerende reporter of het outputgen (Figuur 1). Figuur 2 toont een typische workflow die wordt gebruikt bij de ontwikkeling van een op DoE gebaseerd experiment voor biosensoroptimalisatie; te beginnen met de organisatie van regulerende elementen in afzonderlijke modules die vatbaar zijn voor manipulatie via synthetische biologie door middel van veranderingen op sequentieniveau, met name in operatorsites, hexboxen of RBS' (Figuur 2A). Als zodanig is de volgende stap in de DoE-workflow de randomisatie van sequentiesites om bibliotheken met varianten te genereren (Figuur 2B). De mate van randomisatie moet zorgvuldig worden overwogen, aangezien het aantal gescreende kolonies moet worden geschaald met de mate van randomisatie 4^N, waarbij N gelijk is aan het aantal gerandomiseerde basisposities. Het behandelen van elke unieke promotor of RBS-sequentie als een unieke categorische variabele in DoE zou het aantal vereiste constructen verhogen tot experimenteel onhaalbare niveaus, aangezien een dergelijke conversie naar continue variabelen door karakterisering van de bibliotheken een noodzakelijke triagestap is om het functiebereik te meten dat wordt verkregen door randomisatie en om de bovenste, middelste, en ondergrenzen van functionaliteit. Dit wordt eerst bereikt door analyse van de output van de bibliotheken als maat voor de sterkte van de RBS- of promotorvariant via een reportergen (Figuur 2C). Een lin-log transformatie wordt, zoals getoond, uitgevoerd om de continue variabelen op te splitsen in niveaus die door DoE kunnen worden gebruikt om verschillende combinaties te verkennen en om een model te ontwikkelen dat de effecten van deze varianten beschrijft. Vervolgens wordt een screeningsontwerp geïmplementeerd met behulp van 3 niveaus die het activiteitsbereik voor elke factor op een combinatorische manier beschrijven (Figuur 2D). Door het samenstellen en testen van de voorgestelde ontwerpen wordt de experimentele ruimte efficiënt verkend en worden de interacties tussen factoren onthuld. Statistische analyse van de resulterende gegevens wordt gebruikt om te bepalen welke combinatie van factoren het meest significante effect heeft op de output van de biosensor, en SLSR wordt gebruikt om het gedrag van het systeem te voorspellen onder verschillende criteria, waardoor de optimalisatie van de biosensor wordt vergemakkelijkt in de richting van specifieke resultaten zoals een groter dynamisch bereik of gevoeligheid (Figuur 2D).

Figuur 3 demonstreert de samenstelling en screening van een aTF-gereguleerde promotorbibliotheek. Isotherme assemblage met behulp van een gedegenereerd oligonucleotide werd uitgevoerd om een plasmide-gecodeerde bibliotheek te creëren, waarbij elk plasmide op unieke wijze op specifieke posities wordt gerandomiseerd. De mate van bibliotheekdiversiteit zal uiteindelijk bepalend zijn voor het aantal te screenen kolonies, waarbij grotere theoretische bibliotheekgroottes veel baat hebben bij automatisering. Promotorsequentieanalyse van homologe operonen naar TphR leverde een kaart op van basenbehoud die werd gebruikt om randomisatielocaties te informeren, met name basen die een zekere mate van variatie vertoonden en daarom de activiteit kunnen moduleren zonder absoluut essentieel te zijn²³. Drie basen in elk van de -35 en -10 hex-boxen waren gericht op volledige randomisatie, naast zes basen op de operatorsite (Figuur 3A), wat resulteerde in een theoretische promotorbibliotheek van ~500.000. De plasmidebibliotheek werd vervolgens gebruikt om de gastheerstam te transformeren. In dit stadium is een goede transformatie-efficiëntie van cruciaal belang om voldoende bibliotheekdekking te verkrijgen met algemene benaderingen voor probleemoplossing die worden getoond in Figuur 3B. Optimalisatie van DNA-concentraties, transformatiemethode en kloonontwerp kan de opbrengst van transformatiemiddelen aanzienlijk verbeteren. Figuur 3C demonstreert een typische workflow Bij het verkrijgen van transformatoren moeten individuele kolonies die overeenkomen met unieke varianten eerst in media worden gekweekt voordat met karakteriseringswerk kan worden begonnen. Om de theoretische bibliotheekgrootte te dekken, moet een groot aantal varianten worden gepickt en in platen worden gerangschikt. Door gebruik te maken van geautomatiseerde systemen zoals vloeistofverwerkers en kolonieverzamelaars kan deze arbeidsintensieve stap worden gebagatelliseerd. Stap 1 van Figuur 3C illustreert de overdracht van groeimedia naar MTP's die handmatig in het liquid handler-dock zijn geladen, gevolgd door geautomatiseerde inoculatie door een koloniekiezer. Sommige fasen, zoals het sealen van de platen en het overbrengen naar offline incubators, zijn handmatig, maar kunnen desgewenst ook worden geautomatiseerd. Na de groei van de culturen kunnen liquid handlers ook worden gebruikt om cryo-voorraden te genereren door de toevoeging van glycerol, zoals getoond in Figuur 3C. In dit stadium zal barcodering van de platen ervoor zorgen dat elke gekozen variant wordt gekoppeld aan een specifieke plaat en putlocatie, waardoor gemakkelijke verwijzingen mogelijk zijn voor verdere stroomafwaartse karakterisering. Een van de grote voordelen van geautomatiseerde benaderingen, afgezien van de vermindering van arbeid, is het verminderen van menselijke fouten, waarbij fouten in de fase van de voorbereiding van de bibliotheek minder snel worden overgedragen. Stap 2 van Figuur 3C Illustreert de geautomatiseerde karakteriseringsfase van de bibliotheekvoorbereiding. Dit begint via het vullen van DWB's met media met behulp van het liquid handler-platform, gevolgd door inoculatie met behulp van de cryo-voorraden met barcode. Automatisering in dit stadium zorgt er opnieuw voor dat pipetteerfouten en arbeid tot een minimum worden beperkt. De platen worden vervolgens verzegeld en handmatig overgebracht naar offline incubators voor groei, waarna kan worden begonnen met het rangschikken van effectorverbindingen in verse deepwell-platen. Voor een eerste screening van onderdelenbibliotheken kan een eenvoudig AAN/UIT-scherm wenselijk zijn, omdat dit kan worden gebruikt om niet-functionele varianten die dezelfde of slechtere activiteit vertonen dan de basisconstructie vooraf te screenen en de variantenpool te verrijken voor degenen die verbeterde activiteit vertonen. Dit heeft als bijkomend voordeel dat de materiaalkosten van tips en platen worden verlaagd, die onbetaalbaar kunnen worden in screeningprotocollen voor grote bibliotheken. Wanneer echter optimalisatie van complexere biosensorprestatiemetrieken vereist is (bijv. EC₅₀), zijn aanvullende effectorconcentraties vereist. Na de groei van de culturen worden de platen teruggevoerd naar het vloeistofbehandelingsplatform, dat begint met het inoculeren van de platen met effectorverbindingen voordat ze opnieuw handmatig worden teruggebracht naar de incubator voor de duur van de test. Figuur 3D Demonstreert de laatste automatiseringsstap vóór het verzamelen van gegevens. Na de verstreken periode voor groei en activering van de biosensor, worden de platen uit de offline incubator verwijderd en teruggebracht naar het liquid handler-platform. Om resterende groeimedia te verwijderen, die het verzamelen van fluorescentiegegevens kunnen verstoren, zijn centrifugatie, verwijdering van supernatant en wassen van de cellen met 1x PBS vereist. Het gebruik van vloeistofverwerkers kan dit proces opnieuw bagatelliseren, met geautomatiseerde resuspensie van culturen die een snelle verwerking van de platen mogelijk maakt, inclusief het overbrengen van de gewassen cellen naar MTP's met 96 putjes voor screening. Het verzamelen van gegevens kan handmatig of geautomatiseerd worden uitgevoerd, waarbij sommige lezers zijn voorzien van plaatstapels die kunnen communiceren met vloeistofverwerkers om het gegevensverzamelingsproces verder te automatiseren. Door de verhouding tussen biosensoractivering in aanwezigheid van effector (AAN) en afwezigheid (UIT) te vergelijken, werden 5.000 varianten beoordeeld met behulp van de mate van biosensoractivering (vouwverandering) om de biosensorfunctie te bepalen; Alleen de varianten met activiteit boven die van het basisconstruct (3,6-voudig) werden naar voren gebracht voor verdere karakterisering, zoals aangegeven door het rood-roze gearceerde gebied van het spreidingsdiagram (Figuur 3D). Op basis van de plaat- en putposities van de verrijkte variantenpool kan vervolgens een robuuste karakterisering worden uitgevoerd met behulp van biologische replicaten of verschillende effectorconcentraties door terug te verwijzen naar de originele cryo-voorraadplaten met barcode die in stap 1 van de workflow zijn gegenereerd.

Figuur 4 toont de screening van de getriageerde varianten van de eerste bibliotheekscreening, met als doel een promotorbibliotheek te ontwikkelen voor het optimaliseren van de gevoeligheid. Met behulp van de gegevens van de 5.000 varianten die in de vorige workflow waren gescreend, werd een triagepool van 226 varianten van het initiële AAN/UIT-scherm, waarvan werd vastgesteld dat ze actiever waren dan de ouderlijke sequentie, vervolgens verder gekarakteriseerd en gerangschikt op basis van hun gevoeligheid, om te fungeren als niveaus waarrond een DSD kon worden ontworpen. Als eerste stap moeten de categorische variabelen, in dit geval de P_out top-varianten, worden omgezet in continue variabelen die een breed gevoeligheidsbereik bestrijken. Om de gevoeligheid te screenen, zijn dosis-responscurven nodig om EC_50-gegevens te verkrijgen van een geplotte Hill-functie; dit verhoogt het platingwerk aanzienlijk en is zeer geschikt voor automatisering met behulp van vloeistofbehandelaars om het proces van het instellen en screenen van tests te vereenvoudigen, zoals weergegeven in figuur 4A. Volgens de workflow die is vastgelegd in stap 2 van figuur 3C, werden plaatbarcodes en putposities die overeenkomen met de verrijkte pool van varianten gebruikt om DWB's gevuld met groeimedia en antibiotica te inoculeren. Om de experimentele robuustheid te verbeteren, werden varianten gescreend in biologisch drievoud. Nadat de platen naar de offline incubator waren overgebracht om te groeien, werden verse DWB's gevuld met groeimedia aangevuld met 0, 1, 25 en 1000 μM effector-gevulde groeimedia met behulp van de vloeistofverwerkers om de arbeid te verminderen. Om het aantal platen dat nodig is voor de test te verminderen, werd een concentratiebereik gekozen dat de onderkant, het midden en de bovenkant van de curve omvat, waarbij de middelpuntconcentraties de relatieve gevoeligheden van elke variant onthullen, zoals geïllustreerd in figuur 4A. Na inoculatie van de variantpools bij elke effectorconcentratie en analyse van fluorescentie en OD₆₀₀, werden dosis-responscurven uitgezet, waarbij niet-lineaire regressieanalyse werd gebruikt om EC₅₀ te bepalen. In dit stadium werd een onbewerkte bibliotheek van elke variant met een unieke EC_50-waarde gegenereerd, waarbij de top 100 van meest robuuste varianten werd voortgezet, zoals weergegeven in figuur 4B om de bibliotheekgrootte verder te verkleinen. Voordat deze bibliotheek echter in DoE kan worden gebruikt, moet de conversie van de unieke varianten naar een gerangschikte bibliotheek worden gegenereerd, die het gevoeligheidsbereik vertegenwoordigt dat erin is opgenomen. Dit werd bereikt door een lin-log-transformatie van de gegevens uit te voeren, waarbij de gegevens worden gerangschikt en geschaald zodat elke variant wordt gerangschikt van meest gevoelig (-1) naar minst gevoelig (+1), en door een middelpuntwaarde (0) te definiëren, die het geometrisch gemiddelde van de dataset vertegenwoordigt Figuur 4C. De transformatie van de ruwe gegevens leverde de blauwe grafiek op die wordt weergegeven in figuur 4D, van waaruit discrete_{P-out-sequenties} die overeenkomen met +1, 0 en -1 werden meegenomen naar het definitieve screeningontwerp als_{P-out-factorniveaus} .

Figuur 5 demonstreert de volledige workflow na het genereren van de bibliotheek, van het genereren van DSD tot het modelleren en de wereldwijde optimalisatie van een biosensor op basis van de door het DoE ondersteunde leren. Figuur 5A Bevat een opsplitsing van een typische biosensor in 3 modules met ofwel 1 (transport- en regulatormodules) of 2 (outputmodule) regelknooppunten. In navolging van het voorbeeld van Figuur 4, RBS- of promotorbibliotheken zullen zijn ontwikkeld en niveaus variërend van +1, 0 en -1 zullen zijn geselecteerd om de grootste variatie van elke factor te omvatten. De grootte van de gescreende bibliotheken zou doorgaans het aantal experimenten bepalen dat nodig is om de ontwerpruimte volledig te verkennen, bijvoorbeeld als elke bibliotheek van grootte 22 zou zijn, zou dit gelijk staan aan 22⁴ (234.256) combinaties. DoE heeft tot doel de experimentele werklast te vereenvoudigen door het aantal combinaties te verminderen door middel van gestructureerde screeningontwerpen. Hoewel er veel methodologieën mogelijk zijn, is DSD ideaal voor de ontwikkeling van biosensoren, omdat het de identificatie van de belangrijkste factoren en tweefactorinteracties mogelijk maakt, terwijl verstorende tweede-orde-effecten worden vermeden. Omdat DSD-ontwerpen 3 niveaus gebruiken, is het bovendien mogelijk om de kromming (niet-lineariteit) te schatten. Figuur 5A demonstreert een typische DSD-uitgang waarbij elk van de 4 modules op verschillende niveaus is ingesteld; aangezien elk niveau overeenkomt met een bepaalde promotor- of RBS-variant, wordt isotherme assemblage gebruikt om de genetische constructen te genereren die overeenkomen met de aanbevolen ontwerpen van de DSD. Na het samenstellen en transformeren van de gastheerstam met de aanbevolen constructen, worden vervolgens dosisresponscurven verkregen met behulp van een volledig scala aan effectorconcentraties om meer vertrouwen te geven in de prestaties van elk van de constructen Figuur 5B. Aangezien DSD het aantal constructies drastisch vermindert, kan deze stap vaak met de hand worden uitgevoerd of, indien gewenst, met behulp van geautomatiseerde vloeistofbehandelaars. Figuur 5C presenteert de output van het voorspellingsprofiel dat is verkregen na het construeren en testen van de voorgestelde combinaties van het DSD-scherm en het bouwen van voorspellende modellen op basis van de Hill-coëfficiënt (n_H) en de EG₅₀ output van elke geteste combinatie. Het doel van het experiment was om een biosensorconstructie te ontwikkelen die wereldwijd werd geoptimaliseerd voor zowel n_H en EC₅₀ door modulatie van de expressie van de 4 regulerende knooppunten om beide parameters te maximaliseren. Elke regulerende factor wordt in een eigen kolom weergegeven, waarbij de expressiegraad wordt aangegeven langs de x-as die overeenkomt met de lin-log getransformeerde promotor en RBS-deelbibliotheken (-1 tot +1). Het effect van het veranderen van de expressie van knopen op zowel EC₅₀ en n_H wordt aangegeven door de curven in de subplots. De profielplots benadrukken het vaak niet-intuïtieve karakter van biosensoroptimalisatie, waarbij het afstemmen van één regulerend knooppunt tegengestelde effecten kan hebben op de outputparameters. Bijvoorbeeld, RBS_Trans blijkt geen sterke correlatie te hebben met n_H,_{het correleert echter positief met EC50} op een niet-lineaire manier. In het geval van RBS worden ook hogere orde (niet-lineaire) interacties geïmpliceerd_buiten Een toename in sterkte zal de helling vergroten (hogere n_H) met een gelijktijdige toename van de gevoeligheid (lagere EC₅₀), wat resulteert in een curve met een meer digitale helling en een scherpere respons op toenemende effectorconcentratie. Op basis van deze modellen kunnen niet-intuïtieve facetten van biosensorafstemming duidelijker worden weergegeven, waardoor de regulatieknooppunten kunnen worden geoptimaliseerd naar een globaal optimum. De modellen werden gebruikt om de wereldwijde optima voor zowel EC te voorspellen₅₀ en n_H , waarbij de rode lijnen in de grafiek de optimale niveaus van elk regelgevend knooppunt (Figuur 5C). Figuur 5D demonstreert het dosis-responsprofiel van het initiële ouderlijke biosensorconstruct (blauw) vergeleken met het best presterende DSD-ontwerp (groen) en het wereldwijd geoptimaliseerde construct (lila). Het model gebruiken om de ideale modulesterktes te voorspellen voor het maximaliseren van EC₅₀ en n_H, een variant die overeenkomt met RBS_Trans (-1), P_Reg (-0,7), P_buiten (-0,3) en RBS_buiten (+1) sterke punten werd geassembleerd en gekarakteriseerd met de geoptimaliseerde constructie die verbeteringen in EC vertoonde₅₀ en n_H (Figuur 5D). Terwijl zowel de DSD als de wereldwijd geoptimaliseerde biosensoren een vergelijkbare EC vertonen₅₀ (0,8 versus 0,7 μM), n_H aanzienlijk verbeterd zonder afbreuk te doen aan de₅₀ voordelen die al waren behaald. De resultaten tonen duidelijk de voordelen aan van datagestuurd ontwerp ten opzichte van op intuïtie gebaseerde benaderingen en dienen om DoE te valideren als een middel om het afstemmingsproces van biosensoren te stroomlijnen en te vereenvoudigen.

Figuur 1: Afstemming van genetisch gecodeerde biosensorparameters. Lay-out van genetische modules van een genetisch gecodeerde biosensor, inclusief aTF, operatorsites (OS), hexboxen (-35, -10) en RBS-componenten. Gekleurde vakken komen overeen met interacties die doorgaans van invloed zijn op biosensorparameters zoals: Ligand-aTF-affiniteit (grijs), aTF-operator (roze), RNAP-Hexbox (groen) en RBS (oranje). De effecten van elke parameter op de dosis-responskarakteristieken worden aangegeven in de representatieve grafieken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van een typische DoE biosensor optimalisatie workflow. (A) Overzicht van de modularisering van biosensorcomponenten met een transportmodule die codeert voor een transporteiwit om de doeleffector te importeren, een regulatormodule die betrekking heeft op de aTF en een outputmodule die codeert voor een reportereiwit zoals sfGFP. Er worden ook regulatieknooppunten getoond, zoals RBS_trans, P_reg, P_out en RBS_out, die overeenkomen met de genetische knooppunten die zullen worden onderworpen aan randomisatie om biosensorparameters te onderzoeken. (B) Een selectie van sequentie-elementen die vatbaar zijn voor basenrandomisatie, inclusief promotors en RBS'. De ouderlijke sequentie van de promotor wordt weergegeven op de bovenste regel, met de voltooide mutante sequentie hieronder, sterren geven onveranderde basen aan, terwijl K, M en N respectievelijk verwijzen naar Guanine/Thymine, Adenine/Cytosine of een nucleotide. Promotors bieden een groter randomisatiepotentieel door zich te richten op hexboxen of operatorsites en kunnen ook duplicatie of wijziging van de afstand tussen sequenties omvatten. RBS-bibliotheken bieden beperktere randomisatie-opties, maar ze zijn aanzienlijk gemakkelijker te screenen vanwege hun kleinere maximale diversiteit. (C) De expressieniveaus van de varianten worden gekarakteriseerd en vervolgens geconverteerd naar een gerangschikte lin-log-bibliotheek om de categorische variantfactoren om te zetten in 3 discrete niveaus die beter vatbaar zijn voor analyse via DoE. (D) Het in kaart brengen van de experimentele ruimte wordt uitgevoerd met behulp van gemultiplexte combinaties van de drie niveaus van elke module om een model te genereren dat kan worden gebruikt om ontwerpkeuzes te onderbouwen om de prestaties van de biosensor af te stemmen op de gewenste resultaten, dit kan zijn in de richting van dynamisch bereik of in de richting van gevoeligheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Modularisering van biosensoren, constructie van de promotorbibliotheek en geautomatiseerde workflow. (A) Voorbeeld van randomisatie van specifieke sequenties in de aTF-promotor en invoeging in het biosensorconstruct via isotherme assemblage. Vetgedrukte letters geven posities aan die gerandomiseerd zijn in de operatorsite of hexboxen volgens de verstrekte sleutel tijdens de synthese van gedegenereerde oligonucleotide. (B) Panel dat de transformatie beschrijft van de resulterende biosensorvariantbibliotheek in een kloongastheer zoals E. coli, en de volgende stappen afhankelijk van de opbrengst van de transformator. Een lage transformatie-efficiëntie kan resulteren in een slechte theoretische bibliotheekdekking en ontoereikende verkenning van de ontwerpruimte. Het oplossen van problemen in dit stadium is absoluut noodzakelijk om ervoor te zorgen dat een aanzienlijk deel van de varianten beschikbaar is voor karakterisering, met algemene maatregelen voor probleemoplossing. (C) Workflow van stap 1 en 2 zoals beschreven in het protocol, waarbij het rode handsymbool handmatige stappen aangeeft en het tandwiel geautomatiseerde stappen aangeeft. De stap 1-workflow belicht de belangrijkste stappen in het protocol, van kolonieselectie tot het genereren van cryo-aandelen. De stap 2-workflow demonstreert de heropleving en herschikking van cryovoorraden voor bepaling op basis van een dosis-responscurve. (D) Het panel dat de laatste procedure demonstreert vóór de screening, inclusief het wassen van de cellen en het overbrengen naar testplaten vóór het meten van fluorescentie en OD. In het paneel wordt een gescreende variantenpool van 5000 weergegeven, waarbij de varianten die AAN/UIT demonstreren boven de ouderpromotorsequentie (3,6-voudig) gemarkeerd in het oranje vak. Veel van de varianten clusteren zich rond 1, wat wijst op slechte prestaties en lage variabiliteit, waarschijnlijk als gevolg van de randomisatie op sequentieniveau die functieverlies veroorzaakt. De 226 varianten die in de grafiek worden getoond, zijn naar voren gebracht voor een robuuste karakterisering. Gegevens zijn aangepast van de oorspronkelijke publicatie van Alvarez Gonzalez et al²³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Screening en discretisatie van de topvariant van de promotorbibliotheek via lin-log-transformatie. (A) Overzicht van de standaardprocedure voor het genereren van expressiegegevens voor een RBS- of promotorbibliotheek. Met behulp van de getrieerde varianten die een goed bereik van expressieniveaus vertegenwoordigen, worden vloeistofverwerkers gebruikt om testplaten te genereren die voorgevuld zijn met een vooraf bepaalde concentratie van de effector waaruit dosis-responscurven van de getriageerde 226-varianten kunnen worden afgeleid. (B) Na EC_50-bepaling en verdere reductie van de gekarakteriseerde bibliotheek tot 100 varianten, worden de gegevens uitgezet als een staafdiagram dat de mix van verschillende gevoeligheden weergeeft die worden gegenereerd door de randomisatie van de promotor. (C)De EC_50-gegevens worden getransformeerd met behulp van de lin-log-snelheidsvergelijking om de continue gegevensset om te zetten in een categorische gegevensset die meer geschikt is voor factorisatie in een DSD. (D) De getransformeerde gegevens van de EC_50-variant worden weergegeven, nu teruggebracht tot een vereenvoudigde schaal en gerangschikt van hoge naar lage EC_{50-activiteit} . Hieruit worden 3 niveaus geselecteerd die overeenkomen met de bovenste (+1) geometrisch gemiddelde (0) en onderste (-1) varianten die zullen worden meegenomen naar de DSD om de experimentele ruimte te verkennen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: DSD experimenteel ontwerp, testen en modelgebaseerde leerresultaten. (A) Schematische workflow die het genereren van een DSD-ontwerptabel toont op basis van de lin-log getransformeerde gerangschikte bibliotheken van de RBS_trans-, P_reg-,_P-out- _{en RBS-out-modules}. De DSD-ontwerptabel stelt het kleinste aantal combinaties voor om de experimentele ruimte efficiënt in kaart te brengen. Er wordt een voorbeelduitvoer gegeven waarin +1, 0 en -1 verwijzen naar de hoogste, middelste en onderste presterende varianten voor elk regelgevend knooppunt, zoals beschreven door de lin-log-transformaties. Deze worden geconstrueerd via isotherme assemblage en bevestigd door sequencing voordat ze worden getransformeerd in de expressiegastheer voor karakterisering. (B) Na transformatie worden cellen gekweekt en getest tegen een breed scala aan effectorconcentraties, en de fluorescerende output wordt gemeten om dosis-responscurven te genereren. Verschillende parameters, zoals nH en EC50, worden uit de dosis-responscurven gehaald en in de DSD ingevoerd om voorspellende modellen voor elke factor te genereren. (C) Met behulp van de modellen kunnen voorspellingen worden gedaan over de impact van het moduleren van één biosensorparameter door het expressieniveau van een regulerende module te wijzigen. Belangrijk is dat globale afstemming van de regulerende knooppunten mogelijk wordt, waardoor een of meer biosensorparameters tegelijkertijd kunnen worden gemaximaliseerd, aangegeven door de onderbroken rode lijnen in elk subdiagram. (D) Het optimaliseren van het model voor maximale gevoeligheid resulteert in het wereldwijd geoptimaliseerde construct (lila), waarvan de dosis-responscurve wordt uitgezet tegen het best presterende DSD-construct (groen) en het ouderlijke biosensorconstruct (blauw). Onder de grafiek worden geëxtraheerde n_H en EC₅₀ parameters weergegeven, die de verbetering van beide parameters ten opzichte van het best presterende DSD-construct aantonen, waardoor de doeltreffendheid van de voorspellende modellen die op basis van de DSD worden gegenereerd, wordt gevalideerd. Gegevens zijn aangepast van de oorspronkelijke publicatie van Alvarez Gonzalez et al²³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Geautomatiseerde protocolstappen voor vloeistofverwerking die worden gebruikt voor de voorbereiding van de biosensorbibliotheek en het instellen van tests. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2 bij Aanvullende Figuur 6: Stapsgewijs genereren van een Definitief Screening Design (DSD). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Bibliotheken van genetische elementen die brede genetische variabiliteit omvatten, zijn cruciaal voor het succes van een op DoE gebaseerde methodologie. Zoals aangetoond in figuur 2A, neemt het aantal theoretische varianten toe met het aantal posities dat moet worden getarget voor mutagenese en de mate van randomisatie, waarbij deze steeds groter wordende bibliotheekomvang aanzienlijke screeningknelpunten creëert. Het verminderen van het aantal gerichte posities of de mate van randomisatie kan het aantal varianten dat moet worden gescreend verminderen en is een aantrekkelijke benadering als een meer gerichte benadering van afstemming vereist is of als er a priori aanzienlijke kennis van het systeem als leidraad bestaat. In het geval van systemen zoals biosensoren, die veel overlappende kenmerken hebben of mogelijk geen goed gekarakteriseerde genetische elementen hebben, is het echter moeilijk om de vereiste bibliotheekgrootte te omzeilen. Het gebruik van geautomatiseerde vloeistofverwerkers kan het werk van het plukken van kolonies en kweekvarianten bagatelliseren, met name wanneer meer gegevenspuntverzameling nodig is voor het uitzetten van meer geavanceerde functies zoals dosisresponscurves versus twee gegevenspuntvergelijkers, zoals AAN/UIT. Hoewel het moeilijk is om de tijd die wordt bespaard door het opnemen van geautomatiseerde workflows specifiek te kwantificeren, Het grote voordeel van de implementatie is dat er tijd kan worden besteed aan andere parallelle experimenten³⁸.

Desondanks worden in veel gevallen waar bibliotheken groter zijn dan 10^{4 zelfs} door een vloeistofverwerker ondersteunde methodologieën onpraktisch³⁹. In dergelijke gevallen is een voorlopige screening van varianten met behulp van flowcytometers een zeer aantrekkelijke aanpak, met een veel grotere sorteercapaciteit van maximaal 10⁷ cellen per uur⁴⁰. Het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) met twee rondes van positieve selectie en ten minste één ronde van negatieve selectie is routinematig gebruikt bij de triage van de best presterende varianten van biosensoren vóór een uitgebreidere karakterisering 16,26,42. De ontwikkeling en uitvoering van dergelijke protocollen met behulp van FACS zijn elders in detail besproken³¹. Initiële triageschermen zijn mogelijk met behulp van op platen gebaseerde vloeistofbehandelingstests, zoals beschreven in het bovenstaande protocol; door AAN/UIT-gegevens te vergelijken met behulp van een enkele effectorconcentratie zoals weergegeven in figuur 3D, kunnen alleen variantbiosensoren met een aanzienlijke functiewinst (3,6-voudig zoals voorzien in de methoden) worden geselecteerd voor verdere gedetailleerde karakterisering, stroomlijning van de bibliotheekontwikkeling en experimentele looptijd. Zowel FACS- als liquid handler-platforms gaan echter gepaard met aanzienlijke kapitaalinvesteringen voor het lab en vereisen vaak een niveau van technische expertise om te bedienen en te onderhouden. Schermen op basis van agarplaten bieden een lagere technische en financiële toetredingsdrempel en zijn gebruikt in combinatie met gfp- of blauw-witte koloniescreening om te selecteren op RBS-bibliotheekvarianten en enzymmutanten op basis van de intensiteit van fluorescentie^43,44. Ook deze zijn echter beperkt in het aantal varianten dat effectief kan worden gescreend, maar vereisen ook een aanzienlijk verschil in fluorescentie om detecteerbaar te zijn⁴⁴. Als een compromis tussen volledig combinatorische gelijktijdige mutatie van meerdere elementen tegelijk, is een "verdeel en heers"-methodologie in plaats daarvan gericht op het opsplitsen van grote variantbibliotheken in beter beheersbare screeningblokken⁴¹. Hoewel een gemodulariseerde benadering pragmatisch kan zijn, verkent het niet effectief de combinatorische ontwerpruimte, aangezien bekend is dat de prestaties van biologische componenten sterk contextafhankelijk zijn, vooral in bacteriën, waar transcriptionele en translationele koppeling veel voorkomt. Dit kan leiden tot ontwerpkeuzes die gericht zijn op de lokale maxima in plaats van op de globale optima.

Transport en herkenning van specifieke inductoren vormen een ander belangrijk kenmerk van de ontwikkeling van biosensoren dat het vermelden waard is, ondanks dat het niet de belangrijkste focus is van het geschetste protocol. Het ontbreken van een geschikte aTF voor het doelmolecuul vormt een grote uitdaging voor onderzoekers. Rationele selectie van een bestaande aTF die een structureel analoog van de doeleffector bindt, kan een ideaal sjabloon bieden om codonrandomisatie toe te passen om de specificiteit van de aTF af te stemmen op de gewenste effector¹⁷. Uitlijning van de doelsequentie met opgeloste structuren of alfa-voudige voorspellingen kan de identificatie mogelijk maken van effectorbindingsplaatsen met vermoedelijke aminozuurresiduen die zijn onderworpen aan semi-rationele randomisatie en rangschikking, aanpasbaar aan het protocol¹⁷. Evenzo kan de selectie en modulatie van transporters die verantwoordelijk zijn voor de import/export van effectoren de dosis-responskarakteristieken van biosensoren aanzienlijk veranderen. Transporter-genexpressie bleek een belangrijke speler te zijn in de biosensorrespons, met een gediversifieerde bibliotheek van_{P-tac-promotors} en RBS die de expressie van een MucK-transporter regelen die wordt gebruikt om de expressie ervan over meerdere FACS-rondes te stabiliseren, waardoor de robuustheid van de biosensorrespons wordt verbeterd¹⁷. Evenzo kan screening van verschillende transporteiwitten zelf de specificiteit van biosensoren moduleren, waarbij screening van een vermeende set PcaK-transporters met behulp van een PCA-responsieve biosensor leidt tot de identificatie van twee transporters die op unieke wijze in staat zijn om 3,5-gehydroxyleerde substraten op te nemen, waardoor de set verbindingen die door dat systeem kunnen worden gedetecteerd, wordt uitgebreid²⁴.

Geautomatiseerde platforms kunnen nog krachtigere hulpmiddelen worden voor karakterisering en verkenning wanneer DoE-principes worden gekoppeld aan deep learning-modellen^46,47. Na eerst de ontwerpruimte van een biosensor met een high-throughput-platform te hebben verkend, zijn machine learning-algoritmen gebruikt om de functie van niet-gekarakteriseerde sequenties met goede nauwkeurigheid te voorspellen ⁴⁷. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen gemakkelijk worden toegepast bij het testen van nieuwe taalleermodellen voor het ontwerpen van promotors, vergelijkbaar met modellen die zijn ontwikkeld op basis van cross-RBS-sequentievoorspelling⁴⁸. Bovendien kan de integratie van dergelijke modellen profiteren van sequentie-functiegegevens in de niet-functionele promotorontwerpen en kritisch inzicht verschaffen in de bredere functionaliteit van de biosensor als geheel. Dit zou namelijk het potentieel hebben om een cruciale beperking van de DoE-workflow aan te pakken, namelijk dat valse positieven, bijvoorbeeld een niet-functionele promotor, niet noodzakelijkerwijs gelijk staan aan een gemeten output van nul, met verschijnselen zoals valse transcriptie of het introduceren van een element van ruis in DoE-gegevens, dat moeilijk te identificeren en te controleren is. Cruciaal is dat alle gegenereerde bibliotheken, om de totale experimentele ontwerpruimte te omvatten, een breed scala aan activiteiten moeten vertonen, aangezien een ontoereikend activiteitenbereik zal resulteren in scheve ontwerpresultaten en onbetrouwbaarheid zal creëren in statistische modellen die op basis van de dataset^{worden gegenereerd 30}. Als een lage variabiliteit van de bibliotheek een probleem wordt, kan het verkennen van andere sequentie-elementen of het verhogen van de mate van randomisatie worden geïmplementeerd, en kan de variatie tussen de bibliotheken worden vergeleken totdat een geschikte variantenpool is bereikt.

Een cruciaal aspect van het DoE-proces is de juiste schatting en selectie van primaire en secundaire effecten verkregen uit de DSD, die vervolgens zullen worden opgenomen in de statistische analyse. DoE, dat een op modellering gebaseerde benadering is, is zeer vatbaar voor overfitting en vooringenomenheid, wat het optimalisatieproces snel kan bemoeilijken door iteratieve engineeringinspanningen naar suboptimale delen van de ontwerpruimte te leiden⁴⁹. Als zodanig is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle ontwerpen robuust worden geïsoleerd van dergelijke effecten, zowel in het stadium van het ontwerp als in de analyse van gegevens. In de eerste ontwerpfase van de screening kunnen gecentreerde runs waarbij alle factoren zijn ingesteld op het geometrisch gemiddelde (d.w.z. 0,0,0,0) helpen om modelbias te verminderen door beter rekening te houden met niet-lineaire interacties, zonder significante experimentele belasting toe te voegen (1-3 extra runs)⁴⁹. Bovendien kan het opnemen van gerandomiseerde ontwerpen helpen om rekening te houden met externe variabelen die niet zijn opgenomen in het experimentele ontwerp, maar die toch van invloed kunnen zijn op de responsvariabelen die worden gemeten. In een biologische context richt randomisatie zich op zaken als spatiotemporele effecten, zoals plaatpositie, of batch-tot-batchvariatie, waardoor wordt voorkomen dat dergelijke effecten de interpretatie van gegevens significant beïnvloeden. Aandacht voor dergelijke details in dit vroege stadium kan de robuustheid van modellen verbeteren en tot betrouwbaardere conclusies leiden. Na het uitvoeren van de door DSD voorgestelde experimenten is statistische analyse van de gegevens nodig om de factoren op te helderen die een significante invloed hadden op de outputparameters. Halfnormale grafieken bieden een intuïtieve visuele weergave van effectgroottes, waarbij effecten zonder betekenis doorgaans langs een rechte lijn vallen, terwijl effecten met een significante impact van deze lijn afwijken, waardoor een eenvoudige selectie van de belangrijkste factoren bij biosensoroptimalisatie mogelijk is. Met dit in gedachten moet een conservatieve benadering van effectselectie worden gevolgd, zoals bij alle modellering, om het risico van overfitting van het model te verminderen.

De mogelijkheid om snel biosensoren en andere genetische circuits te ontwerpen en te optimaliseren, zal het tempo van het onderzoek op het gebied van biotechnologie aanzienlijk versnellen, zoals in de ontwikkeling van stammen en enzymen, maar ook in real-time diagnostiek. De opkomst van op DoE gebaseerde screeningmethodologieën op dit gebied is bijzonder veelbelovend, omdat het een efficiënt gebruik van tijd en middelen vergemakkelijkt en tegelijkertijd de maximaal mogelijke ontwerpruimte wordt verkend, en is al met groot succes gebruikt bij de optimalisatie van genetische circuits voor metabole routes en voor biosensoren 31,33,34,51. DoE is bijzonder geschikt voor multifactoriële optimalisatieproblemen waarbij veel interacties van de eerste, tweede of zelfs derde orde aan het werk zijn die anders moeilijk te ondervragen zouden zijn met de typische experimentele ontwerpbenadering van één factor tegelijk. Verder resulteren pogingen om één aspect van een biosensor te ontwikkelen vaak onbedoeld in het opofferen van een andere parameter, zoals het verbeteren van de gevoeligheid ten koste van dynamisch bereik⁵¹. Door het vermogen van DoE om dergelijke verborgen interacties in kaart te brengen en modellen te creëren die het gedrag van biosensoren voorspellen, wordt de leercyclus van de bouwtest aanzienlijk versneld.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL CO-RE Tips, sterile non-filter	Hamilton	235939
2.2 mL 96 Deepwell Plate, Square Wells with V-Shaped Bottoms	Thermo	11594754
300 µL CO-RE Tips, stacked NTRs, sterile	Hamilton	235985
96 well clear bottom, black microtitre plates	Greiner	655097
Agarose	Invitrogen	16500100
Assembled Plasmid DNA	User Supplied	NA
ClarioStar Plus Microplate reader	BMG	NA
Dexynucloetide (dNTP) solution mix	NEB	N0447L
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReaggents	BP231-100
DNA Ladder 100bp	NEB	N3231L
DNA Ladder 1KB	NEB	N3232L
DNA Sequencing	Source Bioscience	NA
DNA Synthesis	IDT	NA
Escherichia coli DH5α Compotent Cells	NEB	C2987H
Gel Loading Dye, Purple X6 No SDS	NEB	B7025S
Gene pulser/Micropulser Electroporation Cuvettes, 0.2cm gap	Biorad	1652082
Graph Pad Prism 10	GraphPad	NA
Hamilton Star Liquid Handler	Hamilton	NA
HT multitron Plate Shaker Incubator	Infors HT	NA
JMP Statistical Analysis Suite	JMP	NA
LB Broth (Miller)	Miller	L3522
LB Broth (Miller) with agar	Sigma	L3147
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621S
Q5 High fidelity DNA polymerase	NEB	M0491S
QIAprep Spin Midiprep Kit	QIAGEN	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706X4
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Qpix 420 Colony Picker	Molecular Devices UK	NA
SOC Outgrowth Medium	NEB	B9020S
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA, 50X)	Thermo Fisher	B49
UltraPureTM Dnase/Rnase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015