Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68463

⸱

7 november 2025

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van op BRET gebaseerde biosensoren voor real-time meting van G-eiwitactivering in levende HEK293-cellen bij G-eiwitgekoppelde receptorligandstimulatie. Hier dienen de β2-adrenerge receptor en cannabinoïde type 1-receptor als voorbeeld om de efficiëntie van sensoren voor verschillende G-eiwitsubtypes en voor verschillende GPCR's aan te tonen.

Samenvatting

G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) vormen de grootste familie van transmembraanreceptoren en spelen een cruciale rol bij cellulaire signalering door extracellulaire stimuli om te zetten in intracellulaire responsen. GPCR-activering leidt tot conformationele veranderingen die interacties met heterotrimere G-eiwitten mogelijk maken. Bij activering ondergaat de Gα-subeenheid GDP-GTP-uitwisseling, waarbij wordt losgekoppeld van het Gβγ-dimeer en stroomafwaartse signaleringscascades worden geactiveerd. Om GPCR-gemedieerde G-eiwitactivering te bestuderen, zijn bioluminescentie-resonantie-energieoverdracht (BRET)-gebaseerde biosensoren een zeer gevoelige en niet-invasieve benadering. De op G-proteïne gebaseerde tricistronische activiteitssensoren (G-CASE-biosensoren), ontwikkeld door Schihada et al., detecteren heterotrimeerdissociatie als een proxy voor activering en maken de real-time monitoring van GPCR-activiteit mogelijk met behulp van een enkele plasmidetransfectie, waardoor de beperkingen van co-transfectiebenaderingen worden overwonnen. BRET-assays bieden verschillende voordelen ten opzichte van op fluorescentie gebaseerde technieken, zoals minder achtergrondruis, minder fotobleken en verbeterde gevoeligheid. In dit protocol werden de op BRET gebaseerde G-CASE biosensoren gebruikt in levende cellen en platen met 96 putjes. Concreet beoordelen we de activiteit van de β2-adrenerge receptor (β2-AR) en de cannabinoïde type 1-receptor (CB1R) in termen van activering van het G-eiwit. Met behulp van HEK 293T wildtype cellen die tijdelijk zijn getransfecteerd met β2-AR en HEK293T cellen die stabiel CB1R tot expressie brengen, wordt de robuustheid van Gs en Gi3 G-CASE biosensoren bevestigd. Dit protocol ondersteunt het nut van deze benadering voor farmacologische studies en high-throughput GPCR-screening om het vermogen van liganden om specifieke routes te activeren, bijvoorbeeld via een bevooroordeelde signalering, beter te begrijpen en zo de ontdekking van nieuwe therapeutische verbindingen te vergemakkelijken.

Inleiding

G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) vertegenwoordigen de grootste superfamilie van transmembraanreceptoren, verantwoordelijk voor het transduceren van extracellulaire stimuli in intracellulaire signaalcascades die resulteren in specifieke biologische reacties. Het zijn cruciale farmacologische doelen, waarbij ongeveer 30% van de op de markt gebrachte geneesmiddelen inwerkt op GPCR's1. GPCR-ligandbinding induceert conformationele veranderingen in de receptor, waardoor interacties met heterotrimere G-eiwitten en/of GPCR-kinasen (GRK's) en β-arrestinen worden vergemakkelijkt, waardoor stroomafwaartse signalering of receptorinternalisatie wordt geïnitieerd2.

Heterotrimere G-eiwitten dienen als de primaire intracellulaire transducers van GPCR-signalering en bestaan uit drie subeenheden: Gα, Gβ en Gγ. Deze heterotrimeren worden ingedeeld in vier families - Gi/o, Gs, Gq en G12/13 - op basis van het Gα-subtype , die elk verschillende signaalroutes activeren: het Gi/o-subtype remt adenylaatcyclase, terwijl Gs het stimuleert, Gq fosfolipase C-β activeert en G12/13 GTPases uit de Rho-familie reguleert.

GPCR-activering leidt tot hun conformationele herschikkingen, waardoor een snelle betrokkenheid van G-eiwitten binnen de kinetiek van minder dan een seconde mogelijk is. Dit proces induceert conformationele veranderingen in het G-eiwit, waardoor de GDP-GTP-uitwisseling in de Gα-subeenheid wordt bevorderd. GTP-binding verandert de conformatie van de Gα subeenheid verder, wat resulteert in dissociatie van het Gβγ-dimeer, waardoor signaalvoortplanting mogelijk wordt. G-eiwitten zijn dus cruciaal bij het moduleren van de specificiteit en temporele dynamiek van cellulaire responsen door het reguleren van diverse effectoreiwitten zoals adenylaatcyclase of ionenkanalen 3,4,5.

Dit protocol schetst de meting van G-eiwitactivering of -inactivatie met behulp van bioluminescentie-resonantie-energieoverdracht (BRET)-gebaseerde biosensoren op GPCR-ligandstimulatie in levende cellen. Geïnspireerd door baanbrekend werk op het gebied van G-eiwit biosensoren 6,7,8,9, is het G-CASE-systeem (G protein tri-cistronic activity sensors), geïntroduceerd door Schihada et al.10, gebaseerd op BRET tussen gelabelde Gα- en Gβγ-subeenheden en biedt het een gestroomlijnde aanpak die slechts een enkele plasmidetransfectie vereist. Deze functie verbetert de gevoeligheid en vermindert de uitdagingen die gepaard gaan met co-transfectie van meerdere plasmiden die coderen voor de drie subeenheden (Gα, Gβ en Gγ) van het heterotrimere G-eiwit. Deze sensoren zijn commercieel ter beschikking gesteld aan academische onderzoeksgroepen (zie Materiaaltabel).

BRET biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Bij BRET vindt energieoverdracht plaats tussen een bioluminescente donor en een fluorescerende acceptor zonder dat er externe lichtbronnen nodig zijn. Deze intrinsieke bioluminescentie vermindert problemen die verband houden met FRET, zoals autofluorescentie en lichtverstrooiing, wat resulteert in een lager achtergrondsignaal en een verbeterde testgevoeligheid 6,7,11.

Deze afwezigheid van externe excitatie in BRET minimaliseert fotobleken en fototoxische effecten, wat leidt tot lagere achtergrondsignalen in vergelijking met FRET. Bijgevolg vertonen BRET-testen meestal een verhoogde gevoeligheid, waardoor de G-eiwitactivering van constitutief actieve GPCR's kan worden gemeten. De verhoogde gevoeligheid van BRET-testen vergemakkelijkt de detectie van subtiele biologische interacties, wat vooral waardevol is in farmacologische studies waar een nauwkeurige meting van de receptoractiviteit cruciaal is.

Deze biosensoren kunnen worden vertaald in high-throughput screening in platen met 96 of 384 putjes, zoals onlangs is aangetoond door Scott-Dennis et al., waar een methode met behulp van deze biosensoren is ontwikkeld in een membraangebaseerde 384-well-assay om de activiteit van cannabinoïde-receptoren CB1R en CB2R12 te analyseren. Dit artikel beschrijft het gebruik van deze biosensoren in platen met 96 putjes in levende cellen door de activiteit van de β2-AR te meten als een klasse-A prototypische GPCR, die Gs-eiwit bindt en de CB1R, die behoort tot klasse-A GPCR's en het Gi/o-familie-eiwit activeert. Het gebruik van twee G-CASE-biosensoren wordt gevalideerd: Gs en Gi3 in HEK 293T-cellen met de GPCR ofwel tijdelijk (met de β2-AR) of stabiel tot expressie gebracht (met de CB1R).

Het is belangrijk op te merken dat dit experiment in verschillende cellijnen kan worden uitgevoerd, wat de veelzijdigheid en robuustheid van deze techniek in verschillende cellulaire contexten aantoont. Dit zorgt ervoor dat de methode kan worden toegepast op diverse experimentele modellen, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het bestuderen van GPCR-signalering in verschillende fysiologische en farmacologische omgevingen. Figuur 1 illustreert het principe van op BRET gebaseerde G-eiwitactiviteitssensoren.

figure-introduction-1
Figuur 1: Principe van op BRET gebaseerde G-eiwit activiteitssensoren. G-eiwitsensoren bestaan uit drie subeenheden: Gα, native Gβ en Gγ. De Gα-subeenheid is gefuseerd met de kleine en heldere NanoLuciferase (Nluc), terwijl de Gγ-subeenheid N-terminaal is gelabeld met circulair gepermuteerde Venus (cpVenus173). De genen die coderen voor deze gemanipuleerde G-eiwitsubeenheden worden gecombineerd tot een enkel plasmide. Ligandbinding aan GPCR's induceert GPCR-conformatieveranderingen, bevordert de rekrutering van G-eiwitten en de daaropvolgende dissociatie, gevolgd door GTP-hydrolyse. Deze dissociatie verstoort de energieoverdracht tussen de partners, wat resulteert in een afname van het BRET-signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Putplaat zaaien (dag 1)

OPMERKING: Volg alle celkweekprotocollen in een steriele laminaire stroomkap om steriele omstandigheden te behouden. Witte putplaten met transparante platte bodems worden gebruikt om de celgroei en levensvatbaarheid te volgen. Gebruik de volledig witte putplaat om het gebruik van een sticker in stap 3.2.1 te vermijden.

  1. Coating van de putplaat
    OPMERKING: Voorgecoate platen kunnen worden gebruikt om deze stap te omzeilen.
    1. Giet in een meerkanaals reservoir ongeveer 6 ml steriel gefilterde Poly-L-lysine (PLL) oplossing (0,01%). Vul met een meerkanaalspipet elk putje van een microplaat met 96 witte putjes met 60 μL PLL.
    2. Plaats de microplaat op een donkere plaats en broed gedurende 20 minuten.
    3. Ga tijdens de incubatie verder met de voorbereiding van de cellen zoals beschreven in de stappen 1.2.1-1.2.3.
    4. Zuig de PLL-oplossing op met de meerkanaalspipet en bewaar deze bij 4 °C in een buisje van 15 ml.
    5. Was de plaat drie keer met DPBS om vrije PLL te verwijderen die celdegradatie zou kunnen veroorzaken.
  2. Celvoorbereiding en plating
    1. Kweek HEK293-cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine bij 37 °C in 5% CO2.
      OPMERKING: FBS wordt aan het kweekmedium toegevoegd om de nodige voedingsstoffen en groeifactoren te leveren die nodig zijn voor een goede levensvatbaarheid van de cellen.
    2. Verwijder het medium en spoel de cellen met 2 ml DPBS.
    3. Voeg 0,5 ml trypsine toe en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken.
    4. Voeg 4,5 ml DMEM toe aan de kolf om trypsine te neutraliseren en pipetteer vervolgens herhaaldelijk op en neer om de cellen los te maken en opnieuw te suspenderen.
    5. Breng de losgemaakte cellen over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 x g (bij kamertemperatuur, RT).
    6. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 2 ml DMEM.
    7. Tel de cellen met een Malassez telkamer en bereid 9 ml met 300.000 cellen/ml. Doe ze in een meerkanaals reservoir en zaai de microplaat met 96 putjes door 100 μL per putje te gieten met de meerkanaalspipet (uiteindelijke dichtheid van 30.000 cellen/putje).
    8. Incubeer de microtiterplaat à 37 °C, 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur.
      OPMERKING: De cellen zouden rond 70%-80% samenvloeiing voor een efficiënte transfectie moeten bereiken.

2. Plasmide-transfectie (dag 2)

OPMERKING: De transfectie van de cel kan op dag één op opgeschorte cellen vóór het plateren, tijdens stap 1.2.7, en gegevensaanwinst op dag 3 worden uitgevoerd.

  1. Verdun 10 μg van het gewenste plasmiden-DNA (bijv. 5 μg β2-adrenerge receptor en 5 μg Gs(kort)-CASE in HEK wt-cellen of slechts 10 μg Gi3-CASE in HEK CB1-cellen) en 20 μL Lipofectamine in de buisjes met 500 μL Opti-MEM-medium. Incubeer 5 minuten bij RT.
    1. Voor een negatieve controle vervangt u de β2-adrenerge receptor door leeg plasmide pcDNA 3.1 in dezelfde concentratie. Combineer de oplossingen in één buis en meng om een transfectiemengsel (1 ml) te verkrijgen.
  2. Incubeer het transfectiemengsel bij RT gedurende 20 min.
  3. Voeg 10 μL van transfectiemengsel van stap 2.2 druppelsgewijs aan elk putje toe, en schommel de plaat voorzichtig heen en weer om het volledige mengen te verzekeren.
    OPMERKING: Er wordt een uiteindelijke concentratie van 100 ng DNA per putje verkregen.
  4. Incubeer de microtiterplaat in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur.

3. Gegevensverzameling (dag 3)

  1. Ligand preparaat
    OPMERKING: Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) buffer: NaCl 140 mM, Kaliumchloride 5 mM, Calciumchloride 1 mM, Magnesiumsulfaat Heptahydraat 0,4 mM, Magnesiumchloride Hexahydraat 0,5 mM, Natriumfosfaat Dibasisch Dihydraat 0,3 mM, Kaliumfosfaat Monobasisch 0,4 mM, D-Glucose (Dextrose) 6 mM, Natriumbicarbonaat 4 mM, pH 7,4, gefilterd 0,22 μm.
    1. Bereid een stockoplossing in de hoogst mogelijke concentratie in het juiste oplosbaarheidsoplosmiddel voor de verschillende liganden (in dit protocol wordt isoproterenol bereid in H20 mQ en WIN-55.212-2 in DMSO).
      OPMERKING: De concentratie van de ligandstockoplossing moet worden aangepast afhankelijk van de oplosbaarheid en de bekende dissociatieconstante (Kd) van de ligand.
    2. Bereid uit deze voorraad een ligand seriële verdunning van 10 μl rond de Kd van de ligand in het geschikte oplosbaarheidsoplosmiddel. Bewaar deze seriële verdunning bij -20 °C.
      OPMERKING: Afhankelijk van de ligand kan het seriële verdunningsbereik tot tien keer worden ingevroren en ontdooid voordat degradatie optreedt. Bereid een oplossing die alleen het oplosmiddel bevat dat wordt gebruikt voor het oplossen van liganden om een mediumconditie op te nemen (in dit protocol H20 of DMSO).
    3. Voer voor elke ligandconcentratie en elk vehiculum een verdunning van 1/100 in HBSS uit door 1,3 μl van elke concentratie toe te voegen aan een totaal volume van 130 μl. Dit resulteert in een uiteindelijke concentratie van 1% voertuig in HBSS.
      OPMERKING: Dit eindverdunningsbereik wordt gebruikt voor experimenten door 10 μl toe te voegen om een totaal volume van 100 μl per putje te verkrijgen. Dit resulteert in een eindconcentratie van 0,1% medium in alle putten. Het volume van 130 μL komt overeen met de hoeveelheid die nodig is om een rij van een plaat met 96 putjes te vullen: (10 x 12) ± 10%. Elke rij komt overeen met een andere ligandconcentratie, waarbij de laatste rij dient als voertuigbesturing.
    4. Bereid 980 μl Furimazine 1/100 verdunning uit stockoplossing (9,8 μl in 970,2 μl HBSS om een totaal volume van 980 μl te verkrijgen).
      OPMERKING: Bereid een verse oplossing van furimazine en laat deze minimaal 3 minuten incuberen. Voeg het vervolgens direct voor de aanschaf toe. Het moet niet te vroeg worden bereid, omdat het signaal bij kamertemperatuur een halfwaardetijd heeft van ongeveer 120 minuten. Om deze beperking te overwinnen, kunnen langwerkende furimazine-derivaten, zoals vivazine en endurazine, worden gebruikt. Deze substraten houden tot 48 uur lang een stabiel BRET-signaal aan.
  2. Plaat lezingen
    OPMERKING: Gebruik een multimode plaatlezer. Pas de meting aan de bestudeerde omstandigheden en het aantal replicaten aan. Hier wordt de gegevensverwerving verdeeld in drie lezingen van 4 kolommen, wat overeenkomt met 32 putjes. Alle metingen worden gedaan met topoptiek met een transparant deksel erop om bufferverdamping te voorkomen. Pas vóór alle metingen de meetversterking aan. In deze studie werd de winst vastgesteld op 3600. Het is mogelijk om handmatige toevoeging van ligand te vermijden door gebruik te maken van een geautomatiseerd injector- of spuitsysteem, dat in veel plaatlezers verkrijgbaar is.
    1. Verwijder het medium uit de eerste 4 kolommen van de plaat met 96 putjes. Spoel elk goed af met 100 μL HBSS en voeg 80 μL HBSS toe. Plak een witte sticker op de onderkant van de plaat. Dit verbetert fluorescentie- en/of bioluminescentiemetingen.
    2. Registratie van G-eiwitluminescentiespectra: Plaats de plaat met 96 putjes in de plaatlezer. Registreer cpVenus173-emissie met behulp van een 535/30-nm monochromator en meet de luminescentie-emissie tussen 500 en 600 nm met een resolutie van 2 nm.
      OPMERKING: Deze opname is een controle om ervoor te zorgen dat fluorescentie wordt uitgezonden bij cpVenus173-excitatie .
    3. Registratie van G-eiwitluminescentiespectra: Registreer de Nluc-emissie-intensiteit met behulp van een monochromator van 450/40 nm en meet de luminescentiemissie tussen 400 nm en 600 nm met een resolutie van 5 nm.
      OPMERKING: Deze opname is een controle om ervoor te zorgen dat er geen bioluminescentie wordt uitgezonden vóór de toevoeging van Nluc-substraat, furimazine.
    4. Verwijder de plaat uit de plaatlezer en voeg met behulp van een meerkanaalspipet 10 μl van de eerder bereide furimazine-oplossing (stap 3.1.4.) toe aan elk putje.
    5. Herhaal stap 3.2.3.
      OPMERKING: Deze opname is een controle om ervoor te zorgen dat bioluminescentie wordt uitgezonden bij toevoeging van furimazine. Ga direct verder met stap 3.2.6 na deze meting om signaalvariatie als gevolg van furimazineconsumptie en/of degradatie te voorkomen. BRET-signaalvariatie kan optreden als gevolg van consumptie en/of afbraak van furimazine en regulerende processen die plaatsvinden om de respons te beëindigen die wordt geïnduceerd door agoniststimulatie. Om deze beperking te overwinnen, kunnen GRK-remmers (CMPD101) en internalisatieremmers (dynasore) of gen-bewerkte cellen zonder GRK's of arrestines worden gebruikt.
    6. Registratie van G-eiwit basale BRET: Voordat GPCR's ligand worden toegevoegd, registreert u de emissie-intensiteit van Nluc en cpVenus173 met behulp van respectievelijk een monochromator van 450/40 nm en een monochromator van 535/30 nm. Meet 3 cycli van 60 s met een meetintervaltijd van 0,30 s (totale leestijd van 3 min).
      OPMERKING: Het verlengen van de meetintervaltijd tot 0,90 s verbetert meestal de signaal-ruisverhouding aanzienlijk, maar resulteert in een veel langere leestijd. De onderzoeker moet beslissen of de hogere temporele resolutie of de verbeterde signaal-ruisverhouding belangrijker is voor hun toepassing.
    7. Verwijder de plaat uit de plaatlezer en voeg met behulp van een meerkanaalspipet 10 μl van het eerder bereide verdunningsbereik van de GPCR-ligand (stap 3.1) toe aan elk putje van één kolom. Volg dezelfde procedure voor de 3 andere kolommen.
    8. Registratie van door G-eiwit ligand geïnduceerde BRET: Registreer de emissie-intensiteit van Nluc en cpVenus173 met behulp van respectievelijk een monochromator van 450/40 nm en een monochromator van 535/30 nm. Meet 16 cycli van 60 s met een meetintervaltijd van 0,30 s (totale leestijd van 16 min).
      OPMERKING: Stel de meetparameters in om de putten in kolommen te meten. Duplicaten worden gelezen met een tijdsverschil van 2,4 s.
    9. Herhaal stap 3.2. voor de volgende vier kolommen 2 keer.

4. Gegevensanalyse

OPMERKING: Verzamel de gegevens van elke meting in afzonderlijke gegevensspreadsheetbestanden.

  1. Meetwaarden controleren
    1. Zet de emissie-intensiteit af tegen de golflengte.
  2. Basale BRET-metingen
    1. Bereken voor elke put de BRET-ratio van de drie metingen. De BRET-ratio wordt gedefinieerd als acceptoremissie/donoremissie.
      figure-protocol-1
    2. Bereken voor elke put het gemiddelde van de drie BRET-ratio's voorafgaand aan ligandtoevoeging. Deze waarde wordt de basale BRET-ratio vóór ligandstimulatie genoemd: Ratiobasaal.
    3. Om de vorige BRET-ratio's van alle putten te normaliseren, trekt u voor elk van de drie metingen respectievelijk de BRET-ratiowaarde berekend op basis van de voertuigcontroleputten af van de BRET-verhouding op het overeenkomstige meettijdstip.
      OPMERKING: De geanalyseerde gegevens komen overeen met de tijdstippen vóór de toevoeging van ligand. Aangezien de putten waarin de ligand wordt toegevoegd bekend zijn, kunnen de controleputten van het voertuig dienovereenkomstig worden geïdentificeerd.
  3. G-eiwit ligand-geïnduceerde BRET-metingen
    1. Bereken voor elke put de BRET-ratio van elke aflezing, zoals beschreven in paragraaf 4.2.1. Die waarden worden Ratiostim genoemd.
    2. Om ligand-geïnduceerde veranderingen te kwantificeren, berekent u de ΔBRET voor elkeRatio-stim van elke put als een percentage boven basaal. Gebruik daarvoor de corresponderendeRatio basaal die eerder is berekend in paragraaf 4.2.2.
      figure-protocol-2
    3. Bereken de ΔBRET(%) om de ΔBRET-waarden van elke put te normaliseren. Trek daarvoor de respectievelijke ΔBRET-waarden van het voertuig af.
    4. Om de ΔBRET-kinetiek in een gegevensspreadsheet te visualiseren, voegt u de drie basale BRET-metingen toe die zijn genormaliseerd in stap 4.2.3. voor de overeenkomstige ΔBRET(%) waarden berekend voor elke put in punt 4.3.3.
    5. Zet de vorige gegevens af tegen het tijdstip van de lezing om een kinetische grafiek te verkrijgen.
    6. Wanneer een plateau is bereikt, neemt u de ΔBRET(%) waarden op een gekozen tijdstip en zet u deze uit tegen de concentratie van de gebruikte ligand, aangezien elke put overeenkomt met een andere ligandconcentratie. Er wordt een dosis-responscurve verkregen.
      OPMERKING: Het plateau wordt meestal ongeveer 5 minuten na ligandstimulatie bereikt. In dit protocol worden de waarden uitgezet die worden verkregen na 15 minuten ligandstimulatie. Om gegevens van verschillende experimenten te vergelijken, past u de tijd aan afhankelijk van de kinetiek van activering.
    7. Plot de eerdere gegevens in analysesoftware en pas ze aan met behulp van een sigmoïdale dosis-respons drie-parameter fit op basis van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-3
      waarbij X de concentratie van de gebruikte ligand is, Y de ΔBRET(%) waarden, Top en Bottom de plateaus vertegenwoordigen en EC50 de ligandconcentratie is die nodig is om 50% van het maximale effect te bereiken. Hiermee kan men de Emax en EC50 behalen.
    8. Vergelijk gegevens van de controleconditie met behulp van een niet-parametrische Mann-Whitney-test. Resultaten worden als significant beschouwd bij p < 0,05.

figure-protocol-4
Figuur 2: Belangrijkste stappen voor het uitvoeren van de BRET-test. Overzicht van de drie belangrijkste experimentele stappen die in dit protocol worden beschreven (celzaaiing, celtransfectie en BRET-signaalacquisitie) en gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor gegevensverzameling. Experimentele opstelling: Op dag 1 worden cellen gezaaid in een PLL-voorgecoate witte plaat met 96 putjes met een vlakke, heldere bodem met een dichtheid van 30.000 cellen/putje. Op dag 2 worden de cellen getransfecteerd met de geselecteerde proteïnesensor G samen met of de bestudeerde GPCR of pcDNA3.1 plasmiden. Na 24 uur incubatie wordt de activiteit van de G-proteïnesensor gemeten door middel van bioluminescentie- en fluorescentiemetingen bij toevoeging van liganden. Gegevensverzameling: Na het HBSS-wassen van de cellen wordt 80 μL HBSS aan de putjes toegevoegd en wordt cpVenus 173-fluorescentie-emissie gemeten tussen 500 nm en 600 nm met behulp van een 535/30-nm monochromator (1). Vervolgens wordt Nluc-bioluminescentie gemeten tussen 400 nm en 600 nm met behulp van een monochromator van 450/40 nm, zowel vóór (2) als na (3) de toevoeging van furimazine. Ten slotte wordt het BRET-signaal voor basale en ligand-geïnduceerde G-eiwitactiviteit gemeten met behulp van respectievelijk 450/40 nm en 535/30 nm monochromatoren gedurende 3 minuten (3 cycli van 60 s met een meetinterval van 0,30 s) (4) en 16 min (16 cycli van 60 s met een meetinterval van 0,30 s) (5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een algemeen schema van de experimentele opzet en uitvoering wordt gedetailleerd beschreven in Figuur 2. De activering van eiwitten van deG-s - of G,i/o-familie , na ligandactivering van twee GPCR's, werd geëvalueerd met behulp van de G-CASE-biosensoren. Eerst werd een prototypische familie A GPCR bestudeerd, de β2-AR die tijdelijk werd getransfecteerd in HEK 293T-cellen. Wanneer een agonist (d.w.z. isoproterenol) werd toegepast op HEK ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van BRET-biosensoren voor real-time meting van G-eiwitactivering in levende cellen als reactie op GPCR-stimulatie met specifieke liganden. Door gebruik te maken van het bioluminescente donor-acceptor energieoverdrachtsprincipe, maakt deze benadering de detectie van conformationele veranderingen en dissociatie van heterotrimere G-eiwitten bij receptoractivering mogelijk, wat een robuust en gevoelig platform biedt voor het bestuderen van GPCR-sig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

HEK-CB1-cellen waren een vriendelijk geschenk van M. Guzman (Complutense Universiteit, Madrid, Spanje), en β2-adrenerge receptorplasmide was een vriendelijk geschenk van D. Perrais (IINS, Interdisciplinair Instituut voor Neurowetenschappen, Bordeaux, Frankrijk). Gi3-CASE en Gs(short)-CASE was een geschenk van Gunnar Schulte (Addgene plasmide # 168122; Addgene plasmide # 168124). Een deel van de illustraties is gemaakt met behulp van BioRender.com. Dit werk wordt ondersteund door het Franse Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche en financiering van het Franse nationale onderzoeksagentschap (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019), AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647) en SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Advanced 96-well culture plate, white with transparent flat bottom, with lid, Greiner bio-oneDutscher655983
BrightMax ClearLine White FilmDutscher760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD4540
DPBS Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cellSigma D8537
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAXSigmaD0822Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik
Fetal bovine serum (FBS)Sigma F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-VenusAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Gift van Gunnar Schulte
Galphas(short isoform)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-VenusAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Gift van Gunnar Schulte
HEK-293T stably expressing CB1R (HEK CB1)Vriendelijk geschenk van M. Guzman (Complutense University, Madrid, Spanje)
HEK-293T wild-type (HEK wt)
IsoproterenolSigmaI6504Gelooid in H20 en bewaard bij – 20 °C
Lipofectamine 2000Invitrogen 116668019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium GlutaMAX SupplementFischer11564506
pcDNA3 Flag beta-2-adrenergic-receptor tag FLAG C-terVriendelijk geschenk van D. Perrais (IINS, Bordeaux)
pcDNA3.1-(empty)-TAGAddgene138209
Penicillin/streptomycinSigma P4333
Poly-L-lysine solution (PLL)SigmaRNBL7086
Trypsin-EDTA Sigma T3924
WIN-55,212-2Cayman Chemicals10009023Gelooid in DMSO en bewaard bij – 20 °C

Referenties

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Zhang, M., et al. G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).
  3. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. protein pathways. Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).
  5. Hepler, J. R., Gilman, A. G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).
  6. Van Unen, J., et al. A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells. PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).
  7. Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).
  8. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2411 (2001).
  9. Galés, C., et al. Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes. Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).
  10. Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors. Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).
  11. Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors. Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).
  12. Scott-Dennis, M., et al. Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors. Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).
  13. Violin, J. D., et al. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics. J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).
  14. Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics. Life Sci. 38, 309-315 (1985).
  15. Thomas, B. F., et al. Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists. J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).
  16. Schihada, H., et al. Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias. J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68463

Trefwoorden

GPCR activiteitBRET assaylive cell imagingG eiwitactivatieligand biased signalering96 wells plaatHEK293T cellenb ta2 adrenerge receptorcannabino dereceptor CB1
Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.