Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Komeettest om DNA-schade te kwantificeren in FLT3-cellen die mutant tot expressie brengen van 32D na blootstelling aan type I en type II FLT3-remmers

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68469

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een effectieve methode voor het kwantificeren van het verschil in DNA-schade veroorzaakt door type I- en type II-remmers in FLT3-mutante cellen door de toepassing van de komeettest.

Samenvatting

FMS-achtig tyrosinekinase 3 (FLT3), een klasse III receptor tyrosinekinase, vertoont een mutatiefrequentie van ongeveer 30% bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML) en vormt een cruciaal therapeutisch doelwit. Als representatieve type I en type II FLT3-remmers worden respectievelijk gilteritinib en Quizartinib (AC220) klinisch gebruikt bij de behandeling van FLT3-mutante AML.

Gilteritinib remt zowel geactiveerde als geïnactiveerde FLT3-eiwitten, met extra remming van AXL-doelen om resistentie te helpen overwinnen. AC220 remt geactiveerde FLT3. De komeettest werd systematisch gebruikt om DNA-schadepatronen te kwantificeren en te vergelijken die werden geïnduceerd door type I versus type II FLT3-remmers in mutante cellen. Uit de experimentele resultaten bleek dat de DNA-schade veroorzaakt door AC220 significant hoger was dan die veroorzaakt door Gilteritinib. Voor sterke DNA-schade kunnen FLT3-remmers worden gecombineerd met DNA-schadeherstelremmers om DNA-hersteldefecten aan te pakken. De resultaten bieden experimentele ondersteuning voor de rationele combinatiestrategie van geneesmiddelen gericht op DNA-schade.

Inleiding

Acute myeloïde leukemie (AML) vertegenwoordigt een klonale hematopoëtische stamcelaandoening die wordt gedefinieerd door pathologische expansie van ongedifferentieerde myeloïde voorlopercellen, resulterend in hematopoëtische onderdrukking en beenmergfalen. De inherente moleculaire heterogeniteit van AML brengt aanzienlijke therapeutische uitdagingen met zich mee1. Van bijzonder klinisch belang vormen FMS-achtige tyrosinekinase 3 (FLT3)-mutaties een van de meest voorkomende genetische veranderingen bij AML, die in ongeveer 30% van de gevallen voorkomen, en vertonen ze een sterke correlatie met ongunstige klinische resultaten2. De FLT3-receptortyrosinekinase ondergaat activering op het plasmamembraan om PI3K/AKT- en RAS/MAPK-signaleringscascades te mediëren, terwijl de FLT3-ITD-mutante variant wordt behouden in het endoplasmatisch reticulum, waardoor persistente signaaltransducer en activator van transcriptie 5 (STAT5) fosforylering worden geïnduceerd. Deze genetische veranderingen drijven leukemogenese aan via meerdere oncogene mechanismen, voornamelijk door ontregeling van signaaltransductie, ongecontroleerde proliferatieve signalering en apoptotische resistentie3.

AC220 en gilteritinib, als typische FLT3-remmers, remmen celproliferatie en induceren apoptose door FLT3-expressie te onderdrukken, maar met verschillende werkingsmechanismen. Gilteritinib (een type I-remmer) bestrijkt niet alleen een breder spectrum van FLT3-activerende mutaties, maar remt ook de AXL-tyrosinekinase, die nauw verwant is aan FLT3. Door dubbele remming kan gilteritinib de groei van kankercellen uitgebreider blokkeren4. AC220 (een type II-remmer) oefent zijn remmend effect uit door competitieve binding aan de geactiveerde kinaseconformatie, specifiek gericht op de ATP-bindende pocket met hoge specificiteit5. Deze remming kan leiden tot stilstand van de celcyclus en verhoogde DNA-replicatiestress.

Gilteritinib wordt in verband gebracht met een laag risico op resistentie en is geïndiceerd voor monotherapie bij recidiverende/refractaire FLT3-mutante AML. AC220 is effectief en selectief voor FLT3-ITD-mutaties, met goede klinische responspercentages, maar is niet effectief voor FLT3-TKD-mutaties, en kan resistent zijn tegen FLT3-TKD-mutaties als gevolg van secundaire FLT3-TKD-mutaties (e.g. D835 of F691L) tegen het ontwikkelen van resistentie. Deze remmers hebben aan bekendheid gewonnen in AML-therapieën op basis van aangetoonde klinische werkzaamheid en verbeterde therapeutische indices6. Het klinische gebruik van deze geneesmiddelen wordt echter uitgedaagd door verworven resistentie en off-target effecten. Langdurig gebruik van AC220 in de kliniek leidt tot resistentie als gevolg van FLT3-TKD-mutaties, terwijl langdurig gebruik van gilteritinib beperkingen kan hebben voor samengestelde mutaties (bijv. FLT3-ITD in combinatie met TKD), zelfs als het niet resulteert in resistentie als gevolg van FLT3-TKD-mutaties 7,8.

Deze twee klassen van FLT3-remmers oefenen een tweeledig therapeutisch effect uit door indirect replicatieve stress te induceren door remming van FLT3 en blokkade van de proliferatieve signaalroute-RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5-signalering. Blokkade van celproliferatie leidt meestal tot stopzetting van de celcyclus, metabole stoornissen (ontregeling van de redoxhomeostase) en uiteindelijk tot apoptose 9,10. Dit mechanisme genereert uiteindelijk DNA-laesies die compenserende DNA-herstelaanpassingen in resistente celpopulaties activeren. De komeettest maakt een kwantitatieve vergelijking mogelijk van remmerspecifieke DNA-schadeprofielen in FLT3-mutante cellen. Deze experimentele benadering biedt cruciale inzichten voor het ontwikkelen van rationele combinatietherapieën die gebruik maken van kwetsbaarheden voor DNA-schade, waardoor verworven therapeutische resistentie wordt overwonnen.

Hedendaagse methodologieën voor het opsporen van DNA-schade omvatten immunohistochemische analyse, agarosegelelektroforese van DNA-fragmenten, polymerasekettingreactie (PCR) en sequencing van de volgende generatie (NGS), die elk een hoge analytische gevoeligheid en specificiteit aantonen11. Deze benaderingen worden echter beperkt door aanzienlijke financiële vereisten, langere verwerkingstijden en strenge experimentele voorwaarden. Dit onderstreept de noodzaak van het toepassen van detectiestrategieën die analytische precisie in evenwicht brengen met operationele eenvoud.

De komeettest is op grote schaal gebruikt in de milieutoxicologie en genotoxiciteitsbeoordeling vanwege de superieure gevoeligheid, technische toegankelijkheid, gevisualiseerde kwantificering van DNA-schade en brede toepasbaarheid in biologische systemen12,13. Er zijn drie belangrijke methodologische varianten vastgesteld: alkalische komeettest voor de detectie van enkele/dubbelstrengsbreuk, neutrale komeettest voor analyse van dubbelstrengsbreuk en enzymgemodificeerde komeettest voor de identificatie van specifieke DNA-laesies. 14

Het methodologische principe omvat: (1) Inductie van DNA-strengbreuken door experimentele behandeling; (2) Lysisbuffer-gemedieerde oplossing van cellulaire en nucleaire membranen, waardoor cytoplasmatische/nucleaire eiwit- en RNA-diffusie in elektroforesebuffer mogelijk is, terwijl DNA met een hoog moleculair gewicht geïmmobiliseerd blijft in de agarosematrix; (3) Alkalische denaturatie (pH > 13) die het afwikkelen van DNA en het vrijkomen van beschadigde DNA-fragmenten induceert; (4) Elektroforetische veldgestuurde anodische migratie van gefragmenteerd DNA die karakteristieke komeetmorfologie creëert, waarbij intact DNA de bolvormige nucleoïde structuur behoudt 15,16. Kwantificering van DNA-schade wordt bereikt door geautomatiseerde analyse van het staart-DNA-percentage (TDP), waardoor een nauwkeurige meting van de genotoxische impact bij een resolutie van één cel wordt verkregen17.

Dit onderzoek maakte gebruik van een systematisch experimenteel kader om de differentiële genotoxische effecten van gilteritinib en AC220 in gevalideerde FLT3-mutante 32D-cellen te vergelijken. Het experimentele ontwerp bestond uit twee hoofdcomponenten: (i) het opzetten van een FLT3-mutatiespecifiek DNA-schademodel, en (ii) kwantitatieve beoordeling van door geneesmiddelen geïnduceerde DNA-schade door middel van alkalische komeettestmethodologie. De FLT3-mutante 32D-cellijn werd onderhouden onder standaard in vitro omstandigheden voorafgaand aan blootstelling aan serieel verdunde FLT3-remmers. De cellulaire levensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van CCK-8-assays, met daaropvolgende berekening van de halfmaximale remmende concentratie (IC50) door middel van niet-lineaire regressieanalyse. Een vijfvoudige IC50-waarde werd gekozen als inductiedrempel voor DNA-schade. Met geneesmiddelen behandelde cellen werden geoogst en ingebed in agarose met een laag smeltpunt op objectglaasjes voor latere analyse. Elektroforetische scheiding werd uitgevoerd bij 24 V (~0,74 V/cm) en 300 mA gedurende 30 minuten in alkalische buffer, waarbij gefragmenteerd DNA anodisch migreerde om karakteristieke komeetmorfologie te vormen, terwijl intact DNA de sferische nucleoïde configuratie behield. Kwantificering van DNA-schade werd bereikt door middel van een computerized image analysis comet assay software project (CASP) dat het staartmoment meet, waarbij verhoogde waarden voor het Olive-staartmoment direct correleren met de mate van DNA-fragmentatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Constructie van een DNA schademodel in 32D cellen met FLT3-ITD mutaties 18

  1. Cel herstel
    1. Breng met behulp van een tang snel gecryopreserveerde FLT3-ITD mutante 32D-cellen over (bewaard bij -80 °C). Haal cryovials op met behulp van een tang en dompel ze onmiddellijk onder in een temperatuurgeregeld waterbad (37 °C ± 0,5 °C) gedurende precies 60 s om het gecontroleerde ontdooien te voltooien.
      OPMERKING: Schud tijdens het ontdooien met tussenpozen de cryovials in het waterbad om een gelijkmatige verwarming te garanderen.
    2. Centrifugeer de gecryopreserveerde monsters bij 150 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C ± 1 °C. Zuig het bovenstaande voorzichtig op met behulp van steriele serologische pipetten met behoud van de cellulaire pellet.
    3. Voeg 1 ml volledig groeimedium (RPMI 1640 + 10% foetaal runderserum + 1% penicilline/streptomycine) toe aan de cryopreservatiebuis. Voer zachte trituratie uit door middel van 10 opeenvolgende pipetteercycli (volume van 1 ml) om volledige resuspensie te garanderen. Breng de celsuspensie over in een celkweekschaaltje van 100 mm en voeg 7 ml volledig medium toe om een eindvolume van 8 ml te verkrijgen.
    4. Schud het kweekvat voorzichtig met vijf horizontale en vijf roterende bewegingen. Houd de cellen in een bevochtigde broedstoof bij 37,0 °C ± 0,2 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Incubeer gedurende 24 uur voorafgaand aan de experimentele verwerking.
  2. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen
    1. Selecteer FLT3-ITD mutante 32D-cellen in de logaritmische groeifase met een goede cellulaire status voor het experiment.
      OPMERKING: Cellen in de logaritmische groeifase hebben meestal een korte delingscyclus en een hoge frequentie van celdeling.
      1. Observeer de morfologie en groeitoestand van FLT3-ITD-gemuteerde 32D-cellen met behulp van een elektronenmicroscoop. Zorg ervoor dat aan de criteria voor cellulaire proliferatiedrempels wordt voldaan: Zoek naar cellen in de vorm van een enkel bolletje met gladde randen, uniforme dispersie, weinig aggregaten, uniforme celgrootte, intacte plasmamembraanintegriteit en cellulair puin < 5%.
    2. Gebruik een cellenteller om de concentratie van de celsuspensie te bepalen.
      OPMERKING: Meng de celsuspensies (10 opeenvolgende pipetteercycli met steriele tips van 1 ml met een maximale pipetsnelheid van 50%).
    3. Standaardiseer de celsuspensie tot 2,0 ×10,5 cellen/ml in volledig groeimedium met behulp van iteratieve verdunning. Doseer met behulp van een pipet 50 μL aliquots in de centrale putjes (B2-G7) van een platbodemplaat met 96 putjes. Vul de perifere putjes (A1-H12) met 100 μL steriel PBS om de luchtvochtigheid op peil te houden en de verdampingseffecten van de randen te minimaliseren.
    4. Bereiding van FLT3-remmerbevattend medium: Selecteer negen putjes in een celkweekplaat met 12 putjes en label ze volgens de FLT3-remmerconcentratieladder (0, 3.90625, 7.8125, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 en 1000 nM). Voeg 400 μL volledig medium toe aan de putjes met het label 10.0 μM en 200 μL compleet medium aan de overige putjes.
      1. Gilteritinib-verdunning: Voeg 4 μL 100 μM Gilteritinib-reagens (Gilteritinib in dimethylsulfoxide) toe aan elk van de putjes met het label 1000 nM met behulp van een pipetpistool en meng de oplossing grondig. Pipetteer 200 μL van 1000 nM Gilteritinib in de putjes met het label 500 nM en meng; pipetteer vervolgens 200 μL van 500 nM Gilteritinib in de putjes met het label 250 nM en meng. Breng elke keer 200 μL van de vorige verdunning in de volgende put en meng om de gewenste concentratie te bereiken.
      2. AC220-verdunning: Voeg 4 μL 100 μM AC220-reagens (AC220 in dimethylsulfoxide) toe aan elk van de putjes met het label 1000 nM met behulp van een pipetpistool. Volg stap 1.2.4.1 voor de andere putjes.
        NOTITIE: Zorg ervoor dat de FLT3-remmervoorraadoplossing in de pipet volledig wordt overgebracht naar de putjes om restoplossing te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing goed gemengd is voordat u verder gaat met verdunnen.
    5. Incubatie: Doseer FLT3-remmerbevattende media met behulp van een pipet in de aangewezen putjes (50 μl/putje). Onderhoud de plaat met 96 putjes onder fysiologische kweekomstandigheden (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% CO2, 95% luchtvochtigheid) gedurende precies 72 uur ± 15 minuten.
    6. 10 μl CCK-8-reagens met behulp van een pipet op alle experimentele en blanco controleputjes. Bescherm de plaat tegen licht en incubeer deze onder normoxische omstandigheden (37 °C, 5% CO2) gedurende 2,0 uur ± 10 minuten.
      OPMERKING: Doseer het reagens met een lage pipetsnelheid en een dompeldiepte van 2 mm in de punt om de vorming van luchtbellen te minimaliseren. Vermijd luchtbellen tijdens het toevoegen van het monster om interferentie met OD-metingen te voorkomen.
    7. Verwijder de 96-wells plaat uit de broedmachine en meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer. Noteer de resultaten.
    8. Bereken de % remming volgens de IC 50-berekeningsformule:
      Remming (%) = figure-protocol-1 × 100%
      De experimentele put van het medicijn geeft celputten aan die met het medicijn zijn behandeld. Celcontroleput geeft celputten aan die niet met het medicijn zijn behandeld. Blanco controleputjes geven alleen het medium zonder cellen aan.
    9. Analyseer de genormaliseerde dosis-responsgegevens door middel van niet-lineaire regressie, met behulp van een logistiek model met vier parameters. Klik op de knop Aanpassingscurve voor aanpassing van de curve. Leid de halfmaximale remmende concentratie (IC50) af uit modelconvergentie (R2 > 0,98, restsom van kwadraten < 0,15) en bereken de 95%-betrouwbaarheidsintervallen door middel van 1000-iteratie bootstrap-herbemonstering.
  3. DNA-schade-experiment van 32D-cellen met FLT3-ITD-mutatie geïnduceerd door FLT3-remmer
    1. Selecteer FLT3-ITD mutante 32D-cellen met een groeispurt (populatieverdubbelingstijd < 24 uur) voor de beoordeling van DNA-schade.
    2. Tel de cellen (zie stap 1.2.2 voor meer informatie).
    3. Celzaaiing: Pas de dichtheid van de celsuspensie aan tot 1 × 106 cellen per schaal, met behulp van een schaaltje met een diameter van 6 cm en 4 ml celsuspensie per schaal.
    4. Bereid drie replicaten voor elke remmerconcentratie: 55 nM gilteritinib: 4 ml medium + 2,2 μl 100 μM bouillon, 0,15 nM AC220: 4 ml medium + 6 μl 100 nM bouillon. Vortex-meng de oplossingen en breng ze gedurende 15 minuten in evenwicht bij 37 °C; Schud de buizen voorzichtig om ervoor te zorgen dat ze goed worden gemengd. Zuig het oorspronkelijke medium op en vervang het door 4 ml/schaaltje vers bereid remmerhoudend medium met behulp van steriele serologische pipetten.
    5. Incubeer de behandelde cellen onder fysiologische omstandigheden (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid) gedurende bepaalde intervallen (0, 2, 4, 6 uur). Verwerk time-zero-controles onmiddellijk voor de beoordeling van DNA-schade bij baseline.
    6. Trypanblauwe uitsluitingstest
      1. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 150 × g gedurende 1 min. Gooi het bovenstaande weg en breng de cellen opnieuw in suspensie met 1 ml kweekmedium.
      2. Pipetteer 100 μL geresuspendeerde cellen in een plastic centrifugebuis, voeg 100 μL trypanblauwe vlek toe (2x), meng voorzichtig en kleur gedurende 3 min.
      3. Tel de cellen (zie stap 1.2.2 voor meer informatie).
      4. Bereken de levensvatbaarheid van de cellen als volgt:
        %Celoverleving = figure-protocol-2 × 100%
        OPMERKING: Alleen monsters met een levensvatbaarheid ≥90% werden verwerkt voor de komeettest.

2. Bereiding van reagens en voorbereiding van celmonsters

  1. Breng de lysisoplossing (met 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) in evenwicht bij 4 °C ± 0,5 °C gedurende 30 minuten in de koelkast.
  2. Smelt laagsmeltende agarose (LMA) gedurende 15 minuten bij 95 °C en bewaar het vervolgens in een waterbad bij 37 °C om stolling te voorkomen.
  3. Bereid de alkalische elektroforesebuffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) voor door 12 g NaOH te wegen met behulp van een elektronische weegschaal, 2 ml 500 mM EDTA-oplossing te pipetteren en vervolgens ddH2O toe te voegen tot 1 l van de buffer.
  4. Cellen oogsten
    1. Vang de celsuspensie op in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de celsuspensies bij 800 × g gedurende 5 min. Zuig de supernatanten op met behulp van vacuümfiltratie.
      1. Resuspendeer de cellen voorzichtig in 1 ml volledig medium met behulp van 1 ml pipetpunten met brede boring, gevolgd door 10 verticale inversies.
      2. Tel de cellen zoals in stap 1.2.
      3. Centrifugeer de celsuspensie in een centrifugebuis van 15 ml bij 150 × g gedurende 5 minuten om het volledige medium te verwijderen. Resuspendeer de gewassen cellen in calciumvrije PBS tot ~5,0 × 105 cellen/ml.

3. Procedure voor komeetbepaling

  1. Bereid komeetanalyseglaasjes en celmonsters van tevoren voor. Bereid met behulp van een pipet een mengsel van 10:1 (v/v) van LMA-agarose en celsuspensie (5 × 105 cellen/ml) in buisjes van 1,5 ml met behulp van een pipet en meng voorzichtig. Doseer 55 μl aliquots van het agarosecelmengsel op komeetglaasjes met behulp van een pipet die in een hoek van 45° wordt gehouden, op een afstand van 2 mm van het oppervlak van de objectglaasjes. Plaats de glaasjes bedekt met het mengsel gedurende 30 minuten op 4 °C om licht te vermijden.
    OPMERKING: Tijdens de toevoeging van het LMA- en celmengsel aan de komeetdia's moet de suspensie langzaam en gelijkmatig worden gedoseerd om belvorming te voorkomen en een homogene gelverdeling te garanderen.
  2. Dompel de gestolde objectglaasjes onder in een voorgekoelde lysisoplossing (met 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) en voer de lysis uit gedurende ≥1 uur bij 4 °C onder tegen licht beschermde omstandigheden.
  3. Verwijder na de lysis het objectglaasje van het lysaat en gebruik een pipetpistool om zoveel mogelijk vloeistof rond de peddel op te zuigen. Plaats het objectglaasje vervolgens in een alkalische elektroforesebuffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) en pre-equilibeer gedurende 1 uur bij 4 °C, waarbij u ervoor zorgt dat licht wordt vermeden.
  4. Elektroforese: Plaats de objectglaasjes in een elektroforesekamer en voeg voldoende alkalische elektroforese-oplossing toe om de objectglaasjes onder te dompelen. Voer elektroforese uit bij 24 V (gelijk aan 0,74 V/cm) met constante stroom (300 mA) gedurende 30 minuten met behulp van een vooraf gebalanceerde buffer (4 °C) om DNA-schade te minimaliseren.
  5. Neutralisatie: Gebruik na de elektroforese een pipetpistool om de alkalische elektroforese-oplossing uit het objectglaasje op te zuigen, dompel de objectglaasjes 2 x 5 minuten onder in dH2O en dompel ze vervolgens 5 minuten onder in 70% ethanol. Droog de glaasjes in een broedmachine bij 37 °C gedurende 15 min.
  6. Kleuring: Breng een hoeveelheid van 100 μL 1x YeaRed nucleïnezuurkleuring per putje aan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder tegen licht beschermde omstandigheden. Verwijder overtollige vlekken door voorzichtig waterig te spoelen, gevolgd door thermisch drogen bij 37 °C.
  7. Beeldvorming: Voer fluorescentievisualisatie uit met behulp van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 4x-objectief, met digitale beeldacquisitie onder gestandaardiseerde belichtingsomstandigheden.

4. Gegevensverwerking

  1. Voer kwantitatieve beeldanalyse uit om standaard komeetparameters te bepalen, waaronder staart-DNA (%), olijfstaartmoment en staartlengte (μm).
    1. Open de interface van de software (Figuur 5).
    2. Importeer een afbeelding in de software, klik op Bestand en klik vervolgens op Bestand selecteren om de afbeelding die u wilt analyseren in de software te importeren. Houd vervolgens de muisknop ingedrukt en sleep totdat een blauw vak verschijnt. Sleep het blauwe vak om ervoor te zorgen dat de cel die u wilt analyseren, in het vak is ingesloten. De optie Aanpassen in de afbeelding kan worden gebruikt om de positie van het frame aan te passen zodat het de hele cel omvat (Afbeelding 5).
    3. Voordat u de analyse start, klikt u op Start en vervolgens op Analyseren. De resultaten van de single-cell analyse worden aan de rechterkant weergegeven onder 'Profielen'. Klik na het analyseren van elke cel op Opslaan. De parameters die kunnen worden gedetecteerd, worden weergegeven aan de rechterkant van 'Profielen' en de numerieke waarden van verschillende parameters worden onderaan weergegeven. Klik ten slotte op Bestand | Resultaten exporteren. De verkregen resultaten zijn onder meer HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment en OliveTailMoment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De komeettest werd systematisch gebruikt om differentiële DNA-schadeprofielen te kwantificeren die werden geïnduceerd door gilteritinib en AC220 in FLT3-mutante cellijnen. Analyses toonden aan dat het verschil in DNA-schade tussen celpopulaties die niet behandeld waren met gilteritinib en AC220 niet statistisch significant was (P > 0,05). Dosisafhankelijke verhogingen van de waarden voor Tail DNA (%) en Olive Moment Tail (OMT) bereikten statistische significantie (P < 0,05) na blootstell...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De komeettest vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in de beoordelingsmethoden voor genotoxiciteit. Deze techniek biedt duidelijke voordelen ten opzichte van conventionele benaderingen door de technische toegankelijkheid, de resolutie van één cel en de directe visualisatie van schadepatronen via elektroforetische migratieprofielen. Bij de therapeutische ontwikkeling van AML maakt de komeettest systematische evaluatie mogelijk van de genotoxische profielen van kandidaat-middelen t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Jiangsu Higher Education Institution Innovative Research Team for Science and Technology (2021), het programma van het Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023), het Zhejiang Provincial Medical and Health Science and Technology Program (2025KY1861), de Natural Science Key Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (subsidie nr. 24KJA310008), de programma's van het Suzhou Vocational Health College (subsidie nr. SZWZYTD202201, szwzy202406), en Project van State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Soochow University (GZK12023013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTABeyotimeST066
1x YeaRed nucleic acid stainYeasen10202ES
32D CELLCobioerCBP60995
AC220TargetMolT2066
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Cell Counting PlateQiuJingXB-K-25
CO2 incubatorThermo51032872
Comet assay software project (CASP)
CometAssay Kit Trevigen4250-050-K
Cytation 5BioTek16280004
FBSPANST30-3302
GilteritinibTargetMolT4409
GraphPad Prism 9.0
high-speed centrifugeThermo 9AQ2861
L-1000XLS+ PipettesRainin17014382
L-20XLS+ PipettesRainin17014392
liquid nitrogen tankMvecryogeYDS-175-216
Multiskan FC microplate photometerThermo1410101
Na2OHDAMAO1588
PBSSolarbioP1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xBeyotimeC0222
RPMI 1640 mediumGibcoC22400500BT
Trinocular live cell microscopeMotic1.1001E+12
Ultra-low temperature freezerHaireV118574

Referenties

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

FLT3 mutante cellenacute myelo de leukemietype I remmerstype II remmersgenotoxiciteitsbeoordelingcombinatietherapiealkalische elektroforese
Komeettest om DNA-schade te kwantificeren in FLT3-cellen die mutant tot expressie brengen van 32D na blootstelling aan type I en type II FLT3-remmers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.