Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Summary

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Abstract

Natuurlijke producten vormen een rijke bron van therapeutische verbindingen met toepassingen bij meerdere ziekten, met name kanker. Door deze biomoleculen te gebruiken als structurele templates in geneesmiddelenontwikkeling, hebben onderzoekers zowel snellere ontwikkelingstijden als verbeterde biologische effectiviteit bereikt in vergelijking met volledig synthetische verbindingen. De eiwitsyntheseroute is uitgegroeid tot een aantrekkelijk doelwit voor natuurlijke producten, vooral gezien de betrokkenheid bij moeilijk te behandelen kankers. De krachtige eiwitsyntheseremmer cycloheximide, afgeleid van Streptomyces griseus, illustreert het potentieel van natuurlijke verbindingen in dit vakgebied. Aangezien deze natuurlijke productderivaten worden ontwikkeld tot geneesmiddelachtige moleculen, blijft het bevestigen van hun eiwitsynthese remmende activiteit een cruciale validatiestap. Het primaire doel is het bieden van een undergraduate-vriendelijk protocol voor snelle evaluatie van de remmingsactiviteit van verbindingen. Het protocol maakt gebruik van een fluorescerend substraat en geavanceerde fluorescentiemicroscopietechnieken om systematisch de remmende eigenschappen van deze natuurlijke producten te detecteren en te meten. De studie onderzocht verbindingen afkomstig van twee plantensoorten: Pinus sylvestris en Psoralea corylifolia. Met cycloheximide als referentie-remmer vertoonden beide natuurlijke producten verschillende niveaus van proteïnesynthese-inhibitie.

Introduction

Eiwitsynthese omvat sterk gereguleerde processen: transcriptie en translatie. Tijdens transcriptie worden DNA-sequenties van genen gekopieerd, waardoor boodschapper-RNA (mRNA) ontstaat. Het enzym RNA-polymerase werkt om de DNA-dubbelhelix te scheiden en gebruikt één streng als gids om een bijpassend mRNA-molecuul te bouwen. Zodra het mRNA volledig gevormd is, reist het van de kern naar het cytoplasma voor translatie. Translatie vindt plaats in het ribosoom, waarbij mRNA als sjabloon wordt gebruikt om aminozuren samen te voegen tot een polypeptideketen. Deze polypeptideketen wordt, wanneer ze de uitgangstunnel van het ribosoom verlaten, gevouwen tot een functioneel eiwit. Transcriptie wordt voornamelijk gereguleerd door transcriptiefactoren, chromatinemodificaties en regulerende RNA's, terwijl translatie wordt geregeld door initiatiefactoren, signaalroutes en RNA-stabiliteitsmechanismen. Deze regulerende systemen stellen cellen in staat cellulaire functies te behouden en effectief te reageren op stress of schade¹.

De overgrote meerderheid van de menselijke kankers—ongeveer 85%—manifesteert zich als solide tumoren². Hoewel deze tumoren sterk kunnen variëren in hun specifieke kenmerken en gedrag, delen ze vaak bepaalde gemeenschappelijke fysiologische kenmerken en patronen, zoals een opgereguleerde eiwitsynthese ongeacht hun etiologie of anatomische positie³. Kankercellen ontregelen de eiwitsynthese door translationele machines te kapen om hun hoge energiebehoefte en ongecontroleerde groei te ondersteunen. Deze herprogrammering is het gevolg van de ontregeling van bijna alle belangrijke oncogene signaalroutes, wat celoverleving, proliferatie en uitzaaiing bevordert, terwijl celsterftepaden worden onderdrukt⁴. In tumorcellen gaat de machine voor het maken van ribosomen op volle toeren, waardoor de eiwitproductie en snelle celdeling toeneemt. Aangezien deze verbeterde eiwitsynthese cruciaal is voor het overleven van kanker, tonen behandelingen die dit proces targeten en blokkeren veelbelovend als potentiële therapieën⁵. Daarom kan onderzoek gericht op kankerspecifieke translatiefactoren, unieke ribosomale samenstellingen of veranderde signaalroutes die de eiwitsynthese reguleren, meer gerichte remmers opleveren met verbeterde therapeutische vensters.

Omdat natuurlijke producten (NP's) bekend staan om hun brede scala aan biologische activiteit, is de ontwikkeling van selectieve eiwitsyntheseremmers voor kankerbehandeling met behulp van hun steigers een veelbelovende benadering ^6,7. NP's kunnen verschillende componenten van het eiwitsynthesemechanisme aanpakken, van ribosoombinding tot interferentie met initiatiefactoren of elongatieprocessen, waardoor ze onmisbare startpunten zijn in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor eiwitsyntheseremmers in solide tumoren⁶. De mogelijkheid om verbindingen snel te screenen op gewenste activiteit dient als een cruciaal toegangspunt voor geneesmiddelenontdekkingsplatforms die efficiënt NP-hits willen identificeren. Typisch maakt high-throughput screening van verbindingen fluorescentie-assays gebruik om snel de leidende kandidaatmoleculen⁸ te verfijnen.

Wetenschappers wereldwijd vertrouwen op fluorescentiegebaseerde technieken als essentiële hulpmiddelen voor het analyseren van biologische systemen. Deze benaderingen worden veel gebruikt om cellulaire processen te bestuderen, waardoor onderzoekers biomoleculaire interacties in^{realtime kunnen} volgen. In combinatie met bio-orthogonale klikchemie-reacties kunnen deze methoden een nauwkeurige visualisatie van eiwitsynthese^{mogelijk maken}. De gepresenteerde fluorescentie-eiwitsynthesetest is een niet-radioactieve techniek voor het beoordelen van eiwitsynthese die gebruikmaakt van O-propargyl-puromycine (OPP), een celdoorlatende alkyne-bevatte puromycine-analoog. Na cellulaire behandeling wordt OPP opgenomen aan het C-terminus van verlengende polypeptideketens, wat translatieterminatie veroorzaakt. Deze alkyne-gelabelde afgeknotte eiwitten worden vervolgens gedetecteerd met behulp van kopergekatalyseerde klikchemie gekoppeld aan 5 FAM-azide.

Deze fluorometrische assay is een waardevol onderzoeksinstrument en een toegankelijke chemische biologische methode voor het opleiden van bachelorstudenten. Door een toegankelijk, efficiënt protocol te bieden met minimale gegevensverwerking, krijgen studenten praktijkervaring met moderne geneesmiddelenontdekkingstechnieken en versnelt het het proces van geneesmiddelenontwikkeling. Naarmate de vraag naar nieuwe eiwitsyntheseremmers toeneemt, biedt deze aanpak bachelorstudenten zinvolle onderzoeksmogelijkheden en draagt het bij aan vooruitgang in kankertherapieën.

Protocol

1. Reagensvoorbereiding uit de kit

OPMERKING: Meng het goed, draai het uit en houd alle reagentia op ijs tot gebruik.

1. Organiseer en verkrijg de proteïnesynthese-inhibitiekit, PBS-buffer, celkweekmedium, celkweekbehandelde platen, 15 mL conische steriele polypropyleen centrifugebuizen, 2 mL centrifugebuizen, p10, p20, p200 en p1000 pipetten, en de juiste tips.
2. Maak wasbuffer klaar.
   1. Ontdooi de 10x wasbuffer op 37 °C door het flesje in de hand te cupen. Gebruik de lichaamswarmte in de handen om te ontdooien en controleer regelmatig of het ontdooien voltooid is.
   2. Verdunn de 10x wasbuffer met 1:10 in gedeïoniseerd water in een centrifugebuis. Meng door inversie of herophanging door op en neer te pipetteren. Bewaar op ijs tot gebruik.
3. Ontdooi fixatieve oplossing op kamertemperatuur. Bewaar op ijs tot gebruik.
4. Bereid de permeabilisatiebuffer voor.
   1. Ontdooi de 10x permeabilisatiebuffer bij 37 °C door het flesje in de hand te cuppen. Gebruik de lichaamswarmte in de handen om te ontdooien en controleer regelmatig of het ontdooien voltooid is.
   2. Verdun de 10x voorraad 1:10 in gedeïoniseerd water in een centrifugebuis. Meng de componenten door omkering of herophanging door op en neer te pipetteren. Bewaar op ijs tot gebruik.
5. Ontdooien 400x proteïnelabel, 100x fluorescerend azide, 100x cycloheximide, DNA-kleuring en het 20x reducerende middel bij kamertemperatuur. Blijf op ijs in een donkere omgeving tijdens gebruik. Bedek de kleurstoffen met folie of bewaar ze in een koelkast van 2 °C wanneer ze niet gebruikt worden.

2. Labeling van controles en experimentele cellen

OPMERKING: Dit protocol is ontwikkeld met behulp van stabiele, epitheliale borstkanker MDA-MB-231 cellen. Alle hechtende cellijnen kunnen worden gebruikt. Alle onderstaande stappen gebruiken een 96-well-plaat, en alle volumes en concentraties worden berekend voor twee testverbindingen en twee controles met een werkvolume van 100 μL.

1. Het cultiveren van aanhechtende zoogdiercellen
   OPMERKING: Cellen moeten worden uitgegeven voordat ze 80-90% confluentie bereiken om een gezonde, exponentiële groei te behouden en contactremming of differentiatie te voorkomen.
2. Ontdooi een flesje met cryopgeconserveerde cellen tot kamertemperatuur en verdun het vervolgens met een geschikt medium.
3. Centrifugeer de suspensie om de cellen te pelleten en het supernatant te aspireren. Suspendeer de pellet opnieuw in een nieuw medium en doe het over in een nieuwe kolf bij de juiste celdichtheid.
4. Zodra de cellen voor 80% samenvloeien, verwijder je het medium en aspireer je oud groeimedium uit de kolf. Spoel vervolgens cellen af met steriele PBS om het resterende serum te verwijderen, dat trypsine remt. Voeg trypsine-EDTA-oplossing toe om de cellaag te bedekken en incubeer 3-5 minuten of totdat de cellen loskomen bij 37 °C.
5. Voeg een volledig medium met serum toe om de trypsine te inactiveren, breng de celsuspensie over in een buis, meng voorzichtig en tel de cellen.
6. Zaadcellen in screeningsplaten verdunnen cellen bij de juiste splitsingsverhouding (bijv. 1:3 of 1:5) in verse kolf(s) met nieuw medium en incuberen (meestal 37 °C, 5% CO₂) om de gewenste celconcentratie te verkrijgen.
   OPMERKING: Voor het hier beschreven experiment werd de cellijn geplateerd op 2 × 10⁴ per put (96-put plaat) en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 12 uur.

3. Toevoeging van verbindingen

1. Bereid mastermix A voor.
   1. Label een centrifugebuis als "A". Pipet 598,5 μL kweekmedium en 1,5 μL eiwitlabel in "A". Suspenseer het mengsel opnieuw om homogeniteit te garanderen door op en neer te pipetten.
2. Bereid mastermix B voor.
   1. Label een centrifugebuis als "B". Pipette 1,5 μL proteïnelabel, 6,6 μL cycloheximide en 591,9 μL kweekmedium in "B". Suspenseer het mengsel opnieuw om homogeniteit te garanderen door op en neer te pipetten.
3. Behandel cellen met gewenste verbindingen (Figuur 1), positieve en negatieve controles.
   1. Verwijder cellen uit de broedmachine en verwijder het groeimedium via aspiratie. Kantel de plaat en aspireer aan de zijkant van de put in plaats van in het midden om verstoring van de cellen te voorkomen.
   2. Pipetteer 1 μL testmiddel in een put en 1 μL teststofvoertuig (0,1% v/v DMSO) in een put. Voor dubbele studies voeg je elk monster toe aan een tweede put en herhaal je dit proces. Voeg 99 μL mastermix A toe aan deze putten. Pipetteer voorzichtig schuin in de zijkant van de put om kinetische verstoring van cellen te voorkomen.
      OPMERKING: De maximale DMSO-concentratie voor chemische screening hangt af van het celtype en de assay, maar de algemene richtlijnen zijn: 0,1-0,5% DMSO—over het algemeen veilig voor de meeste celgebaseerde assays met minimale toxiciteit, en 1% DMSO—veelgebruikt maximaal en acceptabel voor veel celtypen in kortetermijnassays.
   3. Pipette 100 μL mastermix B in twee putten. Pipetteer schuin in de zijkant van de put om verstoring van cellen te voorkomen.
   4. Tik zachtjes op de plaat om de gewenste componenten met de cellen te integreren. Incubeer cellen op 37 °C gedurende 0,5-2 uur.

4. Beëindiging van het experiment en het wassen van cellen

1. Verwijder het kweekmedium via aspiratie. Kantel de plaat en aspireer aan de zijkant van de put in plaats van in het midden om verstoring van de cellen te voorkomen.
2. Voeg 100 μL PBS-buffer toe aan elke put en centrifugeer de plaat op 900 × g gedurende 5 minuten.
3. Verwijder de PBS-buffer via aspiratie.

5. Fixatie en permeabilisatie

1. Voeg 100 μL fixatieve oplossing toe aan elke put. Incubeer de cellen op kamertemperatuur gedurende 15 minuten in een donkere omgeving.
2. Verwijder de fixatieve oplossing via aspiratie. Kantel de plaat en aspireer aan de zijkant van de put in plaats van in het midden.
3. Was cellen met 100 μL wasbuffer en verwijder de buffer via aspiratie. Herhaal deze stap twee keer.
4. Voeg 100 μL permeabilisatiebuffer toe aan elke put en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Verwijder de permeabilisatiebuffer via aspiratie. Kantel de plaat en aspireer aan de zijkant van de put in plaats van in het midden.

6. Eiwitreactie en kleuring

1. Bereid de reactie-cocktail master mix voor.
   1. Voeg 651 μL PBS-buffer, 7,0 μL 100x koperreagens, 7 μL fluorescerend azide en tenslotte 35 μL reductiemiddel toe aan een centrifugebuis. Sussie dit mengsel opnieuw om homogeniteit te waarborgen.
      OPMERKING: Volg deze exacte volgorde bij het toevoegen van de reagentia. Gebruik binnen 15 minuten na de bereiding.
2. Voeg 100 μL van de reactiecocktail toe aan elke put. Incubeer de cellen 30 minuten op kamertemperatuur in een donkere omgeving om fotobleaching te voorkomen.
3. Centrifugeer cellen op 900 × g gedurende 5 minuten. Balanceer de centrifuge door lege platen toe te voegen om het gewicht gelijkmatig te verdelen. Verwijder het mengsel via aspiratie.
4. Was cellen met 100 μL wasbuffer en verwijder de buffer via aspiratie. Herhaal deze stap twee keer.

7. DNA-kleuring

1. Bereid een verdunning van 1x van de totale DNA-kleuring voor en voeg 100 μL toe aan elke put. Incubeer cellen op kamertemperatuur gedurende 20 minuten in een donkere omgeving om fotobleaching te voorkomen.
2. Centrifugeer de plaat op 900 × g gedurende 5 minuten. Balanceer de centrifuge door lege platen toe te voegen om het gewicht gelijkmatig te verdelen. Verwijder het mengsel via aspiratie.
3. Was cellen met 100 μL wasbuffer en verwijder de buffer via aspiratie. Herhaal deze stap twee keer.
4. Suspensieer cellen opnieuw met 100 μL gekoelde PBS-buffer om ze voor te bereiden op beeldvorming.

8. Beeldvorming

1. Steek de plaat in de platenlezer.
2. Stel de vergroting in op 20x.
3. Analyseer de kernkleuring met het GFP 469/525 nm-kanaal. Gebruik autobinning en autofocus om de beeldvorming te verbeteren.
4. Analyseer de synthese van actieve eiwitten met het Texas Red 586/647nm kanaal. Gebruik autobinning en autofocus om de beeldvorming te verbeteren.

Results

Deze test gebruikte fluorescentie om het vermogen van verschillende natuurlijke producten om de eiwitsynthese te remmen te visualiseren en te kwantificeren. Cycloheximide (CHX) is een bekende eiwitsynthese-remmer waarvan de werkingswijze het verstoren van het translocatieproces tijdens de elongatie¹¹ inhoudt. Voor deze studie werden levende cellen gedetecteerd met een groene, fluorescerende nucleaire kleurstof. OPP is een afgeleide van puromycine die covalent bind...

Discussion

Dit protocol biedt een fluorometrische screeningsmethode voor het testen van natuurlijke producten en kleine moleculen om hun vermogen te evalueren om de eiwitsynthese te remmen. De eenvoud van dit protocol stelt bacheloronderzoekers in staat het correct te implementeren, waardoor zij substantiële bijdragen aan wetenschappelijke kennis kunnen leveren. Het protocol vereist een basisbegrip van biologische methoden en technieken, waarbij stappen zorgvuldige uitvoering vereisen om nauwkeurig...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Biotek Cytation 1 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Agilent	BTCYT1V
Compound 1 (Dehydroabietylamine, CAS 1446-61-3)	Enamine	EN300-7409771
Compound 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific	75004271
Ibidi Gmbh-slide 96-well plate	Ibidi	80826
MDA-MB-231 Cell Lines	ATCC	ATCC HTB-26
Phosphate Buffered Saline pH 7.4	ATCC	ATCC 30-2200
Protein Synthesis Assay Kit (Green)	Abcam	Ab239725