Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

Samenvatting

Dit protocol schetst het ontwerp van gesplitste hybridisatiesondes die gebruik maken van fluorescerende oplichtende aptameer DAP-10-42 als signaalreporter en hun toepassing voor nucleïnezuurdetectie en differentiatie tussen doelen met single-nucleotidesubstituties.

Samenvatting

Op DNA gebaseerde fluorescerende oplichtende aptameren (FLAP's) zijn veelbelovend voor bioanalytische tests omdat ze een goedkope fluorescerende signaaluitlezing bieden zonder de noodzaak om nucleïnezuursignaalreporters te labelen met fluoroforen en/of quenchers, in tegenstelling tot conventionele hybridisatiesondes die worden gebruikt voor onmiddellijke detectie van nucleïnezuur. In plaats daarvan binden FLAP's niet-covalent kleurstofliganden, die intrinsiek lage fluorescentie vertonen in waterige oplossingen, maar sterk emitterend worden bij FLAP-binding. Dit protocol beschrijft een algoritme voor het ontwerpen van gesplitste oplichtende aptameersensoren (SLAS's) met behulp van DAP-10-42, de meest efficiënte DNA-FLAP die tot nu toe is gerapporteerd. Wanneer SLAS is uitgerust met nucleïnezuursequenties die complementair zijn aan een nucleïnezuurdoelwit van belang, is het een veelbelovend hulpmiddel voor nucleïnezuuranalyse dat de sequentiespecifieke detectie van nucleïnezuurdoelen mogelijk maakt met selectiviteit tot op één nucleotide om analyse van single-nucleotide substituties (SNS's) mogelijk te maken. SLAS's bieden het voordeel van een labelvrije op fluorescentie gebaseerde signaaluitlezing, die kan worden gemeten met een conventionele op cuvetten gebaseerde fluorescerende spectrofotometer, een draagbare fluorometer, of visueel kan worden waargenomen bij excitatie met een draagbare lichtbron. De SLAS-aanpak is gunstig voor biosensing-toepassingen in ziektediagnostiek, milieumonitoring en biomoleculair onderzoek.

Inleiding

Nucleïnezuuranalyse met behulp van hybridisatiesondes wordt routinematig uitgevoerd om specifieke DNA/RNA-sequenties te detecteren en te kwantificeren¹. Een van de meest succesvolle hybridisatiesondes is de Molecular Beacon (MB) -sonde, een haarspeldvormig DNA
oligonucleotide gelabeld met een fluorofoor en een quencher aan de tegenovergestelde uiteinden ^2,3. Het detecteert onmiddellijk (zonder de noodzaak om het sonde-doelwitcomplex van het overschot van de sonde te wassen) de aanwezigheid van een nucleïnezuursequentie die complementair is aan het lusfragment van de sonde en wordt vaak gebruikt in kwantitatieve PCR (qPCR). De noodzaak om twee kleurstoffen - de fluorofoor en de quencher - covalent aan de oligonucleotidesequentie van de sonde te hechten, verhoogt de kosten, vooral wanneer een nieuwe MB-sonde die zich richt op een nieuwe nucleïnezuursequentie nodig is. Als alternatief kan de MB-sonde worden gebruikt als een signaalreporter in een multicomponent (gesplitst) hybridisatiesondeformaat, waarbij twee niet-gelabelde oligonucleotiden interageren met zowel het doelwit als de MB-sondereporter⁴. De multicomponent-sondebenadering verbetert de selectiviteit voor nucleïnezuurherkenning en verbetert de binding van de sonde aan gestructureerde doelen ^5,6,7, Deze benadering elimineert echter niet de noodzaak van covalente labeling van de reporter met een fluorofoor⁸.

Fluorescerende lichtgevende aptameren (FLAP's)⁹ zijn aptameren die affiniteit hebben met laagfluorescerende omgevingsgevoelige kleurstoffen (fluorogenen), waarbij binding door FLAP de fluorescentie van het fluorogene spruitstuk verbetert. In tegenstelling tot fluorescerend gelabelde sondes en signaalreporters, vereisen FLAP's geen detectie-elementen die covalent worden gelabeld met een of meer kleurstoffen en bieden ze dus het voordeel van labelvrije fluorescentiedetectie¹⁰. Dit is vooral belangrijk tijdens de optimalisatiestap, wanneer tientallen nucleïnezuurconstructies moeten worden getest om bevredigende testprestaties te bereiken. Bovendien kunnen FLAP-assays worden geoptimaliseerd door de concentratie van een fluorogene en/of FLAP-sensor aan te passen in plaats van het ontwerp van de sensor te wijzigen. Deze voordelen kunnen belangrijk zijn voor low-budget onderzoeks- en onderwijslaboratoria. DNA-FLAP's zijn bijzonder veelbelovend als signaalreporters van hybridisatiesondes met meerdere componenten die Split Light-up Aptamer Sensors (SLAS's) worden ^genoemd11. De meest efficiënte DNA-FLAP die tot nu toe is gerapporteerd, is DAP-10-42, die oorspronkelijk werd geselecteerd om de fluorescentie van dapoxylsulfonylkleurstoffen¹² te verbeteren, met een promiscue vermogen om te binden en de fluorescentie van een verscheidenheid aan arylmethaankleurstoffen te versterken (bijv. auramine O, AO; kristalviolet, CV)¹³. DAP-10-42 is omgezet in SLAS voor gebruik voor nucleïnezuuranalyse 13,14,15.

Het doel van de hier beschreven methode is om sequentiespecifieke analyse van interessante nucleïnezuurdoelen mogelijk te maken met behulp van labelvrije SLAS-strengen en een fluorogene kleurstof als buffercomponent. Dit protocol beschrijft een algoritme om SLAS te ontwerpen op basis van DAP-10-42 en benadrukt SLAS-prestaties voor zeer selectieve detectie van nucleïnezuursequenties die verschillen in slechts een enkele nucleotide.

De SLAS-nucleïnezuurdetectietest vereist twee op maat gesynthetiseerde ongemodificeerde DNA-oligonucleotiden die worden gebruikt in een eindconcentratie van 0,5-1 μM voor maximale prestaties. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbare Auramine O (AO) kleurstof als fluorogeen. De uiteindelijke AO-concentratie in de test varieert van 1-10 μM om een hoge fluorescentieverbetering te garanderen in aanwezigheid van een specifiek nucleïnezuurdoelwit over de blanco (afwezigheid van het doelwit; Aanvullende figuur 1). De noodzakelijke componenten van de analysebuffer zijn kalium- en magnesiumionen (aanvullende figuur 2). Kaliumionen (1,25-40 mM) stabiliseren het voorgestelde G-quadruplex-domein van de FLAP die als signaalreporter wordt gebruikt. Magnesiumionen (2,5-50 mM) verminderen de afstoting van negatief geladen fosfaatgroepen bij SLAS-doelwitinteracties. De temperatuur van de SLAS-test waarbij gebruik wordt gemaakt van de gerapporteerde sequenties voor het signaalrapportagedomein mag niet hoger zijn dan 28 °C om prestatieverlies te voorkomen¹⁶.

SLAS is compatibel met enkelstrengs nucleïnezuurdoelen, zoals DNA-amplicons van asymmetrische PCR of een isotherme DNA-amplificatiereactie (bijv. recombinasepolymeraseamplificatie, RPA¹⁷), RNA-producten van transcriptie-gemedieerde amplificatie (TMA) of op nucleïnezuursequentie gebaseerde amplificatie (NASBA)¹⁸, en native RNA-moleculen zoals miRNA, rRNA of ncRNA). Variaties in de nucleotidesequentie van het doelwit tot op een enkel nucleotide kunnen worden gedetecteerd met behulp van de SLAS-benadering^13,14.

Protocol

1. Ontwerp van de Split Light-up Aptamer Sensor (SLAS) met DAP-10-42 als signaalreporter

1. Ontwerp de sequenties van twee ongemodificeerde DNA-oligonucleotidestrengen die SLAS vormen. Gebruik een fragment dat nucleotiden (nts) 4,6-39 van DAP-10-42 bevat (Tabel 1, Figuur 1A).
2. Zet de volgorde van stam 1 (nts 1-8 en 36-42) om in stam 1' door een uitpuilend thymineresidu op positie nt 5 te verwijderen, de stengel in te korten tot 4 bp (nts 4,6-8 en 36-39) en een terminale C-G bp toe te voegen (Figuur 1A, stap 1). Bovendien bevat een van de SLAS-strengen nts 9-29 van de DAP-10-42-kernsequentie, terwijl een andere SLAS-streng nts 30-35 van de sequentie bevat.
3. Verleng de 3'-terminale sequentie van het fragment dat nts 9-29 bevat met d(GGTCAT), en de 5'-terminale sequentie van het nts 30-35-fragment met d(ATGACC) om een 6-bp stam 2 te vormen (Figuur 1A, stap 2).
   OPMERKING: De basisparen T4-A39, A6-T38, C7-G37 en G8-C36 van stam 1 in DAP-10-42 zijn vereist voor de oplichtfunctie van de aptameer. De sequentie van stam 1' kan alleen worden gewijzigd aan het eindpunt bp en kan een G-C, A-T, T-A basenpaar zijn of indien nodig worden uitgebreid met 1-2 basenparen. De volgorde van stam 2 is willekeurig en kan worden gewijzigd. Het wordt echter aanbevolen om de thermodynamische stabiliteit van steel 2 te behouden, tenzij de analysetemperatuur boven 28 °C wordt verhoogd. Het inkorten of anderszins destabiliseren van stengel 2 voorkomt voortijdige kleurstofbinding zonder doel als een hoge achtergrond van de op SLAS gebaseerde fluorescerende test wordt waargenomen. Splitsing van de DAP-10-42 nucleotidesequentie tussen nts 28-29, 27-28 of 26-27 in plaats van nts 29-30 is ook toegestaan (Figuur 1B).
4. Om de ontworpen SLAS aan te passen aan een nucleïnezuurdoelwit of interesse, breidt u stam 1' uit met DNA-sequenties die complementair zijn aan de doelwitbindingsfragmenten (armen) via d(TT)-linkers (Figuur 1A, stap 3). Dit levert de sequenties van strengen SLAS-U en SLAS-S op die de sonde vormen.
5. Maak de doelbindingsarm van SLAS-S complementair aan een 7-10-nt fragment van het doel dat de SNS-plaats bevat, en de doelbindingsarm van SLAS-U - complementair aan een 15-25 nt fragment van het doel grenzend aan de doelbindingsarm van SLAS-S (Tabel 1).
   OPMERKING: Het is optioneel om de doelbindingsarm van SLAS-S aan te sluiten op nt 4 of nt 39 van de DAP-10-42-sequentie (respectievelijk Figuur 1, arm 1 of arm 2).
6. Beoordeel de smelttemperatuur (T_m) van de duplexen tussen het doel van belang en de doelbindingsarmen van SLAS-S en SLAS-U met behulp van de UNAFold Web Server (unafold.org)¹⁹.
   1. Klik op het tabblad DINAMelt bovenaan de webpagina; ga naar Toepassingen en selecteer Hybridisatie van smelten in twee toestanden (aanvullende afbeelding 3A). Voer op de pagina Two-State Melting Hybridization een van de op elkaar inwerkende sequenties in het linkervak en een andere in het rechtervak (aanvullende afbeelding 3B). Zorg ervoor dat beide sequenties in volgorde van 5' tot 3' staan. U kunt meer dan één paar op elkaar inwerkende sequenties invoeren door ze te scheiden met puntkomma's.
   2. Vermeld onderaan de pagina de analysetemperatuur (22 °C), monovalente en tweewaardige kationconcentraties (respectievelijk 20 mM en 25 mM) die overeenkomen met de analyseomstandigheden. Geef de concentratie van de op elkaar inwerkende sequenties aan.
   3. Druk op Verzenden (aanvullende afbeelding 3B). Bekijk de resultaten die de Gibbs-energieverandering, enthalpieverandering en entropieverandering van de binding omvatten, evenals de T_m-waarden voor de corresponderende duplexen (aanvullende figuur 3B).
   4. Zorg ervoor dat de T_m-waarden voor de duplexen tussen het volledig overeenkomende doel (M) en de doelbindingsarmen van SLAS-S en SLAS-U boven de analysetemperatuur liggen, die in het huidige protocol 22 °C is. Hier waren de T_m-waarden respectievelijk 32,2 °C en 74,4 °C (aanvullende figuur 3C).
   5. Zorg ervoor dat de duplex tussen SLAS-S en een niet-overeenkomend doel (MM) met een SNS een T_m onder de analysetemperatuur heeft. Dit zorgt voor een hoge selectiviteit van de sonde-doelherkenning, waardoor wordt voorkomen dat het AO-fluorogeen de aanwezigheid van de beoogde nucleïnezuuranalyt signaleert als deze een SNS in het SLAS-bindende fragment bevat (Figuur 2). Hier was de T_m 21,3 °C (aanvullende figuur 3C), wat voldoende was om de mismatch van het gematchte complex te onderscheiden.
   6. Pas de sequenties van de doelbindingsarmen aan door de doelcomplementaire fragmenten indien nodig in te korten of te verlengen om aan de aangegeven stabiliteitsvereisten te voldoen.
7. Verkrijg de ontworpen strengen SLAS-S en SLAS-U van elke commerciële leverancier die op maat gemaakte DNA-oligonucleotiden levert of synthetiseer de DNA-strengen in eigen huis met behulp van een geautomatiseerde oligonucleotidesynthesizer.

Figuur 1: Ombouw van een fluorescerende light-up aptameer (FLAP) DAP-10-42 naar een split light-up aptameer sensor (SLAS). (EEN)De secundaire structuur van DAP-10-42¹² wordt voorspeld door een DNA-vouwtoepassing van de UNAFold Web Server¹⁹ bij 22 °C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺. De aptameer heeft een haarspeld secundaire structuur met een kern die zich vermoedelijk vouwt tot een G-quadruplex motief dat wordt gestabiliseerd door stam 1. Om DAP-10-42 om te zetten in een SLAS, wordt (1) stam 1 van de aptameer ingekort tot 4 bp en geflankeerd door een extra G-C bp om stam 1 te maken'; (2) de kernsequentie is gesplitst tussen nts 29 en 30, waarbij de 3'- en 5'-zijden van de gesplitste plaats worden uitgebreid met respectievelijk complementaire sequenties d (GGTCAT) en d (ATGACC) om stam 2 te maken; (3) Stam 1' wordt uitgebreid met de sequenties die complementair zijn aan de aangrenzende fragmenten van een interessant doelwit - doelbindingsarmen, met een d(TT)-linker tussen de doelbindende armen en het signaalrapportagedomein van de sonde. (B) De kern kan ook worden gesplitst tussen nts 28-29, 27-28 of 26-27 zonder significant verlies van het signaal en/of fluorescentievouwverhoging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: SLAS-mechanisme voor het genereren van signalen. SLAS is samengesteld uit twee strengen - SLAS-U en SLAS-S - en een fluorogene kleurstof (bijv. Auramine O; AO). Bij afwezigheid van een nucleïnezuurdoelwit van belang, bevinden beide strengen zich in de gedissocieerde toestand en kunnen ze de kleurstof niet binden; Er wordt geen signaal waargenomen (midden). In de aanwezigheid van een volledig gematcht doelwit M, hybridiseren zowel SLAS-U als SLAS-S naar het aangrenzende fragment van M om de kernfragmenten in de buurt te brengen. Dit zorgt voor de vorming van de kleurstofbindingsplaats. Binding van AO verbetert de fluorescentie, die wordt gemeten als een fluorescerende signaaluitlezing (links). In de aanwezigheid van een niet-overeenkomend doelwit MM dat een single-nucleotide substitutie (SNS) bevat in een fragment dat interageert met SLAS-S, kan alleen SLAS-U hybridiseren naar het MM-doelwit , terwijl SLAS-S zich in de gedissocieerde toestand bevindt. Dit voorkomt de vorming van de kleurstofbindingsplaats en er wordt geen signaal waargenomen (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Versterking van de beoogde sequentie

1. Amplificeer een fragment van het gen dat moet worden geanalyseerd met de SLAS-test. Gebruik voor PCR- of RPA-amplificatie asymmetrische omstandigheden (bijv. met de Forward Primer toegevoegd met een 10-voudige overmaat ten opzichte van de Reverse Primer) om een enkelstrengs amplicon te genereren. Om een 126 nt-fragment van het NANOGP8-gen te amplificeren met behulp van Linear After The Exponential (LATE) PCR²⁰, gebruikt u de primersequenties die in tabel 2 worden vermeld. Hier werd een enkelstrengs DNA-sjabloon (sjabloon NANOGP8 of sjabloon G1423C, tabel 2) gebruikt die overeenkomt met het 126-nt-fragment van het gen. De sjabloon is op maat gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies, Inc.
   1. Bereid een PCR-reactie van 100 μl voor door 10 μl 10x standaard Taq-reactiebuffer, 2 μl 10 mM dNTP-mengsel (om de uiteindelijke concentratie van 0,2 mM) te hebben), 10 μl 10 μM Forward primer en 10 μl 1 μM Reverse Primer (voor de eindconcentratie van 1 μM en 0,1 μM) te mengen, respectievelijk), 0,5 μL 5U/μL Taq DNA-polymerase, DNA-sjabloon en nucleasevrij water. Voor een besturingselement zonder sjabloon, voegt u water toe in plaats van het sjabloon.
   2. Gebruik de volgende thermocyclische omstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 1 min; 45 cycli van (1) denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, (2) primergloeien bij 60 °C gedurende 30 s, (3) primerverlenging bij 68 °C gedurende 30 s; en laatste verlenging bij 68 °C gedurende 5 min.
      OPMERKING: Op transcriptie gebaseerde amplificatietechnieken zoals NASBA¹⁸ kunnen worden gebruikt in plaats van PCR of RPA, vooral als er een RNA-sjabloon beschikbaar is voor amplificatie. NASBA genereert een enkelstrengs RNA-amplicon met een eindproductconcentratie in het micromolaire bereik, die hoog genoeg is om te worden gebruikt in de stroomafwaartse SLAS-test zonder productconcentratie.
2. Sla de geamplificeerde monsters neer met ethanol door 0,1x volume 3 M natriumacetaat (pH 5,5) en 3x volume ethanol toe te voegen. Incubeer gedurende 1 uur bij -20 °C, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000-18.000 x g en gooi het bovenstaande weg.
3. Was de pellet met 70% ethanol, centrifugeer opnieuw en gooi het bovenstaande weer weg. Droog de pellet aan de lucht en los op in 10 μL nucleasevrij water voor gebruik in de SLAS-test.

3. Fluorescentietest met behulp van SLAS

1. Bereid voorraadoplossingen van AO (0,1 mM in DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM in nucleasevrij water, 10x), SLAS-U (10 μM in nucleasevrij water, 10x) en 4x assaybuffer (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl).
   OPMERKING: Kaliumionen zijn nodig om het veronderstelde G-quadruplex-motief van de aptameer, dat deel uitmaakt van de kleurstofbindingsplaats, te stabiliseren. Slechts 1 mM KCl (bij 25 mM MgCl₂) in 1x assaybuffer is voldoende om ~14-voudige fluorescentieverbetering te garanderen in aanwezigheid van het specifieke doelwit, M over de blanco (monster zonder doelwit; Aanvullende figuur 2B). Magnesiumionen stabiliseren de interacties van de nucleïnezuurstrengen (tussen SLAS-S, SLAS-U en het doelwit). De concentratie van Mg²⁺ in de 1x assaybuffer moet ten minste 5 mM zijn (bij 20 mM KCl; Aanvullende figuur 2C,D). De stamoplossing van AO (~1 mM) wordt bereid in DMSO. Voorraadconcentraties van SLAS-S en SLAS-U zijn willekeurig en kunnen indien nodig worden aangepast zolang de uiteindelijke concentraties van de strengen worden gehandhaafd (zie de grondgedachte voor de selectie van de uiteindelijke SLAS-concentratie in Discussie).
   LET OP: AO is schadelijk bij inslikken, giftig bij contact met de huid en wordt ervan verdacht kanker te veroorzaken. Draag altijd handschoenen bij het werken met AO-oplossingen. Het wegen van AO en het bereiden van de voorraadoplossingen moet onder de chemische motorkap gebeuren.
2. Bereid het mastermengsel voor dat alle analysecomponenten bevat, behalve het doel. Bereken het mastermixvolume (_V-mix) door het samplevolume (60 μL) te vermenigvuldigen met het aantal samples plus één (n+1):
   
   Het aantal monsters n moet de nodige negatieve en positieve controles bevatten.
3. Combineer 0,25x V_mix μL 4x Assay Buffer, 0,1x V_mix μL 0,1 mM AO, 0,1x V_mix μL 10 μM SLAS-S en 0,1x V_mix μL 10 μM SLAS-S. Voeg nucleasevrij water toe aan het uiteindelijke volume van zodanig dat het geschikt is voor het doelvolume dat in stap 3.4 is toegevoegd. Vortex en centrifugeer kort de mastermix. 50 μL van het mastermengsel in n monsterbuisjes.
   OPMERKING: Het samplevolume kan worden aangepast afhankelijk van de kenmerken van het instrument dat wordt gebruikt om het fluorescerende signaal te detecteren. Het volume van de mastermix dat in monsterbuisjes wordt verdeeld, kan worden aangepast op basis van het doelvolume dat in stap 3.4 is toegevoegd. De hoeveelheid nucleasevrij water die wordt toegevoegd om het mastermengsel te maken, moet dienovereenkomstig worden aangepast. Als het doelmonster bijvoorbeeld wordt toegevoegd in een dosis van 10% (V/V) van het uiteindelijke monstervolume, moet water aan het mastermengsel worden toegevoegd tot 0,9x_V-mengsel.
4. Gebruik één steekproef als no-target-controle (blanco) en één steekproef als positieve controle. Voeg 10 μl van het doelhoudend monster toe aan het mastermengsel (50 μl) om het uiteindelijke monstervolume van 60 μl met 10-1000 nM doel te maken. Gebruik voor de blanco nucleasevrij water (10 μL) in plaats van het doelwit. Gebruik voor positieve controle een synthetisch DNA-oligonucleotide dat de beoogde sequentie bevat (bv. doelwit M, tabel 1). Voeg 10 μL 0,6-3 μM controle toe om de eindconcentratie van 0,1-0,5 μM te bereiken.
   OPMERKING: Hoge fluorescentie in deze positieve controle zorgt ervoor dat de test werkt zoals verwacht, zelfs als een negatief signaal wordt waargenomen voor de geteste onbekende monsters.
5. Meng de monsters en draai naar beneden met behulp van een microcentrifuge. Incubeer de monsters gedurende 10-60 minuten bij 22 °C. Het signaal neemt slechts met <15% toe tussen 40 minuten en 60 minuten (Figuur 3).
6. Meet de fluorescentie van de monsters bij 540 nm bij excitatie bij 475 nm met behulp van een fluorescerende spectrofotometer.
   OPMERKING: Het is mogelijk om een draagbare fluorometer te gebruiken die fluorescentie meet in dunwandige PCR-buisjes. De fluorometer moet excitatie- en emissiefilters hebben die geschikt zijn voor het detecteren van AO-fluorescentie. Een voorbeeld van een geschikt excitatiefilter is een short-pass van 495 nm. Een voorbeeld van een geschikt emissiefilter is 510-580 nm. Als alternatief kan het signaal visueel worden waargenomen bij excitatie van AO-fluorescentie in het monster met een UV- of blauwlichtbron.
   LET OP: Als een UV-lamp wordt gebruikt, draag dan een UV-beschermende bril.

Figuur 3: Tijdsafhankelijkheid van de signaalgeneratie voor SLAS-29U/30S. Een monster met AO, SLAS-29U en SLAS-30S werd geanalyseerd met behulp van de kinetische modus van een fluorescerende spectrofotometer (excitatie bij 475 nm, emissie bij 540 nm, excitatie-/emissiespleten van 5 nm) gedurende 60 minuten. Op een tijd van 5 minuten (aangegeven met een pijl) werd doel M aan de steekproef toegevoegd. De gegevens zijn gemiddeld van twee onafhankelijke onderzoeken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De prestaties van SLAS met behulp van DAP-10-42-kern als signaalreporter werden gedemonstreerd met behulp van een sonde die was ontworpen om een fragment van het NANOGP8-gen te ondervragen dat belangrijk is voor de progressie van glioblastoma multiforme (GBM), een agressieve vorm van hersenkanker²¹. Er werd gemeld dat dit fragment SNS'en bevatte in de DNA-lading van exosomen afkomstig van kankercellen²². Daarom werd de SLAS afgeste...

Discussie

In het gerapporteerde protocol omvatten de kritieke stappen (i) het SLAS-ontwerp; ii) de analysetemperatuur; iii) aanwezigheid van mono- en tweewaardige metaalkationen (K⁺ en Mg²⁺); iv) concentraties van SLAS-strengen.

SLAS-ontwerp
Bij het ontwerpen van SLAS-strengen is het belangrijk om rekening te houden met de thermodynamische stabiliteit van de complexen gevormd door SLAS-S- en SLAS-U-strengen bij afwezigheid van d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Auramine O	MP Biomedicals	195064	een fluorogeen kleurstof gebruikt voor signaalrapportage
Cary Eclipse Fluorometer	Agilent Technologies	G9800A	om het fluorescerende signaal van de monsters te meten
Dimethy Sulfoxide	MP Biomedicals	196055	oplosmiddel om stamoplossingen van Auramine O te bereiden
DNA oligonucleotiden (primers, SLAS strengen, synthetische template voor PCR)	IDT	N/A	op maat gemaakt en ontzilt door de verkoper, gebruikt zonder verdere zuivering
dNTP mix, 10 mM	ThermoFisher Scientific	R0191	voor LATE PCR reactie
Magnesium Chloride	invitrogen	AM9530G	buffercomponent; nodig voor de correcte associatie van de strengen van de sonde met het geanalyseerde doelwit
Microcentrifugebuizen (1,5-mL )	Fisherbrand	02-681-320	kunststof voor monstervoorbereiding
Micropipet (0,1-2,5 µL)	Eppendorf	K56877G	gebruikt voor monstervoorbereiding
Micropipet (100-1000 µL)	Eppendorf	K13160F	gebruikt voor monstervoorbereiding
Micropipet (20-200 µL)	Eppendorf	J05253M	gebruikt voor monstervoorbereiding
Micropipet (2-20 µL)	Eppendorf	G24675G	gebruikt voor monstervoorbereiding
Mini Centrifuge	Corning	6770	gebruikt om de monsters naar beneden te centrifugeren
Nuclease-Vrij Water (niet DEPC-Behandeld)	ThermoFisher Scientific	AM9932	Gebruik voor monsters in PCR en SLAS-assay
PCR-buizen (0,5-mL)	invitrogen	AM9932	om de fluorescentie te meten met behulp van Quantus fluorometer
Pipettips (20-200 µL)	VWR	76322-150	kunststof voor monstervoorbereiding
Pipettips (1-10 uL)	VWR	76322-528	kunststof voor monstervoorbereiding
Kaliumchloride	Invitrogen	AM9640G	buffercomponent; nodig voor de correcte vouwing van het fluorescente oplichtende aptamerdomein van de sonde
Quantus Fluorometer	Promega	E6150	draagbare laaggeprijsde fluorometer die kan worden gebruikt voor fluorescentiemetingen
Kwarts cuvet	Starna	16.50F-Q-10/Z15	te gebruiken voor fluorescentiemeting met behulp van Cary Eclipse fluorometer
Taq DNA Polymerase met Standaard Taq Buffer	New England BioLabs	M0273S	voor versterking van een te analyseren genfragment met de SLAS-assay
Tris-HCl buffer (pH 7.4)	Boston Bioproducts	R-314	buffercomponent
UV-lamp	UVP	95-0016-14	om AO te exciteren voor visuele signaalvermelding
Vortexmixer	VWR	10153-838	gebruikt voor het mengen van de monsters