Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

Samenvatting

Dit protocol presenteert een multimodale benadering die Raman-spectroscopie en tomografische fasemicroscopie combineert voor labelvrije, niet-invasieve fenotypering van levende menselijke borstkankercellen. Het omvat een gebruiksvriendelijke, menselijke bias-vrije analysepijplijn voor snelle, kwantitatieve morfochemische analyse, die gedetailleerde moleculaire en structurele inzichten biedt met toepassingen in kankeronderzoek en celbiologie.

Samenvatting

We presenteren multimodale confocale Raman-microspectroscopie (RS) en tomografische fasemicroscopie (TPM) voor snelle morfochemische fenotypering van menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231). Door gebruik te maken van de niet-perturbatieve aard van deze geavanceerde microscopietechnieken, hebben we gedetailleerde morfomoleculaire gegevens vastgelegd van levende, labelvrije cellen in hun oorspronkelijke fysiologische omgeving. Er werden pijplijnen voor gegevensverwerking zonder menselijke vooroordelen ontwikkeld om hyperspectrale Raman-beelden te analyseren (die Raman-modi omvatten van 600 ^cm-1 tot 1800 ^cm-1, die op unieke wijze een breed scala aan moleculaire bindingen en subcellulaire structuren karakteriseren), evenals morfologische gegevens van driedimensionale brekingsindextomogrammen (met metingen van celvolume, oppervlak, voetafdruk en bolvorm met nanometerresolutie, naast de droge massa en de dichtheid). Door de rijke single-cell details die RS en TPM leveren systematisch op te splitsen, tonen we op een kwantitatieve manier het voordeel aan van zo'n multimodale microscopiemethode voor het fenotyperen van tumorale borstkankercellen. Onze tools geven ook meer inzicht in de subcellulaire informatie zonder het gebruik van labels. Ten slotte bestuderen en bespreken we alle unieke of gecorreleerde informatie die RS- en TPM-afgeleide datasets bevatten. Wij zijn van mening dat onze tools en pijplijnen voor kwantitatieve gegevensanalyse een revolutie teweeg kunnen brengen in fenotyperingstaken in biomedisch onderzoek wanneer er behoefte is aan een snelle en niet-verstorende methode op levende cellen in kweek, met het potentieel voor toekomstige vertaling naar klinische en diagnostische toepassingen.

Inleiding

Celkarakterisering en fenotypering zijn cruciale aspecten van biomedisch onderzoek¹. Het kunnen karakteriseren van cellen op zowel morfologisch als moleculair niveau is van het grootste belang voor het begrijpen van celfunctie, differentiatie en pathologie ^1,2,3. Het is met name van belang op het gebied van oncologie, waar nauwkeurige celprofilering nodig is voor de diagnose van tumoren, het bepalen van het ziektestadium en uiteindelijk het identificeren van therapeutische doelen². Traditionele ....

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

1. Zaad MDA-MB-231-cellen op kwartspetrischalen.
   1. Plaat MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen op 3,5 cm petrischaaltjes met kwartsglasbodem.
   2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een omgeving met 5% CO₂ tot ze volledig aan het oppervlak zijn gehecht (ten minste 12 uur na het zaaien).
2. Was de cellen en bereid ze voor op de meting.
   1. Verwijder het kweekmedium van de cellen zodra ze zich aan het petrischaaltje hebben gehecht.
   2. Was de cellen voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om restmateriaal te....

Resultaten

We beschreven een workflow voor de labelvrije morfochemische karakterisering van levende cellen op basis van confocale RS en TPM. We hebben het vermogen van de voorgestelde workflow getest om de moleculaire samenstelling en morfologische parameters van de menselijke borstkankercellijn MDA-MB-231 te bereiken (Figuur 1).

MDA-MB-231-cellen werden gezaaid op petrischalen met kwartsglasbodem. Een op maat gemaakte confocale Raman-micros.......

Discussie

We presenteerden een multimodale aanpak en een eenvoudige analysepijplijn waarin twee geavanceerde, labelvrije beeldvormingstechnieken werden geïntegreerd: RS en TPM. De beschreven workflow maakte snelle, niet-invasieve morfochemische fenotypering van levende menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231) mogelijk zonder de noodzaak van externe labeling.

RS is een niet-destructieve techniek die het mogelijk maakt om de biochemische samenstelling van biologische mon.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CCD camera	Princeton Instruments	PIXIS 100BR eXcelon	Detector voor Raman-verstrooiingssignaal.
CCD camera besturingssoftware	Princeton Instruments	LightField
Continuous-wave Ti-Saffier laser (golflengte: 785 nm)	Spectra-Physics	3900 S	Het wordt gebruikt voor Raman-microscopie-excitatie.
Dichroüsch spiegel	ThorLabs	DMSP750B	749-nm dichroüsch spiegel, leidt 785-nm Raman-excitatie naar monster, filtert fluorescentie- en brightfield-signalen.
Fetaal bovien serum	Thermo Fisher Scientific	A5256701
Fluorescentiemicroscoop body	Olympus	IX83
Laser (golflengte: 532 nm)	Spectra-Physics	Millennia eV	Pomplaser voor 785-nm Ti-Saffier lasersysteem.
MATLAB software	MathWorks	2023a
MDA-MB-231 cellijn	ATCC	HTB-26
NIR spectrograaf	Andor	Holospec HS-HSG-785-LF	Het wordt gebruikt voor spectrale analyse van terugverstrooid licht.
Objectieflens (60× 1,2 NA water-immersie)	Olympus	UPLSAPO60×
Onstage incubatiekamer	Tokai Hit	stxg-welsx-set
Open-source microscoopbesturingssoftware	µManager	Micro-Manager-2.0
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Fenoolvrij DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041025
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco	10-010-023
Kwartsglas bodem Petri schotels	Waken B Tech	SF-S-D12
Raman data-analysesoftware	RamApp		Web-gebaseerde tool voor Raman hyperspectrale dataverwerking.
sCMOS camera	Hamamatsu Photonics	Orca Flash 4.0 v2
Spuitpomp	Chemyx	Fusion 720
Tomografische fasemicroscoop	Tomocube, Inc.	HT-2H	Commercieel systeem voor het verkrijgen van kwantitatieve fasebeelden.
TPM data-analysesoftware	Tomocube, Inc.	TomoStudio	Software gebruikt voor het analyseren van tomografische fasemicroscopie (TPM) gegevens.