Methodenartikel

Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68498

⸱

22 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een multimodale benadering die Raman-spectroscopie en tomografische fasemicroscopie combineert voor labelvrije, niet-invasieve fenotypering van levende menselijke borstkankercellen. Het omvat een gebruiksvriendelijke, menselijke bias-vrije analysepijplijn voor snelle, kwantitatieve morfochemische analyse, die gedetailleerde moleculaire en structurele inzichten biedt met toepassingen in kankeronderzoek en celbiologie.

Samenvatting

We presenteren multimodale confocale Raman-microspectroscopie (RS) en tomografische fasemicroscopie (TPM) voor snelle morfochemische fenotypering van menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231). Door gebruik te maken van de niet-perturbatieve aard van deze geavanceerde microscopietechnieken, hebben we gedetailleerde morfomoleculaire gegevens vastgelegd van levende, labelvrije cellen in hun oorspronkelijke fysiologische omgeving. Er werden pijplijnen voor gegevensverwerking zonder menselijke vooroordelen ontwikkeld om hyperspectrale Raman-beelden te analyseren (die Raman-modi omvatten van 600 cm-1 tot 1800 cm-1, die op unieke wijze een breed scala aan moleculaire bindingen en subcellulaire structuren karakteriseren), evenals morfologische gegevens van driedimensionale brekingsindextomogrammen (met metingen van celvolume, oppervlak, voetafdruk en bolvorm met nanometerresolutie, naast de droge massa en de dichtheid). Door de rijke single-cell details die RS en TPM leveren systematisch op te splitsen, tonen we op een kwantitatieve manier het voordeel aan van zo'n multimodale microscopiemethode voor het fenotyperen van tumorale borstkankercellen. Onze tools geven ook meer inzicht in de subcellulaire informatie zonder het gebruik van labels. Ten slotte bestuderen en bespreken we alle unieke of gecorreleerde informatie die RS- en TPM-afgeleide datasets bevatten. Wij zijn van mening dat onze tools en pijplijnen voor kwantitatieve gegevensanalyse een revolutie teweeg kunnen brengen in fenotyperingstaken in biomedisch onderzoek wanneer er behoefte is aan een snelle en niet-verstorende methode op levende cellen in kweek, met het potentieel voor toekomstige vertaling naar klinische en diagnostische toepassingen.

Inleiding

Celkarakterisering en fenotypering zijn cruciale aspecten van biomedisch onderzoek1. Het kunnen karakteriseren van cellen op zowel morfologisch als moleculair niveau is van het grootste belang voor het begrijpen van celfunctie, differentiatie en pathologie 1,2,3. Het is met name van belang op het gebied van oncologie, waar nauwkeurige celprofilering nodig is voor de diagnose van tumoren, het bepalen van het ziektestadium en uiteindelijk het identificeren van therapeutische doelen2. Traditionele methoden voor celkarakterisering kunnen geen temporele dynamiek bieden en zijn meestal gebaseerd op invasieve technieken, zoals kleuring of labeling, die de oorspronkelijke toestand van de cellen kunnen verstoren en mogelijke vertekeningen in de gegevens kunnen introduceren4. Daarom is er steeds meer vraag naar niet-invasieve strategieën om nauwkeurige en grondige fenotypering van levende cellen te bieden, in hun aanstaande, onverstoorbare staat.

In deze context hebben labelvrije multimodale beeldvormingsmethoden een revolutie teweeggebracht in het celbiologisch onderzoek door complementaire modaliteiten te combineren om zowel morfologische als moleculaire informatie vast te leggen 2,5. Deze benaderingen maken een geïntegreerde en niet-invasieve karakterisering van de cellen mogelijk die individuele traditionele technieken niet altijd kunnen bieden 2,5,6. Hoewel microscopietechnieken zoals fluorescentiemicroscopie bijvoorbeeld op grote schaal worden gebruikt bij morfologische en functionele celbeeldvorming, hebben ze inherente beperkingen. Fluorescentiemethoden hebben vaak last van fotobleken, fototoxiciteit en lage hoeveelheden doelbare moleculen, die het analytische potentieel beperken4. Bovendien vereisen deze benaderingen vaak het gebruik van exogene labels of kleurstoffen, die de oorspronkelijke celtoestand kunnen verstoren of tot artefacten kunnen leiden7.

Multimodale beeldvormingsplatforms, die de sterke punten van meerdere beeldvormingsmodaliteiten combineren, overtreffen deze beperkingen door het mogelijk te maken verschillende soorten gegevens uit levende cellen te verkrijgen zonder dat labeling nodig is. De integratie van Raman-spectroscopie (RS) met andere beeldvormingsmodaliteiten zoals fasecontrastmicroscopie of tomografische fasemicroscopie (TPM) is een veelbelovende strategie geweest om de beperkingen van enkelvoudige technieken te overwinnen. Multimodale beeldvorming biedt inderdaad een beter begrip van cellulaire fenotypes, vooral bij complexe biologische aandoeningen en pathologieën zoals kanker, waar moleculaire en structurele eigenschappen cruciaal zijn voor een nauwkeurige karakterisering 2,5.

Labelvrije RS is zeer geschikt voor chemische beeldvorming van cellen8. Door moleculaire trillingsmodi te detecteren, biedt RS biochemische vingerafdrukken die diepgaande informatie kunnen onthullen over de moleculaire samenstelling van cellen 9,10,11. Raman-spectra verkregen uit biologische monsters bevatten informatie over een verscheidenheid aan biomoleculen zoals lipiden, eiwitten, nucleïnezuren en metabolieten, die een essentiële rol spelen bij het begrijpen van de moleculaire aard van cellen 9,12. Een van de belangrijkste sterke punten van RS is dat het niet-invasief is, waardoor levende cellen in hun natuurlijke staat kunnen worden gekarakteriseerd zonder hun fysiologische toestand te veranderen.

Ondanks de vele voordelen heeft RS ook enkele beperkingen. Hoewel RS gedetailleerde moleculaire informatie verschaft, staat het geen kwantitatieve informatie toe over de morfologie of structuur van cellen2. Dit is waar complementaire beeldvormingstechnieken zoals TPM een cruciale rol spelen.

TPM is een vorm van kwantitatieve fasebeeldvorming (QPI)13,14 en maakt de visualisatie mogelijk van labelvrije kwantitatieve informatie met hoge resolutie over celmorfologie15,16. TPM verschilt van traditionele microscopietechnieken doordat er geen contrastmiddelen voor nodig zijn; in plaats daarvan werkt het door faseverschuivingen te meten die het gevolg zijn van variaties in de brekingsindex (RI) van het monster17. Faseverschuivingen geven informatie over de structurele eigenschappen van de cel, inclusief het volume, het oppervlak, de vorm en de interne structuur 2,18. TPM kan een hoge ruimtelijke resolutie bereiken, tot op nanometerniveau, en is daarom een ideale techniek voor het vastleggen van morfologische details met hoge resolutie van levende cellen. Verder maakt de mogelijkheid om 3D RI-tomogrammen te reconstrueren het mogelijk om subcellulaire structuren in hun vivo-omgeving te visualiseren18, wat nauwkeurigere informatie oplevert in vergelijking met 2D-projecties. Een van de belangrijkste beperkingen van TPM is echter het gebrek aan chemische specificiteit, omdat het voornamelijk informatie geeft over de morfologie en faseverdeling van de cel, zonder onderscheid te kunnen maken tussen verschillende chemische componenten of biochemische kenmerken te kunnen identificeren.

De combinatie van RS en TPM in een multimodale techniek levert voordelen op bij celfenotypering. Terwijl RS rijke moleculaire informatie mogelijk maakt, voegt TPM een structureel aspect toe, waardoor de cellulaire morfologie in aanzienlijk detail kan worden geanalyseerd. Onlangs is de combinatie van RS met TPM met succes aangetoond in verschillende onderzoeken gericht op kankeronderzoek 2,19,20. Eerder werk heeft bijvoorbeeld gemeld dat het co-registreren van Raman-spectroscopie met holografische fasemicroscopiegegevens aanvullende moleculaire en morfologische informatie kan opleveren, waardoor onderscheid kan worden gemaakt tussen verschillende celtypen en tumorontwikkelingsstadia2. Deze onderzoeken hebben de kracht van multimodale beeldvorming benadrukt om de nauwkeurigheid van celfenotypering te verbeteren, met name in de context van kanker, waar de moleculaire en structurele kenmerken van cellen nauw verband houden met hun maligniteit en gedrag 2,20.

Ondanks de recente vooruitgang op het gebied van multimodale beeldvorming zijn er nog steeds uitdagingen die moeten worden aangepakt, met name op het gebied van gegevensverwerking en -analyse21. De grote hoeveelheden gegevens die multimodale beeldvormingstechnieken opleveren, kunnen omslachtig zijn om te analyseren, en er moeten eenvoudige procedures worden gebruikt om zinvolle informatie te extraheren. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, moeten er gebruiksvriendelijke gegevensverwerkingspijplijnen worden opgezet om de complexiteit van de gegevens aan te kunnen en menselijke vooringenomenheid in de analyse te minimaliseren. Dergelijke pijplijnen zijn van cruciaal belang voor het bereiken van nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten en de mogelijke vertaling van deze benaderingen naar klinische en diagnostische toepassingen.

Het doel van dit werk is om het potentieel te illustreren van het samenvoegen van RS met TPM voor labelvrije, snelle en niet-perturbatieve fenotypering van levende enkelvoudige kankercellen. Door deze twee robuuste beeldvormingsbenaderingen samen te voegen, bieden we een uitgebreide en kwantitatieve karakterisering van de moleculaire en morfologische eigenschappen van menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231). Het werk benadrukt ook het belang van het opzetten van gegevensverwerkingspijplijnen zonder menselijke vooroordelen om ervoor te zorgen dat de geëxtraheerde informatie uit de multimodale datasets correct en betrouwbaar is. Hier proberen we een robuust platform op te zetten voor fenotypering van kankercellen dat kan worden gegeneraliseerd naar andere soorten cellen. De veelzijdigheid en gevoeligheid van deze benadering maken het een potentiële kandidaat voor een breed scala aan biomedische toepassingen, van fundamentele celbiologische studies tot diagnostiek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

  1. Zaad MDA-MB-231-cellen op kwartspetrischalen.
    1. Plaat MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen op 3,5 cm petrischaaltjes met kwartsglasbodem.
    2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een omgeving met 5% CO2 tot ze volledig aan het oppervlak zijn gehecht (ten minste 12 uur na het zaaien).
  2. Was de cellen en bereid ze voor op de meting.
    1. Verwijder het kweekmedium van de cellen zodra ze zich aan het petrischaaltje hebben gehecht.
    2. Was de cellen voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om restmateriaal te verwijderen.
    3. Voeg vers celkweekmedium toe en houd de cellen gedurende de hele meetprocedure bedekt met het medium om hun levensvatbaarheid te garanderen.
      OPMERKING: Als kweekmedium werd in deze studie fenol roodvrije DMEM/F-12 gebruikt, aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en penicilline (100 IE/ml)-streptomycine (100 μg/ml).

2. Raman-microscoopsysteem met hoge doorvoer

OPMERKING: Technische details van de zelfgebouwde Raman-microscoop die wordt gebruikt voor het huidige werk met betrekking tot live-cell beeldvorming van MDA-MB-231-cellen werden eerder beschreven22. In het kort is het gebruikte, op maat gemaakte Raman-microscoopsysteem met hoge doorvoer voorzien van een 785-nm Ti-Sapphire-laser die wordt gepompt door een 532-nm laser (Figuur 1A). De 785-nm Raman-excitatielaser is gekoppeld aan een omgekeerd IX83 fluorescentiemicroscooplichaam, waarbij de excitatie naar het monster wordt gericht via een UPLSAPO60× 1,2 NA wateronderdompelingsobjectief met behulp van een dichroïsche spiegel van 749 nm. Een polarisator stemt het gemiddelde laservermogen af op de achterpoort van de microscoop. Helderveldbeeldvorming wordt mogelijk gemaakt door wit licht op een vergelijkbare manier te koppelen. Het systeem schakelt tussen de Raman- en helderveldmodi door dichroïsche filters automatisch te wijzigen. Het systeem combineert galvo-mirror en stage scanning voor high-throughput beeldvorming. Een aangepast MATLAB-script werkt samen met open-source microscoopbesturingssoftware, een data-acquisitiebord (DAQ) en signaaldetectiesystemen om het data-acquisitieproces te automatiseren. Het terugverstrooide Raman-licht wordt verzameld door hetzelfde objectief, terwijl zichtbaar licht wordt gefilterd door een dichroïsche spiegel van 785 nm en gericht op een NIR-spectrograaf en een charge-coupled device (CCD) detector. Deze opstelling maakt multidimensionale beeldvorming mogelijk, waarbij helderveld-, fluorescentie- en Raman-signalen worden vastgelegd over verschillende posities en z-stacks 2,22.

  1. Raman beeldvorming procedure
    1. Voorbereiding van het monster en behoud van fysiologische omstandigheden
      1. Installeer het monster in de couveuse op het podium om de fysiologische omstandigheden te behouden. Zorg ervoor dat de broedmachine is ingesteld op 37 °C, met real-time feedbackregeling voor temperatuurregeling.
      2. Houd de luchtvochtigheid in de kamer op >95% met behulp van de interne perifere badeenheid gevuld met gedestilleerd water. Stel de CO2 -gasregelaar in om 5% CO2 te mengen met 95% lucht en voer dit toe aan de broedkamer.
    2. Geautomatiseerd beheer van onderdompeling in water
      1. Schakel de zelfgebouwde geautomatiseerde waterdompelgoot in om de objectieflens van water te voorzien met een debiet van 2 μl/min met behulp van spuitpompen en spuitnaalden die op de objectiefpunt zijn gelijmd.
      2. Controleer regelmatig het waterpeil om verdamping te voorkomen en zorg voor consistente beeldvormingsomstandigheden tijdens de metingen.
    3. Gegevensverzameling van Raman-spectroscopie
      1. Zet de pomplaser aan en pas het vermogen aan om een laservermogen op het monstervlak van 75 mW te bereiken.
      2. Open de Micro-manager open-source microscoopbesturingssoftware. Selecteer in de configuratie-instellingen BF en klik op Live aan de linkerkant van het softwarevenster om het heldere veldbeeld te visualiseren. Selecteer de gewenste enkele cel waaruit het Raman-spectrum zal worden verkregen. Klik vervolgens op Stoppen om de helderveldvisualisatie te beëindigen.
      3. Stel de Z-coördinaat van het Raman-beeldvormingsvlak in door het aantal signalen op de CCD-camera te maximaliseren.
      4. Open hiervoor de CCD-camerabesturingssoftware (LightField); stel bij de experimentinstelling de belichtingstijd in op 1.5 seconde. Klik vervolgens op Uitvoeren op de werkbalk Experiment en schakel de laserstraal in.
      5. Pas vervolgens de Z-positie aan om het aantal signalen in het vingerafdrukgebied te maximaliseren van 600 cm-1 tot 1800 cm-1 om de visualisatie van de Raman-pieken die verband houden met biologische handtekeningen te optimaliseren. Schakel vervolgens de laser uit en klik op Stop in de experimentbalk van de CCD-camerasoftware en sluit de software af.
        OPMERKING: Er werd waargenomen dat het gemaximaliseerde aantal Raman-signalen op de CCD-camera in overeenstemming was met de positie langs de Z-as die samenviel met +8 μm ten opzichte van het beeldvlak dat geen enkel spoor van celgerelateerde Raman-pieken vertoonde, vanwege een brandpunt dat redelijk in het kwarts viel. Deze waarde kan variëren afhankelijk van het celtype en de status.
    4. Start het data-acquisitieproces met behulp van het MATLAB-script, dat automatisch Raman-kanalen in multidimensionale metingen verwerkt en de hyperspectrale Raman-gegevens opslaat.
    5. Stel het gezichtsveld in op 50 × 50 μm2, 40 × 40 pixels, waarbij elk pixelgebied overeenkomt met 1,25 × 1,25 μm2. Stel de belichtingstijd voor elk Raman-spectrum in op 1.5 s.
      OPMERKING: Voer regelmatig golfgetalkalibratie uit met behulp van acetamidofenolmonsters om bekende Raman-pieken te annoteren. Kalibreer de Raman-verschuivingsas door middel van kwadratische interpolatie.
      LET OP: Ga voorzichtig om met lasers. Gebruik altijd de juiste veiligheidsbril die geschikt is voor de lasergolflengte tijdens installatie en gebruik.

3. Analyse van RS-gegevens

  1. Nabewerking Raman hyperspectrale kaarten via RamApp webgebaseerde tool (https://ramapp.io/):
    1. Log in op de webgebaseerde tool.
    2. Importeer de hyperspectrale gegevens. Klik op het tabblad Mijn analyses op Nieuw en upload het .mat-bestand, dat de variabele ruimtelijke en spectrale gegevens en de variabele x-as (d.w.z. Raman-verschuivingswaarden) bevat.
    3. Als u het spectrum wilt inkorten tot de opgegeven regio('s) in de Raman-verschuiving, klikt u in de vervolgkeuzelijst Bijsnijden en roteren op Spectraal bijsnijden en definieert u de ondergrens en de bovengrens van het Raman-verschuivingsgebied gelijk aan respectievelijk 600 cm-1 en 1800 cm-1.
      OPMERKING: Door deze spectrumafkapping uit te voeren, wordt de brede en hoge amplitudepiek met betrekking tot het kwartsmateriaal van de petrischaal uitgesloten van de analyse.
    4. Om de Raman-spectra voor kosmische straling te corrigeren, klikt u in de opties voor ruisonderdrukking op Despike, selecteert u Z-score als methode en stelt u de drempel gelijk aan 8.
      OPMERKING: De Despike-voorverwerkingsfunctie helpt bij het oplossen van het probleem van pixels met pieken in hun signaal, die het gevolg zijn van kosmische straling.
    5. Vink de optie Gebruik eerste verschil aan om uitschieters te vinden met behulp van het eerste discrete verschil van intensiteit langs het spectrum, en vink de optie Pieken corrigeren aan. Het spectrum van elke slechte pixel wordt vervangen door het mediane spectrum van de aangrenzende pixels.
    6. Klik op Uitvoeren om de spikes te corrigeren.
    7. Als u ruis wilt verwijderen van de kaarten die overeenkomen met elk golfgetal, klikt u in de opties voor ruisonderdrukking op Vloeiende kaart, selecteert u Mediaanfilter en stelt u de grootte in van de zijde van het vierkant waarmee rekening wordt gehouden bij het toepassen van het filter op elke pixel van de kaart gelijk aan 3 pixels. Klik vervolgens op Uitvoeren.
    8. Als u een filter wilt toepassen om het spectrum van elke pixel vloeiender te maken, klikt u op Vloeiend spectrum in de selecties Ruisonderdrukking . Selecteer het Savitzky-Golay-filter als de methode en stel de lengte van het filtervenster gelijk aan 7 en de polynomiale volgorde van het filter gelijk aan 2. Klik vervolgens op Uitvoeren.
      OPMERKING: Een Savitzky-Golay-filter vereist het specificeren van de lengte van het filtervenster (een positief oneven geheel getal) en de volgorde van de polynoom.
    9. Als u het gemiddelde achtergrondsignaal van de voorgrond wilt verwijderen, opent u het deelvenster Optisch substraat verwijderen en klikt u op Substraat identificeren. Stel k-gemiddelden in als een methode en het aantal clusters is gelijk aan 2.
      OPMERKING: Met deze functie worden de cellen (de 'voorgrond') en hun substraat gesegmenteerd met behulp van een clusterbenadering. U kunt dan het gemiddelde achtergrondsignaal van de voorgrond verwijderen of sommige stappen beperken om alleen op voorgrondpixels te werken. Het aantal te selecteren clusters kan variëren, afhankelijk van het specifieke exemplaar.
    10. Vink bij geavanceerde opties Morfologisch opschonen aan om enkele kleine klodders van de voorgrond te verwijderen (bijv. valse celdelen, enz.). Klik vervolgens op Uitvoeren.
    11. Als u in het deelvenster Optisch substraat het gemiddelde achtergrondsignaal wilt aftrekken, klikt u op Substraat verwijderen, selecteert u vervolgens Globaal gemiddelde (gemiddelde van de centrale 95% van de waarden) en klikt u op Uitvoeren.
      OPMERKING: K-means is meestal sneller, hoewel niet-deterministisch (echter, aangezien de willekeurige seed vastligt, zal hetzelfde resultaat worden verkregen in elke run, als al het andere gelijk is). Het aantal clusters kan worden vergroot tot meer dan 2 als bepaalde delen van de voorgrond nog steeds als achtergrond worden herkend. Het cluster met het laagste gemiddelde signaal wordt gedefinieerd als de achtergrond.
    12. Als u de fluorescentie van de basislijn wilt corrigeren, opent u het deelvenster Basislijn en klikt u op Basislijn corrigeren. Selecteer asPLS (Adaptive Smoothness PLS) en stel λ in op 5000000. Klik vervolgens op Uitvoeren.
      OPMERKING: Er zijn 7 beschikbare methoden die kunnen worden geselecteerd, waarvan er 5 zijn gebaseerd op bestrafte kleinste kwadraten (PLS). In deze PLS-methoden is een afvlakkingsparameter (λ) noodzakelijk. Een hogere waarde van λ resulteert in vloeiendere basislijnen.
    13. Als u elke hyperspectrale Raman-kaart wilt normaliseren door deze te delen door de Frobenius-norm, klikt u op Diversen en selecteert u de optie Normaliseren . Selecteer vervolgens Frobenius als de methode en klik op Uitvoeren.
      OPMERKING: De Frobenius-norm wordt gebruikt om de gehele datamatrix te normaliseren.
    14. Als u een afbeelding met valse kleuren wilt verkrijgen die de ruimtelijke verdeling van een subcellulaire component illustreert, klikt u in het deelvenster Afbeeldingen aan de rechterkant op de intensiteitsafbeelding op het menusymbool Openen . Klik vervolgens op de Afbeelding bewerken optie om het bewerkingspaneel te openen.
    15. Selecteer in het bewerkingspaneel de optie Enkelvoudige band en definieer vervolgens het spectrale bereik (bijv. 715-725 cm-1 voor het cytoplasma). Selecteer Dubbele kleur op de kleurenkaart, definieer de kleur, de intensiteitsdrempel en de dekking en klik vervolgens op Bevestigen.
    16. Als u een enkelpunts spectrum wilt downloaden, klikt u op de pixel die u interesseert op de afbeelding om deze te selecteren. Klik vervolgens in het deelvenster Spectrale legenda in de sectie Cursor op Spectrum downloaden. Herhaal dezelfde procedure voor verschillende subcellulaire componenten.
    17. Als u de Raman-spectra op de voorgrond en het substraat wilt exporteren, klikt u in het deelvenster Spectrale legenda in de sectie Substraatidentificatie op Spectrum downloaden voor zowel de secties Voorgrond als Substraat .
      OPMERKING: In het eerder beschreven protocol voor RS-gegevensanalyse werden voorverwerkingsstappen en univariate analyse beschreven om valse kleurenbeelden te genereren die de ruimtelijke verdeling van belangrijke subcellulaire componenten, Raman-intensiteitsspectra van zowel voorgrond als substraat illustreren, en enkelpuntsspectra van subcellulaire structuren. Hoewel downstream-analyse vaak is afgestemd op de specifieke biologische vraag, belicht deze studie nu representatieve multivariate en classificatiemethoden die toegankelijk zijn via de sectie Kaartanalyse van de gebruikte webgebaseerde tool. Deze omvatten clusteranalyse, Principal Component Analysis (PCA), Multivariate Curve Resolution (MCR), N-FINDR en Spectrale aanpassing. Spectrale aanpassing maakt de kwantificering en vergelijking van spectrale kenmerken mogelijk met behulp van op afstand gebaseerde benaderingen zoals de Pearson-correlatiecoëfficiënt of Spectral Angle Mapper. Clusteranalyse kan worden uitgevoerd met behulp van algoritmen zoals k-means, Mini-batch k-means of hiërarchische agglomeratieve clustering, waardoor segmentatie van hyperspectrale gegevens op basis van spectrale gelijkenis wordt vergemakkelijkt. PCA kan worden toegepast om de dimensionaliteit van gegevens te verminderen en variantiepatronen te markeren, terwijl MCR decompositie van gemengde signalen in zuivere componentspectra mogelijk maakt. Het N-FINDR-algoritme helpt bij het extraheren van eindlidspectra door eerst PCA toe te passen om de dimensionaliteit te verminderen, waardoor het bijzonder geschikt is voor hyperspectrale datasets. Deze tools bieden een robuust kader voor stroomafwaartse exploratie van biologische patronen die zijn gecodeerd in spectrale gegevens van Raman.

4. TPM meetprotocol

  1. Bereid de microscoopopstelling voor.
    1. Plaats een druppel gedestilleerd water op de objectieflens van de microscoop. Plaats het monster op de translatiefase van de microscoop. Pas de positie van het monster aan om deze uit te lijnen met de objectieflens.
  2. Lijn de objectieven en de condensorlenzen uit.
    1. Zet de microscoop aan en start de TomoStudio-beeldvormingssoftware. Klik op het microscooppictogram op de werkbalk. Klik na initialisatie op Configuratie. Selecteer LiveCell in het deelvenster Taak en PBS als het medium.
      OPMERKING: De RI-waarde in het deelvenster Medium wordt automatisch ingesteld op 1,337 wanneer PBS als medium is geselecteerd.
    2. Ga naar het tabblad Kalibratie in het configuratiescherm van de beeldvormingssoftware. Stel de axiale posities van de objectieven en de condensorlenzen in door respectievelijk Focus en Surface te selecteren.
    3. Klik op de scanmodus om de lenzen handmatig aan te passen en ervoor te zorgen dat de verlichtingspatronen geconcentreerd zijn in het midden van het gezichtsveld en bijna stilstaan.
  3. Zoek het monster.
    1. Klik op Normale modus en pas de vertaalfase aan om de cel in het gezichtsveld te plaatsen. Stel scherp op het monster door de axiale positie van de objectieflens aan te passen totdat de monstergrens bijna onzichtbaar wordt op het scherm.
    2. Pas de vertaalfase aan om een gebied zonder cellen te lokaliseren, zodat u een onbelemmerd zicht krijgt.
  4. Kalibreer het systeem.
    1. Selecteer Kalibreren in de beeldsoftware om meerdere 2D-hologrammen vast te leggen met verschillende verlichtingshoeken.
  5. Verkrijg het 3D RI-tomogram.
    1. Pas de vertaalfase aan om de cel binnen het gezichtsveld te centreren. Navigeer naar het tabblad Acquisitie en selecteer 3D-snapshot om het tomogram van de cel vast te leggen.
      OPMERKING: De acquisitietijd voor een 3D RI-tomogram van een enkele cel is aanzienlijk korter (in de orde van seconden) in vergelijking met de acquisitietijd die vereist is voor RS-gegevens; dus de adoptie van een incubator op het podium voor TPM is doorgaans niet vereist. Als er echter metingen moeten worden uitgevoerd op een groot aantal cellen, of onder specifieke omstandigheden, zijn er speciale commerciële incubatiekamers beschikbaar die fysiologische omstandigheden bieden en die in het TPM-systeem kunnen worden geïntegreerd.

5. Analyse van TPM-gegevens

  1. TPM-kaarten na verwerking met behulp van TomoStudio-software.
    1. Als u de holografische tomogrammen wilt visualiseren, selecteert u de gegevens in het deelvenster Gegevensnavigatie , klikt u met de rechtermuisknop op de gegevens en klikt u op Openen. Het tabblad Onderzoek wordt automatisch geopend voor verdere analyse. Klik in het deelvenster Gegevensbeheer op RI-tomogram.
    2. Selecteer in het deelvenster Volumevisualisatie de optie RI en teken vier rechthoekige kleurvakken in het RI-canvas.
      OPMERKING: Met elk kleurvak kunt u op het tomogram dat op het beeldscherm wordt weergegeven, een specifieke kleur koppelen aan celcomponenten die worden gekenmerkt door het RI-bereik dat wordt geïdentificeerd door het vak in het RI-canvas. Na het tekenen van elk kleurvak verschijnt de gerelateerde informatie automatisch in de tabel onder het RI-canvas.
    3. Stel in het deelvenster onder het RI-canvas de minimum- en maximumwaarden van het RI-bereik in voor elk kleurvak (d.w.z. eerste kleurvak: MinRI = 1,3450 en MaxRI = 1,3499, tweede kleurvak: MinRI = 1,3506 en MaxRI = 1,3571, derde kleurvak: MinRI = 1,3586 en MaxRI = 1,3650, vierde kleurvak: MinRI = 1,3688 en MaxRI = 1,3866). Koppel een dekkingswaarde en een kleur (door te dubbelklikken op elk vak en een kleur te selecteren) aan elk vak. Dit maakt de visualisatie van de tomogrammen mogelijk volgens de 3D RI-verdelingen.
    4. Klik op Opslaan om de gedefinieerde RI-bereiken en kleurvakken op te slaan.
      OPMERKING: De RI-bereiken moeten worden aangepast afhankelijk van de specifieke monsters.
    5. Gebruik de analyse-interface om kwantitatieve descriptoren van celmorfologie te verkrijgen (d.w.z. volume [V], oppervlakte [S], geprojecteerd gebied [A], gemiddelde RI, dichtheid [D], droge massa [DM] en bolvorm [Φ]).
      OPMERKING: Details over de theoretische berekening van de kwantitatieve parameters zijn hierte vinden 2,23.
      1. Klik op de werkbalk op Analyse. Selecteer in het deelvenster Analyse aan de rechterkant de optie Handmatig in het deelvenster Segmentatie en stel 1,3450 in als RI-drempel. Klik vervolgens op Toepassen.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de waarden van de RII (fl/pg) en Baseline RI respectievelijk 0,19 (de brekingstoename, die algemeen is vastgesteld door eerdere onderzoeken24) en 1,3370 (RI van PBS gebruikt voor RI van PBS-achtergrondkalibratie) zijn. De beeldvormingssoftware voert een volumetrische segmentatie van de doelcel uit volgens de ingestelde RI-drempel en berekent de morfologische indexen (V, S, A, gemiddelde RI, D, DM en Φ) en rapporteert deze in een uitvoertabel in het meetpaneel .
      2. Klik op Opslaan om de berekende morfologische indexen op te slaan.
        OPMERKING: Naast de gebruikte software kunnen verschillende open-source tools worden gebruikt voor het kwantificeren van morfologische kenmerken uit TPM-gegevens. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) biedt tools voor beeldanalyse, waaronder segmentatie en functie-extractie, die compatibel zijn met fasecontrastbeelden. Fiji (https://fiji.sc/) is een open-source software met plug-ins voor segmentatie en de berekening van morfologische parameters25. Napari (https://napari.org/) is een multidimensionale beeldviewer met ondersteuning voor het integreren van machine learning-modellen voor segmentatie en analyse. Ilastik (https://www.ilastik.org/) biedt segmentatietools op basis van machine learning en DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) integreert deep learning-modellen met ImageJ/Fiji voor geavanceerde analyse. Daarnaast biedt MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) tools voor 2D en 3D morfologische operaties in Fiji. Cellpose326 is een andere op deep learning gebaseerde tool voor celsegmentatie die kan worden toegepast op fasecontrastbeeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We beschreven een workflow voor de labelvrije morfochemische karakterisering van levende cellen op basis van confocale RS en TPM. We hebben het vermogen van de voorgestelde workflow getest om de moleculaire samenstelling en morfologische parameters van de menselijke borstkankercellijn MDA-MB-231 te bereiken (Figuur 1).

MDA-MB-231-cellen werden gezaaid op petrischalen met kwartsglasbodem. Een op maat gemaakte confocale Raman-micros...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteerden een multimodale aanpak en een eenvoudige analysepijplijn waarin twee geavanceerde, labelvrije beeldvormingstechnieken werden geïntegreerd: RS en TPM. De beschreven workflow maakte snelle, niet-invasieve morfochemische fenotypering van levende menselijke borstkankercellen (MDA-MB-231) mogelijk zonder de noodzaak van externe labeling.

RS is een niet-destructieve techniek die het mogelijk maakt om de biochemische samenstelling van biologische mon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Progetto Rocca van de stichting MIT-Italië, NIH-subsidies (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Seoul, Zuid-Korea) en het National Cancer Center, Korea (NCC-24H1170). Leonardo Bianchi erkent de toekenning van een Progetto Rocca Post-doctoral Fellowship om gezamenlijk onderzoek te doen aan het Massachusetts Institute of Technology en Politecnico di Milano.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CCD cameraPrinceton InstrumentsPIXIS 100BR eXcelonDetector voor Raman-verstrooiingssignaal.
CCD camera besturingssoftwarePrinceton InstrumentsLightField
Continuous-wave Ti-Saffier laser (golflengte: 785 nm)Spectra-Physics3900 SHet wordt gebruikt voor Raman-microscopie-excitatie.
Dichroüsch spiegelThorLabsDMSP750B749-nm dichroüsch spiegel, leidt 785-nm Raman-excitatie naar monster, filtert fluorescentie- en brightfield-signalen.
Fetaal bovien serumThermo Fisher ScientificA5256701
Fluorescentiemicroscoop bodyOlympusIX83
Laser (golflengte: 532 nm)Spectra-PhysicsMillennia eVPomplaser voor 785-nm Ti-Saffier lasersysteem.
MATLAB softwareMathWorks2023a
MDA-MB-231 cellijnATCCHTB-26
NIR spectrograafAndorHolospec HS-HSG-785-LFHet wordt gebruikt voor spectrale analyse van terugverstrooid licht.
Objectieflens (60× 1,2 NA water-immersie)OlympusUPLSAPO60×
Onstage incubatiekamerTokai Hitstxg-welsx-set
Open-source microscoopbesturingssoftwareµManagerMicro-Manager-2.0
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Fenoolvrij DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21041025
Fosfaat gebufferde zoutoplossingGibco10-010-023
Kwartsglas bodem Petri schotelsWaken B TechSF-S-D12
Raman data-analysesoftwareRamAppWeb-gebaseerde tool voor Raman hyperspectrale dataverwerking.
sCMOS cameraHamamatsu PhotonicsOrca Flash 4.0 v2
SpuitpompChemyxFusion 720
Tomografische fasemicroscoopTomocube, Inc.HT-2HCommercieel systeem voor het verkrijgen van kwantitatieve fasebeelden.
TPM data-analysesoftwareTomocube, Inc.TomoStudioSoftware gebruikt voor het analyseren van tomografische fasemicroscopie (TPM) gegevens.

Referenties

  1. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
  2. Bresci, A., et al. Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography. Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).
  3. Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy. Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).
  4. Vicar, T., et al. Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison. BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).
  5. Kang, J. W., et al. Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).
  6. Pandey, R., et al. Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells. J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).
  7. Zhao, W., Sun, D., Yue, S. Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures. Front Phys. 10, 1100090(2023).
  8. Hanna, K., et al. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).
  9. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  10. Puppels, G. J., et al. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).
  11. Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing. Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).
  12. Chandra, A., et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research. ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).
  13. Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. Quantitative phase imaging trends in biomedical applications. Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).
  14. Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).
  15. Kuś, A., et al. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).
  16. Memmolo, P., et al. Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors. Intell Comput. 2, 0010(2023).
  17. Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited]. JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).
  18. Pirone, D., et al. Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry. Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).
  19. Bresci, A., et al. Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells. Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).
  20. Ghislanzoni, S., et al. Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells. Biosensors. 13 (11), 973(2023).
  21. Bischof, J., et al. Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers. npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).
  22. Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA. Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).
  23. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  24. Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).
  27. Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).
  28. Hobro, A. J., et al. Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES. Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).
  29. Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  30. Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).
  31. Park, C., Shin, S., Park, Y. Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths. JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).
  32. Bresci, A., et al. Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy. Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).
  33. Baczewska, M., et al. Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy. Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).
  34. Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).
  35. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).
  36. Allakhverdiev, E. S., et al. Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research. Cells. 11 (3), 386(2022).
  37. Xu, J., et al. Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing. Cancers. 13 (7), 1718(2021).
  38. Swain, R. J., et al. Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping. Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).
  39. Smith, R., Wright, K., Ashton, L. Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies. Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).
  40. Du, J., et al. Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells. Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).
  41. Jones, R. R., et al. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).
  42. Shirokova, O., et al. Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain. Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).
  43. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  44. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  45. Jung, J., et al. Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography. Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).
  46. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Raman microspectroscopietomografische fasemicroscopielabelvrije beeldvormingmorfo chemische fenotyperinghyperspectrale Raman beeldvormingbrekingsindextomografieanalyse van celmorfologiesubcellulaire mapping

Gerelateerde artikelen