Method Article

Op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een protocol voor een high-throughput kloonmethode, CRISPR-gebaseerde shuttle-klonen (CRISPRshuttle-klonen), die de overdracht van interessante DNA-fragmenten tussen vectoren mogelijk maakt zonder de noodzaak van PCR-amplificatie van de DNA-fragmenten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van genoombrede plasmidebibliotheken met behulp van bestaande genomische repositories dient als een cruciale voorwaarde voor systematische functionele karakterisering van genen in diverse biologische processen. De huidige high-throughput-methodologieën voor de overdracht van intervector-DNA-fragmenten vereisen echter PCR-amplificatie van doelsequenties voorafgaand aan het klonen, waardoor het genereren van plasmidecollecties op genoomschaal technisch veeleisend en tijdrovend wordt. Door gebruik te maken van een CRISPRshuttle-cassette hebben we een nieuwe high-throughput kloonmethode ontwikkeld, CRISPR-gebaseerde shuttle-klonen (CRISPRshuttle-klonen), die de overdracht van veel DNA-fragmenten van donorplasmiden die identieke backbone-sequenties delen naar een CRISPRshuttle-compatibele vector vergemakkelijkt zonder PCR-amplificatie van de DNA-fragmenten. Hier presenteren we een protocol voor CRISPRshuttle. Dit protocol omvat twee opeenvolgende reageerbuisreacties voorafgaand aan bacteriële transformatie. Eerst worden doel-DNA-fragmenten uit donorplasmiden gesneden door Cas9-gemedieerde splitsing van hun gedeelde vectorruggengraatsequentie. Ten tweede worden de uitgesneden DNA-fragmenten ingevoegd in gelineariseerde CRISPRshuttle-compatibele vectoren door middel van Gibson-assemblage. Onze resultaten tonen aan dat de efficiëntie van CRISPRshuttle meer dan 94% bedraagt en dat twee onderzoekers met CRISPRshuttle in 7 dagen ongeveer 300 plasmiden kunnen genereren. CRISPRshuttle vergemakkelijkt de efficiënte, aanpasbare en kosteneffectieve overdracht van DNA-fragmenten tussen vectoren, waardoor het genereren van genoombrede plasmidebibliotheken aanzienlijk wordt gestroomlijnd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het samenstellen van genoombrede plasmidebibliotheken uit beschikbare bronnen is de basis en voorwaarde voor het gebruik van functionele genomica om biologische processen te ontleden. De huidige kloonmethoden met hoge doorvoer, waaronder Gateway-, In-Fusion-, Creator- en Univector-kloonsystemen, vereisen PCR-amplificatie van doel-DNA-fragmenten 1,2,3,4,5. Deze voorwaarde omvat fragmentspecifieke verwerkingsworkflows die meerdere gestandaardiseerde bewerkingen omvatten, incl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bepaling van de optimale Cas9/sgRNA-splitsingsplaatsen aan weerszijden van cDNA/ORF

  1. Bereiding van cDNA/ORF-plasmiden
    1. Verkrijg cDNA/ORF-klonen uit openbare repositories.
      OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de pLX304 vectorgebaseerde ORF-klonen uit de menselijke CCSB-brede lentivirale expressiebibliotheek8.
    2. Isoleer plasmide met behulp van een plasmide-miniprep-kit en meet de concentratie met een spectrofotometer.
  2. sgRNA-ontwerp
    1. Ga naar de website van CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Plak het 20-100 bp-gebied van....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben CRISPRshuttle gebruikt om een UAS-cDNA/ORF-plasmidecollectie op te bouwen die 1.397 menselijke genen omvat die geconserveerd zijn in Drosophila7. Uit restrictieanalyse bleek dat CRISPRshuttle een efficiëntie van 94,5% bereikt voor het gebruik van CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvectoren die twee repetitieve sequenties bevatten en 96,1% voor het gebruik van bestemmingsvectoren zonder repetitieve sequenties7. Onze gege.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een cruciale stap in het CRISPRshuttle-protocol is de voorbereiding van gelineariseerde CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvectoren. Om een volledige spijsvertering te garanderen, gebruikt u een overmaat aan restrictie-enzymen om de vectoren te verteren, en gelzuivering van de verteerde vectoren wordt sterk aanbevolen. Een andere cruciale stap is de vertering van cDNA/ORF-plasmiden met Cas9. Als de constructie van het plasmide mislukt, gebruik dan agarosegelelektroforese om te controle.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (32071135) en een startfonds van het Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China. We zijn Prof. Feng Zhang dankbaar voor het vriendelijk verstrekken van het pX330-plasmide en Dr. Xiaohui Cai voor technische assistentie.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar PowderChembaseKBS-001H
AgaroseSangonA600014-0100
Automated Digital Gel Image Analysis SystemTanonTanon-2500B
ChloramphenicolSangonA100230-0010
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmegaD2500-02
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmegaD6942-02
EcoRI-HFNEBR3101S
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis KitNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621X
PCR Thermal CyclerLongGeneT20
Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Scientific12361010
PvuII-HFNEBR3151L
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Shaking IncubatorZhichuZQLY-180V
SpectrophotometerShimadzuBioSpec-nano
T4 DNA ligasePromegaM1801
Trans 10 Chemically Competent CellTransGenCD101-02
TryptoneOxoidLP0042
XbaINEBR0145S
Yeast ExtractOxoidLP0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from th....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

Related Articles