Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68503

⸱

13 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor een high-throughput kloonmethode, CRISPR-gebaseerde shuttle-klonen (CRISPRshuttle-klonen), die de overdracht van interessante DNA-fragmenten tussen vectoren mogelijk maakt zonder de noodzaak van PCR-amplificatie van de DNA-fragmenten.

Samenvatting

De ontwikkeling van genoombrede plasmidebibliotheken met behulp van bestaande genomische repositories dient als een cruciale voorwaarde voor systematische functionele karakterisering van genen in diverse biologische processen. De huidige high-throughput-methodologieën voor de overdracht van intervector-DNA-fragmenten vereisen echter PCR-amplificatie van doelsequenties voorafgaand aan het klonen, waardoor het genereren van plasmidecollecties op genoomschaal technisch veeleisend en tijdrovend wordt. Door gebruik te maken van een CRISPRshuttle-cassette hebben we een nieuwe high-throughput kloonmethode ontwikkeld, CRISPR-gebaseerde shuttle-klonen (CRISPRshuttle-klonen), die de overdracht van veel DNA-fragmenten van donorplasmiden die identieke backbone-sequenties delen naar een CRISPRshuttle-compatibele vector vergemakkelijkt zonder PCR-amplificatie van de DNA-fragmenten. Hier presenteren we een protocol voor CRISPRshuttle. Dit protocol omvat twee opeenvolgende reageerbuisreacties voorafgaand aan bacteriële transformatie. Eerst worden doel-DNA-fragmenten uit donorplasmiden gesneden door Cas9-gemedieerde splitsing van hun gedeelde vectorruggengraatsequentie. Ten tweede worden de uitgesneden DNA-fragmenten ingevoegd in gelineariseerde CRISPRshuttle-compatibele vectoren door middel van Gibson-assemblage. Onze resultaten tonen aan dat de efficiëntie van CRISPRshuttle meer dan 94% bedraagt en dat twee onderzoekers met CRISPRshuttle in 7 dagen ongeveer 300 plasmiden kunnen genereren. CRISPRshuttle vergemakkelijkt de efficiënte, aanpasbare en kosteneffectieve overdracht van DNA-fragmenten tussen vectoren, waardoor het genereren van genoombrede plasmidebibliotheken aanzienlijk wordt gestroomlijnd.

Inleiding

Het samenstellen van genoombrede plasmidebibliotheken uit beschikbare bronnen is de basis en voorwaarde voor het gebruik van functionele genomica om biologische processen te ontleden. De huidige kloonmethoden met hoge doorvoer, waaronder Gateway-, In-Fusion-, Creator- en Univector-kloonsystemen, vereisen PCR-amplificatie van doel-DNA-fragmenten 1,2,3,4,5. Deze voorwaarde omvat fragmentspecifieke verwerkingsworkflows die meerdere gestandaardiseerde bewerkingen omvatten, inclusief maar niet beperkt tot het ontwerp van oligonucleotideprimers, gelzuivering en sequentievalidatie door middel van sequencing. Als gevolg hiervan is het construeren van genoombrede plasmidebibliotheken (bijv. cDNA/ORF-overexpressiebibliotheken) arbeidsintensief en tijdrovend geworden, wat de vooruitgang van functionele genomica belemmert.

Eerder hebben we CRISPRmass ontwikkeld, een high-throughput kloonmethode die is ontworpen om specifieke DNA-fragmenten (bijv. de UAS-module) te integreren in meerdere plasmiden die identieke vectorruggengraat delen6. Met behulp van CRISPRmass hebben we meer dan 5.500 GAL4/UAS-gebaseerde UAS-cDNA/ORF-plasmiden geconstrueerd uit een Drosophila cDNA/ORF-bibliotheek, de Drosophila Genomics Resource center (DGRC) Gold Collection6. CRISPRmass mist echter de mogelijkheid om DNA-fragmenten tussen vectoren over te dragen, waardoor de toepassing ervan bij high-throughput klonen wordt beperkt.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen (CRISPRshuttle) ontwikkeld, een nieuwe high-throughput-methode die de overdracht van meerdere doel-DNA-fragmenten naar bestemmingsvectoren van donorplasmiden mogelijk maakt7. Dit proces vereist slechts twee opeenvolgende reageerbuisreacties, waardoor de vereiste voor fragmentspecifieke behandeling van discrete DNA-doelen wordt omzeild7.

Het CRISPRshuttle-protocol omvat twee opeenvolgende reageerbuisreacties (Figuur 1). Eerst worden gedeelde vectorruggengraatsequenties van donorplasmiden gesplitst door Cas9/sgRNA om doel-DNA-fragmenten vrij te maken. Deze fragmenten worden vervolgens via Gibson-assemblage overgebracht naar de CRISPRshuttle-cassette van een CRISPRshuttle-compatibele vector om de uiteindelijke plasmiden te genereren. Een CRISPRshuttle-cassette bestaat uit een ~20-40 bp vector-backbone-sequentie die de 5'- en 3'-uiteinden van de DNA-fragmenten flankeert die afkomstig zijn van donorplasmiden, en een of twee unieke restrictie-enzymherkenningsplaatsen die zich tussen deze flankerende sequenties bevinden. Een CRISPRshuttle-compatibele vector wordt geconstrueerd door een CRISPRshuttle-cassette in een bestemmingsvector te plaatsen, die vervolgens wordt gelineariseerd door de restrictieplaatsen in de cassette te verteren. De bestemmingsvector moet drager zijn van een antibioticaresistentiegen dat verschilt van dat in donorplasmiden; Als het gen identiek is, moet het vóór gebruik worden vervangen door een afzonderlijk gen.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat gebruikmaakt van CRISPRshuttle om een UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek te bouwen. Dit proces omvat het overbrengen van menselijke ORF's van de CCSB-Broad Lentiviral Expression Library naar de Drosophila-transgenesevector pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle stroomlijnt de constructie van genoombrede plasmidebibliotheken en faciliteert zo functionele genomics-studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bepaling van de optimale Cas9/sgRNA-splitsingsplaatsen aan weerszijden van cDNA/ORF

  1. Bereiding van cDNA/ORF-plasmiden
    1. Verkrijg cDNA/ORF-klonen uit openbare repositories.
      OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de pLX304 vectorgebaseerde ORF-klonen uit de menselijke CCSB-brede lentivirale expressiebibliotheek8.
    2. Isoleer plasmide met behulp van een plasmide-miniprep-kit en meet de concentratie met een spectrofotometer.
  2. sgRNA-ontwerp
    1. Ga naar de website van CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Plak het 20-100 bp-gebied van de pLX304-vectorruggengraat die het ORF 3'-uiteinde flankeert in het doelveld.
    2. Selecteer Drosophila melanogaster als de soort en klik op Doellocaties zoeken. Selecteer sgRNA-kandidaten waarvan wordt voorspeld dat ze een efficiëntie van meer dan 80% hebben.
  3. sgRNA-preparaat
    1. Synthese van een voorwaartse primer (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3") waarbij (N)20 de sgRNA-doelsequentie vertegenwoordigt, en een omgekeerde primer sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3").
      OPMERKING: PAGE-gezuiverde primers worden aanbevolen.
    2. Genereer een DNA-sjabloon voor sgRNA in vitro transcriptie (IVT) via PCR. Bereid een reactie van 100 μl voor met elk 5 μl van sjabloon pX330 (Addgene plasmide 42230; 0,1 ng/μl), voorwaartse primer (10 μM) en sgRNA-REV-primer (10 μM); 50 μL 2x high-fidelity PCR mastermix; en 35 μL diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld ultrapuur water.
    3. Amplificeren in een PCR Thermal Cycler met behulp van het volgende programma: 98 °C gedurende 30 s; 5 cycli van 98 °C gedurende 8 s, 52 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 5 s; 30 cycli van 98 °C gedurende 8 s, 72 °C gedurende 20 s; 72 °C gedurende 2 min.
    4. Los PCR-producten op met een 0,8% agarosegel. Snijd de ~120-bp-band weg en zuiver deze met behulp van een gelextractiekit.
    5. Bereid een IVT-reactie van 10 μL voor met 300 ng gezuiverd DNA-fragment, 3,33 μL NTP-buffermix, 0,67 μL T7 RNA-polymerasemix en DEPC-behandeld ultrapuur water. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
    6. Kwantificeer ongezuiverd sgRNA door spectrofotometrie, verdun tot 20 ng/μL met DEPC-behandeld ultrapuur water en vries in bij -80 °C in kleine aliquots.
      OPMERKING: DNase-behandeling is niet nodig, omdat rest-DNA de stroomafwaartse reacties niet verstoort.
  4. sgRNA-evaluatie
    1. Verteer een cDNA/ORF-plasmide dat de pLX304-vectorruggengraat bevat met behulp van een restrictie-enzym. Los de resulterende DNA-fragmenten op via 0,8% agarosegel. Zuiver het DNA-substraat met behulp van een gelextractiekit.
    2. Bereid een Cas9-splitsingsreactiemengsel van 5 μl voor dat 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng/μl sgRNA, 0,015 pmol DNA-substraat, 0,5 μl 10x Cas9 Buffer en DEPC-behandeld ultrapuur water bevat. Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Los de decolletéproducten op met 0,8% agarosegel. Neem het niet-gesplitste DNA-substraat op als negatieve controle.
    4. Visualiseer de splitsingspatronen met behulp van een digitaal beeldvormingssysteem en selecteer het sgRNA met minimaal resterend ongecleaved substraat voor volgende experimenten (Figuur 2).

2. Het antibioticaresistentiegen van de bestemmingsvector verwisselen

OPMERKING: In dit protocol gebruiken we het voorbeeld van het verwisselen van het ampicillineresistentiegen van de bestemmingsvector pBID-UASC met het chlooramfenicolresistentiegen, waardoor de chlooramfenicol-dragende bestemmingsvector pBIDC-UASC wordt gegenereerd.

  1. Verwijder het ampicillineresistentiegen uit pBID-UASC.
    OPMERKING: Het ampicillineresistentiegen van pBID-UASC werd verwijderd door Cas9-digestie in combinatie met twee sgRNA's, f1Ori5-G4 (doelsequentie: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') en Amp3-G2 (doelsequentie: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), wat resulteerde in een lineaire pBID-UASC vectorruggengraat van 7.687 bp. Deze twee sgRNA's richten zich respectievelijk op de 5' stroomopwaarts en 3' stroomafwaarts van het ampicillineresistentiegen.
    1. Bereid een splitsingsreactie van 10 μl voor met 0,03 pmol pBID-UASC, 0,25 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 20 ng f1Ori5-G4, 20 ng Amp3-G2, 1 μl 10x Cas9 Buffer en DEPC-behandeld ultrapuur water. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Het Cas9-gesplitste plasmide, zonder zuivering, wordt direct onderworpen aan Gibson-assemblage.
  2. PCR-amplificeren van het chlooramfenicolresistentiegen.
    OPMERKING: Een 840 bp chlooramfenicolresistentiegen werd geamplificeerd uit het plasmide pMartini-Cam6 door middel van PCR met behulp van de f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3') en Amp3-CAM-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') primers.
    1. Bereid het chlooramfenicolresistentiegen voor door PCR-amplificatie van het 840 bp chlooramfenicolresistentiegen. Zet een PCR-reactie van 20 μl op met 2 μl pMartini-Cam (0,1 ng/μl), 1 μl f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μl Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μl 5x buffer, 0,4 μl dNTP's (10 mM), 0,4 μl high-fidelity DNA-polymerase (2,5 eenheden/μl), 11,2 μl ultrapuur water.
    2. Voer PCR uit onder de volgende thermocycle-omstandigheden: 1 cyclus van 95 °C gedurende 1 minuut; 5 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 46 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 20 s; 30 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 61 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 20 s; 1 cyclus van 72 °C gedurende 2 min. Voer de reactie uit in een thermische cycler.
    3. Los de splitsingsproducten op met 0,8% agarosegel en zuiver een DNA-fragment van 840 bp met behulp van een gelextractiekit.
  3. Plaats het chlooramfenicolresistentiegen in de gelineariseerde pBID-UASC vectorruggengraat, wat resulteert in pBIDC-UASC.
    1. Voer een Gibson-assemblagereactie van 2 μL uit: 0,008 pmol van 840 bp chlooramfenicolresistentiegen, 0,002 pmol van de gelineariseerde pBID-UASC (stap 2.1.1), 1,0 μL 2x Gibson-assemblagemastermix. Voer de reactie uit bij 50 °C gedurende 1 uur.
    2. Transformeer 10 μL E . coli-competente cellen met 1 μL ligatiereactieproduct. Selecteer transformatoren op een LB-plaat aangevuld met 15 μg/ml chlooramfenicol.
    3. Kies een enkele kolonie en onderwerp deze aan een daaropvolgende bacteriecultuur en plasmide miniprep. Verifieer de chlooramfenicol-dragende bestemmingsvector pBIDC-UASC door middel van restrictieanalyse en DNA-sequencing.

3. Constructie van CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvector

OPMERKING: Een CRISPRshuttle-cassette bestaat uit ongeveer 20-40 bp vector-backbone-sequenties die zowel de 5'- als de 3'-uiteinden van doel-DNA-fragmenten flankeren, met een of twee unieke restrictieplaatsen ertussen.

  1. Gloeiende oligonucleotiden met behulp van een thermische cycler met het volgende programma: 94 °C gedurende 2 min; 70 cycli van 52 s bij (95-N) °C, waarbij N staat voor het cyclusgetal.
    LET OP: De gegloeide CRISPRshuttle cassette bevat 5'-overhangs die complementair zijn aan EcoRI en XbaI.
  2. Ligate de gegloeide CRISPRshuttle-cassette in EcoRI/XbaI-verteerde bestemmingsvector pBIDC-UASC om de CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvector pBIDC-UASC-pLXvect te genereren.
    OPMERKING: Deze ligatie elimineert de oorspronkelijke EcoRI- en XbaI-sites binnen de meerdere kloonsites, waardoor de EcoRI- en XhoI-sites in het midden van de CRISPRshuttle-cassette uniek zijn in de uiteindelijke vector. De unieke restrictieplaatsen in de CRISPRshuttle-cassette maken linearisatie van de CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvector mogelijk.
    1. Bereid een ligatiereactie van 5 μL voor met 14 ng 8.451 bp EcoRI/XbaI-verteerd pBIDC-UASC, 0,02 pmol van de gegloeide CRISPRshuttle-cassette, 0,5 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 0,3 μL T4 DNA-ligase. Incubeer de reactie een nacht bij 16 °C.
    2. Transformeer 10 μL E . coli-competente cellen met 1 μL van het ligatiereactieproduct. Selecteer transformatoren op een LB-plaat aangevuld met 15 μg/ml chlooramfenicol en incubeer een nacht bij 37 °C.
    3. Kies een enkele kolonie en onderwerp deze aan een daaropvolgende bacteriecultuur en plasmide miniprep. Controleer de CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvector pBIDC-UASC-pLXvect door middel van restrictieanalyse en DNA-sequencing.

4. Generatie van UAS-cDNA/ORF-plasmiden met behulp van CRISPRshuttle

OPMERKING: Het CRISPRshuttle-protocol omvat tweestaps reageerbuisreacties die parallel worden uitgevoerd vóór bacteriële transformatie (Figuur 1).

  1. Reageerbuisreactie stap 1
    1. Snijd ORF's weg uit pLX304-ORF-plasmiden door de vectorruggengraat te splitsen met Cas9 in combinatie met twee sgRNA's, pLX304-CMV-G16 (doelsequentie: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', gelokaliseerd in de pLX304-vectorruggengraat die het ORF 5'-uiteinde flankeert) en pLX304-3'-G1 (doelsequentie: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', gelokaliseerd in de pLX304-vectorruggengraat die het ORF 3'-uiteinde flankeert).
      1. Bereid een basismengsel voor een bepaald aantal (N) verteringsreacties als volgt: (N+1) x 0,4 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μL 80 ng/μL pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μL 80 ng/μL pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μL 10x Cas9 Buffer en (N+1) x 1,45 μL DEPC-behandeld ultrapuur water.
      2. Meng grondig en draai de mastermix naar beneden. 3,75 μL van het mastermengsel in elke buis. Voeg 0,75 μL 0,03 μM pLX304-ORF-plasmide toe aan elk buisje. Meng grondig en incubeer de reacties gedurende 1 uur bij 37 °C.
        OPMERKING: Verdun elk pLX304-ORF-plasmide tot een concentratie van 0,03 μM met DEPC-behandeld ultrapuur water. Als de concentratie lager is dan 0,03 μM, voeg dan plasmide-DNA rechtstreeks toe aan de reactie. De Cas9-gesplitste plasmiden hoeven niet te worden gezuiverd na splitsingsreacties en kunnen direct worden gebruikt voor de daaropvolgende Gibson-assemblage.
  2. Reageerbuisreactie stap 2
    1. Plaats de uitgesneden ORF's in de CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvector pBIDC-UASC-pLXvect via Gibson-assemblage, wat resulteert in UAS-cDNA/ORF-plasmiden.
      1. Verteer pBIDC-UASC-pLXvect met EcoRI en XbaI. Scheid de gelineariseerde pBIDC-UASC-pLXvect door agarosegelelektroforese en zuiver met behulp van een gelextractiekit.
      2. Bereid een mastermix voor een bepaald aantal (N) Gibson-assemblagereacties als volgt: (N+1) x 0,14 μL 3,36 μM gelineariseerde pBIDC-UASC-pLXvect, en (N+1) x 1,8 μL Gibson-assemblagemastermix.
      3. Meng grondig en draai de mastermix naar beneden. 1,94 μL van het mastermengsel in elke buis. Voeg 1,66 μL Cas9-gesplitst plasmide toe aan elke buis. Meng grondig en incubeer de reacties gedurende 1 uur bij 50 °C.
        OPMERKING: Houd het mastermengsel en de buizen voor incubatie op 50 °C.
  3. Transformeer E. coli met Gibson assemblageproducten.
    OPMERKING: De producten van de Gibson-assemblage hoeven niet te worden gezuiverd voorafgaand aan de transformatie van E. coli .
    1. Ontdooi bacterieel competente cellen op ijs. Hoeveelheid 10 μL cellen op elke voorgekoelde tube van 1,5 ml.
      OPMERKING: Competente bacteriële cellen met een transformatie-efficiëntie van ten minste 1 × 108 CFU/μg pUC19-DNA worden aanbevolen.
    2. Meng voorzichtig 10 μL competente cellen met 1 μL Gibson-assemblageproducten. Plaats 30 minuten op ijs.
    3. Heatshock bij 42 °C gedurende 1 minuut en koel vervolgens 2 minuten op ijs.
    4. Voeg 100 μL voorverwarmd SOC-medium (37 °C) toe aan elke buis. Schudden op 250 tpm gedurende 1 uur op 37 °C.
    5. Plaats cellen op LB-platen die 15 μg/ml chlooramfenicol bevatten. Incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het uitvoeren van deze procedures op grote schaal duurt doorgaans enkele uren. Tenzij anders vermeld, moeten zowel de reagentia als de reactieopstellingen in de ijskast worden bewaard.
  4. Verificatie van UAS-cDNA/ORF-plasmiden.
    1. Inoculeer een enkele kolonie in 4,5 ml LB-medium met 15 μg/ml chlooramfenicol. Schud 's nachts bij 250 tpm bij 37 °C.
    2. Isoleer plasmide-DNA met behulp van een plasmide mini-prep kit.
    3. Bereid een 20 μL restrictieve digestiereactie voor elk plasmide dat 300-500 ng plasmide-DNA, 0,3 μL PvuII, 2 μL 10x buffer en ultrapuur water bevat. Voer de reacties uit bij 37 °C gedurende 1 uur.
    4. Los DNA-fragmenten op door 0,8% agarosegel. Afbeelding onder UV-licht (Figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben CRISPRshuttle gebruikt om een UAS-cDNA/ORF-plasmidecollectie op te bouwen die 1.397 menselijke genen omvat die geconserveerd zijn in Drosophila7. Uit restrictieanalyse bleek dat CRISPRshuttle een efficiëntie van 94,5% bereikt voor het gebruik van CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvectoren die twee repetitieve sequenties bevatten en 96,1% voor het gebruik van bestemmingsvectoren zonder repetitieve sequenties7. Onze gege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een cruciale stap in het CRISPRshuttle-protocol is de voorbereiding van gelineariseerde CRISPRshuttle-compatibele bestemmingsvectoren. Om een volledige spijsvertering te garanderen, gebruikt u een overmaat aan restrictie-enzymen om de vectoren te verteren, en gelzuivering van de verteerde vectoren wordt sterk aanbevolen. Een andere cruciale stap is de vertering van cDNA/ORF-plasmiden met Cas9. Als de constructie van het plasmide mislukt, gebruik dan agarosegelelektroforese om te controle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (32071135) en een startfonds van het Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China. We zijn Prof. Feng Zhang dankbaar voor het vriendelijk verstrekken van het pX330-plasmide en Dr. Xiaohui Cai voor technische assistentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar PowderChembaseKBS-001H
AgaroseSangonA600014-0100
Automated Digital Gel Image Analysis SystemTanonTanon-2500B
ChloramfenicolSangonA100230-0010
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmegaD2500-02
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmegaD6942-02
EcoRI-HFNEBR3101S
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis KitNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621X
PCR Thermal CyclerLongGeneT20
Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Scientific12361010
PvuII-HFNEBR3151L
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Shaking IncubatorZhichuZQLY-180V
SpectrofotometerShimadzuBioSpec-nano
T4 DNA ligasePromegaM1801
Trans 10 Chemically Competent CellTransGenCD101-02
TryptoneOxoidLP0042
XbaINEBR0145S
Yeast ExtractOxoidLP0021

Referenties

  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).
  3. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  4. Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes. Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).
  5. Marsischky, G., Labaer, J. Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).
  6. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  7. Liu, X., et al. CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).
  8. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  9. Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila. PLoS One. 7 (7), e42102(2012).
  10. Christie, K. A., et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).
  11. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  12. Lei, C., et al. The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CRISPR-shuttlecloneringgenoombrede plasmidenbibliothekenDNA-fragmentoverdrachtCas9-gemedieerde splitsingGibson-assemblygeneratie van plasmidenbibliothekendonorplasmidenvectorbackbonefunctionele genomics
Op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.