Methodenartikel

In vivo Nabijheidsbiotinylering voor onderzoek naar eiwitinteractie in Paramecium tetraurelia

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

12 september 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol presenteert een methode voor in vivo covalente hechting van biotine aan eiwitten op basis van hun nabijheid tot een biotineligase die is gefuseerd met een interessant eiwit. Deze modificatie maakt een selectieve verrijking van de eiwitten mogelijk met behulp van streptavidinekorrels als dat nodig is in eiwitinteractiestudies.

Samenvatting

Paramecium is een belangrijk modelorganisme voor de studie van moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij geprogrammeerde genomische herschikkingen en transposoneliminatie tijdens meiotische reproductie. Veel details van dit proces blijven raadselachtig vanwege de complexiteit van de betrokken moleculaire machinerie en voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties. Hier presenteren we een methode voor tijdopgeloste labeling van eiwitten met biotine in de buurt van een interessant doeleiwit. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende doelen, aangezien de biotinylering wordt bereikt door injectie van een DNA dat codeert voor een doeleiwit dat is gefuseerd met een gemanipuleerd biotineligase. Het fusieconstruct wordt tot expressie gebracht door de promotor van het endogene gen, waardoor een stadiumspecifiek expressieprofiel mogelijk is dat vergelijkbaar is met dat van het natuurlijke eiwit. Met name de covalent gehechte biotinegroep maakt de selectieve verrijking van de gelabelde eiwitten mogelijk met behulp van met streptavidine beklede kralen. Bovendien tonen we met immunofluorescentiekleuring aan dat efficiënte etikettering suppletie van de cultuur met biotine vereist. De plug-and-play gemanipuleerde expressievector, gecombineerd met de efficiënte injectieprocedure die hier wordt gedemonstreerd, maakt het mogelijk om snel Paramecium-lijnen te genereren die een gemodificeerd eiwit tot expressie brengen. De hier gedemonstreerde biotinyleringsprocedure kan worden opgevolgd met massaspectrometrie voor de identificatie van de verrijkte eiwitten die de interagerende partners van het doeleiwit bevatten. Nabijheidsbiotinylering heeft het potentieel om de ontdekking van eiwit-eiwitinteracties in Paramecium te vereenvoudigen en te versnellen en de inspanningen op te voeren om de genoombewerkingsmachine te begrijpen.

Inleiding

Het trilhaarvormige eencellige organisme Paramecium tetraurelia herbergt twee verschillende soorten kernen: een kiembaankern voor de langdurige opslag van genetische informatie en een somatische kern voor de fysiologische functies van de cel1. Seksuele voortplanting in dit organisme vereist de vorming van een nieuw somatisch genoom. Dit proces omvat de onomkeerbare excisie van meer dan 45.000 DNA-fragmenten uit het somatische genoom2, waaronder transponeerbare elementen3 en andere herhalingen. Bijzonder opvallend is dat de excisiegebeurtenissen worden uitgevoerd met een nauwkeurigheid tot op het enkelvoudige basenpaar1. Deze nauwkeurigheid is biologisch noodzakelijk, aangezien de uitgesneden DNA-fragmenten eiwitcoderende regio's4 verstoren en elke defecte excisie frameshift-mutaties kan oproepen, voortijdige stopcodons kan veroorzaken of de eiwitcoderende sequentie kan veranderen. Een ingewikkeld RNA-vergelijkingsmechanisme stelt de cel in staat om de sequenties te differentiëren die nodig zijn in het nieuwe somatische genoom. Het wordt geïnitieerd met de transcriptie van het hele kiembaangenoom5, gevolgd door het bijsnijden tot een grootte van 25 bp6, transport naar het oude somatische genoom7, waar alle complementaire RNA's worden weggegooid8. De resterende sRNA's die geen complementaire sequenties hebben in het oude somatische genoom, worden verder getransporteerd naar het zich nieuw ontwikkelende somatische genoom, waar ze zich afstemmen op eventuele kiembaanbeperkte sequenties en hun excisie sturen9. Dit complexe proces in meerdere stappen vereist een nauwkeurig en tijdig samenspel van vele cellulaire componenten, en met name voorbijgaande zwakke interacties wanneer de kleine RNA's tussen de verschillende kernen passeren10,11. Eerder werden pogingen gedaan om de moleculaire mechanica van het proces te begrijpen met behulp van knockdown-experimenten om te bepalen of vermeende componenten essentieel zijn voor het proces, gevolgd door immunoprecipitatiebenaderingen om de interacties van essentiële eiwitten bloot te leggen 12,13,14. Hoewel deze methode nuttig is voor de detectie van sterke en continue binding die ook de niet-fysiologische omstandigheden tijdens de pulldown doorstaat, kan de detectie van zwakke en voorbijgaande interacties vervelende optimalisatie vereisen. Vanwege de potentieel voorbijgaande aard van veel interacties die betrokken zijn bij het genoombewerkingsproces, zouden in vivo-methoden de detectie van dergelijke interacties kunnen verbeteren. Bovendien kunnen sommige eiwitten niet efficiënt worden opgelost in extracellulaire omstandigheden15, wat een probleem is dat kan worden opgelost door in vivo op interactie gebaseerde eiwitmodificaties, zoals nabijheidslabeling met biotine.

Hier beschrijven we een nieuwe methode die een specifieke in vivo biotinylering mogelijk maakt van eiwitten die dicht bij het gewenste doeleiwit zijn gelokaliseerd. De covalente biotinemodificatie kan worden gebruikt voor efficiënte verrijking met behulp van op streptavidine gebaseerde pulldown-benaderingen. De ontwikkeling van deze methode werd bereikt door het biotineligase TurboID16 te gebruiken voor het uitvoeren van de eiwitinteractiestudies in Paramecium tetraurelia. Onze aanpak kan eenvoudig worden toegepast op elk doeleiwit volgens de stappen die in het protocol worden beschreven. Daarom biedt dit artikel een efficiënte en schaalbare strategie voor nabijheidsbiotinylering die kan worden gebruikt voor proteomische studies met hoge doorvoer in een prominent protozoaire modelorganisme.

Protocol

1. Algemene methoden

  1. Zorg voor buffers, reagentia en andere materialen zoals vermeld in tabel 1.
  2. Kweek monoklonale Paramecium-lijnen zoals eerder beschreven17. Kortom, breng één cel over naar een nieuwe depressieput die gebacterieerd licht medium bevat (0,8 μg/ml β-sitosterol) zodat de celdichtheid lager blijft dan 500 cellen/ml, om voortijdige start van de meiotische cyclus te voorkomen. Breng de cellen bij 50 celdelingen over naar een gebacteriëliseerde rijke mediumcultuur (met 0,8 μg/ml β-sitosterol) en laat staan totdat alle bacteriën zijn geconsumeerd, waardoor seksuele voortplanting (autogamie) wordt geïnduceerd18.
    OPMERKING: Na voltooiing van de seksuele voortplantingscyclus blijven de cellen in een niet-delende postautogame toestand totdat een nieuwe voedingsbron wordt verstrekt.
  3. Construeer fusie-eiwitten van de doelgenen door gebruik te maken van een vector die een codon-geoptimaliseerde 3x HA turboID-sequentie bevat met stroomopwaartse restrictie-enzymknipplaatsen.
    1. Voer PCR-amplificatie uit van het doelgen en zijn promotorgebied uit genomisch DNA, met behulp van primers die zijn ontworpen met overhangs die coderen voor geschikte restrictieplaatsen.
    2. Plaats het product met behulp van standaard restrictiedigestie in de in-frame compatibele snijplaatsen19 stroomopwaarts van de turboID-coderingsgebieden.
  4. Sequentie, verifieer en amplificeer het geconstrueerde plasmide-DNA in E.coli DH5α. Isoleer het plasmide met behulp van een plasmide-midiprep-kit en lineariseer 100 μg plasmide-DNA door restrictie-digestie.
  5. Zuiveren met fenol-chloroform-extractie en vervolgens filteren door een centrifugaalfilter12. Voer ethanolprecipitatie uit en los de DNA-pellet op in water om een concentratie van 5 mg/ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Het DNA kan in de somatische kernen van Paramecium-cellen worden ingebracht met behulp van de volgende micro-injectieprocedure.

2. Micro-injectie in de somatische kern (MAC)

  1. Breng een cel van de postautogame cultuur verkregen in stap 1.2 over naar een vers depressieglaasje met gebacterieerd licht medium met 0,8 μg/ml β-sitosterol. Incubeer gedurende twee dagen voorafgaand aan de injectie bij 27 °C om de cellen te herstellen.
  2. Gebruik een stereomicroscoop om de cellen van de herstelde cultuur over te brengen naar een vers geprepareerd depressieglaasje gevuld met het wasmedium.
  3. Terwijl de cellen zich in het wasmedium bevinden, voegt u 20 μL ddH2O toe op een glasplaatje en bedekt u dit met een afdekglas.
  4. Voeg 200 μL minerale olie toe aan de bovenkant van het dekglas.
  5. Breng vervolgens de afzonderlijke gewassen cellen als druppels onder de minerale olie over met zo min mogelijk vloeistofvolume. Plaats maximaal 20 bubbels met een enkele cel per objectglaasje en plaats vervolgens het voorbereide objectglaasje op het voetstuk van de injectiemicroscoop.
  6. Bevestig de aspiratienaald en beweeg deze op zijn plaats, start vervolgens de robotarm en de injectiemachine.
  7. Voeg met behulp van een microloaderpipetpunt 2-3 μl van de in stap 1.5 bereide DNA-oplossing toe aan de injectienaald. Bevestig de naald aan de robotarm en beweeg deze in positie, sluit deze vervolgens aan op het drukventiel van de injectiemachine.
  8. Gebruik de robotarm om de injectienaald in een lege waterdruppel op de glijbaan te plaatsen. Druk vervolgens op Schoon om de resterende lucht in de injectienaald te verwijderen totdat de DNA-stroom is waargenomen.
  9. Ga verder met een druppel die een cel bevat en laat vervolgens de aspiratienaald zakken. Verwijder voorzichtig de vloeistof (water) uit deze druppel totdat de cel geïmmobiliseerd is.
  10. Til de aspiratienaald op, laat de injectienaald zakken en schakel vervolgens over op een hogere vergroting.
  11. Zorg ervoor dat de somatische kern (MAC) nu zichtbaar is als een donkerder gebied zonder voedselvacuolen (zie figuur 1c) waarin de injectienaald moet worden ingebracht.
  12. Probeer de MAC volledig binnen te dringen met de injectienaald en trek de naald langzaam terug gedurende enkele seconden.
    OPMERKING: Wanneer de naald zich in de MAC bevindt, zal het DNA in de MAC stromen vanwege de constante luchtdruk die door de injectiemachine wordt uitgeoefend. Een diffuse vacuole bestaande uit het geïnjecteerde DNA zou zichtbaar kunnen worden binnen de grenzen van de MAC.
    OPMERKING: Het is mogelijk om dezelfde cel meerdere keren te injecteren om een succesvolle injectie te garanderen.
  13. Nadat de celinjectie is voltooid, laat u de aspiratienaald met het opgezogen water zakken in stap 2.9. Keer de stroom om om voldoende water terug te voeren naar de druppel totdat de cel weer begint te bewegen.
  14. Ga door totdat alle druppels die een cel bevatten zijn verwerkt.
  15. Win elke geïnjecteerde cel terug door de druppeltjes van het objectglaasje te verzamelen en elk van hen over te brengen naar een afzonderlijk putje gevuld met gebacterieerd licht medium, met 0,8 μg/ml β-sitosterol.
  16. Incubeer een nacht bij 27 °C, breng een enkele cel van elke put over naar een nieuwe put en houd de oorspronkelijke put op 18 °C als back-up.
  17. Kweek de overgebrachte cellen gedurende 1 dag een nacht bij 27 °C en breng vervolgens 5 cellen van elke monoklonale put over in een PCR-buisje. Gebruik constructspecifieke primers voor de amplificatie om de aanwezigheid van het geïnjecteerde DNA in de cellen te verifiëren.

3. Immunofluorescentiekleuring voor verificatie van de juiste eiwitlokalisatie en biotineligasefunctie

  1. Kweek de geselecteerde PCR-positieve klonen in 20 ml bacterieel medium met 0,8 μg/ml β-sitosterol.
  2. Nadat het medium minder troebel is geworden, verzamelt u een monster van 50 μL uit de cultuur. Voeg 1 μl DAPI-oplossing (0,1 mg/ml) en 1 μl EDTA (0,5 mM) toe voor DNA-kleuring om te controleren of autogamie is begonnen.
    OPMERKING: Autogamie begint meestal bij een celdichtheid van 2.000 cellen/ml.
  3. Als biotinylering gewenst is, vul het kweekmedium dan aan met biotine tot een eindconcentratie van 500 μM gedurende ten minste 1 uur voordat de cellen worden geoogst.
  4. Oogst de cellen in het juiste ontwikkelingsstadium met behulp van een oliemeetcentrifuge die is uitgerust met peervormige buisjes van 280 x g gedurende 2 minuten. Gooi het kweekmedium weg en voeg PBS toe aan de buisjes, centrifugeer opnieuw en verwijder de PBS.
  5. Resuspendeer de celpellet in PBS en breng over naar een doorzichtige microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  6. Bereid een PFA-verdunning van 3,7% in PBS voor uit de 37% voorraadoplossing.
  7. Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml 3,7% PFA en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een buisrotator.
  8. Centrifugeer op 600 x g gedurende 1 min tot er een zichtbare pellet ontstaat. Gooi de PFA-oplossing weg in de daarvoor bestemde container voor speciaal afval.
  9. Resuspendeer de pellet in 1 ml 50 mM Glycine in PBS. Incubeer gedurende 5-10 minuten op een buisrotator.
  10. Centrifugeren op 600 x g gedurende 1 min. Verwijder het bovenstaande en voeg 0,8 ml 1x PBS toe. Eventueel nog een keer wassen met PBS.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen de cellen indien nodig bij 4 °C worden bewaard.
  11. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 600 x g , verwijder de PBS en voeg 500 μl 0,5 % Triton X-100 in PBS toe. Incubeer gedurende 20 minuten op een buisrotator.
  12. Centrifugeer tot de pellet zichtbaar wordt (1.000 x g gedurende 2 min), verwijder de Triton X-100-oplossing en suspendeer de cellen opnieuw in PBS.
  13. Bereid een 5% BSA-oplossing in PBS volgens het vereiste antilichaamvolume.
  14. Verwijder de PBS-wash uit de cellen en voeg 100 μL van het primaire antilichaam verdund in 5% BSA in PBS toe aan de cellen. Pas de incubatietijd aan op basis van het gebruikte antilichaam.
    OPMERKING: Incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur is voldoende voor de meeste antilichamen.
  15. Centrifugeer bij 600 x g, verwijder de primaire antilichaamverdunning en spoel de cellen met 500 μL PBS.
  16. Voeg 100 μL van het secundaire antilichaam verdund in 5% BSA in PBS toe. Pas de incubatietijd aan; Over het algemeen is 1 uur bij kamertemperatuur voldoende. Dek de buis af met aluminiumfolie om de fluorofoor tegen licht te beschermen.
  17. Voeg 1 μL DAPI-oplossing (0,1 mg/ml) toe tijdens de laatste 10 minuten van de incubatie met het secundaire antilichaam.
  18. Centrifugeer op 600 x g gedurende 1 min, verwijder de vlekkenoplossing en was tweemaal met PBS. Laat 20 μL van de tweede wasbeurt in de tube zitten en suspendeer de cellen opnieuw.
  19. Monteer 10 μL op een objectglaasje voor inspectie onder een microscoop.

4. Selectieve verrijking van gebiotinyleerde eiwitten

  1. Oogst 1 x 106 cellen in het juiste ontwikkelingsstadium zoals beschreven onder 3.4.
  2. Resuspendeer de pellet in 3 ml lysisbuffer.
  3. Breng over naar een dounce-homogenisator en lyseer de cellen met 100 stamperslagen.
  4. Breng het lysaat over in twee microcentrifugebuisjes en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 21.000 x g bij 4 °C.
  5. Breng met streptavidine beklede magnetische kralen in evenwicht door 20 μl (per monster) van puls-vortex geresuspendeerde kralenslurry te mengen met 1 ml lysisbuffer in een microcentrifugebuis en gedurende 2 minuten te incuberen.
  6. Verwijder de lysisbuffer van de kralen met behulp van een magnetische standaard en suspendeer deze opnieuw in de lysisbuffer.
  7. Herhaal stap 4.6.
  8. Verwijder de lysisbuffer en meng de gebalanceerde korrels met het bovenstaande (geklaard lysaat) uit stap 4.4.
    OPMERKING: De optimale zoutconcentraties en het percentage wasmiddelen voor binding aan de korrels kunnen verschillen en moeten experimenteel worden gevalideerd. Bovendien is het mogelijk om de pellet te incuberen van 4,4 in 50 μL 2% SDS gedurende 10 minuten bij 60 °C om eiwitten uit de onoplosbare fractie te extraheren, gevolgd door centrifugatie bij 21.000 x g gedurende 10 minuten. Voeg dit extract toe aan het geklaarde lysaat en de korrels.
  9. Incubeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur op een buisrotator.
  10. Centrifugeer kort (<1s) de buis om alle vloeistof naar de bodem van de buis te herstellen, verzamel de kralen op een magnetische standaard en vervang vervolgens het bovenstaande (doorstroom) door wasbuffer 1.
  11. Incubeer gedurende 5 minuten op een buisrotator en herhaal dan zoals in stap 4.10 voor een tweede wasbeurt.
  12. Vervang wasbuffer 1 door wasbuffer 2 voor twee extra wasbeurten (was 3 en 4).
  13. Vervang wasbuffer 2 door wasbuffer 3 voor twee laatste wasbeurten (was 5 en 6).
  14. Bewaar de parels na het verwijderen van de laatste was bij -20 °C voordat u ze stroomafwaarts verwerkt.
    OPMERKING: De kralen kunnen worden geëlueerd met Laemmli-buffer voor westerse blot-analyse en worden ingediend bij massaspectrometriediensten voor een peptidepreparaat op de kraal voor eiwitidentificatie.

Resultaten

Ons protocol beschrijft een vereenvoudigde methode voor de introductie van een covalente biotinemodificatie in de eiwitten in de buurt van een doeleiwit in Paramecium (Figuur 1A). Deze gebiotinyleerde eiwitten kunnen vervolgens verder worden verrijkt met behulp van een streptavidine-pulldown en worden geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie20. Om een praktische use case van de methode aan te tonen, hebben we het protocol toegepast op het Nowa1-eiwit. Dit eiwit is essentieel voor het genomische herschikkingsproces en heeft dynamische veranderingen in zijn lokalisatie12. In de vroege stadia blijft het in de oude somatische kern en fragmenten, maar later wordt het gelokaliseerd in de zich nieuw ontwikkelende kern. Met name onze eerdere pogingen voor een tag-gemedieerde verrijking van de Nowa1-interagerende eiwitten waren niet succesvol (niet-gepubliceerde resultaten). Dit was waarschijnlijk te wijten aan de complexe herhalingen die gelijkenis vertoonden met het prioneiwit PrP27 dat zelfaggregatie kon veroorzaken onder niet-optimale omstandigheden tijdens de pulldown-procedure21. We hebben de Nowa1-coderende regio samen met de stroomopwaartse niet-coderende regio die de promotor bevat, PCR geamplificeerd. Het product werd vervolgens in het frame ingevoegd met een voor codon geoptimaliseerde turboID-coderingssequentie (Figuur 1B). Om transgen-geïnduceerde uitschakeling te voorkomen die wordt veroorzaakt door de injectie van circulair DNA in Paramecium, werd de vector vóór injectie gelineariseerd. Het gelineariseerde en gezuiverde DNA werd vervolgens micro-geïnjecteerd in de somatische kern (MAC) zoals beschreven in dit protocol. Een verspreide druppel opgesloten in het donkere gebied van de somatische kern werd zichtbaar in enkele van de succesvolle injecties (Figuur 1C). De succesvolle injectie en de amplificatie van het DNA door de cellen tijdens de celdeling werden vervolgens geverifieerd door middel van PCR. Zoals verwacht was 40-50% van de cellen positief voor het geïnjecteerde DNA van het Nowa1-construct (verwachte productgrootte 685 bp) (Figuur 2). De volgende stap was het verifiëren van de aanwezigheid van het eiwit dat wordt gecodeerd door het geïnjecteerde DNA. Aangezien de ontvangervector de turboID-sequentie bevat, geflankeerd door een drievoudige HA-tag, gebruikten we immunofluorescentiekleuring om de tag te detecteren. Dit stelde ons in staat om te verifiëren of de geïnjecteerde cellen het fusie-eiwit tot expressie brengen en of het correct gelokaliseerd was. We gebruikten cellen in een laat stadium die lokalisatie van het fusie-eiwit in de twee nieuw ontwikkelende kernen vertoonden, zoals eerder waargenomen voor het wild-type Nowa1-eiwit12. De individuele geïnjecteerde cellijnen vertoonden verschillende niveaus van het fusie-eiwit (Figuur 3). Een lager expressieniveau kan gunstig zijn voor toepassingen waar een verminderde achtergrond wenselijk is, maar in dit geval hebben we gekozen voor een maximaal signaal en zijn we doorgegaan met kloon 2, die de hoogste expressie liet zien. Vervolgens verzamelden we monsters tijdens verschillende ontwikkelingsstadia om de lokalisatie van het fusie-eiwit te volgen. Het eiwit was aanvankelijk gelokaliseerd in de strengen gevormd uit de oude somatische kern en in de gescheiden nucleaire fragmenten tijdens de vroege stadia van autogamie. Bij het verschijnen van het nucleaire anlagen ging het fusie-eiwit over naar deze zich nieuw ontwikkelende kernen (Figuur 4). Om de biotinylering van het proximale proteoom in de verschillende stadia te bevorderen, vulden we de cultuur aan met 500 μM biotine gedurende 2 uur alvorens de cellen voor IF te oogsten. We visualiseerden de biotine-gelabelde eiwitten via een IF-kleuring met behulp van een fluorescerend gelabeld streptavidine. Het waargenomen signaal kwam overeen met de lokalisatie van het HA-gelabelde fusie-eiwit. Belangrijk is dat het mogelijk was om biotinyleringslokalisatie te verkrijgen die specifiek is voor de verschillende nucleaire ontwikkelingsstadia, aangezien zelfs een korte incubatie met biotine voldoende is om significante biotinylering te bereiken (Figuur 4). Bovendien was zonder de toevoeging van aanvullende biotine slechts verwaarloosbare biotinylering detecteerbaar in de geïnjecteerde cellen. In wildtype cellen veroorzaakte de toevoeging van aanvullende biotine geen detecteerbare biotinylering (Figuur 5A). Met name accumuleerde de biotine zich niet alleen in de zich ontwikkelende kern, want zelfs in denatureringsomstandigheden blijft het gehecht aan de eiwitten. (Figuur 5B). Met behulp van met streptavidine beklede magnetische kralen was het mogelijk om de gebiotinyleerde eiwitten (Figuur 6). De verrijkte eiwitten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie. In deze daaropvolgende eiwitidentificatie-experimenten kunnen de niet-gesupplementeerde cultuur, evenals cellen die een niet-gefuseerd turboID-eiwit tot expressie brengen, worden gebruikt als achtergrondcontrolegroepen.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de procedure voor nabijheidsbiotinylering in P. tetraurelia. (A) Algemeen overzicht van het protocol. (B) Kloonprincipe voor de plug-and-play turboID-ontvangervector en het resulterende construct voor het Nowa1-fusie-eiwit. Het 3'UTR-gebied dat in dit plasmide wordt gebruikt, is afgeleid van CenH3a. (C) Zichtbare diffuse druppel in het donkere gebied dat overeenkomt met de somatische kern (MAC) na een succesvolle injectie van DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: PCR-test voor succesvolle injectie. Agarosegelanalyse van PCR-reactie voor een product met een voorwaartse primer specifiek voor het stroomopwaartse gebied dat codeert voor ampicillineresistentie (amp start) en een omgekeerde primer complementair aan Nowa1. De pijlpunt geeft de verwachte productgrootte aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Immunofluorescentiekleuring om de juiste lokalisatie van het turboID-fusie-eiwit te valideren. Immunofluorescentiekleuring met behulp van konijn-anti-HA primair antilichaam (1:100) en geit-anti-konijn Alexa Fluor 568 geconjugeerd secundair antilichaam (1:1000) van monoklonale Paramecium-lijnen met een positief PCR-signaal voor het DNA dat codeert voor een Nowa1-HA-turboID-fusie-eiwit. Schaal 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Nowa1-specifieke biotinylering in verschillende ontwikkelingsstadia. Immunofluorescentiekleuring van de monoklonale lijn 2 in voortschrijdende stadia tijdens de vorming van de nieuwe somatische kern. Het kweekmedium werd aangevuld met 500 μM biotine voor een optimale turboID-activiteit. HA-tag werd gedetecteerd zoals in figuur 3 en biotine werd gedetecteerd met behulp van Streptavidin-FITC (1:200). Schaal 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Efficiënte nabijheidslabeling door turboID vereist aanvullende biotine in de cultuur. (A) Immunofluorescentiekleuring van wt en geïnjecteerde cellen in de late ontwikkelingsfase die de expressie van Nowa1-HA-turboID en de waargenomen biotinylering met 500 μM aanvullende biotine aantoont. HA-tag en biotine werden gedetecteerd zoals in figuur 4. Schaal 20 μm. (B) Western blot-analyse voor biotine met behulp van HRP-streptavidine van gewtecellen gekweekt met 500 μM biotine en turboID geïnjecteerde cellen met en zonder biotine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Verrijking van gebiotinyleerde eiwitten met streptavidine magnetische kralen. Western blot-analyse voor biotine van monsters van een pulldown-experiment met behulp van met streptavidine beklede magnetische kralen. De monsters zijn: Nowa1-HA-turboID-cellysaat (input), de ongebonden fractie (doorstroom), de wasstappen (wash 1-6) en de eiwitten gebonden aan de kralen (output). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een techniek voor het hechten van een biotinegroep aan de eiwitten in de buurt van het eiwit van belang. Op basis van de sterke affiniteit van streptavidine voor biotine zorgt dit voor een snelle en efficiënte verrijking van de gemodificeerde eiwitten. Gecombineerd met het snelle aanpassingsvermogen voor verschillende eiwitten die van belang zijn, kan de gepresenteerde methode de studies van multiproteïne-interacties in Paramecium vergemakkelijken. Dit modelorganisme is goed ingeburgerd voor onderzoek naar de transposon-gastheer interacties tijdens meiotische reproductie3. Bovendien zou het nieuwe moleculaire hulpmiddelen kunnen bieden voor nauwkeurige genoombewerking, aangezien het meer dan 45.000 sequenties wegsnijdt tijdens de geprogrammeerde genomische herschikkingen. Het proces wordt georkestreerd door een complexe machinerie met meerdere componenten die een nauwkeurige RNA-gestuurde excisie van deze DNA-fragmenten mogelijk maakt met een reproduceerbare splitsingsplaats over elke generatie. De hier gepresenteerde methode biedt twee grote voordelen voor het bestuderen van dit proces. Het vereenvoudigt de ontdekking van voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties. Bovendien maakt de plug-and-play ontvangervector het mogelijk om snel veel functionele fusie-eiwitten te maken. Aangezien er waarschijnlijk in verschillende stadia meerdere factoren bij het proces betrokken zijn, maakt het aanpassingsvermogen het mogelijk om de interactomen van veel eiwitten bloot te leggen die deel zouden kunnen uitmaken van de excisiemachinerie. Belangrijk is dat de fusieconstructen tot expressie worden gebracht door de promotor van het endogene gen en daarom nauw overeenkomen met het tijdsverloop van de oorspronkelijke expressie. Bovendien maakt het aangetoonde gebruik van micro-injectie voor de afgifte van exogeen genetisch materiaal aan dit modelorganisme het mogelijk om homogene monoklonale populaties te genereren. Dergelijke populaties maken een meer synchrone initiatie van het autogamieproces mogelijk, waarbij de ontwikkeling van een nieuwe somatische kern plaatsvindt.

Hoewel de gedemonstreerde procedure voor het introduceren van de turboID-fusieconstructen robuust is, kan specifieke optimalisatie nodig zijn in de stroomafwaartse eiwitverrijkingsprotocollen, vanwege het mechanisme van biotinylering. Aangezien het gefuseerde turboID-enzym reactieve biotine-AMP-groepen genereert die van het enzym af diffunderen, kunnen deze mogelijk reageren met elk nucleofiel deel in de buurt. Een essentiële stap in deze methodologie is dus de identificatie van de echte interactiepartners uit de achtergrondhits en uit de eiwitten die in de algemene nabijheid van het turboID-fusie-eiwit zijn gelokaliseerd, die niet de werkelijke interactiepartners zijn. Om dit te bereiken, kan een variatie van parameters worden aangepast, zoals de duur van de incubatie met biotine16. Bovendien zou een experimentele opstelling met een controlegroep zonder aanvullende biotine in het medium de achtergrondbinding kunnen aangeven. Zoals aangetoond zal een dergelijke controlegroep genetisch identiek zijn aan het eigenlijke experiment, maar de biotinylering door turboID is sterk verminderd vanwege de lage overvloed aan biotine. Andere belangrijke controlegroepen kunnen een niet-gefuseerd turboID-eiwit zijn, evenals een wildtypegroep, beide gekweekt in het medium aangevuld met biotine. Bovendien, hoewel de sterke affiniteit van streptavidine voor biotine een aanzienlijk voordeel is ten opzichte van pulldowns op basis van antilichamen, hebben verschillende zout- en wasmiddelconcentraties waarschijnlijk invloed op de zuiverheid en efficiëntie van de verrijking.

Superieure proteomische benaderingen kunnen ons begrip van de unieke moleculaire mechanismen van Paramecium, en mogelijk andere ciliaten, vergroten. Moleculaire componenten met nieuwe functies zijn veelbelovend om te worden hergebruikt als hulpmiddelen in de synthetische biologie en kunnen zo biotechnologische ontwikkelingen bevorderen22,23. Gemanipuleerde synthetische eiwitten bestaan vaak uit combinaties van functionele domeinen met nieuwe eigenschappen die voorheen onpraktische therapeutische toepassingen mogelijk maken. Gemanipuleerde eiwitten kunnen ook worden gebruikt in farmaceutische productieprocessen24. Het RNA-gestuurde genoomexcisiesysteem van Paramecium is van bijzonder belang voor dergelijke ontwikkelingen. Dit systeem bereikt RNA-afhankelijke excisie van duizenden DNA-fragmenten, met een precisie tot op de enkele nucleotide25. Dergelijke parameters maken het interessant om de nauwkeurigheid van genoombewerking in menselijke cellen te verbeteren. De gepresenteerde nabijheidsbiotinyleringsmethode kan worden gebruikt om de ontdekking van nieuwe eiwitcomponenten en hun interacties binnen moleculaire machines met meerdere eiwitten te versnellen en te bevorderen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een DigiK-beurs van de Universiteit van Bern en een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation 229074 toegekend aan B.-A.S. en de subsidie van de Zwitserse National Science Foundation 214853 toegekend aan M.N.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscope Axiovert 40 CFL (10x, 40x lenzen)Zeissna
b-sitosterolSigma Aldrich567152
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA9647
CellTram OilEpendorfna
codon optimized 3xHA-turboID DNA sequenceTwist biosciencenaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGTGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA
TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPISigma AldrichD9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
epT.I.P.S. microloader tipsEpendorf5242956003
EthanolGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfna
Femtotip IICalibre Scientific5242957000
Formaldehyde solutionSigma AldrichF8775
GlycineAppliChem10021259
Goat anti-rabbit IgG antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
HA-tag (C29F4) rabbit mABcell systems3724
InjectMan NI 2Ependorfna
light mediumnana0.2x tarwekiemen poeder oplossing in 2,5 mM Na2HPO4
Mineral oilSigma AldrichM8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Phenol-Chloroform-IsoamylalkoholSigma Aldrich77617
phosphor buffered saline Fischer Scientific10722497
Plasmid plus midiprep kitQiagene12945
rich mediumnana1x tarwekiemen poeder oplossing in 2,5 mM Na2HPO4
Streptavidin-FITCThermo Fisher Scientific11-4317-87
Ultrafree-MC GV centrifugal filter EMD MiliporeUFC30GV00
washing solutionnana0.1% BSA in Volvic water 
tarwekiemen poeder oplossingPines internationalnaBereid als 20x stock uit het poeder zoals eerder beschreven (0,5g/10mL)
Streptavidin-HRPabcamab7403
Streptavidin coated magnatic beadsSigma AldrichLSKMAGT02
Lysis buffer voor pulldownnana50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Sodium deoxycholate; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x cOmplete protease inhibitor (Roche); 
Wash buffer 1 voor pulldownnana50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Sodium deoxycholate; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;
Wash buffer 2 voor pulldownnana10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM MgCl2
Wash buffer 3 voor pulldownnana10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl;

Referenties

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BiotinyleringTurboID ligaseDNA microinjectieimmunofluorescentiekleuringstreptavidinekralenWestern bloteiverrijking
In vivo Nabijheidsbiotinylering voor onderzoek naar eiwitinteractie in Paramecium tetraurelia
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.