Genereren van hele bacteriële genomen uit klinische monsters met behulp van een workflow voor doelverrijking

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om sequencing van het hele genoom van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen uit klinische monsters mogelijk te maken met behulp van doelverrijking. Deze nieuwe, syndromale panelgebaseerde methode overwint de uitdagingen van overvloedig menselijk DNA en lage bacteriële belasting, waardoor genomische surveillance voor Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum en Mycoplasma genitalium wordt vergemakkelijkt.

Samenvatting

Het verkrijgen van volledige genomen van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen (soa's) rechtstreeks uit klinische monsters is een uitdaging vanwege de aanwezigheid van menselijk DNA, microbiota en zeer lage bacteriële pathogene belastingen. Cultuur is vaak geen optie, omdat deze soorten kieskeurig zijn en de meeste monsters worden genomen in transportmedia die micro-organismen lyseren, waardoor ze niet levensvatbaar zijn voor cultuur. Om deze problemen aan te pakken, gebruikten we een sondepanel dat was ontworpen voor vier soorten om volledige genoomsequenties van bacteriële soa's te genereren en voerden we doelverrijking uit, een hybridisatieprocedure van twee tot drie dagen voorafgaand aan genoomsequencing. Onze eerste resultaten leverden uitstekende genomische gegevens op met behulp van monsters waarvoor directe sequencing niet succesvol was. Doelverrijking bleek zeer effectief te zijn voor het sequencen van bacteriële soa-genomen, vooral wanneer de ziekteverwekkerbelasting hoog was (Ct < 30). Geteste monsters die Mycoplasma genitalium bevatten, hadden vaak Ct-waarden boven de 30, wat leidde tot lagere slagingspercentages voor genoomherstel; er zijn verbeteringen waargenomen na het optimaliseren van de hybridisatietemperatuur van 65 °C naar 62,5 °C. Naast het mogelijk maken van genomische surveillance, kan de beschikbaarheid van volledige genomen waardevolle inzichten verschaffen in antimicrobiële resistentie, zoals het identificeren van verworven resistentiedeterminanten geassocieerd met Neisseria gonorrhoeae. Deze methode heeft al geleid tot de identificatie van een nieuwe afstamming van Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum in Buenos Aires, ompA-genotype L4, wat het potentieel van deze aanpak benadrukt voor het blootleggen van nieuwe genomische diversiteit en het verbeteren van soa-surveillance.

Inleiding

De komst van next-generation sequencing (NGS) technieken heeft bacteriële whole-genome sequencing (WGS) mogelijk gemaakt, waardoor de sequentiebepaling van klinische isolaten in vele soorten menselijke bacteriële pathogenen mogelijk is. De technologie heeft tal van vergelijkende studies mogelijk gemaakt door het genereren van volledige genomen op een ongekende schaal. Dit heeft een grote impact gehad op de klinische microbiologie en de volksgezondheid, aangezien toegang tot genoomgegevens uit klinische monsters via WGS typering en detectie van antimicrobiële resistentiegenen mogelijk maakt. Bovendien maken metagenomische benaderingen de directe detectie van ziektegeassocieerde pathogenen uit klinische monsters mogelijk. Dergelijke informatie creëert nieuwe mogelijkheden voor gepersonaliseerde behandelingsstrategieën voor patiënten. Bovendien is WGS een krachtig hulpmiddel dat inzicht geeft in de evolutie van circulerende stammen van een specifieke ziekteverwekker, evenals hun transmissiepatronen, waardoor volksgezondheidsautoriteiten uitbraken van ziekteverwekkers beter kunnen begrijpen en erop kunnen reageren ^1,2,3.

Om voldoende sequencingkwaliteit voor WGS te bereiken, is doorgaans bacteriële isolatie door middel van kweek nodig om de vereiste microbiële DNA-hoeveelheden^{te verkrijgen 4,5,6}. Dit is een beperkende factor voor organismen die moeilijk te kweken zijn, organismen die niet kunnen worden gekweekt vanwege niet-levensvatbare diagnostische monsterverwerking of organismen die tijdens de behandeling van de patiënt aan antibiotica zijn blootgesteld. Voorbeelden van dergelijke moeilijk te kweken micro-organismen zijn seksueel overdraagbare bacteriële pathogenen, zoals Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum en Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Deze soorten zijn moeilijk te kweken vanwege verschillende factoren, waaronder hun intracellulaire aard, kwetsbaarheid, kieskeurige groeivereisten en trage replicatiesnelheden. Om deze redenen is het ontwikkelen en implementeren van technieken die WGS mogelijk maken ondanks een laag DNA-gehalte - zoals vaak het geval is in patiëntmonsters - cruciaal voor het uitvoeren van genomische analyses in klinische omgevingen.

Doelverrijking is de meest veelbelovende methode voor genoomsequencing wanneer microbieel DNA schaars is¹⁰. In de context van ziekteverwekkers die seksueel overdraagbare aandoeningen (soa's) veroorzaken, is bijvoorbeeld slechts een klein deel van het DNA dat in een patiëntenmonster aanwezig is, afkomstig van de ziekteverwekker. In het geval van C. trachomatis-infecties is gebleken dat pathogeen-DNA tot maximaal 0,6% van het totale DNA uitmaakt, maar de waarden zijn doorgaans veel lager¹¹. De doelverrijkingsmethode bestaat uit het selectief vastleggen van het microbiële DNA dat van belang is voorafgaand aan NGS. Dit wordt bereikt met behulp van speciaal ontworpen biotine-gelabelde RNA-sondes die complementair zijn aan het microbiële DNA van het doelwit. Adapterligatie wordt uitgevoerd om een genomische bibliotheek te genereren, voorafgaand aan hybridisatie, waarbij deze sondes binden aan het complementaire microbiële DNA. Vervolgens worden met streptavidine beklede magnetische kralen gebruikt om de met biotine gelabelde nucleïnezuurcomplexen op te vangen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de sterke interactie tussen biotine en streptavidine. Ten slotte amplificeert een polymerasekettingreactie (PCR) de geselecteerde DNA-fragmenten. Deze belangrijke conceptuele stappen zijn nodig voor het begrijpen van de doelverrijkingsstrategie. Aanvullende procedurele stappen, zoals wassen en kwaliteitscontrole, zijn echter ook betrokken bij het volledige protocol^10,12.

Voordat het sequencingprotocol wordt gestart, is het belangrijk om de hoeveelheid ingevoerd DNA te evalueren en ervoor te zorgen dat de omstandigheden in de workflow de integriteit ervan behouden. Volgens de aanbevelingen van de fabrikant vereist het standaardprotocol 10-200 ng DNA in een volume van 7 μL, wat overeenkomt met een concentratiebereik van ongeveer 1,4 tot 28,6 ng/μL. Wanneer de DNA-concentratie lager is, wordt een aangepaste versie van het protocol met 17 μL geadviseerd, waarbij concentraties tussen 0,6 en 11,8 ng/μL mogelijk zijn met behoud van de vereiste inputhoeveelheid¹². Gezien de lage concentraties die vaak worden verkregen uit klinische monsters, hebben we routinematig de 17 μL-protocolvariant geïmplementeerd. Hybridisatie- en sequencingprestaties worden geassocieerd met DNA-kwaliteit, wat het belang onderstreept van de juiste opslag- en transportomstandigheden voor monsters om de integriteit van nucleïnezuur te behouden. Daarom zijn de juiste behandelingspraktijken, zoals het stabiliseren van verzamelmedia, snelle verwerking, het handhaven van koelketencondities en het minimaliseren van vries-dooicycli, belangrijke maatregelen om de DNA-kwaliteit te optimaliseren. Naast de vereiste DNA-concentraties is de lengte van het DNA-fragment een indicator van integriteit. We raden aan om DNA-degradatie tijdens de behandeling en opslag van monsters tot een minimum te beperken om langere fragmenten te verkrijgen en de sequentieresultaten te optimaliseren. Dit is met name relevant in klinische omgevingen, waar variabiliteit in verzamelmethoden, medium en behandeling gebruikelijk is. We hebben dit protocol met succes toegepast op DNA geëxtraheerd uit zowel 2-SP-medium als NAAT-transportmedia, met gemiddelde fragmentlengtes tot 1 kb, zoals beschreven in de representatieve resultaten. Ten slotte werd succesvolle sequencing gedefinieerd als het bereiken van meer dan 95% genoomdekking met een gemiddelde leesdiepte van meer dan 10x¹⁰.

Tot op heden is doelverrijking door verschillende onderzoeksgroepen met succes toegepast op een breed scala aan micro-organismen en virussen, waaronder ziekteverwekkers die soa's veroorzaken, norovirussen, veevirussen en plantpathogenen 10,13,14,15,16. Tot nu toe is het ontwerp van de sonde echter over het algemeen beperkt tot afzonderlijke pathogenen in plaats van een panel dat zich richt op volledige genomen van meerdere syndromisch gekoppelde pathogenen. Ideale doelwitten zijn organismen met kleine, geconserveerde genomen, waaronder inderdaad C. trachomatis, T. pallidum en M. genitalium. Hoewel N.gonorrhoeae een diverser genoom en een groter pan-genoom heeft, kunnen de sondes om het te bedekken nog steeds worden gerationaliseerd in een ontwerp met de andere drie bacteriën. Er is enige divergentie in %G+C tussen deze bacteriën, en andere die syndromisch met elkaar verbonden kunnen zijn, wat betekent dat de omstandigheden mogelijk moeten worden geoptimaliseerd.

Het doel van dit protocol is om volledige genomen rechtstreeks uit klinische monsters te verkrijgen om fylogenetische en epidemiologische analyses mogelijk te maken. We demonstreren een nieuwe en effectieve strategie met behulp van een sondepanel op maat van C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum en M. genitalium om volledige genomen te herstellen met behulp van geëxtraheerd DNA uit klinische monsters zoals urogenitale en anorectale uitstrijkjes. Deze aanpak is succesvol gebleken en werd toegepast bij de karakterisering van de uitbraak van lymfogranuloma venereum (LGV) in Buenos Aires, waardoor de beschrijving van een nieuwe afstamming van C. trachomatis LGV^10,13 mogelijk werd.

De doelverrijkingsprocedure zal worden beschreven, inclusief het gebruik van een in de handel verkrijgbare DNA-opnamemethode met post-capture pooling voor next-generation sequencing (NGS) die wordt gebruikt om volledige genomen rechtstreeks te verkrijgen uit klinische monsters van patiënten met de diagnose C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum en/of M. genitalium Infecties. Voor optimaal succes wordt aanbevolen om monsters te selecteren met een Ct-waarde van minder dan 30, aangezien hogere Ct-waarden een lagere pathogene belasting weerspiegelen en minder kans hebben om volledige genomen op te leveren. DNA-extract voor de methode kan worden verkregen uit klinische monsters van verschillende soorten monsters en verzamelmedia. DNA-extractieprocedures kunnen handmatig of met geautomatiseerde systemen worden uitgevoerd, met behulp van kits die zijn ontworpen voor de isolatie van pathogeen- of viraal DNA uit monsters van menselijke uitstrijkjes (zie materiaaltabel).

De sondeset die werd gebruikt in de doelverrijkingsprocedure (zie Tabel met materialen) was speciaal ontworpen om de genomische diversiteit van C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum en M. genitalium vast te leggen. Aangepaste sondes werden gegenereerd met behulp van meerdere volledige genomen voor elke soort, waardoor de dekking van hun bekende pangenomen werd geoptimaliseerd¹⁰. De ontwerpcriteria omvatten een minimale sequentiehomologie van 90% ten opzichte van de referentiesequenties en een tegelfrequentie van 1x-2x om de efficiëntie van het vastleggen van doelen te verbeteren. Om de kosteneffectiviteit te optimaliseren, minimaliseerde het algoritme dat werd gebruikt bij het ontwerpen van sondes het aantal sondes met behoud van een uitgebreide genomische weergave. De uiteindelijke sondeset bestond uit 242.000 sondes voor de multiplexontwerpen gericht op C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium en T. pallidum. Het volledige doelverrijkingsprotocol kan in 2 of 3 dagen worden uitgevoerd. Er worden duidelijke indicaties van stoppunten gegeven voor zowel de tweedaagse als de driedaagse workflowopties.

ETHISCHE VERKLARING
Deze studie stelt methodologische verbeteringen voor op basis van eerder gepubliceerde protocollen^10,13. De beschreven procedures omvatten alleen geanonimiseerde monsters en bevatten geen patiëntgegevens; Daarom was er geen specifieke ethische goedkeuring vereist voor de methodologische aspecten. De representatieve resultaten werden verkregen uit twee sets eerder bestudeerde monsters: Argentijnse monsters verzameld onder het goedgekeurde protocol Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, goedkeuring nr. 201723), met schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemers; en geanonimiseerde Finse monsters, waarvoor geen specifieke ethische goedkeuring vereist was. Voorafgaand aan de indiening van de resulterende sequentiegegevens in de database, moeten menselijke lezingen worden verwijderd.

Protocol

OPMERKING: De werkruimte moet worden opgedeeld in een pre-PCR-zone (ampliconvrije werkruimte) en een post-PCR-zone (amplicon-handling werkruimte) om besmetting te voorkomen. Tenzij uitdrukkelijk anders vermeld, moeten alle stappen worden uitgevoerd in een van de twee gecontroleerde werkruimten. Alle mastermengsels en PCR-reactiemengsels moeten worden bereid in de ampliconvrije werkruimte, terwijl alle volgende stappen met geamplificeerd DNA moeten worden uitgevoerd in de ampliconverwerkingswerkruimte. Alle hoeveelheden in dit protocol zijn berekend om acht monsters te verwerken.

1. DNA-fragmentatie

1. Meet de DNA-concentratie van de DNA-extracten van klinische monsters die doelpathogeen DNA (DNA) bevatten met behulp van een gevoelige, nauwkeurige, op fluorescentie gebaseerde methode (dubbelstrengs DNA [dsDNA]-test, waarbij 1 μL monster wordt gebruikt, met een detectiebereik tot 120 ng/μL; zie Materiaaltabel). Deze kwantificeringsmethode wordt in het hele protocol consequent gebruikt wanneer de DNA-concentratie wordt gemeten.
2. Verdun elk DNA-monster tot een concentratie van 10 - 200 ng met nucleasevrij water, zorg voor een eindvolume van 17 μL in elke PCR-buisstrip. Om optimale sequentieresultaten te bereiken, gebruikt u de hoogst mogelijke hoeveelheid input-DNA binnen het aanbevolen bereik.
   OPMERKING: In gevallen waarin de totale DNA-concentratie lager is dan het aanbevolen minimum van 10 ng in 17 μL, kan suppletie met achtergrond-DNA (bijv. menselijk genomisch DNA) worden gebruikt om te voldoen aan de invoervereisten, zoals voorgesteld door de fabrikant. Dit kan helpen de reactie op de bibliotheekvoorbereiding te stabiliseren en de sequentieprestaties in klinische monsters met weinig input te verbeteren.
3. Ontdooi de fragmentatiebuffer (5x), vortex en plaats op ijs.
4. Programmeer de thermische cycler volgens tabel 1. Start het programma en pauzeer direct.
   OPMERKING: De duur van de incubatiestap van 37 °C kan variëren, afhankelijk van de initiële grootte van het DNA-fragment en de gewenste NGS-leeslengte. Voor DNA-monsters van hoge kwaliteit wordt een incubatietijd van 15 minuten aanbevolen om fragmenten van 150 tot 200 bp te verkrijgen die geschikt zijn voor 2 100x lezingen, en 10 minuten om fragmenten van 180 tot 250 bp te verkrijgen voor 2 150x lezingen.
5. Haal de benodigde flesjes voor de fragmentatiemastermix op uit de opslag van -20 °C. Bereid de mastermix voor op basis van tabel 2. Sluit de buis en vortex 5-10 s met hoge snelheid af. Draai kort om bubbels te verwijderen en houd de mastermix op ijs.
6. Voeg 3 μL fragmentatie mastermix toe aan elk putje met 17 μL input-DNA. Meng door 20x op en neer te pipetteren, sluit de PCR-buisstrip af, vortex met hoge snelheid gedurende 5-10 s en draai kort.
7. Plaats de strip van de PCR-buis in de thermische cycler (zie Materiaaltabel) en hervat het programma dat wordt geïllustreerd in Tabel 1 aan het begin van stap 1.
8. Zodra de houdbaarheidsdrempel van 4 °C is bereikt, verwijdert u de PCR-buisstrip van de thermische cycler en voegt u 30 μL nucleasevrij water toe. Plaats de strip van de PCR-sonde op ijs.

Tabel 1: Thermisch cyclerprogramma voor enzymatische fragmentatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Bereiding van de fragmentatiemastermix Klik hier om deze tabel te downloaden.

2. Voorbereiding van de bibliotheek

1. Voorbereiding van ligatie master mix
   OPMERKING: De ligatiemastermix moet op dit punt worden bereid, omdat het 30-45 minuten nodig heeft om op kamertemperatuur te komen.
   1. Haal de ligatiebuffer uit de opslag van -20°C en ontdooi op ijs. Haal het T4 DNA-ligase uit de opslag van -20°C, meng door de injectieflacon om te keren en bewaar op ijs.
   2. Bereid de ligatiemastermix voor volgens tabel 3. Sluit de buis en vortex 10-20 s op hoge snelheid af, draai kort en bewaar voor gebruik 30-45 minuten op kamertemperatuur.
2. Eindreparatie en dA-staartfragmenten
   1. Programmeer de thermische cycler volgens tabel 4.
   2. Haal de eindreparatiebuffer uit de opslag van -20 °C en ontdooi op ijs. Eenmaal ontdooid, vortex met hoge snelheid, draai kort. Haal de eindreparatie-A-tailing enzymenmix op, meng door de injectieflacon om te keren en blijf op ijs.
   3. Bereid de eindreparatie/dA-tailing mastermix voor volgens tabel 5 (zie materiaaltabel). Meng door de buis en vortex 10-20 s op hoge snelheid goed af te sluiten, kort te draaien en op ijs te blijven.
   4. Pipetteer 20 μL end repair/dA-tailing mastermix in elk putje met 50 μL DNA-fragmenten (uit de stappen 1.1-1.8). Sluit de PCR-buisstrip af, meng grondig door 5-10 s met hoge snelheid te vortexen. Draai de strip van het PCR-buisje kort rond en plaats deze in de thermocycler. Hervat het programma van Tabel 4.
3. Ligatie van MBC-gelabelde adapters
   1. Zodra het programma in tabel 4 de laatste stap heeft voltooid, plaatst u de strip van de PCR-sonde op ijs. Stel de thermische cycler in volgens de parameters in tabel 6. Start het programma en pauzeer het direct.
   2. Voeg 25 μl ligatiemastermix op kamertemperatuur toe aan elk monster dat in stap 2.1 is bereid. Sluit de strip van de PCR-buis, draai gedurende 5-10 s en draai kort.
   3. Haal de adapter oligo-mix voor MBC-gelabelde bibliotheken (zie Materiaaltabel) op bij -20 °C opslag en ontdooi op ijs. Eenmaal ontdooid, vortex met hoge snelheid gedurende 5-10 s. Kort ronddraaien en op ijs houden.
   4. Voeg 5 μL adapter oligo mix voor MBC-gelabelde bibliotheken toe aan elk sample. Sluit de PCR-buisstrip en vortex met hoge snelheid gedurende 5-10 s af, draai kort. Plaats de PCR-buisstrip onmiddellijk in de thermische cycler en ga verder met het uitvoeren van het programma zoals gespecificeerd in tabel 6.
4. Opruimen van ligatie
   1. Voer DNA-zuivering uit met behulp van magnetische kralen. Haal de kralen uit de opslag van 4 °C en laat ze voor gebruik op kamertemperatuur komen.
   2. Bereid 4 ml 70% ethanol met nucleasevrij water. Bewaar op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om een 70% ethanoloplossing vers te bereiden voor gebruik in de opruimstappen om optimale prestaties te garanderen. Gebruik voor 70% ethanolbereiding nucleasevrij water direct voor gebruik.
   3. Draai de magnetische kralensuspensie grondig totdat het mengsel uniform is en de kleur consistent lijkt.
   4. Wanneer het programma in tabel 6 de houdstap van 4 °C bereikt, brengt u de PCR-buisstrip van de thermische cycler over naar kamertemperatuur. Voeg 80 μL kralensuspensie toe aan elk putje. Sluit de strip van de PCR-buis en de vortex 5-10 s af, draai kort.
   5. Incubeer de kralensuspensies gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de strip van het PCR-buisje over op een magnetische standaard (zie materiaaltabel) en wacht 5-10 minuten totdat de oplossing helder wordt.
   6. Terwijl u de strip van de PCR-buisjes in de magnetische standaard houdt, verwijdert u voorzichtig de geklaarde oplossing uit elk putje en gooit u deze weg, waarbij u contact met de kralen vermijdt.
   7. Voer met de strip van de PCR-buis in de magnetische standaard twee wasbeurten uit met 70% ethanol op de volgende manier: voeg 200 μL 70% ethanol toe aan elk monster. Wacht 1 minuut en verwijder 70% ethanol. Raak de kralen niet aan tijdens het verwijderen van de oplossing.
   8. Sluit na de tweede wasbeurt de strip van de PCR-buisjes af en draai de monsters kort rond om de resterende ethanol op te vangen. Plaats de strip van de PCR-slang gedurende 30 s in de magnetische standaard.
   9. Verwijder de opgevangen ethanol en vermijd het aanraken van de kralen. Om de resterende ethanol te verwijderen, verwijdert u de PCR-buisstrip van de magnetische standaard en houdt u deze maximaal 5 minuten niet-verzegeld (idealiter in een kap). Zorg ervoor dat de kralen volledig gedroogd zijn, maar er niet gebarsten uitzien; Dit zou de efficiëntie van het elutieproces verminderen.
   10. Elueer het DNA door 35 μL nucleasevrij water toe te voegen aan elk monsterputje. Meng grondig door 10x-15x op en neer te pipetteren, sluit de buizen af en vortex gedurende 5-10 s. Bevestig de afwezigheid van zichtbare klonten. Als die er zijn, draaikolk totdat deze is opgelost.
   11. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de strip van de PCR-buis in een magnetische standaard en wacht ongeveer 5 minuten totdat de oplossing is verdwenen.
   12. Verwijder voorzichtig het geklaarde supernatans (~34 μL) uit elk putje en breng het over naar een corresponderend putje in een verse PCR-buisstrip. Bewaar de monsters op ijs en gooi de kralen weg.
       LET OP: Voor een 3-daags protocol markeert dit het einde van dag 1. Bewaar de monsters een nacht bij 4 °C.
5. Versterking en dubbele index
   OPMERKING: Selecteer het juiste indexprimerpaar voor elk monster om een goede identificatie tijdens de sequentiebepaling te garanderen. Elke indexsequentie bestaat uit een tag van 8 bp die is opgenomen in de primers die worden gebruikt voor de versterking van de pre-capture-bibliotheken.
   1. Haal de high-fidelity DNA-polymerasebuffer met dNTP's (5x) uit -20 °C opslag en ontdooi op ijs. Haal de geselecteerde geïndexeerde sequencingprimers uit de opslag van -20 °C en bewaar ze op ijs.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u de specifieke streepjescode registreert die aan elk monster is toegewezen voor nauwkeurige identificatie en traceerbaarheid tijdens het sequencingproces.
   2. Programmeer de thermische cycler volgens tabel 7. Start het programma en pauzeer direct.
      OPMERKING: De fabrikant raadt aan om 8 tot 14 pre-capture PCR-cycli uit te voeren, afhankelijk van de kwaliteit en kwantiteit van het ingevoerde DNA. In dit protocol werden 11 cycli geïmplementeerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant, wat resulteerde in hoogwaardige sequencinggegevens^10,12.
   3. Haal het high-fidelity fusie-enzym voor PCR-amplificatie op uit opslag bij -20 °C. Pipetteer het enzym op en neer om te mengen zonder overmatige agitatie, en draai de high-fidelity DNA-polymerasebuffer om homogeniteit te garanderen. Bereid de pre-capture PCR-reactiemix voor (zoals beschreven in tabel 8). Vortex de laatste mix en draai kort naar beneden, blijf op ijs.
   4. Doseer 11 μl van het pre-capture PCR-reactiemengsel (bereid zoals beschreven in tabel 8) in elk monsterputje dat de gezuiverde DNA-bibliotheek bevat. Voeg aan elke reactie 5 μL van het geselecteerde indexprimerpaar toe. Sluit de strip van de PCR-buis en de vortex gedurende 5 s af en draai dan snel naar beneden.
   5. Hervat het thermische cyclerprogramma zoals gespecificeerd in Tabel 7. Zodra de temperatuur 98 °C bereikt, plaatst u de PCR-buisstrip in de thermische cycler en sluit u het deksel goed.
6. Opruimen van de bibliotheek
   1. Laat magnetische kralen voor gebruik minimaal 30 minuten op kamertemperatuur komen. Bereid 4 ml 70% ethanol met nucleasevrij water. Bewaar op kamertemperatuur.
   2. Draai de magnetische kralensuspensie grondig totdat het mengsel uniform is en de kleur consistent lijkt.
   3. Wanneer het programma in tabel 7 de houdstap van 4 °C bereikt, brengt u de PCR-buisstrip van de thermische cycler over naar kamertemperatuur. Voeg 50 μL kralensuspensie toe aan elk monster. Sluit de strip van het PCR-buisje en de vortex 5-10 s af, draai kort rond (zonder de magnetische kralen te pelleteren).
   4. Incubeer de kralensuspensies gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de strip van de PCR-buis over op een magnetische standaard en wacht 5-10 minuten totdat de oplossing helder wordt.
   5. Terwijl u de strip van de PCR-buisjes in de magnetische standaard houdt, verwijdert u voorzichtig de heldere oplossing uit elk putje en gooit u deze weg. Raak de kralen niet aan tijdens het verwijderen van de oplossing.
   6. Met de PCR-buisstrip in de magnetische standaard voert u op de volgende manier twee wasbeurten uit met 70% ethanol. Voeg 200 μL 70% ethanol toe aan elk monster. Wacht 1 minuut en verwijder 70% ethanol. Raak de kralen niet aan tijdens het verwijderen van de oplossing.
   7. Sluit na de tweede wasbeurt de strip van de PCR-buisjes af en draai deze kort rond om resterende ethanol op te vangen. Plaats de strip van de PCR-slang gedurende 30 s in de magnetische standaard. Verwijder de resterende ethanol en vermijd het aanraken van de kralen.
   8. Om de resterende ethanol te verwijderen, verwijdert u de PCR-buisstrip van de magnetische standaard en houdt u deze maximaal 5 minuten niet-verzegeld (idealiter in een kap). Zorg ervoor dat de kralen volledig gedroogd zijn, maar er niet gebarsten uitzien, omdat dit de efficiëntie van het elutieproces zou verminderen.
   9. Elueer het bibliotheek-DNA door 15 μL nucleasevrij water toe te voegen aan elke monsterbuis. Meng grondig door 10x-15x op en neer te pipetteren, sluit de PCR-buisstrip af en vortex gedurende 5-10 s. Bevestig de afwezigheid van zichtbare klonten. Als die er zijn, draaikolk totdat deze is opgelost.
   10. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de strip van de PCR-buis in een magnetische standaard en wacht ongeveer 5 minuten totdat de oplossing is verdwenen.
   11. Verwijder voorzichtig het geklaarde supernatans (~15 μL) uit elk putje en breng het over naar een corresponderend putje in een verse PCR-buisstrip. Bewaar de monsters op ijs en gooi de kralen weg.
7. Kwaliteitscontrole
   1. Meet de DNA-concentratie van het gezuiverde bibliotheek-DNA. Vanwege de hogere gevoeligheid kunt u een op fluorescentie gebaseerde methode gebruiken om het DNA in 1 μL te kwantificeren.

Tabel 3: Bereiding van het ligatiemastermengsel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Thermisch cyclerprogramma voor eindreparatie/dA-tailing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Bereiding van de eindreparatie/dA tailing master mix. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6 Thermisch cyclerprogramma voor ligatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: Pre-capture PCR thermal cycler-programma. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 8: Bereiding van het PCR-reactiemengsel vóór de vangst. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Hybridisatie/vangst van monsters

1. Hybridisatiebibliotheken om te onderzoeken
   1. Programmeer de thermische cycler volgens tabel 9. Start het programma en pauzeer direct.
      OPMERKING: De fabrikant beveelt een hybridisatietemperatuur van 65°C aan. Deze temperatuur werd verlaagd tot 62,5 °C, wat resulteerde in betere resultaten.
   2. Haal de hybridisatiebuffer uit de opslag van -20 °C, ontdooi op ijs en bewaar tot gebruik op kamertemperatuur. Haal zowel de RNase-blokker als de oligonucleotideblokker uit de opslag van -20 °C en ontdooi op ijs. Bewaar deze injectieflacons op ijs tot gebruik.
   3. Bereken het volume dat nodig is om elk monster 500-1000 ng DNA-bibliotheek te laten bevatten, op basis van de DNA-concentratie gemeten in stap 2.7. Breng het berekende volume over in een nieuwe PCR-buisstrip en stel het totale volume in op 12 μl met nucleasevrij water.
   4. Draai en draai snel de oligonucleotideblokkermix. Voeg 5 μL toe aan elke monsterbuis. Sluit de strip van de PCR-buis af en breng deze over naar de thermische cycler. Hervat het thermische cyclusprogramma beschreven in tabel 9 en voer het uit tot stap 3, waar extra reagentia rechtstreeks aan de monsterputjes in de thermische cycler moeten worden toegevoegd.
   5. Bereid de 25% RNase-blokoplossing volgens tabel 10. Sluit de buis en vortex 10-20 s op hoge snelheid af, draai kort en blijf op ijs tot gebruik.
      NOTITIE: Vermijd langdurige blootstelling van sondehoudende oplossingen aan kamertemperatuur. Alleen tijdens de bereidingsstappen op kamertemperatuur bewaren.
   6. Haal de sondeflacon uit de opslag van -80 °C en bewaar de injectieflacon in een koelrek wanneer deze niet in gebruik is. Breng over naar ijs om te ontdooien. Het wordt aanbevolen om sondes te gebruiken zoals meegeleverd, maar kunnen worden verdund als ze worden getest^10,13.
   7. Zodra alle in tabel 11 vermelde reagentia op kamertemperatuur zijn gekomen, combineert u deze om de sondehybridisatiemix te bereiden. Meng de oplossing door 5 s op hoge snelheid te vortexen, kort naar beneden te draaien en onmiddellijk door te gaan naar de volgende stap.
   8. Wanneer de thermische cycler stap 3 van het programma bereikt dat wordt beschreven in tabel 9, voegt u 13 μL van het hybridisatiemengsel van de kamertemperatuursonde toe aan elk monsterputje, waarbij u de buizen gedurende het hele proces in de thermische cycler houdt. Meng grondig door langzaam 8x-10x op en neer te pipetteren.
   9. Sluit de strip van de PCR-buisjes goed af, draai kort voort en draai de buisjes naar beneden. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn en breng de stripbuizen vervolgens onmiddellijk terug naar de thermische cycler. Controleer nogmaals of de buizen goed zijn afgedicht.
   10. Hervat het thermische cyclusprogramma om hybridisatie van de voorbereide bibliotheek-DNA-monsters met de sondes uit te voeren. Hybridisatie gaat van de ene op de andere dag door
       LET OP: Voor een 2-daags protocol markeert dit het einde van dag 1. Voor een 3-daags protocol markeert dit het einde van dag 2.
2. Bereiding van streptavidinekorrels
   1. Haal de met streptavidine beklede magnetische kralen (streptavidine kralen) uit de opslag van 4 °C. Draai de injectieflacon grondig om ervoor te zorgen dat de kralen volledig opnieuw in suspensie zijn. De suspensie moet homogeen zijn.
   2. Breng voor elk hybridisatiemonster 50 μl van de volledig geresuspendeerde kralen over in afzonderlijke buisjes van een nieuwe PCR-buisstrip.
   3. Was de streptavidinekorrels op de volgende manier: voeg 200 μL bindbuffer toe aan elke buis, meng door op en neer te pipetteren. Sluit de buizen af, draai met hoge snelheid gedurende 5-10 s en draai kort naar beneden. Plaats de strip van de PCR-sonde in een magnetische standaard. Laat de oplossing 5 minuten klaren, verwijder dan voorzichtig het supernatant en gooi het weg. Herhaal stap 2x en voltooi in totaal drie wasbeurten.
   4. Resuspendeer de kralen in 200 μL bindbuffer.
3. Vastleggen van gehybridiseerde bibliotheken
   1. Zodra het in tabel 9 aangegeven programma voor thermische hybridisatie zijn laatste stap heeft voltooid, brengt u de PCR-buisstrip over naar kamertemperatuur.
   2. Breng het volledige volume (~30 μL) van elke tube over naar de overeenkomstige tubes met 200 μL voorgewassen streptavidinekorrels. Meng grondig door 5x-8x op en neer te pipetteren en sluit vervolgens de stripbuis goed af.
   3. Plaats de stripbuis op een 96-puts plaatmixer en meng krachtig bij 1800 tpm gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Zorg voor een goede menging van de vloeistof in de putjes.
      NOTITIE: Als er geen plaatmixer met 96 putjes beschikbaar is of als de monsters niet effectief worden gemengd, overweeg dan alternatieve methoden, zoals het horizontaal bevestigen van de stripbuizen op het bovenoppervlak van de mixer of het gebruik van een temperatuurgeregelde shaker (met verwarmingsoptie uitgeschakeld) om een grondige monsterbeweging te garanderen.
   4. Bereid tijdens deze incubatietijd zes aliquots van 200 μL wasbuffer op hoge temperatuur voor elk monster (d.w.z. in dit geval 6 x 8 stripbuizen met elk 200 μL). Sluit de buizen af en incubeer in de thermische cycler die op 70 °C wordt gehouden tot
   5. Zodra de incubatie van 30 minuten is voltooid, draait u de PCR-buisstrip kort rond om de vloeistof op te vangen. Plaats de strip van de PCR-buis in een magnetische standaard om de kralen op te vangen. Wacht tot de oplossing helder wordt (ongeveer 2 min), verwijder dan voorzichtig het bovenstaande en gooi het weg zonder de kralen aan te raken.
   6. Nadat u de strip van de PCR-buis van de magnetische standaard hebt verwijderd, voegt u 200 μL wasbuffer op kamertemperatuur toe. Pipetteer op en neer totdat streptavidinekorrels volledig opnieuw zijn gesuspendeerd (15x-20x).
   7. Plaats de strip van de PCR-buis in de magnetische standaard en wacht tot de suspensie is verdwenen (ongeveer 1 minuut). Verwijder vervolgens de supernatant en gooi deze weg.
      OPMERKING: Om de specificiteit van de opvang te garanderen, is het van cruciaal belang om de parelsuspensie op 70 °C te houden tijdens de hieronder beschreven wasprocedure. Controleer daarom voor gebruik of de wasbuffer op hoge temperatuur is voorverwarmd tot 70 °C.
   8. Was de streptavidinekorrels 6x met verdeelde en voorverwarmde tot 70 °C wasbuffer op hoge temperatuur zoals hieronder beschreven.
      1. Verwijder de PCR-stripbuis met de kralen van de magnetische standaard. Voeg 200 μL 70 °C voorverwarmde wasbuffer op hoge temperatuur toe aan elke tube met de kralen. Pipetteer op en neer totdat de kralen volledig opnieuw zijn gesuspendeerd (15x-20x). Sluit de strip van de PCR-buisjes zorgvuldig af, draai 8 s met hoge snelheid en draai snel zonder de kralen te pilleren.
      2. Plaats de monsterstripbuis met de geresuspendeerde korrels gedurende 5 minuten in het thermische cyclerblok bij 70 °C. Breng de stripbuis bij kamertemperatuur over van de thermische cycler naar de magnetische standaard.
      3. Wacht 1 minuut totdat de oplossing is verdwenen. Verwijder vervolgens de supernatant en gooi deze weg. Herhaal 5x voor een totaal van zes wasbeurten.
   9. Zorg ervoor dat alle wasbuffer volledig is verwijderd en voeg vervolgens 25 μL nucleasevrij water toe aan elke monsterbuis. Breng de kralen langzaam weer in suspensie door 8x op en neer te pipetteren, in een poging luchtbelvorming te voorkomen.
   10. Bewaar de PCR-strip met de monsters op ijs totdat ze klaar zijn om te worden gebruikt in de hieronder beschreven PCR-reacties.
4. Met versterking verrijkte bibliotheken
   1. Programmeer de thermische cycler volgens tabel 12. Start het programma en pauzeer direct.
      NOTITIE: De fabrikant raadt aan om 10 tot 16 PCR-cycli na het vastleggen uit te voeren, afhankelijk van de grootte van het sondeontwerp. In dit protocol werden 22 cycli geïmplementeerd, wat resulteerde in succesvol genoomherstel van pathogenen ^10,12.
   2. Haal zowel de high-fidelity DNA-polymerasebuffer met dNTP's (5x) als de post-capture primermix (zie Materiaaltabel) op uit -20 °C opslag, ontdooi en bewaar op ijs. Draai op hoge snelheid en draai snel naar beneden voor gebruik.
   3. Haal het high-fidelity fusie-enzym voor PCR-amplificatie (zie materiaaltabel) op uit opslag bij -20 °C. Om de enzymoplossing goed te mengen, pipetteert u de vloeistof op en neer om overmatig roeren te voorkomen. Bereid vervolgens de PCR-reactiemix na afname voor door alle reagentia te combineren volgens tabel 13. Vortex de laatste mix en draai kort naar beneden, blijf op ijs.
   4. Voeg 25 μl van het PCR-reactiemengsel na afvang toe aan elke monsterbuis (elk met 25 μl met kralen gebonden doelwitverrijkt DNA). Pipetteer op en neer om de reacties te mengen totdat de hielsuspensie gelijkmatig is. Sluit de strip van de PCR-buis goed af. Draai de strip van de PCR-buis in dit stadium niet naar beneden.
   5. Plaats de PCR-buisstrip in de thermische cycler en hervat het thermische cycler-programma zoals gespecificeerd in tabel 12. Zodra het programma de laatste stap heeft bereikt, draait u de strip van het PCR-buisje kort. Plaats de strip van de PCR-buis in de magnetische standaard, wacht ongeveer 2 minuten totdat de oplossing is verdwenen.
   6. Breng ongeveer 50 μl supernatans van elke PCR-buisstrip over in het overeenkomstige putje van een nieuwe PCR-buisjesstrip. De striptube met de streptavidinekorrels kan worden weggegooid.
5. Opschoning van de uiteindelijke bibliotheken
   1. Laat magnetische kralen voor gebruik minimaal 30 minuten op kamertemperatuur komen. Bereid 4 ml 70% ethanol met nucleasevrij water. Bewaar op kamertemperatuur.
   2. Draai de magnetische kralensuspensie grondig totdat het mengsel uniform is en de kleur consistent lijkt.
   3. Voeg 50 μL kralensuspensie toe aan elk monsterbuisje. Sluit de buizen en vortex 5-10 s af, draai kort (zonder de magnetische kralen te pelleteren).
   4. Incubeer de kralensuspensies gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de strip van de PCR-buis over op een magnetische standaard en wacht 5-10 minuten totdat de oplossing helder wordt.
   5. Terwijl u de strip van de PCR-buisjes in de magnetische standaard houdt, verwijdert u voorzichtig de heldere oplossing uit elk putje en gooit u deze weg. Raak de kralen niet aan tijdens het verwijderen van de oplossing.
      1. Voer met de strip van de PCR-buis in de magnetische standaard twee wasbeurten uit met 70% ethanol op de volgende manier: voeg 200 μL 70% ethanol toe aan elk monster. Wacht 1 minuut om de verstoorde parels te laten bezinken en verwijder de 70% ethanol. Raak de kralen niet aan tijdens het verwijderen van de oplossing.
   6. Sluit na de tweede wasbeurt de buisjes af en draai de PCR-buisstrip kort rond om resterende ethanol op te vangen. Plaats de strip van de PCR-sonde gedurende 30 s op de magnetische standaard.
   7. Om de resterende ethanol te verwijderen, verwijdert u de strip van de PCR-buis van de magnetische standaard en houdt u deze maximaal 5 minuten niet-verzegeld (idealiter in een kap). Zorg ervoor dat de kralen volledig gedroogd zijn, maar er niet gebarsten uitzien, dit zou de efficiëntie van het elutieproces verminderen.
   8. Elueer het bibliotheek-DNA door 25 μL nucleasevrij water toe te voegen aan elke monsterbuis. Meng grondig door 10x-15x op en neer te pipetteren, sluit de PCR-buisstrip af en vortex gedurende 5-10 s. Bevestig de afwezigheid van zichtbare klonten.
   9. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de strip van de PCR-buis in een magnetische standaard en wacht ongeveer 5 minuten totdat de oplossing is verdwenen.
   10. Verwijder voorzichtig het geklaarde bovenstaande middel (ongeveer 25 μl) uit elk putje en breng het over naar een corresponderend putje in een verse PCR-buisstrip. Bewaar de monsters op ijs en gooi de kralen weg.
6. Kwaliteitscontrole
   1. Meet de DNA-concentratie van het gezuiverde bibliotheek-DNA. Om een betere gevoeligheid te bereiken, gebruikt u een op fluorescentie gebaseerde methode om het DNA in 1 μL te kwantificeren.
7. Sequencing van de volgende generatie
   OPMERKING: Afhankelijk van de capaciteit van het gebruikte platform en van de hoeveelheid sequencinggegevens die per monster nodig zijn, kunnen geïndexeerde bibliotheken uit verschillende batches worden gemultiplext in een enkele sequencing-run.
   1. Voordat u de monsters samenvoegt, moet u de DNA-concentratie van elk monster aanpassen aan 5 ng/μL. Bundel de bibliotheken in gelijke hoeveelheden om een evenwichtige weergave te behouden.
   2. Sequentie van de voorbereide bibliotheken met behulp van een high-throughput short-read sequencing-systeem met bijvoorbeeld een 150 bp paired-end leesconfiguratie (zie Materiaaltabel).

Tabel 9: Thermisch cyclerprogramma voor hybridisatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 10: Bereiding van de RNaseblokoplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 11: Bereiding van het sondehybridisatiemengsel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 12: PCR thermal cycler-programma na afvang. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 13: Bereiding van PCR-reactiemix na afvang. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Resultaten

Een studie naar de C. trachomatis LGV-uitbraak in Buenos Aires, Argentinië, toonde enkele nieuwe kenmerken in de monsters, namelijk 10 nucleotidesubstituties in het ompA-gen in vergelijking met ompA-genotype L1, en een ongebruikelijke Multi-Locus Sequence Typing (MLST) sequentie type 2 17,18,19. We wilden het genoom van deze klinische monsters onderzoeken en ze in de context van wereldwijde gegevens plaatsen. Om dit te bereiken, vergeleken we de prestaties van een doelverrijkingsbenadering met directe metagenomische sequencing voor WGS van bacteriële soa's uit klinische monsters, in een poging de uitdagingen van lage bacteriële belasting en overvloedig menselijk en microbieel DNA te overwinnen.

Het gebruikte DNA was ofwel afkomstig van rectale uitstrijkjes die tussen 2017 en 2023 in Buenos Aires, Argentinië, waren verzameld, geplaatst in 2-SP-medium (sucrosefosfaatmedium) aangevuld met 2% foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica (gentamicine 25 μg/ml, vancomycine 0,5 mg/ml en amfotericine B 2,5 μg/ml) en bewaard bij -80 °C, of gepoold urethraal, anorectaal, en faryngeale uitstrijkjes verzameld in het Universitair Ziekenhuis Zürich (USZ) in NAAT's (Nucleic Acid Amplification Tests) buffer. DNA uit de monsters van Buenos Aires werd geëxtraheerd met behulp van een handmatige extractiekit op basis van silica, terwijl DNA uit USZ-monsters werd geëxtraheerd met behulp van een geautomatiseerd systeem op basis van magnetische kralen.

Alle klinische monsters die in deze studie zijn opgenomen, werden positief bevestigd door een intern ontwikkelde multiplex real-time PCR-assay (zie materiaaltabel) met qPCR-cyclusdrempelwaarden (Ct) die als volgt variëren: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae: 24-31, T. pallidum: 27-36 en M. genitalium:  30-37. De DNA-concentratie werd gekwantificeerd met behulp van een zeer gevoelige fluorometrische test voorafgaand aan sequencing om het inputmateriaal van de klinische monsters te karakteriseren (zie Tabel met materialen).

Om directe metagenomische sequencing te vergelijken met doelverrijking, gebruikten we 32 monsters, waarvan er 29 positief waren voor C. trachomatis, negen voor N. gonorrhoeae, vijf voor T. pallidum en drie voor M. genitalium. Directe metagenomische sequencing resulteerde niet in volledige genomen en bereikte inderdaad nauwelijks doelgegevens boven de basislijn die werd gezien in negatieve monsters. Doelverrijking met hybridisatie bij 65 °C resulteerde in veel betere resultaten voor elke ziekteverwekker, en in veel gevallen werden succesvolle genomen verkregen uit deze methode (Figuur 1).

Om de optimale steekproefselectie voor doelverrijking te beoordelen, evalueerden we de relatie tussen diagnostische qPCR Ct-waarden en de efficiëntie van genoomherstel, zoals gemeten aan de hand van het percentage on-target reads (%OTR). Deze metriek weerspiegelt het aandeel van de sequencing-lezingen die overeenkomen met het genoom van het doelorganisme en wordt vaak gebruikt om de verrijkingsprestaties te beoordelen. Er werd een significante correlatie gevonden tussen de ziekteverwekkerbelasting en het succes van de sequencing voor C. trachomatis, met een Ct-cut-off voor succes rond Ct30. Hoewel de gegevens voor de andere doelpathogenen beperkt waren, werd een vergelijkbare trend waargenomen, waarbij succes bij genoomsequencing voornamelijk optrad in monsters met een pathogene belasting onder Ct30 (Figuur 2).

Dit experiment met een hybridisatietemperatuur van 65 °C gaf genoomsequencing succespercentages met doelverrijking van 75%-80% voor C. trachomatis, N. gonorrhoeae en T. pallidum, op basis van monsters met Ct-waarden onder de 30. De drie M. genitalium-positieve monsters hadden Ct-waarden van 30-37 en bereikten een lagere genoomdekking en gemiddelde leesdiepte. Om deze resultaten te verbeteren, hebben we geëxperimenteerd met het verlagen van de hybridisatietemperatuur, wat de hybridisatie verbetert vanwege het lage %G+C-gehalte in het genoom van M. genitalium . Met behulp van lagere hybridisatietemperaturen, zoals de nu aanbevolen temperatuur van 62,5 °C, kunnen we het herstel van M. genitalium-genomen verbeteren zonder het herstel van andere genomen in gevaar te brengen (Figuur 3). Deze resultaten tonen aan dat doelverrijking een effectieve benadering is voor het verkrijgen van waardevolle genomische informatie uit klinische monsters en kan worden aangepast aan een breed scala aan genomen, ook in een panelgebaseerd ontwerp.

Fylogenetische analyse van de succesvol verrijkte C. trachomatis-genomen toonde aan dat de meerderheid van de monsters uit Buenos Aires clusteren binnen de ompA-genotype L2b-clade, wat wijst op een succesvolle afstamming met wereldwijde circulatie. De analyse onthulde ook de aanwezigheid van een nieuwe, aparte afstamming in Argentinië, waardoor LGV ontstond. De monsters van deze clade verschillen ongeveer 600 SNP's van de andere LGV-lijnen, en deze afstamming wordt voorgesteld als ompA-genotype L4 (Figuur 4). Een gedetailleerde beschrijving van de monsters die zijn gebruikt in figuur 1, figuur 2 en figuur 4 wordt gegeven in aanvullende tabel 1.

Deze bevindingen onderstrepen de waarde van doelverrijking bij het bestuderen van de diversiteit van pathogenen en tonen een hoge mate van succes bij genoomsequencing aan van klinische monsters.

Figuur 1: Verrijking van genomen met behulp van doelverrijking in vergelijking met directe metagenomische sequencing. Het percentage on-target reads (%OTR), gedefinieerd als het percentage sequentie-reads dat in kaart wordt gebracht op het genoom van het doelorganisme, geeft de mate van verrijking weer die is bereikt met doelverrijking. De lijn geeft de mediaan van alle gegevenspunten weer en het vak geeft het interkwartielbereik (IQR) van 50% aan. De kleuren van de datapunten komen overeen met de steekproefbron: lichtblauw voor Argentinië en rood voor Zwitserland. Het succes van genoomsequencing, gedefinieerd als dekking >95% en gemiddelde leesdiepte >10, wordt weergegeven door grote punten, terwijl falen wordt aangegeven door kleine punten. Let op de verschillende schalen op de y-as. Afkortingen: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Correlatie van %OTR van doelverrijking met diagnostische qPCR Ct-waarden. De kleuren van het gegevenspunt geven de steekproefbron weer: lichtblauw voor Argentinië en rood voor Zwitserland. Het succes van genoomsequencing, gedefinieerd als dekking >95% en gemiddelde leesdiepte >10, wordt aangegeven door grote punten, terwijl falen wordt weergegeven door kleine punten. Let op de verschillende schalen op de y-as. Afkortingen: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Effect van hybridisatietemperatuur op het herstel van volledige genomen van alle soa-bacteriële pathogenen in tien monsters. Menselijk DNA in het bereik van dat in klinische monsters werd verrijkt met bekende concentraties van bacterieel doel-DNA afzonderlijk (enkelvoudig) en ook in totaal om een monster met meerdere infecties te vertegenwoordigen (gepoold). Er werden twee experimenten uitgevoerd, elk met de vijf pathogenen/combinaties: 0,01% en 0,03% om het geschatte percentage DNA van elk micro-organisme weer te geven ten opzichte van het totale DNA in het monster (het resterende DNA komt overeen met menselijk DNA). Het herstel van M. genitalium wordt verbeterd bij lagere temperaturen. C. trachomatis DNA was in een lage concentratie geprikt; verdere experimenten tonen aan dat de temperaturen geen invloed hadden op het herstel van het genoom van C. trachomatis (gegevens niet getoond). Afkortingen: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Voor recombinatie gecorrigeerde fylogenie van LGV-stammen uit Argentinië. De analyse omvat alle beschikbare LGV-genomen met gepubliceerde gegevens. Metagegevens die rechts van de fylogenie worden weergegeven, omvatten dubbele patiëntmonsters, Bayesiaanse analyse van de populatiestructuur (BAPS; cluster = clade, waarbij de polyfyletische BAPS-cluster 6 de genetische diversiteit van de populatie vertegenwoordigt), genoomsequencingmethode (gegevens uit deze studie), ompA-genotype , land en jaar, zoals aangegeven in de sleutel linksboven. Ontbrekende gegevens worden in het wit weergegeven. Genoomnamen uit deze studie zijn gemarkeerd in lichtblauw voor Argentinië en donkerblauw voor Finland (niet verkregen door doelverrijking). Deze kleuren worden uitsluitend gebruikt om de genomen te onderscheiden die in deze studie zijn gegenereerd. Bootstrap-waarden van 1000 ultrasnelle bootstraps worden weergegeven als percentages op de belangrijkste vestigingen. Dit cijfer is gewijzigd van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Beschrijving van de materialen, reagentia, instrumenten en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt. De tabel bevat gedetailleerde informatie over de handelsnaam, de fabrikant en het catalogusnummer van de componenten die worden gebruikt voor DNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding, doelverrijking en sequencing. Het omvat ook items die worden gebruikt voor interne qPCR-assays en algemene moleculair-biologische procedures. Gelijkwaardige alternatieven kunnen worden gebruikt voor items die zijn gemarkeerd met een asterisk (*). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het genereren van volledige bacteriële genoomgegevens uit klinische monsters is bijzonder uitdagend. Toch hebben we deze gegevens nodig om informatie te verkrijgen over circulerende klonen en om antimicrobiële resistentieprofielen te onderzoeken, met name bij kieskeurige en moeilijk te kweken bacteriën. Met behulp van alternatieve methoden zoals diepe sequencing of adaptieve sequencing met Oxford Nanopore Technologies kunnen niet voldoende gegevens worden verkregen voor analyse van de sequentie van het hele genoom. In gevallen zoals soa-monsters is doelverrijking de optimale techniek om toegang te krijgen tot het volledige genoom, en deze methode kan worden gebruikt voor een panel van bacteriële soa-pathogenen. Hoewel het geen goedkope procedure is, kunnen de resultaten die het kan bieden op geen enkele andere manier worden verkregen¹⁰.

De juiste steekproeven moeten zorgvuldig worden geselecteerd, idealiter om relevante en belangrijke vragen in diagnostiek en onderzoek te beantwoorden. Het medium dat voor de verzameling wordt gebruikt, speelt niet noodzakelijkerwijs een cruciale rol, met succesvolle sequenties verkregen uit zowel 2-SP- als NAAT-media. Monsteropslag is belangrijk, met als doel de integriteit van het DNA te behouden. De belangrijkste factor bleek de diagnostische belasting te zijn, waarbij werd gestreefd naar benaderende Ct-waarden onder Ct30. Voor monsters met Ct-waarden van meer dan 30 is het succes van volledige genoomsequencing minder waarschijnlijk, maar gedeeltelijke gegevens kunnen in sommige gevallen relevante informatie opleveren.

De procedure is niet triviaal en omvat vele stappen, waaronder PCR-cycli, hybridisatie en veel kralenwasbeurten. Zorgvuldige aandacht voor de procedure is vereist voor optimale resultaten. De kritieke stappen van het protocol - DNA-fragmentatie, hybridisatie met opnamesondes en magnetische kralen gebaseerde opname met wassen - vereisen een zorgvuldige uitvoering en de juiste behandeling. Het protocol kan na een paar pogingen door onderzoekers en technici worden geleerd. In de eerste rondes, tijdens het leren, kan het 3-daagse protocol een voordeel zijn; Met meer ervaren gebruikers kan het 2-daagse protocol de resultaten versnellen. Omdat de reagentia duur zijn, kan het de moeite waard zijn om een testrun uit te voeren zonder de dure componenten, bijvoorbeeld de sondes. Voor alternatieve aassets kan de hybridisatietemperatuur worden aangepast, wat de gevoeligheid of specificiteit van de verrijking kan verbeteren. Als er voldoende gegevens worden gegenereerd en een aanzienlijk deel van de PCR-duplicaten wordt waargenomen, kan ook het aantal PCR-cycli vóór en na de opname worden aangepast.

Gegevens die uit deze experimenten zijn verkregen, kunnen worden gebruikt om te typen, waarbij MLST en andere relevante doelen worden geëxtraheerd. Het kan verder worden geanalyseerd in een epidemiologische context, wereldwijd of lokaal, vergeleken met relevante genomen voor hedendaagse inzichten. Recombinatie en analyse van mobiele elementen in het hele genoom leiden ook veranderingen in de tijd en onder selectiedruk af, en mogelijke co-infecties. Met voldoende gegevens en bijbehorende metadata kunnen temporele berekeningen worden gemaakt en kunnen de voorouders van specifieke kenmerken en afstammingslijnen worden afgeleid, evenals mogelijke transmissieroutes en -mechanismen. Al deze vorderingen in onze kennis van een belangrijke groep ziekteverwekkers kunnen de strategieën voor de volksgezondheid informeren. Ons protocol en onze representatieve resultaten tonen het gebruik aan van syndromale paneldoelsondes, die effectief zijn in bacteriële soa-monsters en kunnen worden uitgebreid naar andere soorten monsters.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
8-kanaals pipet 0,5-10 µL	Eppendorf	3125000010	Eppendorf Research plus, 8-kanaals, 0,5-10 µL, middelgrijs, variabel volume.
8-kanaals pipet 10-100 µL	Eppendorf	3125000036	Eppendorf Research plus, 8-kanaals, 10-100 µL, geel, variabel volume.
Adapter Oligo Mix voor MBC-gelabelde bibliotheken	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
Geautomatiseerd nucleïnezuurextractiesysteem met behulp van een DNA-extractiekit voor virussen/pathogenen	Qiagen	937036 (kit) / 9001297 (instrument)	QIAsymphony SP/AS-instrument gebruikt met QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit voor geautomatiseerde DNA-extractie.
Binding Buffer	Agilent Technologies	5190-9687	Onderdeel van SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
DNA-extractiekit en geautomatiseerd instrument	Zymo Research Corporation	D3024/D3025	Quick-DNA Miniprep Kit gebruikt voor totale DNA-extractie uit klinische monsters. Handmatige of geautomatiseerde workflow compatibel.
End Repair- A Tailing Enzym Mix	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
End Repair Tailing Buffer	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
Ethanol	VWR Chemicals BDH	20816.298	Ethanol absoluut ≥99,5% Ph. Eur., USP
Fluorometer met hoge gevoeligheid dsDNA Assay / Fluorescerende methode voor het kwantificeren van DNA	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Qubit 4 Fluorometer met 1X dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit.
Fragmentatie Buffer	Agilent Technologies	5191-4080	Onderdeel van SureSelect Enzymetic Fragmentation Kit met de naam ''5X Fragmentatie Buffer''.
Fragmentatie Enzym	Agilent Technologies	5191-4080	Onderdeel van SureSelect Enzymetic Fragmentation Kit.
High-fidelity DNA polymerase buffer	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR) met de naam ''Herculase II Buffer''.
High-fidelity DNA polymerase buffer met dNTPs (5X)	Agilent Technologies	5190-9687	Onderdeel van SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) met de naam ''Herculase II Buffer''.
High-fidelity fusie-enzym voor PCR-amplificatie	Agilent Technologies	5191-5688	Onderdeel van SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) met de naam ''Herculase II''.
Hoge temperatuur wasbuffer	Agilent Technologies	5190-9687	Onderdeel van SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) met de naam ''Wash buffer 2''.
Hybridisatie Buffer	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
Gendiceerde sequencing primers	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Index Primer Pairs 1-96 voor ILM (Pre PCR).
In-house multiplex real-time PCR-test	Tib Molbiol	N/A	In-house ontwikkelde en geaccrediteerde test op basis van Lightmix Kits voor STI-detectie
Ligatie Buffer	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
Magneetkralen voor opruiming	Agilent Technologies	5191-5740	SureSelect DNA AMPure XP Beads.
Magneetstandaard	Permagen Labware	MSRLV08	0,2mL PCR 8 Strip Magnetic Separator 5 µL ~0,2mL Volume.
Next-generation sequencing (NGS): Hoogdoorvoersysteem voor korte leeslengtes	Illumina, Inc.	N/A	Paired-end 150 bp sequencing (PE150) uitgevoerd op Illumina NextSeq1000 en MiSeq-platforms.
Nuclease-vrij water	BioConcept	3-07F04-H	Water voor moleculaire biologie, DNA/DNAse/RNase-vrij, steriel, PCR-remmer-vrij.
Oligonucleotide Blocker Mix	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
PCR-buisjesstrook	avantor, geleverd door VWR	732-3608	PCR-buisjesstroken met aangehechte Flat Caps.
Post-Capture Primer Mix	Agilent Technologies	5190-9687	Onderdeel van SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
RNA-sonde	Agilent Technologies	5191-6916	SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb Probe, bijv. Design ID S3465164).
RNase Blocker	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
Wasbuffer op kamertemperatuur	Agilent Technologies	5190-9687	SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) met de naam ''Wash buffer 1''.
Streptavidinekralen	Agilent Technologies	5191-5742	SureSelect Streptavidin Beads.
T4 DNA Ligase	Agilent Technologies	5500-0147	Onderdeel van SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit voor ILM (Pre PCR).
Doelverrijkingsmethode / DNA-vangstmethode	Agilent Technologies	G9983-90000	SureSelect XT HS2 DNA Kit met Library Prep, Fast-Hyb Target Enrichment en Post-capture