Deze studie richt zich op de in vivo subcutane inductie van luminescente colorectale kankercellen in een muizenmodel en de daaropvolgende luminescentiemeting met behulp van een beeldvormingssysteem. De procedure heeft tot doel een reproduceerbaar tumorgroeimodel op te zetten voor real-time monitoring en therapeutische evaluatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Subcutane injectie van menselijke colorectale kankercellen bij athymische naakte muizen om de werkzaamheid van antitumoren te evalueren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Colorectale kanker (CRC) is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van kankergerelateerde sterfgevallen, wat de dringende behoefte aan verbeterde preklinische modellen benadrukt om mogelijke therapieën te evalueren. Diermodellen zijn essentieel voor het ophelderen van tumorbiologie en het beoordelen van nieuwe therapeutische interventies. Muismodellen bieden belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande modellen, waaronder genetische manipuleerbaarheid, snelle reproductie, kosteneffectiviteit en de beschikbaarheid van immunocompetente en immunodeficiënte stammen, waardoor nauwkeurige modellering van menselijke kankers mogelijk is.
Dit protocol richt zich op de subcutane inductie van de bioluminescente colorectale kankercellijn HCT-116 in een immunodeficiënt muizenmodel, gevolgd door niet-invasieve bioluminescentiebeeldvorming met behulp van het IVIS-systeem en de schuifmaat om tumorprogressie en -groei te volgen. Het gebruik van lichtgevende cellen biedt een realtime, kwantificeerbare benadering voor het volgen van tumorontwikkeling en respons op therapeutische interventies, waardoor de noodzaak van invasieve procedures wordt verminderd. Een cohort muizen (n = 12) is vereist voor de implantatie van tumorcellen en de luminescentie-intensiteit wordt gemeten om een gestandaardiseerd model voor therapeutische tests op te stellen. Het tumorvolume wordt doorgaans berekend met behulp van alleen lengte- en breedtemetingen of breedte.
De huidige methodologie zorgt voor een consistente vorming van de tumor en minimaliseert° de variabiliteit, wat uiteindelijk de betrouwbaarheid van de preklinische beoordeling verbetert. De bevindingen van deze studie zullen bijdragen aan het verfijnen van tumormodellen voor het testen van geneesmiddelen en het verbeteren van het translationele potentieel van preklinisch onderzoek in klinische toepassingen. Door gebruik te maken van geavanceerde beeldvormingstechnieken en een reproduceerbaar experimenteel ontwerp, heeft deze studie tot doel de nauwkeurigheid en efficiëntie van in vivo geneesmiddelevaluatie voor de behandeling van colorectale kanker te verbeteren.
Inleiding
Colorectale kanker (CRC) is een grote wereldwijde gezondheidslast en behoort tot de meest voorkomende en dodelijke maligniteiten1. Het ontwikkelen van betrouwbare preklinische modellen is essentieel voor het evalueren van nieuwe therapeutische benaderingen, aangezien traditionele in vitro testen er niet in slagen de complexiteit van tumorgroei en geneesmiddelrespons in een levend systeem volledig vast te leggen. In vivo modellen, met name muizenmodellen, zijn gebruikt om waardevolle inzichten te verschaffen in de tumorbiologie, waardoor onderzoekers de werkzaamheid van mogelijke behandelingen in een gecontroleerde omgeving kunnen beoordelen.
Het gebruik van luminescente CRC-cellen in muizenmodellen vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in preklinisch onderzoek, waardoor realtime, niet-invasieve monitoring van tumorprogressie mogelijk is2. Deze studie heeft tot doel een gestandaardiseerd protocol op te stellen voor subcutane tumorinductie en IVIS-beeldvorming om tumorgroei dynamisch te volgen. Er werd gekozen voor een subcutaan injectiemodel vanwege de technische eenvoud, reproduceerbaarheid en het gemak van longitudinale tumormonitoring. Door gebruik te maken van bioluminescentiebeeldvorming kunnen onderzoekers nauwkeurige, kwantificeerbare gegevens verkrijgen over tumorontwikkeling en therapeutische reacties zonder de noodzaak om dieren op meerdere tijdstippen te euthanaseren3.
Het IVIS-beeldvormingssysteem is een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van tumorlast met hoge gevoeligheid en specificiteit, waardoor de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van in vivo onderzoeken worden verbeterd. Deze studie zal dienen als basis voor toekomstige therapeutische evaluaties en een gestandaardiseerde en efficiënte benadering bieden voor preklinische geneesmiddelentesten voor de behandeling van colorectale kanker. Door het verfijnen van tumorinductiemethoden en het implementeren van geavanceerde beeldvormingstechnieken, draagt dit onderzoek bij aan het overbruggen van de kloof tussen preklinische en klinische toepassingen in de oncologie4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dieren werden gehouden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden volgens de richtlijnen die zijn opgesteld door de ethische commissie van het Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Murcia) (nr. A13240502). Inspecties werden wekelijks uitgevoerd door gekwalificeerd personeel in overeenstemming met RD 1201/2005.
1. Dieren
OPMERKING: Alle dieren moeten stevig en veilig worden vastgehouden voordat ze worden geïnjecteerd. Als u met immunodeficiënte muizen werkt (d.w.z. naakte athymische muizen zoals Crl: NU(NCr)-Foxn1nu), is het essentieel om steriliteit te behouden. De huidige studie gebruikte 12 athymische naaktmuizen, 5 weken oud (20-22 g voor vrouwtjes en 22-26 g voor mannetjes) aan het begin van het experiment (50% mannetjes). Alle anesthesie- en experimentele procedures werden uitgevoerd in de Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación van het centrum, met goedkeuring van de institutionele ethische commissie (Protocol nr. A13240502) en in overeenstemming met de Spaanse wetgeving (R.D. 1201/2005).
- Voordat met de test wordt begonnen, moeten de muizen, in de leeftijd van 4 weken, ongeveer 1 week in het dierencentrum acclimatiseren. Voer vervolgens de volgende procedures uit.
2. Bereiding van de D-luciferinebouillon
- Bereid een werkoplossing van 15 mg/ml D-Luciferine Kaliumzout Bioluminescent Substraat in voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een conische buis in een bioveiligheidskast. Keer de buis meerdere keren om om de oplossing goed te homogeniseren.
- Breng de oplossing over door een spuitfilter van 0,2 μm voor sterilisatie.
- Verdeel de gesteriliseerde oplossing in ondoorzichtige microbuisjes van 1 ml en bewaar bij -20 °C.
LET OP: Luciferine is lichtgevoelig.
3. Extracellulaire matrix voorbereiding
- Ontdooi de fenolroodvrije commerciële extracellulaire matrix (ECM) hydrogel 's nachts op ijs in de koelkast tussen 2 °C en 8 °C5.
- Bewaar de ECM op de dag van de injectie op ijs en breng met behulp van een voorgekoelde P1000-micropipet 200 μl ECM aan in steriele buisjes.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om microbuisjes met brede diameter te gebruiken. Minimaliseer temperatuurveranderingen en vermijd herhaalde vries-dooicycli. - Koel de spuiten en naalden voor op ijs voordat u injecties bereidt om plotselinge temperatuurveranderingen van de ECM te voorkomen.
4. Celloslating en tellen
- Plaat HCT-116 bioluminescente cellen (ATCC-cellijn CCL-247-LUC2) in T75-kolven een paar dagen voor de inductie van de tumor om voldoende celaantal te garanderen. Houd de celcultuur op 37 °C, 5% CO2 en vervang het medium indien nodig6.
- Zuig op de dag van het experiment het kweekmedium voorzichtig op om te voorkomen dat de aanhangende cellen worden gestoord.
- Was de cellen met 8 ml steriel PBS (voorverwarmd bij 30 °C in een waterbad) om het resterende serum te verwijderen.
- Voeg per kolf 2 ml warme trypsine-EDTA (0,05%) toe en incubeer 4-5 minuten bij 37 °C. Bewaak de celloslating onder een omgekeerde microscoop. Als de cellen blijven vastzitten, tik dan zachtjes op de zijkant van de kolf om het losmaken te bevorderen.
- Neutraliseer trypsine door 10 ml volledig groeimedium met foetaal runderserum (FBS) toe te voegen.
- Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Spoel de kolven af met nog eens 2 ml vers medium om eventuele resterende cellen op te vangen en voeg de wasbeurten toe aan de tube van 15 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het bovenstaande voorzichtig op zonder de celpellet te verstoren.
- Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 3 ml zaaimedium om een homogene suspensie te verkrijgen.
- Tel de cellen in een Neubauer-kamer of een automatische cellenteller. Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen door 10 μL van de celsuspensie te mengen met 10 μL Trypanblauw en tel levensvatbare cellen onder een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Bereid een voldoende aantal cellen voor op het onderzoek: minimaal 3 × 106 levensvatbare cellen per muis. - Resuspendeer de cellen in steriel PBS (voorverwarmd bij 30 °C in een waterbad) en wijzig de concentratie van levensvatbare cellen tot een eindconcentratie van 2 × 10-7 cellen/ml met PBS. Bereid aliquots van 200 μl.
5. Stel uitrustingsitems in en verdoven dieren.
- Schakel het beeldvormingssysteem ten minste 4 uur voor de beeldvorming in.
OPMERKING: Volg de instructies van het systeem om de initialisatiestap toe te staan, inclusief het aanpassen van instellingen voor lichtintensiteit en belichtingstijd van de camera, afhankelijk van de signaal-ruisverhouding. Deze instelling moet handmatig worden ingesteld op basis van de experimentele omstandigheden. - Weeg de dieren en bereken de hoeveelheid D-luciferine die moet worden toegediend (200 μl van een oplossing van 15 mg/ml per 20 g van het dier).
- Reinig en desinfecteer de beeldkamers en de kast.
- Identificeer en houd elke muis veilig in bedwang voor anesthesie.
OPMERKING: Draag twee paar handschoenen om de handen te beschermen tegen onbedoelde naaldprikken tijdens de subcutane injectie. - Verdoof muizen met 2% isofluraan in zuurstof bij een stroom van 1,8-2,0 l/min. Zet de zuigpomp gelijktijdig met de anesthesiepomp aan.
6. Voorbereiding van de cellen voor injectie
- Meng 200 μL 2 × 107 bioluminescente CRC-cellen/ml met 200 μL ECM in een cryovial in een bioveiligheidskast. Piket voorzichtig met een P1000-pipet om de vorming en dissociatie van luchtbellen te voorkomen.
- Breng het mengsel van 400 μl over in een spuit van 1 ml, verwijder de luchtbellen en ga onmiddellijk over tot injectie.
- Verwijder de dop van de naald veilig, waarbij de naald altijd steriel blijft.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voor elk dier individuele naalden te gebruiken om besmetting te minimaliseren. Voor elke muis wordt een nieuwe naald gebruikt om infectie bij muizen te voorkomen. - Bevestig een naald van 25 G en stel de inhoud van de spuit in op 200 μl, waarbij eventuele luchtbellen worden verwijderd.
OPMERKING: Injecties worden meestal gedaan met 200 μL, wat leidt tot 2 × 106 cellen per injectie. - Schuif de naald losjes terug in de dop zonder de dop of de naald vast te pakken terwijl het dier wordt vastgehouden.
7. Subcutane tumorinductie
- Haal de muis uit de kamer zodra deze is verdoofd en plaats de snuit van het dier in een stopcontact dat dezelfde verdoving toedient.
OPMERKING: In ons geval is het mondstuk gemaakt met behulp van een handschoen. - Leg het dier op zijn rechterzij op een vlakke ondergrond. Gebruik de toppen van de vingers van de niet-dominante hand om voorzichtig in de huid van het dier in het kwadrant linksonder te knijpen en op te tillen.
- Alvorens te injecteren, moet u eerst aspireren om er zeker van te zijn dat de naald op de juiste manier wordt geplaatst. Steek de naald met de dominante hand schuin omhoog, tweederde in de opgetilde huid, evenwijdig aan het lichaam, en zorg ervoor dat u geen vingers prikt of door de dubbele handschoenen prikt.
NOTITIE: De juiste plaatsing moet negatieve druk opleveren en geen aspiratie in de naaf van de naald. - Injecteer de inhoud van de spuit (200 μl) in de gelifte huid, precies tussen de twee vingers. Houd kort vast voordat u de naald langzaam terugtrekt. Verwijder de naald na de subcutane injectie en gooi deze veilig weg in een naaldencontainer.
8. Intraperitoneale injectie van D-luciferine
- Voordat het dier teruggaat naar de anesthesiekamer, dient u D-luciferine intraperitoneaal (IP) toe te dienen in een concentratie van 150 mg/kg lichaamsgewicht met de 15 mg/ml stockoplossing in een insulinespuit van 30 g (200 μl per 20 g van het dier).
OPMERKING: Injectie tot 0,5 ml wordt goed verdragen. - Handmatig vasthouden, dorsale lighouding (buikzijde naar boven), met het craniale (kop) uiteinde van het dier naar beneden gericht. Laat de darminhoud naar beneden bewegen.
- Houd de naald met de schuine kant naar boven en licht gekanteld op 15-20°, duw de naald in de buikholte zodat de punt van de naald net de buikwand van het kwadrant van de linker onderbuik van het dier binnendringt.
- Injecteer de D-luciferine langzaam in de intraperitoneale holte, verwijder de naald en gooi deze veilig weg.
- Plaats de muis in de anesthesiekamer en laat hem ongeveer 5 minuten stabiliseren. Ga na 15 minuten verder met in vivo beeldvorming.
OPMERKING: Construeer een kinetische curve van D-luciferine voor elk nieuw diermodel om de pieksignaaltijd te bepalen. In ons geval piekte de lichtemissie na ongeveer 15 minuten in in vivo beeldvorming.
9. In-vivo-analyse van beeldvorming
- Plaats het volledig verdoofde dier in de kamer van het beeldvormingssysteem, op de rechterflank. Zorg ervoor dat het dier goed is uitgelijnd met de camera en de lichtbron om het tumorgebied vast te leggen.
- Open de gekoppelde software. Kies de visuele of fotografische beeldvormingsmodus om de positie van het dier te bevestigen. Sla de gegevens op en wijzig de naam van de map.
- Kies de bioluminescentiebeeldvormingsmodus en stel deze in op automatisch. Leg bioluminescentiebeelden vast en bewaak het tumorlicht op het computerscherm.
- Zodra de beeldvorming is voltooid, brengt u het dier terug naar zijn kooi en observeert u eventuele complicaties.
- Voer nabewerking uit, schaal eerst het bioluminescente licht zodat alle muizentumoren dezelfde schaal vertonen, meestal tussen 1e6 en 1e8.
- Stel een Region of Interest (ROI) rond de tumor op voor analyse en kopieer deze voor verdere analyses. Meet het licht van de ROI en exporteer deze resultaten voor verdere analyse. Plak eerder gemaakte en gekopieerde ROI van dezelfde grootte voor volgende tumoren.
- Sluit het systeem af volgens de instructies van de fabrikant en reinig de beeldkamer. Schakel de afzuig- en anesthesiepompen uit, samen met de zuurstofstroom.
10. Meting van het tumorvolume
- Verdoof dieren met isofluraan voor tumormeting. Zet het dier stabiel en bedek zijn kop. Immobiliseer het dier snel.
- Meet de lengte, breedte en diepte van de tumor met behulp van een gekalibreerde digitale schuifmaat.
NOTITIE: Voer de metingen snel uit, aangezien het dier ongeveer 1 minuut na verwijdering uit de anesthesiekamer begint te ontwaken. - Herhaal metingen en bereken een gemiddelde.
- Bereken het volume volgens de formule voor sferische of elliptische tumoren:
Voor sferische tumoren 7
(1)
Voor ellipsoïde tumoren 8
(2)
OPMERKING: Om meetbias tot een minimum te beperken, moeten alle tumormetingen binnen het onderzoek door dezelfde operator worden uitgevoerd. Bovendien moet worden opgemerkt dat op de dag van tumorinductie nauwkeurige metingen vaak een uitdaging zijn omdat de tumormassa nog niet volledig is gestold.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol maakt het mogelijk om menselijke cellen in een immunodeficiënt muismodel te introduceren, waardoor de groei van deze tumorcellen in vivo mogelijk wordt, wat fysiologisch altijd relevanter is dan in vitro. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de experimentele omstandigheden zo reproduceerbaar mogelijk zijn, dat tumoren een vergelijkbaar aantal levensvatbare cellen bevatten en dat ze op een vergelijkbare en consistent toegankelijke locatie worde...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol voor de subcutane inductie van luminescente colorectale kankercellen in een athymisch naaktmuismodel presenteert een gestandaardiseerde en reproduceerbare benadering voor tumorvorming en real-time monitoring. Ten eerste is het belangrijk op te merken dat dergelijke onderzoeken doorgaans gedurende 28 dagen worden uitgevoerd, waarbij luminescentiemetingen worden uitgevoerd op de dag van tumorinductie en vervolgens wekelijks. Omgekeerd worden metingen van het tumorvolume niet o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed kunnen zijn op het werk dat in deze studie wordt gerapporteerd.
Dankbetuigingen
ACS en CNN behoren tot het "Health Sciences PhD Program, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spanje" en hebben PhD-beurzen van de UCAM. De auteurs zijn dankbaar voor de Animal Facility-platforms van IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Murcia), waar de preklinische test werd uitgevoerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL opaque microtubes tubes | Eppendorf | 30125215 | D-luciferin opslag |
| 15 mL conische buis | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Celcultuurmateriaal |
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | Celcultuurreagens |
| Athymic Nude Muis | Charles River | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | Immunodeficiente naakte muis |
| Bioluminescent Human Colon kankercellen HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 is ideaal voor in vivo bioluminescentie |
| D-luciferin Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | Voor bioluminescentie meting |
| Extracellulaire Matrix (ECM) | Corning | 356231 | Matrigel Matrix voor celinvasie |
| Foetaal Rundserum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Celcultuurreagens |
| Filter Pipettips | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Om luchtbelletjesvorming te voorkomen |
| Insulinspuit 25 G 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | Voor HCT-116 implantatie van cellijn |
| Insulinspuit 30 G 0.5 mL | DH Material medico | 9.41652E+15 | Voor D-luciferin toediening |
| IVIS beeldsysteem met Living Image software | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Bioluminescentie en fluorescentie beeldscanner |
| Naald Sterican Heparine | VWR | 612-0153 10 | Toediening van D-luciferin en HCT-116 implantatie |
| Fosfaat Buffered Saline (PBS) | VWR | 392-0042P | Celsuspensieoplossing voor het losmaken en implanteren van HCT-116 |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | Celcultuurreagens |
| T-75 Kolf, TC-Behandeld | STARLAB | CC7682-41 | Celcultuurmateriaal |
Referenties
- Brough, D., Amos, H., Turley, K., Murkin, J. Trends in subcutaneous tumour height and impact on measurement accuracy. Cancer Inform. 22, 11769351231165181(2023).
- Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732(2022).
- Evans, J. P., et al. Development of an orthotopic syngeneic murine model of colorectal cancer for use in translational research. Lab Anim. 53 (6), 598-609 (2019).
- Song, W. -J., et al. Colorectal cancer mouse metastasis model combining bioluminescent and micro-computed tomography imaging for monitoring the effects of 5-fluorouracil treatment. Transl Cancer Res. 12 (10), 2572-2581 (2023).
- Francescone, R. A., Faibish 3rd, M., Shao, R. A. A Matrigel-based tube formation assay to assess the vasculogenic activity of tumor cells. J Vis Exp. (55), e3040(2011).
- Li, C., Lau, H. C. -H., Zhang, X., Yu, J. Mouse models for application in colorectal cancer: Understanding the pathogenesis and relevance to the human condition. Biomedicines. 10 (7), 1710(2022).
- Jensen, M. M., Jørgensen, J. T., Binderup, T., Kjær, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16(2008).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Anim. 42 (6), 217-224 (2013).
- Jensen, M. M., Jørgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Med Imaging. 8, 16(2008).
- Vedder, A. R., et al. Effects of Corynebacterium bovis on engraftment of patient-derived chronic-myelomonocytic leukemia cells in NSGS mice. Comp Med. 69 (4), 276-282 (2019).
- Evans, M. S., et al. A synthetic luciferin improves bioluminescence imaging in live mice. Nat Methods. 11 (4), 393-395 (2014).
- Jain, S. Kinetic model for designing a cancer therapy. Cancer Cell Int. 2 (1), 13(2002).
- Chiu, W. -C., Ou, D. -L., Tan, C. -T. Mouse models for immune checkpoint blockade therapeutic research in oral cancer. Int J Mol Sci. 23 (16), 9195(2022).
- Peyton, S. R., Platt, M. O., Cukierman, E. Challenges and opportunities in modeling the dynamic tumor matrisome. BME Front. 4, 0006(2023).
- Ravoori, M. K., et al. Magnetic resonance imaging and bioluminescence imaging for evaluating tumor burden in orthotopic colon cancer. Sci Rep. 9 (1), 6100(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
