Method Article

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige, labelvrije beeldvorming van darmorganoïden is cruciaal voor het bestuderen van hun morfologie, groeidynamiek en reacties op omgevingsstimuli. Holotomografie (HT) biedt driedimensionale (3D) visualisatie met hoge resolutie van levende organoïden zonder dat er fluorescerende markers nodig zijn, waardoor fototoxiciteit wordt geminimaliseerd en de integriteit van het monster behouden blijft. Real-time fasegebaseerde beeldvorming maakt het mogelijk om structurele en functionele veranderingen continu en labelvrij te volgen. Door de brekingsindex te gebruiken als een intrinsiek beeldvormingscontrast, maakt deze methode kwantificering van biofysische eigenschappen zoals volume, eiwitdichtheid en eiwitgehalte mogelijk. De beeldvormingsgegevens worden verder verwerkt door middel van machine learning-gestuurde segmentatie en functie-extractie ter ondersteuning van consistente, high-throughput analyse. Dit protocol beschrijft de volledige experimentele workflow voor het gebruik van HT met lage coherentie in organoïdenonderzoek, met inbegrip van organoïdebereiding, beeldvorming en op machine learning gebaseerde gegevensanalyse. Door computationele segmentatie en kwantitatieve beoordelingen te integreren, maakt deze benadering een onbevooroordeelde evaluatie mogelijk van de belangrijkste organoïde eigenschappen, waaronder levensvatbaarheid, structurele organisatie en geneesmiddelrespons. De mogelijkheid om real-time morfologische veranderingen met subcellulaire resolutie vast te leggen, maakt dit protocol zeer toepasbaar op op organoïden gebaseerde studies in regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en farmaceutische screening. De stapsgewijze methodologie die hier wordt beschreven, vergemakkelijkt de reproduceerbaarheid en brede aanpassing in verschillende organoïdesystemen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden zijn driedimensionale (3D) geminiaturiseerde versies van organen gekweekt uit stamcellen, die in staat zijn om de belangrijkste structurele en functionele kenmerken van echte organen in vitro te recapituleren 1. Onderzoekers hebben organoïde systemen ontwikkeld voor een breed scala aan weefsels - waaronder de darm, hersenen, longen, lever en nieren - die elk de zelforganiserende architectuur en diversiteit van het celtype demonstreren die doet denken aan zijn in vivo tegenhanger. Door de inheemse orgaanarchitectuur en meercellige complexiteit te weerspiegelen, dienen organoïden als krachtige modelsystemen voor het bestuderen van menselijke ontwikkeling, weefselregeneratie en ziektemechanismen1. Ze zijn cruciale hulpmiddelen geworden voor ziektemodellering en het ontdekken van geneesmiddelen, waardoor onderzoekers ziektepaden kunnen verkennen en nieuwe therapieën kunnen testen op patiëntspecifieke 3D-weefsels in het laboratorium2. Met name organoïden zijn ook veelbelovend in de regeneratieve geneeskunde3: van organoïden afgeleide weefsels kunnen in vivo worden geënt om schade te herstellen, zoals aangetoond met darm- en leverorganoïden, wat hun potentieel voor het herstellen van de orgaanfunctie onderstreept4. Deze veelzijdigheid maakt organoïden onmisbaar in modern biomedisch onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde.

Gezien hun meercellige samenstelling en structurele 3D-complexiteit is het vastleggen en analyseren van de dynamiek van organoïden cruciaal. Conventionele beeldvormingstechnieken hebben echter te maken met aanzienlijke beperkingen bij het oplossen van organoïde structuren en dynamiek, waarbij vaak 2D-snapshots worden geproduceerd die niet hun volledige fysiologische toestand weergeven5.

Brightfield-microscopie is een veelgebruikte, niet-invasieve methode voor het vastleggen van organoïden. Het bewaakt gemakkelijk de groei en morfologie, maar biedt een beperkt contrast in ongekleurde 3D-monsters. Bovendien mist het optische doorsneden, wat resulteert in een slechte resolutie van interne structuren. Organoïden lijken grotendeels transparant, wat de detectie van fijne kenmerken onder het oppervlak belemmert6. Fasecontrast verbetert de zichtbaarheid door faseverschuivingen om te zetten in intensiteitsverschillen, waardoor de algemene architectuur (bijv. een centraal lumen) zonder vlekken wordt onthuld. Ondanks het nut ervan voor real-time observatie, lijdt het fasecontrast onder halo-artefacten, een lage resolutie en een beperkte penetratiediepte, waardoor het minder effectief is voor dikkere organoïden7.

Seriële doorsnede gevolgd door hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en op antilichamen gebaseerde immunokleuring wordt veel gebruikt om de organoïde microstructuur en cellulaire samenstelling te analyseren8. Verbeterde weefselverwerkingstechnieken, zoals formaline-gefixeerde paraffine-inbedding (FFPE) en cryosectie, verbeteren het behoud van de morfologie, waarbij FFPE superieure resultaten biedt9. Het inbedden van organoïden in hydrogels zoals agarose en centrifugatie brengen meerdere monsters op één lijn in één sectie, waardoor de analyse-efficiëntie wordt verbeterd. H&E-gekleurde secties van tumororganoïden afkomstig van patiënten weerspiegelen de oorspronkelijke tumorhistologie, terwijl immunofluorescentiekleuring markers zoals CK8 voor celidentificatie10 benadrukt. Deze technieken kunnen echter geen levende organoïden monitoren en kunnen artefacten zoals weefselrimpels of vervorming tijdens het doorsnijden introduceren.

Confocale fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt voor organoïde beeldvorming, wat optische secties met een hoge resolutie (sub-micrometer) oplevert die een gedetailleerde visualisatie van de organoïde-architectuur en cellulaire samenstelling mogelijk maken11,12. Confocale beeldvorming van 3D-organoïden is echter doorgaans beperkt tot oppervlakkige lagen (tot 100 μm diepte) en kan tijdrovend en fototoxisch zijn vanwege de laserverlichting met puntscanning13. Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) overwint enkele van deze beperkingen door alleen het beeldvormingsvlak te verlichten, waardoor snelle volumetrische beeldvorming van volledige organoïden wordt bereikt met minimale fotobleken en fototoxiciteit14,15; Deze techniek vereist echter vaak weefselopruiming voor een optimale beeldvorming van dikke preparaten. Bovendien wordt de LSFM-beelddiepte beperkt door lichtverstrooiing en brekingsindex (RI)-mismatches, die kunnen worden beperkt door adaptieve optica, multi-view beeldvorming en geoptimaliseerde excitatiegolflengten16. Monstermontage introduceert ook structurele vervormingen, terwijl grote 3D-datasets computationele uitdagingen met zich meebrengen bij opslag en analyse. Recente ontwikkelingen, waaronder verbeterde genetische labelingstechnieken, nieuwe clearingreagentia, adaptieve optica en AI-gestuurde beeldanalyse, pakken deze beperkingen aan, waardoor LSFM steeds haalbaarder wordt voor organoïdenonderzoek7.

Ondanks deze vooruitgang vormen 3D-fluorescentiebeeldvormingstechnieken verschillende uitdagingen voor de langetermijnmonitoring van levende organoïden. Ten eerste introduceert het gebruik van fluorescerende etikettering fototoxische effecten en verstoort het biologische processen, wat een uitdaging vormt voor langdurige live beeldvormingsstudies17. Ten tweede lijdt op antilichamen gebaseerde labeling aan beperkte penetratie als gevolg van diffusiebarrières binnen dichte organoïde structuren, waarvoor geavanceerde permeabilisatie- en weefselopruimingsmethoden nodig zijn, die langer dan 10 dagen incubatie duren voor het gebruik van eerste en secundaire antilichamen18. Ten derde blijven transfectie en stabiele fluorescerende eiwitexpressie in organoïden inefficiënt, aangezien conventionele benaderingen voor genafgifte worstelen met 3D-omgevingen19. Ten vierde leiden optische clearingtechnieken, essentieel voor diepe beeldvorming, vaak tot verlies van fluorescentiesignalen en weefselvervorming, waardoor geoptimaliseerde clearingprotocollen nodig zijn die transparantie en behoud van fluorescentie in evenwicht brengen20.

Om deze beperkingen aan te pakken, is holotomografie (HT) geïntroduceerd als een techniek voor het in de loop van de tijd afbeelden van niet-gelabelde live organoïden met een hoge resolutie. HT, ook bekend als 3D kwantitatieve fasebeeldvorming, is een labelvrije modaliteit met hoge resolutie die realtime, kwantitatieve visualisatie van organoïden mogelijk maakt met behoud van hun oorspronkelijke fysiologische toestand. Het principe van HT is analoog aan röntgencomputertomografie; door meerdere 2D-beelden van optische velden vast te leggen onder verschillende verlichtingsomstandigheden, wordt de 3D RI-verdeling van een niet-gelabeld monster gereconstrueerd door middel van het oplossen van inverse golfvergelijkingen 21,22,23. HT is op grote schaal toegepast op verschillende biologische gebieden, waaronder hematologie24,25, fasecondensatie in celbiologie26, microbiologie27 en histopathologie28. Meer recentelijk wordt de labelvrije 3D-beeldvormingscapaciteit met hoge resolutie in toenemende mate gebruikt voor organoïdenonderzoek 21,22,23,29, en biedt een niet-invasieve benadering voor het bestuderen van hun structurele en functionele dynamiek.

In deze studie presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van laagcoherente HT bij langdurige, labelvrije monitoring van dunne darmorganoïden (sIO's) van muizen. Deze methode maakt real-time visualisatie van organoïdegroei en geneesmiddelresponsen gedurende 24 uur mogelijk, terwijl kwantitatieve metingen van organoïdevolume, eiwitdichtheid en eiwitgehalte worden geboden, waardoor een rigoureuze, gegevensgestuurde analyse van organoïdegedrag mogelijk wordt. Om morfologische veranderingen in organoïden te onderzoeken, behandelden we de monsters met cisplatine, een op platina gebaseerd chemotherapeutisch middel waarvan bekend is dat het apoptose induceert door DNA-crosslinks te vormen en cellulaire replicatie te remmen30. Terwijl 3D RI-beeldvorming structurele details vastlegt, is systematische analyse essentieel voor het kwantificeren van de organoïdedynamiek. Om dit te bereiken, integreren we ilastik, een op machine learning gebaseerde segmentatietoolkit31 om organoïde regio's van de achtergrond te onderscheiden. Dit protocol schetst de volledige workflow, inclusief de voorbereiding van de organoïdecultuur, 3D HT-acquisitie, op machine learning gebaseerde segmentatie en kwantitatieve analyse van RI-tomogrammen. Door een schaalbaar, reproduceerbaar en niet-invasief beeldvormingskader te bieden, zet deze aanpak een nieuwe standaard voor organoïdenonderzoek met brede toepassingen in ziektemodellering, regeneratieve geneeskunde en screening van geneesmiddelen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en software die in dit protocol worden gebruikt, worden verstrekt in de Materiaaltabel. Gelijkwaardige producten van verschillende fabrikanten kunnen als alternatief worden gebruikt. Een schematisch proces van het gehele protocol wordt weergegeven in Figuur 1.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Bereiding van sIO kweekmedium
    1. Bereid het in de handel verkrijgbare kweekmedium voor volgens de instructies van de fabrikant. Steriliseer het kweekmedium door het te filteren door een filtereenheid van 0,22 μm.
      OPMERKING: Als het medium volledig onder steriele omstandigheden in een celkweekkap is bereid en alle componenten vooraf zijn gesteriliseerd (bijv. geleverd in steriele flessen en injectieflacons), is filtratie door een filter van 0.22 μm mogelijk niet strikt noodzakelijk.
    2. Verdun 15 ml bereid medium in steriele bewaarbuisjes. Verwarm het gedroogde medium tot kamertemperatuur (15 - 25 °C) voor gebruik in de organoïdencultuur.
  2. Ontdooien sIO voorraad
    1. Ontdooi de bevroren organoïde bouillon snel binnen 2 minuten met behulp van een waterbad van 37 °C. Breng de ontdooide organoïde suspensie over in een microcentrifugebuis en centrifugeer op 150 x g gedurende 3 minuten om de organoïden te pelleteren.
    2. Verwijder voorzichtig het bovenstaande om DMSO uit te wassen, waardoor mogelijke cytotoxische effecten tot een minimum worden beperkt.
    3. Voeg media en verse extracellulaire matrix (ECM) toe in een verhouding van 1:4 en pipetteer voorzichtig om een gelijkmatige resuspensie van de pellet te garanderen. Doseer 15 μL per koepel in elk putje van een plaat met 48 putjes. Houd ECM op ijs om voortijdige polymerisatie te voorkomen.
    4. Plaats de plaat ondersteboven gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om ECM-polymerisatie mogelijk te maken. Voeg na polymerisatie voorzichtig 200 μL verse media toe aan elk putje.
      OPMERKING: Dit protocol is compatibel met verschillende commerciële beeldvormingsschotels en putplaten. Pas het mediavolume aan op basis van het type put om ervoor te zorgen dat de ECM-koepel volledig ondergedompeld is.
  3. Passeren van sIO's
    OPMERKING: Organoïden hebben de neiging zich te hechten aan pipetpunten. Om de hechting te minimaliseren, maakt u de pipetpunten nat met het medium.
    1. Aspireren verbruikt medium. Voeg 200 μl celhersteloplossing toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C om de afbraak van ECM en het ophalen van organoïden te vergemakkelijken.
    2. Verzamel de organoïde suspensie door voorzichtig te pipetteren en breng deze over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer op 150 x g gedurende 3 minuten en verwijder dan voorzichtig het supernatant.
    3. (Optioneel) Voer een van de volgende dissociatiemethoden uit om als afzonderlijke cellen te passeren:
      1. Enzymatische methode: Voeg 100 μL eencellige dissociatieoplossing toe aan de pellet en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 1-2 min. Voeg 150 μL media toe om te neutraliseren. Pipetteren of zachtjes tikken. Centrifugeer 3 minuten bij 150 x g en verwijder het supernatant, zodat alleen de pellet overblijft.
        OPMERKING: Vermijd te veel incubatie, aangezien langdurige blootstelling zeer schadelijk kan zijn voor cellen.
      2. Mechanische dissociatie: Resuspendeer de pellet in 200 μL kweekmedium. Gebruik een P200-pipet om organoïden 20x-30x op en neer te pipetteren om organoïden mechanisch te dissociëren in kleinere fragmenten of afzonderlijke cellen. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 150 x g , zuig vervolgens het bovenstaande op en bewaar de pellet.
    4. Voeg media en verse ECM toe in een verhouding van 1:4 en pipetteer voorzichtig om een gelijkmatige resuspensie van de pellet te garanderen. Doseer 15 μL per koepel in elk putje van een plaat met 48 putjes.
    5. Plaats de plaat ondersteboven in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur om de ECM de kans te geven polymeriseren.
    6. Voeg na polymerisatie 200 μL vers kweekmedium toe aan elk putje en vul de lege buitenste putjes met PBS om verdamping te voorkomen. Vervang de voedingsbodem elke 2-3 dagen en passeer de organoïden wekelijks. Pas het passage-interval aan volgens de gewenste organoïdegrootte.
  4. Medicamenteuze behandeling
    1. Bereid een 10 mM stockoplossing van cisplatine door 3,00 mg cisplatinepoeder (MW ≈ 300,05 g/mol) op te lossen in 1 ml DMSO. Draai kort en bescherm de oplossing tegen licht met behulp van amberkleurige buisjes of door ze in aluminiumfolie te wikkelen.
    2. Om het behandelingsmedium voor te bereiden, verdunt u de 10 mM cisplatinevoorraad 1:1.000 in volledig sIO-kweekmedium om een uiteindelijke concentratie van 10 μM cisplatine en 0,1% DMSO te verkrijgen.
    3. Bereid voor de voertuigcontrole 0,1% DMSO in kweekmedium om overeen te komen met de uiteindelijke DMSO-concentratie zonder cisplatine.
    4. Verwijder het gebruikte medium uit sIO-culturen en vervang het voorzichtig door een 10 μM cisplatinehoudend medium of een controlemedium met alleen DMSO.
    5. Breng de monsters na de behandeling over naar de incubator van het beeldvormingssysteem.

2. Holotomografiebeeldvorming met lage coherentie met behulp van besturingssoftware

  1. Monstervoorbereiding voor beeldvorming
    1. Doseer 15 μL organoïde-ECM-koepel op de #1.5 beeldschaal met dekglaasbodem door de procedure te volgen die wordt beschreven in de stappen 1.3.1-1.3.4. Plaats elke koepel in de schaal zo dicht mogelijk bij het midden voor een optimale beeldvorming.
    2. Incubeer voorafgaand aan de polymerisatie 1 minuut bij kamertemperatuur om de organoïden naar de bodem te laten zakken.
    3. Plaats de plaat ondersteboven in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 1 uur om de ECM te polymeriseren. Voeg vervolgens voorzichtig voldoende kweekmedium toe om de organoïden volledig onder te dompelen.
      OPMERKING: Pas het gemiddelde volume aan om ervoor te zorgen dat de organoïden volledig ondergedompeld zijn, afhankelijk van de grootte van de beeldvormingsschotel met dekglaasbodem.
    4. Was het monster 5x-3x 5 dagen na de passage 2x-3x met PBS onmiddellijk voor de beeldvorming om vuil te verwijderen en optische artefacten te verminderen.
  2. Beeldvorming instellen
    1. Schakel de omgevingscontroller in om de levensvatbaarheid van het monster te behouden. De kamerregelaar stelt automatisch de temperatuur in op 37 °C en de CO2 -concentratie op 5%.
    2. Druk op de deurknop aan de voorkant van het instrument om de deur te openen. Voeg water toe om een dunne laag in de kamerput te vormen om te voorkomen dat de kweekmedia uitdrogen.
    3. Plaats de beeldvormingsschotel in een geschikte vathouder, plaats deze in de beeldkamer en zet deze vast met een pin om beweging te voorkomen. Zorg ervoor dat de schaal stevig aan de vathouder is bevestigd zonder te kantelen.
    4. Sluit de deur van het instrument met de deurknop om externe lichtinterferentie te blokkeren.
    5. Start de TomoStudio X-software en log in. Klik op Start om het hoofdvenster te openen.
    6. Klik op Project toevoegen in de linkerbovenhoek en wijs experimentele parameters toe (bijv. projectnaam, mediumtype, voorbeeldtype, enz.). Het monsterpaneel wordt automatisch aangemaakt. Zorg ervoor dat het juiste mediumtype is toegewezen voor het gebruik van de juiste RI in het experiment.
    7. Klik op de Gewenste put in het paneel en klik bovenaan op Maken om de putten als exemplaren te registreren.
    8. Klik op ROI-instelling in de rechterbovenhoek om het interessegebied (ROI) in het gerecht te definiëren. Zodra alle parameters zijn ingesteld, klikt u op Experiment uitvoeren in de rechterbenedenhoek om het venster voor het verzamelen van afbeeldingen te openen.
    9. Klik op Laadschip in de rechterbovenhoek. Er verschijnt een helderveldafbeelding. Pas de Z-positie aan met de +Z - en -Z-knoppen om scherp te stellen.
    10. Pas op het tabblad Enkele beeldvorming de ROI-grootte aan. Leg organoïden vast binnen een gezichtsveld van 160 μm x 160 μm en verkrijg axiale stapels tot 140 μm diep. Voor grotere organoïden kunt u meerdere RI-tomogrammen en steekafbeeldingen aanschaffen door het selectievakje Tile Imaging onderaan aan te vinken.
    11. Navigeer naar het tabblad Time Lapse Imaging om langetermijnbeeldvorming te configureren. Stel de duur en intervaltijd naar wens in. In dit experiment werd time-lapse-beeldvorming uitgevoerd met tussenpozen van 10 minuten gedurende een periode van 24 uur en de analyse werd uitgevoerd met tussenpozen van 2 uur gedurende dezelfde duur.
    12. Klik op het pictogram Scannen om de huidige ROI-locatie vast te leggen. Centreer de ECM-koepel handmatig met behulp van helderveldbeeldvorming. Klik op de BF-knop om de intensiteits- en belichtingswaarden voor helderveldbeelden aan te passen.
    13. Selecteer ROI door het ROI-vak te verplaatsen dat wordt weergegeven in het deelvenster Voorbeeld. Zodra de gewenste ROI is gevonden, klikt u onderaan op Punt toevoegen . De lijst met beeldvormingspunten verschijnt.
    14. Klik op Verkrijgen om de beeldvorming te starten. De onbewerkte beeldgegevens worden verkregen.
  3. Acquisitie van afbeeldingen
    OPMERKING: Dit proces genereert een Tomocube Common File (TCF) op basis van onbewerkte afbeeldingsgegevens. De onbewerkte beeldgegevens moeten worden verwerkt in een TCF-bestand, dat meerdere soorten afbeeldingen bevat, zoals een RI-tomogram en een projectie met maximale intensiteit. Het RI-tomogram vertegenwoordigt de 3D RI-verdeling van het monster en de projectie van de maximale intensiteit toont de hoogste RI-waarde voor elke laterale positie in het XY-vlak.
    1. Sleep onbewerkte afbeeldingsbestanden naar de HTX-verwerkingsserver. Klik op Verwerken om een TCF-bestand te genereren op basis van het onbewerkte afbeeldingsbestand.
    2. Gebruik TomoAnalysis Viewer, MATLAB of Python om de RI-tomogrammen weer te geven die in het TCF-bestand zijn gegenereerd. Om een TCF-bestand in MATLAB te bekijken, gebruikt u functies zoals h5info en h5read. Gebruik in Python ook het h5py-pakket voor het lezen van H5-bestanden.

3. Beeldanalyse

  1. Beeldsegmentatie op basis van machine learning
    1. Exporteer het TCF-afbeeldingsbestand naar het HDF5-formaat (aanvullend coderingsbestand 1) om ervoor te zorgen dat de gegevens een multidimensionaal formaat hebben dat compatibel is met ilastik.
    2. Open ilastik en navigeer naar Bestand > nieuw project. Selecteer Pixelclassificatie onder de sectie Segmentatiewerkstromen. Sla het projectbestand op in een aangewezen map.
    3. Laad het HDF5-bestand door naar 1 te gaan. Tabblad Invoergegevens. Klik op Nieuw bestand toevoegen, selecteer de juiste H5-gegevensset en zorg ervoor dat de juiste afbeeldingskanalen zijn toegewezen.
    4. Navigeer naar 2. Tabblad Functieselectie om relevante kenmerken te selecteren (Kleur/Intensiteit, Rand, Textuur) om de segmentatie te optimaliseren.
      OPMERKING: De selectie van functies kan variëren, afhankelijk van de dataset en de kenmerken van de afbeelding. Voor de huidige analyse waren de geselecteerde functies: Kleur/intensiteit (σ = 1,60), Rand (σ = 3,50) en Textuur (σ = 1,60). Afhankelijk van de complexiteit van het beeld kan optimalisatie op basis van een heuristische benadering nodig zijn. Als alternatief kan de functie Functies voorstellen > Functieselectie uitvoeren in ilastik worden gebruikt om een optimale set parameters te identificeren.
    5. In 3. Trainingstabblad, label organoïde en niet-organoïde regio's door penseelstreken van verschillende kleuren toe te passen. Om de segmentatiegetrouwheid te verbeteren, annoteert u zorgvuldig regio's rond grenzen.
    6. Klik op Live Update om een voorbeeld van de segmentatieresultaten te bekijken en indien nodig verfijningen aan te brengen.
    7. Navigeer naar 4. Voorspelling exporteren. Kies in de bronselectie de optie Eenvoudige segmentatie om gelabelde voorspellingen te exporteren. Klik op Alles exporteren en zorg ervoor dat de uitvoerindeling is ingesteld op .h5 of .tiff, afhankelijk van de vereisten voor downstreamanalyse.
  2. Kwantitatieve functieanalyse
    OPMERKING: Deze protocolstap wordt uitgevoerd in MATLAB, waarbij elke procedure wordt beschreven in Aanvullend coderingsbestand 2.
    1. Door het RI-tomogram te combineren met de maskerafbeelding, maakt u een gemaskeerde RI-afbeelding die alleen het organoïde gebied bevat.
    2. Bereken met behulp van het gemaskeerde RI-beeld kwantitatieve parameters zoals organoïdevolume, eiwitdichtheid en eiwitgehalte.
      1. Volume: Bereken het totale volume van de organoïde door het aantal pixels in het gesegmenteerde masker te vermenigvuldigen met de pixelresolutie voor de X, Y en Z. Bereken het aantal pixels door alle voxelwaarden in de organoïde-gelabelde maskerarray te tellen, met behulp van de ingebouwde MATLAB-functie Som.
        OPMERKING: De pixelresolutie wordt bepaald door het beeldvormingssysteem en is te vinden onder de groep Gegevens > 3D-attributen binnen de HDF5-structuur.
      2. Eiwitdichtheid: Bereken de eiwitdichtheid door de gemiddelde RI-waarde af te trekken van de gemiddelde organoïde RI en deze te delen door de Protein Refractive Index Increment.
        1. Medium RI: Meet de RI van het omringende medium met behulp van een refractometer voorafgaand aan de analyse.
        2. Gemiddelde RI-waarde: Bepaal de gemiddelde RI van de organoïde door het gemiddelde te nemen van de RI-waarden van voxels die zich in het organoïdemasker bevinden.
        3. Protein Refractive Index Increment (α): Gebruik een eerder gerapporteerde empirische constante die is afgeleid van studies naar brekingsindexverhogingen.
      3. Eiwitgehalte: Bereken het totale eiwitgehalte door het in stap 3.2.2.1 bepaalde volume te vermenigvuldigen met de in stap 3.2.2.2 verkregen eiwitdichtheid.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 illustreert de schematische workflow voor 4D-beeldvorming en kwantitatieve analyse van sIO's. Dit protocol maakt continue live beeldvorming en uitgebreide beoordeling van sIO's mogelijk via een proces in vier stappen: cultuur, 4D-beeldvorming, beeldverwerking en kwantitatieve analyse (Figuur 1D).

Na een incubatietijd van 5 dagen werden rijpe sIO's overgebracht naar beeldvormingsschalen met de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Holotomografie biedt een krachtige benadering voor labelvrije beeldvorming met hoge resolutie van levende organoïden, waarmee veel uitdagingen van conventionele beeldvormingstechnieken worden overwonnen. In dit protocol beschrijven we een uitgebreide methodologie voor het toepassen van low-coherence HT op sIO-onderzoek, waardoor realtime, kwantitatieve visualisatie van organoïde morfologie, groeidynamiek en respons op medicamenteuze behandeling mogelijk is. De integratie van op machine l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. en Y.K.P. hebben financiële belangen in Tomocube Inc., een bedrijf dat holotomografie en kwantitatieve fasebeeldvormingsinstrumenten op de markt brengt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de subsidie van de National Research Foundation of Korea, gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) via het International Cooperative R&D-programma (P0028463), en de subsidie van het Korean Fund for Regenerative Medicine (KFRM), gefinancierd door de Koreaanse regering (het ministerie van Wetenschap en ICT en het ministerie van Volksgezondheid en Welzijn) (21A0101L1-12). De data-acquisitie werd uitgevoerd door M.J.L. en J.H.L., waarbij J.H.L. verantwoordelijk was voor de gegevensverwerking en J.M.C. voor de data-analyse. Alle auteurs hebben bijgedragen aan het schrijven van het manuscript. We danken ChulMin Oh en Chungha Lee voor waardevolle technische discussies en hulp bij de voorbereiding van de figuur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48-well plate Corning3548Kweekschaal
Cell recovery solution Corning354253Matrigel degradatie 
CisplatinsupelcoPHR1624N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650Voertuig
Eppendorf tubeCorningMCT-175-C-SN/A
HTX processing serverTomocube Inc., KoreaN/AData verwerkingsserver
HT-X1Tomocube Inc., KoreaN/ABediening software
IlastikN/AN/AMachine learning-gebaseerd segmentatie-toolkit
Imaging dish vessel holder Tomocube Inc., KoreaN/ABeeldvormingsschaal houder
IntestiCult Organoid Growth Medium (Muis)STEMCELL Technologies#06005Commercieel verkrijgbaar kant-en-klaar kweekmedium 
MatlabMathWorksMatlab 2024aSoftware voor beeldverwerking
MatrigelCorning356231ECM voor 3D organoïden
Millipore Steritop Vacuum Bottle Top FilterMerckS2GPT05RE0,22 μm filtereenheid voor medium sterilisatie
Muis intestinale organoïdenSTEMCELL Technologies#70931N/A
RefractometerATAGOR-5000Brekingsindex calculator
TomoDishTomocube Inc., Korea901002-02#1.5 coverslip-bodem beeldvormingsschaal
TomoStudio XTomocube Inc., KoreaN/ABeeldvormingssoftware
TrypLEGibco12604Eencellig dissociatie
```

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Holotomography ImagingIntestinal OrganoidsLabel Free Imaging3D Organoid ImagingMachine Learning SegmentationRefractive Index MappingOrganoid MorphologyProtein Density QuantificationDrug Response AnalysisTime Lapse Imaging

Related Articles