Methodenartikel

Asymbiotische ontkieming en regeneratie op basis van bladexplantatie van de bedreigde medicinale orchidee Hemipilia cucullata uit rijpe zaden

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68541

⸱

19 september 2025

 ,  ,  , 
1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de asymbiotische zaadontkieming, de ontwikkeling van zaailingen en de rek van scheuten in Hemipilia cucullata te optimaliseren. Het protocol maakt ook de inductie van protocorm-achtige lichamen uit steriele bladexplantaten mogelijk, waardoor efficiënte in vitro vermeerdering wordt vergemakkelijkt voor het behoud en duurzaam gebruik van deze bedreigde medicinale orchidee.

Samenvatting

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) is een terrestrische orchidee die alom wordt gewaardeerd om zijn geneeskrachtige eigenschappen en sierlijke aantrekkingskracht, maar de wilde populaties worden bedreigd door aantasting van het leefgebied, lage levensvatbaarheid van zaden en beperkt bestuivingssucces. Om het behoud en duurzaam gebruik ervan te ondersteunen, ontwikkelde deze studie een geoptimaliseerd protocol voor de asymbiotische kieming van rijpe zaden, de ontwikkeling van protocormen, scheutverlenging en protocorm-achtige lichaamsinductie (PLB) uit steriele bladexplantaten. Zaden gekweekt in 1/2 MS vloeibaar medium aangevuld met 0,5 mg/L NAA vertoonden een kiemkracht van 72 ± 6%, significant hoger dan het controlemedium (46%) en vaste medium (31%), waarbij de ontkieming ongeveer 21 dagen eerder begon in vloeibare cultuur. Protocormen werden subgekweekt op B5-medium dat 0,5 mg/L BA, 0,2 mg/L NAA en 100 ml/L kokoswater bevatte, wat leidde tot efficiënte proliferatie. Na 5-6 weken werden de plantjes overgebracht naar een scheutenrekmedium (B5 aangevuld met 0,5 mg/L BA en 1 mg/L NAA), waar ze een robuuste scheutenrek en gezonde bladvorming vertoonden. Voor PLB-inductie werd de hoogste inductiesnelheid (44,3 ± 5,1%) bereikt op MS-medium met BA (3 mg/l) en NAA (0,2 mg/l). Dit uitgebreide en reproduceerbare protocol kan een effectief platform zijn voor de grootschalige vermeerdering en ex situ conservering van H. cucullata, en biedt waardevolle ondersteuning voor herstelinspanningen van deze bedreigde orchidee.

Inleiding

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, algemeen bekend als cucullaat neottianthe orchidee, is een wilde terrestrische orchidee afkomstig uit gematigd Eurazië en is wijd verspreid van Polen tot Japan1. Aanvankelijk geclassificeerd in het geslacht Neottianthe, werd deze soort onlangs opnieuw toegewezen aan het geslacht Hemipilia, sectie Neottianthe, op basis van moleculair bewijs2. De plant groeit uit ondergrondse knollen en bereikt een hoogte tot 30 cm en produceert roze of paarsrode bloemen die in een eenzijdige aar zijn gerangschikt. Door de elegante vorm en aantrekkelijke kleur van de bloemen heeft het een aanzienlijke sierwaarde. Bovendien wordt de hele plant in meerdere landen erkend als een geneeskrachtig kruid, waar het op grote schaal wordt gebruikt voor verschillende therapeutische doeleinden, waaronder de behandeling van hartaandoeningen, verbetering van de bloedcirculatie, verlichting van kneuzingen en bevordering van fractuurgenezing 3,4. Recente fytochemische studies hebben verschillende anthocyanen in deze soort geïdentificeerd, zoals cyanidine 3-oxalylglucoside, chrysant en cyaan, die antioxiderende en vasoprotectieve eigenschappen bezitten en kunnen bijdragen aan de geneeskrachtige effecten 5,6.

Momenteel worden wilde populaties van H. cucullata bedreigd door verlies van leefgebied en verstoringen van het milieu, wat leidt tot ernstige afname van de populatie en, in sommige gebieden, de soort met uitsterven bedreigd 3,7,8. Het behoud van deze soort is echter bijzonder uitdagend vanwege moeilijkheden bij de natuurlijke voortplanting. In het wild plant H. cucullata zich zowel klonaal als seksueel voort, maar beide modi zijn inefficiënt. Natuurlijke klonale voortplanting is traag en zeldzaam, terwijl seksuele voortplanting wordt beperkt door een slecht bestuivingssucces en een lage levensvatbaarheid van zaden 9,10. Bovendien hebben veldonderzoeken een duidelijk onevenwichtige leeftijdsstructuur aan het licht gebracht, met een schaarste aan jonge individuen en beperkte natuurlijke rekrutering, vooral onder antropogene of pyrogene stressomstandigheden 7,8,11. De zaden van H. cucullata zijn, net als veel orchideeën, klein, missen endosperm en hebben specifieke schimmelpartners nodig voor ontkieming, wat de natuurlijke regeneratie verder bemoeilijkt. Ondanks de brede geografische spreiding nemen de populatieomvang en de leeftijdsopbouw van wilde populaties af en nemen de lokale uitstervingsrisico's toe7. Daarom is het opzetten van een efficiënte methode voor kunstmatige snelle vermeerdering essentieel, zowel voor het behoud van kiemplasmabronnen als voor het duurzame gebruik van deze orchideeënsoort.

Onder de beschikbare vermeerderingstechnieken kan symbiotische kieming - gebaseerd op de associatie met orchideeënmycorrhiza-schimmels - natuurlijke processen nauwkeurig simuleren, maar is vaak moeilijk te standaardiseren vanwege de afhankelijkheid van soortspecifieke schimmelpartners 12,13,14. Asymbiotische kieming daarentegen biedt een eenvoudiger en beter reproduceerbaar alternatief dat veel wordt gebruikt in weefselkweeksystemen voor orchideeën15. Hoewel er protocollen voor asymbiotische kieming en snelle vermeerdering zijn ontwikkeld voor verschillende medicinale orchideeën zoals Bletilla, Dendrobium en Cypripedium 16,17,18,19, is soortspecifieke optimalisatie van kweekmedia en weefselkweekomstandigheden voor H. cucullata nog steeds vereist.

In deze studie gebruikten we rijpe zaden van H. cucullata verkregen door handmatige kruisbestuiving van wilde individuen (Figuur 1A) op Mount Tianmu in Oost-China (30°20' N, 119°22'E) om een effectief protocol op te stellen en te optimaliseren voor asymbiotische zaadontkieming, de ontwikkeling van zaailingen en scheutenrek. Daarnaast hebben we een regeneratiesysteem ontwikkeld van bladexplantaten via PLB-inductie, waarmee we bijdragen aan het behoud en de teelt van deze bedreigde medicinale orchidee.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Draag voordat u met het experiment begint persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Voer alle procedures uit onder een laminaire stromingskap voor steriliteit. Ga voorzichtig om met ethanol en natriumhypochloriet en gooi afval weg volgens de veiligheidsvoorschriften van het laboratorium.

1. Capsulesterilisatie en zaadextractie

  1. Plaats de capsule in een bekerglas. Voeg 1-2 druppels wasmiddel toe en spoel grondig af met kraanwater om oppervlakteverontreinigingen te verwijderen.
  2. Was de capsule 5 minuten onder stromend water. Absorbeer het oppervlaktewater met steriel absorberend papier.
  3. Breng de capsule over naar een steriele werkbank voor verdere desinfectie.
  4. Dompel de capsule 30 s onder in 75% (v/v) ethanol.
  5. Steriliseer de capsule door deze onder te dompelen in 50 ml 20% (v/v) natriumhypochlorietoplossing (verdund uit een in de handel verkrijgbaar bleekmiddel dat ~5% beschikbaar chloor bevat), met toevoeging van 2 druppels onverdund huishoudelijk afwasmiddel gedurende 10-12 minuten.
  6. Spoel de capsule vijf keer met steriel gedestilleerd water om achtergebleven desinfectiemiddel te verwijderen.
  7. Verwijder met een steriel scalpel ongeveer 1 mm van zowel de top als de basis (steeluiteinde) van de capsule.
  8. Maak een kleine incisie aan de bovenkant van de capsule om de zaden bloot te leggen. Plaats de capsule in een steriel petrischaaltje voor zaadextractie.

2. Bereiding van kweekmedium

  1. Bereid 1/2 MS vloeibaar medium: Gebruik de helft van de macronutriëntenconcentraties van het standaard MS-medium, behoud alle andere componenten zoals in het MS-medium, voeg 20 g/L sacharose en α-naftaleenazijnzuur (NAA, 0,5 mg/L) toe en pas de pH aan op 5,8.
  2. Doseer het medium na het koken onmiddellijk in kweekflessen van 500 ml (het aantal flessen kan worden aangepast aan de gewenste vermeerderingsschaal).
  3. Plaats het gedoseerde medium in een autoclaaf en steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 °C. Haal het medium na sterilisatie uit de autoclaaf en laat het voor gebruik afkoelen tot kamertemperatuur.

3. Ontkieming van zaden

  1. Gebruik een steriele tang om ongeveer 500-600 zaden gelijkmatig in elke fles medium te verspreiden (bereid in stap 2.3). Laat de zaden water opnemen en zich op de bodem van het vloeibare medium nestelen.
  2. Houd culturen op 25 °C met een licht/donkercyclus van 12 uur en een lichtintensiteit van 36 μmol·m-2·s-1.
  3. Observeer wekelijks de ontkieming van zaden, registreer morfologische veranderingen en maak foto's voor documentatie.
  4. Tel na ongeveer 12 weken, als de meeste zaden zijn ontkiemd, het aantal ontkiemde zaden en bereken de kiemkracht. Gebruik een steriele inoculatielus om willekeurig een lus met vloeibaar medium met zaden te verzamelen. Breng de bemonsterde zaden over naar een petrischaaltje of glasplaatje en observeer onder een stereomicroscoop.
  5. Tel het aantal zaden dat protocorms heeft gevormd als ontkiemd. Bereken de kiemkracht met behulp van de volgende formule:
    Kiemkracht (%) = (Aantal ontkiemde zaden/Totaal aantal zaden in het monster) × 100.

4. Protocorm-subcultuur en proliferatie

  1. Bereid het proliferatiemedium voor door B5-medium (3,21 g/L) aan te vullen met kokoswater (100 ml/l), 6-benzylaminopurine (BA, 0,5 mg/l) en NAA (0,2 mg/l). Voeg 20 g/l sacharose en 7,3 g/l agar toe en breng de pH op 5,8.
  2. Doseer het medium na het koken onmiddellijk in kweekflessen van 150 ml (het aantal flessen kan worden aangepast aan de gewenste vermeerderingsschaal).
  3. Plaats het gedoseerde medium in een autoclaaf en steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 °C. Laat het medium voor gebruik afkoelen tot kamertemperatuur.
  4. Breng 10-15 gekiemde protocorms (0,3-1 cm groot) per fles aseptisch over op de voedingsbodem die in stap 4.3 is bereid.
  5. Beoordeel na een teeltperiode van 5 weken de proliferatiestatus en registreer het aantal nieuw gevormde protocorms per fles.
  6. Ga door met het kweken van de geprolifereerde protocorms gedurende nog eens 4-6 weken om ontwikkeling mogelijk te maken tot plantjes met zichtbare scheuttop en rhizoïde-achtige structuren voorafgaand aan de overdracht voor scheutverlenging.
    OPMERKING: Houd culturen op 25 °C, met een licht/donkercyclus van 12 uur en een lichtintensiteit van 36 μmol·m-2·s-1.

5. Rek schieten

  1. Bereid het medium voor op scheutenrek door B5-medium (3,21 g/l) aan te vullen met BA (0,5 mg/l) en NAA (1 mg/l). Voeg 20 g/l sacharose en 7,3 g/l agar toe en breng de pH op 5,8.
  2. Doseer het medium na het koken in kweekflessen van 150 ml (het aantal flessen kan worden aangepast aan de gewenste vermeerderingsschaal).
  3. Selecteer gezonde plantjes (1-2 cm groot, zonder duidelijke zwarting of volledige vergeling) voor rek van de scheuten. Breng met behulp van een gesteriliseerde en gekoelde tang aseptisch 8-12 plantjes over in elke kweekfles van 150 ml met vers medium dat is bereid in stap 5.1. Zorg ervoor dat de plantjes gelijkmatig over elke fles zijn verdeeld.
  4. Selecteer na een scheutenrekperiode van 5 weken plantjes met volledig ontwikkelde scheuten en gezonde bladeren voor bladexplantatiebemonstering.
    OPMERKING: Houd culturen op 25 °C, met een licht/donkercyclus van 12 uur en een lichtintensiteit van 36 μmol·m-2·s-1.

6. Inductie van PLB's uit bladexplantaten

  1. Bereid het inductiemedium van PLB voor door het basaalmedium MS (4,43 g/l) aan te vullen met BA (3 mg/l) en NAA (0,2 mg/l). Voeg 20 g/l sacharose en 7,3 g/l agar toe en breng de pH op 5,8.
  2. Doseer het medium na het koken in kweekflessen van 150 ml (het aantal flessen kan worden aangepast aan de gewenste vermeerderingsschaal).
  3. Selecteer gezonde plantjes na 5 weken rek van de scheut (stap 5.4). Snijd volledig uitgezette steriele bladeren weg, verwijder het apicale gebied en de randen en snijd elk blad in segmenten van ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm met behulp van een steriel scalpel onder aseptische omstandigheden.
  4. Plaats de 10 vleugelsegmenten op het PLB-inductiemedium met het adaxiale oppervlak naar boven gericht en zorg voor een stevig contact met het mediumoppervlak.
  5. Beoordeel na 5 weken kweek het aantal succesvol geïnduceerde PLB's en bereken de inductiesnelheid (%). Noteer daarnaast de gemiddelde knophoogte (cm) en het aantal knoppen dat per explant wordt gevormd.
    OPMERKING: Houd culturen op 25 °C, met een licht/donkercyclus van 12 uur en een lichtintensiteit van 36 μmol·m-2·s-1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De protocolstappen die in deze studie worden gepresenteerd, vertegenwoordigen de geoptimaliseerde methodologie die is ontwikkeld door middel van een reeks vergelijkende experimenten gericht op het verbeteren van asymbiotische zaadkieming, protocormproliferatie, scheutverlenging en PLB-inductie in H. cucullata. Bij de selectie van PGR's om de kieming van zaden te bevorderen, verbetert NAA bijvoorbeeld de ontwikkeling van embryo's en de wateropname, terwijl BA de knopdifferentiati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Orchideeëncapsules bevatten meestal talloze zaden, vaak meer dan tienduizend, maar hun natuurlijke ontkieming is uiterst beperkt vanwege de afwezigheid van endosperm en hun grote afhankelijkheid van symbiotische schimmelassociaties en specifieke omgevingsfactoren20. Asymbiotische ontkiemingsprotocollen zijn daarom op grote schaal toegepast om deze beperkingen te omzeilen en een efficiënte vermeerdering van zaailingen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1/2 MS Base Salts with vitaminsCoolaberPM1061
6-BenzylaminopurineShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.1214-39-7
Agar PowerBeijing Chembase Technology Co., Ltd.1400
Clean BenchSuzhou Purification Equipemnt Co., Ltd.SW-CJ-2G
Coconut WaterGOOD FARMERhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
DetergentLiby Science and Technology6920174756784
Gamborg B5 MediumPhytoTechnology LaboratoriesG398
Glass BottleMorebetter Biotechnology Co., Ltd.MBT-BL-240
Murashige & Skoog Basal SaltsPhytoTechnology LaboratoriesM519
PipetteEppendorf3123000268
Precision BalanceMETTLER TOLEDO30834109
SPSSInternational Business Machines CorporationSoftware gebruikt voor statistische significantietesten
SucroseSinopharm chemical Reagent Co., Ltd.20210802
ThidiazuronShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.51707-55-2
α-Naphthaleneacetic AcidShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.86-87-3

Referenties

  1. Chen, X., et al. Flora of China. , Science Press and Missouri Botanical Garden Press. Beijing, St. Louis, MO. (2009).
  2. Tang, Y., Yukawa, T., Bateman, M., Jiang, H., Peng, H. Phylogeny and classification of the East Asia Amitostigma alliance (Orchidaceae: Orchideae) based on six DNA markers. BMC Evol Biol. 15 (1), 1-32 (2015).
  3. Minarchenko, M. Threatened medicinal plants of Ukraine: An assessment of the current protection status. J Plant Dev. 24, 117-131 (2017).
  4. Pant, B., Raskoti, B. Medicinal Orchids of Nepal. , Himalayan Map House Pv Ltd. Kathmandu, Nepal. (2013).
  5. Strack, D., Busch, E., Wray, V., Grotjahn, L., Klein, E. Cyanid 3oxalylglucoside in orchids. Naturforsch C. 41 (7-8), 707-711 (1986).
  6. Strack, D., Busch, E., Klein, E. Anthocyanin patterns in European orchids and their taxonomic and phylogenetic relevance. Phytochemistry. 28 (8), 2127-2139 (1989).
  7. Ilyina, N., Kozlovskaya, O. V. Dynamics of the population structure and abundance of the rare species Neottianthe cucullata (L Schlechter under conditions of pyrogenic load in the territory adjacent to the Buzuluksky Bor National Park (Samara region). Samara J Sci. 13 (2), 35-41 (2024).
  8. Khapugin, A., Chugunov, G., Silaeva, T., Kunaeva, E. Neottianthe cucullata (L Schltr. (Orchidacea Juss.), an endangered orchid in central Russia. Wulfenia. 23, 189-202 (2016).
  9. A method for the rapid propagation of Hemipilia cucullata. using its floral bracts as explants. China patent. , CN106993535A (2017).
  10. Johnson, D., Edwards, T. The structure and function of orchid pollinaria. Plant Syst Evol. 222, 243-269 (2000).
  11. Ilyina, V., Senator, S., Mitroshenkova, A., Kozlovskaya, O. Peculiarities of the Neottianthe cucullata population structure under industrial loads (Samara Oblast). AIP Conf Proc. 3184 (1), 8(2024).
  12. Zhang, L., et al. Symbiotic culture of three closely related Dendrobium species reveals a growth bottleneck and differences in mycorrhizal specificity at early developmental stages. Diversity. 14 (12), 1119(2022).
  13. Leng, C., Hou, M., Xing, Y., Chen, J. Perspective and challenges of mycorrhizal symbiosis in orchid medicinal plants. Chin Herb Med. 16, 172-179 (2024).
  14. Zoubi, L. Complexities and innovations in orchid germination: A review of symbiotic and asymbiotic techniques. J Plant Sci. 12 (4), 90-94 (2024).
  15. Chen, J., et al. Symbiotic and asymbiotic germination of Dendrobium officinale (Orchidaceae) respond differently to exogenous gibberellins. Int J Mol Sci. 21 (17), 6104(2020).
  16. JinYing, C., Xuefeng, W., Baocai, L., Yuqing, Z. Efficient germination system in asymbiotic culture of Bletilla striata (Thunb Reichb). f. Fujian J Agric Sci. 33 (2), 131-135 (2018).
  17. Mei, H., JiJun, K., ZhenYong, X., LiMing, Z., Hong, J. Study on seedlings of nonsymbiotic germination of Paphiopedilum wenshanense. J West China For Sci. 49 (3), 56-59 (2020).
  18. Teixeirada Silva, A., Cardoso, J. C., Dobránszki, J., Zeng, S. Dendrobium micropropagation: A review. Plant Cell Rep. 34, 671-704 (2015).
  19. Zeng, S., et al. Seed biology and vitro seed germination of Cypripedium. Crit Rev Biotechnol. 34 (4), 358-371 (2014).
  20. Cozzolino, S., Widmer, A. Orchid diversity: An evolutionary consequence of deception. Trends Ecol Evol. 20 (9), 487-494 (2005).
  21. Miura, C., et al. Autoactivation of mycorrhizal symbiosis signaling through gibberellin deactivation in orchid seed germination. Plant Physiol. 194 (1), 546-563 (2023).
  22. Bustam, B., Dixon, K., Bunn, E. vitro propagation of temperate Australian terrestrial orchids: Revisiting asymbiotic compared with symbiotic germination. Bot J Linn Soc. 176 (4), 556-566 (2014).
  23. Gogoi, K., Kumaria, S., Tandon, P. Ex situ conservation of Cymbidium eburneum Lindl.: a threatened and vulnerable orchid, by asymbiotic seed germination. 3 Biotech. 2, 337-343 (2012).
  24. Robinson, E. J., Kakati, J. P., Sebastinraj, S., Suriya, K. I vitro seed germination of Cymbidium aloifolium L Sw., a potential medicinal orchid from Eastern ghats of Tamil Nadu India. J Plant Biotechnol. 44, 343-348 (2017).
  25. Hossain, M., Sharma, M., Teixeirada Silva, J. A., Pathak, P. Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall. Lindl. Sci Hortic. 123 (4), 479-487 (2010).
  26. Ibrahim, L., Jenkinson, P. Effect of artificial culture media on germination, growth, virulence and surface properties of the entomopathogenic hyphomycete Metarhizium anisopliae. Mycol Res. 106 (6), 705-715 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

OrchisregeneratiebladexplantaatkweekprotocormontwikkelingPLB inductieweefselkweekprotocolzaadsterilisatiescheutelongatieex situ conservatie

Gerelateerde artikelen