Methodenartikel

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

DOI:

10.3791/68568

⸱

6 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektronenmicroscopie (EM) en vooral driedimensionale (3D) EM-technieken zijn gevestigde waarden geworden in de structurele virologie. Onderzoek naar door virussen geïnduceerde verandering van de cellulaire ultrastructuur, zoals door het Zikavirus (ZIKV) geïnduceerde replicatiefabrieken of coronavirusreplicatieorganellen, vereist 3D-beeldvorming. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) tomografie is een veelgebruikte methode, ondanks de beperking tot monsters met een dikte tot 200 nm. Gefocusseerde ionenbundel-scanning elektronenmicroscopie (SEM)-tomografie kan 3D-gegevens produceren van grotere volumes met isotrope, zij het doorgaans lagere resolutie. Alternatieve technieken, zoals blokscanning-elektronenmicroscopie (BF-SEM), SEM-arraytomografie of TEM-beeldvorming van seriële secties worden gebruikt voor beeldvorming van grotere volumes. In vergelijking met de eerder genoemde technieken gaan deze technieken echter ten koste van een veel lagere resolutie langs de Z-as van het monster. Een techniek die 3D-informatie levert van monsters tot een dikte van 1 μm met een isotrope resolutie van enkele nanometers, is scanning transmission electron microscopy (STEM) tomografie.

Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van onder hoge druk ingevroren, gevriesgesubstitueerde en in hars ingebedde virologische monsters en hun analyse met behulp van STEM-tomografie. Dit protocol profiteert van de voordelen van beeldvorming op kamertemperatuur, terwijl de biologische ultrastructuur in een bijna-oorspronkelijke staat behouden blijft. We laten twee representatieve voorbeelden zien voor vragen die kunnen worden beantwoord met behulp van STEM-tomografie. Eerst passen we het protocol toe voor het bestuderen van virionmorfogenese van een recombinant vesiculair stomatitisvirus (VSV). De STEM-tomogrammen bieden informatie over recombinante VSV-knopvorming die anders niet toegankelijk is voor 2D-beeldvorming. Ten tweede tonen we correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) met behulp van Foerster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming en STEM-tomografie (FRET-3D-CLEM) van EF-C peptide nanofibrillen. Deze recent gepubliceerde combinatie geeft nieuwe inzichten in de opname en demontage van infectiebevorderende peptide-nanofibrillen, waarbij vooral wordt geprofiteerd van het grote volume dat toegankelijk is via STEM-tomografie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
Figuur 1: Vergelijking van verschillende 3D-microscopietechnieken, rekening houdend met resolutie, instrumentatie, acquisitietijd en inspanning. Het maximaal haalbare volume van de technieken ligt tussen de technisch veeleisende cryo-TEM-tomografie die moleculaire resolutie biedt, en lichtmicroscopie, waarbij de resolutie wordt beperkt door de diffractielimiet van licht. Afkortingen: TEM = transmissie-elektronenmicroscopie; STEM = scannen TEM; SEM = scanning-elektronenmicroscopie; FIB = gefocusseerde ionenstraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Virusgerelateerde structuren en systemen bestrijken een schaal van het sub-angstromregime (bijv. kleine moleculen voor virotherapie, geïsoleerde virale eiwitten) tot enkele meters (bijv. hele geïnfecteerde organismen). Virale deeltjes bevinden zich in het bereik van 20-1.000 nm en worden voornamelijk onderzocht in hun biologische context, zoals gastheercellen en virale productiecellijnen, die zich in het μm-bereik bevinden. Visualisatie van specifieke virusgerelateerde structuren is dus afhankelijk van het kiezen van een techniek die een voldoende gezichtsveld en een geschikte resolutie biedt. De studie van met virus geïnfecteerde cellen en weefselstukken is gebaseerd op microscopietechnieken (Figuur 1). Hoewel overzichtsbeelden van cellen en weefsels kunnen worden verkregen met behulp van klassieke lichtmicroscopie, worden intracellulaire structuren die betrokken zijn bij virusreplicatie vaak bestudeerd met behulp van elektronenmicroscopie (EM). Hoewel EM tegenwoordig vooral wordt gebruikt in fundamenteel virologisch onderzoek, wordt het ook gebruikt in diagnostiek 1,2 en heeft het ook zijn weg gevonden naar biofarmaceutische toepassingen3.

Vaak kunnen 2D EM-benaderingen zoals klassieke transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) een bepaalde biologische vraag niet voldoende beantwoorden. In de virologie is dit vooral het geval bij het bestuderen van virus-gastheer-celinteracties zoals aanhechting en binnenkomst van virionen, de vorming van virale fabrieken of virionmorfogenese 4,5,6,7,8,9. Daarom wordt EM-tomografie gebruikt om de 3D-ultrastructuur van biologische monsters te analyseren. In principe zijn er twee manieren om een tomogram van een bepaalde steekproef te verkrijgen: 1) stapsgewijze beeldvorming van seriële plakjes die later worden gecombineerd tot een 3D-beeldstapel, of 2) acquisitie van projecties vanuit verschillende kijkhoeken van de steekproef, gevolgd door computationele reconstructie van de informatie in een virtuele beeldstapel.

De technieken van het eerste type omvatten beeldvorming van seriële doorsneden door middel van TEM of SEM (SEM-arraytomografie), seriële blokvlak-SEM en gefocusseerde ionenbundel (FIB)-SEM-tomografie. SEM- en TEM-beeldvorming van seriële secties mist de resolutie in z, die wordt beperkt door de dikte van de secties, maar biedt een groot gezichtsveld en is afhankelijk van apparatuur die direct beschikbaar is in de meeste EM-laboratoria4. FIB-SEM-tomografie kan een isotrope resolutie opleveren, maar apparaat- en onderhoudskosten kunnen een uitdaging zijn, en beeldvorming van hele cellen met isotrope resolutie is tijdrovend 9,10.

Het tweede type tomografie is uitsluitend gebaseerd op de overdracht van de elektronenbundel door een monster. Dit kan worden gedaan met behulp van twee verschillende beeldvormingsmodaliteiten: TEM of scanning transmission electron microscopy (STEM). Hoewel TEM-tomografie wijdverbreider en gemakkelijker te implementeren is, is de sectiedikte beperkt tot ~200 nm. Daarom kunnen structuren die groter zijn dan de dikte van de sectie, zoals mitochondriën, blaasjes of virionen, niet binnen een enkel tomogram worden afgebeeld. STEM-tomografie biedt de mogelijkheid om monsters tot 1 μm dikte11,12 in beeld te brengen. Het vereist echter een STEM met een hoge acceleratiespanning (≥200 kV) en een opstelling die zowel hoge kantelhoeken als een kleine semi-convergentiehoek13 ondersteunt. Hoewel STEM-beeldvorming een veelgebruikte techniek is in de materiaalwetenschap, blijft het een zeldzame techniek in biologische EM-laboratoria.

Hier presenteren we een toepassingsgerichte benadering om STEM-tomografie te gebruiken voor virologische monsters. Vanwege de hoge complexiteit en het arbeidsintensieve karakter van EM-tomografie is een hoogwaardige monstervoorbereiding cruciaal. Hoewel cryogene TEM (tomografie) ongetwijfeld de gouden standaard is voor onderzoek op moleculair niveau, zorgt beeldvorming op kamertemperatuur van onder hoge druk ingevroren, gevriessubstitueerde cellen voor een solide behoud en helderheid van de cellulaire ultrastructuur 7,14. Kortom, aanhangende cellen worden op een saffierschijf gekweekt en naar wens geïnfecteerd of anderszins behandeld. De cellen worden vervolgens geïmmobiliseerd door ze onder hoge druk te bevriezen met zeer hoge afkoelsnelheden, wat resulteert in vitrificatie van het water binnenin. Vervolgens wordt het water vervangen door een oplosmiddel, terwijl de monsters worden gecontrasteerd en langzaam weer op kamertemperatuur worden gebracht. De monsters worden vervolgens geleidelijk ingebed in hars.

Er zijn veel protocollen voor invriezen onder hoge druk en vriessubstitutie, die verschillen in de machines, het draagsysteem en de samenstelling van het monster. Er zijn gedetailleerde protocollen voor bevriezing onder hoge druk gepubliceerd, waaronder een van Walther et al.15 en een videoprotocol van Steyer et al.16, dat zich richt op weefselvoorbereiding voor FIB-SEM met behulp van microgolf-ondersteunde contrastverbetering. Voor virologisch onderzoek publiceerden Read et al.17 en Romero-Brey18 gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van met virus geïnfecteerde cellen door bevriezing onder hoge druk met saffierschijven en daaropvolgende analyse met behulp van elektronentomografie. Ultradunne doorsnede is ook eerder beschreven15,17. Raadpleeg de geciteerde literatuur voor meer informatie over deze benaderingen.

Hier presenteren we een workflow die een aangepaste en bijgewerkte versie is van de eerder gepubliceerde protocollen15,17 voor het eerst gekoppeld aan een gedetailleerde videogids. Het protocol biedt een workflow voor monstervoorbereiding met behulp van bevriezing onder hoge druk, vriesvervanging en inbedding in epoxyhars. Secties met een dikte van 800 nm-1.000 nm worden gesneden met behulp van een ultramicrotoom. Een tilt-serie wordt verkregen met een 200 kV STEM, met behulp van de software EM-tools. Dit protocol is geoptimaliseerd voor aanhangende cellen en biedt een uitgebreide workflow, terwijl het mogelijk is om wijzigingen aan te brengen voor andere soorten monsters, zoals weefsel- of suspensiecellen. Voor STEM-tomografie onder cryogene omstandigheden, zie het werk van Michael Elbaum's groep19,20.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur

  1. Voorbereiding van saffierschijven
    1. Reinig de saffierschijven door 3x 20 minuten in 100% ethanol te wassen. Verwijder de resterende ethanol door de schijven over een droog filtreerpapier te trekken. Laat de schijven minimaal 30 minuten in een droogkamer van 37 °C staan, of totdat ze volledig droog zijn.
      OPMERKING: In dit protocol worden saffierschijven met een diameter van 3 mm en een dikte van 0,16 mm gebruikt. Voor andere systemen, een workflow die is geoptimaliseerd voor weefsel- of suspensiecellen, zie Walther et al.15. Enkele "tips en trucs" voor gekweekte cellen en andere systemen worden gegeven door McDonald et al.21.
    2. Bedek de saffierschijven met koolstofcoating door ongeveer 50 saffierschijven plat op een schoon horlogeglas te plaatsen en ze te bedekken met een 10-15 nm dikke koolstoflaag met behulp van een koolstofcoatingapparaat. Bak de schijven een nacht op 120 °C om de koolstoflaag te stabiliseren.
      OPMERKING: Introduceer voor correlatieve EM-benaderingen een coördinatensysteem: plaats een vinderraster bovenop de saffierschijven vóór de koolstofcoating, zodat het raster zichtbaar is als een negatief op de schijf21.
    3. Om later de met koolstof beklede kant van de saffierschijf te kunnen identificeren, gebruikt u een scherp stuk gereedschap (bijv. de punt van een pincet) om een markering in de koolstof te krassen die slechts vanaf één kant correct kan worden gelezen.
      OPMERKING: We raden het cijfer "2" of iets dergelijks aan (Figuur 2A,B). Sla deze stap over voor saffierschijven met een gecoat coördinatensysteem.
    4. Bewaar de saffierschijven tot verder gebruik in een droogkamer van 37 °C.
      OPMERKING: Het wordt afgeraden om saffierschijven opnieuw te gebruiken, omdat dit de kans vergroot dat ze breken tijdens bevriezing onder hoge druk.
  2. Celcultuur
    1. Kort voor plaatsing in celcultuur, gloeit u de met koolstof beklede kant van de schijven met een gloeiontladend apparaat om ze hydrofiel te maken (bijv. 0.26 mbar met een stroom van 20 mA gedurende 40 s). Steriliseer vervolgens de schijven door ze gedurende 15 minuten bloot te stellen aan UV-licht.
      OPMERKING: Blootstelling aan UV-licht gedurende meer dan 30 minuten kan de koolstofcoating beschadigen.
    2. Gebruik een steriel pincet om de schijven op de bodem van een kweekschaal met media te plaatsen en zorg ervoor dat de schijven niet gaan drijven. Zaai de cellen er voorzichtig op. Als de saffierschijven in de celkweekmedia zweven, gloei dan langer bij het herhalen van het experiment.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de "2" correct is georiënteerd, wat betekent dat de met koolstof beklede kant naar boven wijst. Een celmonolaag op de schijven met een uiteindelijke confluentie van ~80% is gewenst. De celgroei op de saffierschijven kan verschillen van die in de omringende kweekschaal. Controleer de verdeling en kwaliteit van cellen op de schijven met een omgekeerd lichtmicroscoop voordat u verder gaat met het protocol. De verdeling van cellen kan worden verbeterd door de plaat zachtjes te schudden tijdens het zaaien van de cellen.
      Bedek voor suspensiecellen met koolstof beklede saffierschijven met poly-L-lysine of gebruik capillairen, zoals beschreven in15. Stel met poly-L-lysine bedekte schijven niet bloot aan UV-licht, omdat dit de poly-L-lysinecoating kan beschadigen.
    3. Voer elke gewenste behandeling van de cellen uit (bijv. infectie, medicamenteuze behandeling) terwijl u de saffierschijven op hun plaats houdt. Behandel de schijven voorzichtig om te voorkomen dat cellen losraken of krassen op de koolstoflaag komen. Incubeer de cellen dienovereenkomstig. Voer chemische voorfixatie uit met bijvoorbeeld 2,5% glutaaraldehyde, 1% sacharose in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,3) of 4% paraformaldehyde, volgens de lokale regelgeving, voordat u de monsters naar de hogedrukvriezer transporteert 1,7,22.
      OPMERKING: Voordat geïnfecteerde monsters de laboratoria van het bioveiligheidsniveau verlaten, moet u voldoen aan alle lokale bioveiligheidsvoorschriften die van toepassing zijn op het modelsysteem.

figure-protocol-1
Figuur 2: Bevriezing onder hoge druk. (A) Saffierschijven met een koolstoflaag met "2" (links) of een coördinatensysteem voor correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (rechts). (B) Schematische weergave van een SD-gouden spacer-SD-sandwich terwijl deze wordt voorbereid voor invriezen onder hoge druk. De cellen die op de schijven groeien, staan tegenover elkaar en worden daardoor beschermd in de nauwe holte. (C) Houder voor invriezen onder hoge druk die een SD-sandwich bevat. (D) Materialen en apparaten voor het laden van de HPF-houder: (1) Verwarmingsplaat, (2) Stereomicroscoop, (3) Filterpapier, (4) Reactiebuis met 1-hexadeceen, (5) Pincet, (6) Ongecoate SD's, (7) Petrischaal met gouden afstandhouders, (8) HPF-houder. (E) Opstelling van het HPF-systeem: (1) LN-box voor het overbrengen van diepgevroren monsters (zie ook F), (2) Föhn om het opwarmen van de HPF-houder na het invriezen te versnellen, (3) Stikstofdewar om de LN-box bij te vullen. (F) LN-doos voor het bewaren van ingevroren monsters na bevriezing onder hoge druk met een centrale trog (gestippelde omtrek) waarin de HPF-houder kan worden geopend en SD's veilig kunnen worden gehanteerd. Materialen die direct na het invriezen onder hoge druk nodig zijn: (1) Houder voor maximaal zes monsterhouders, (2) Geïsoleerde pincetten, (3) Monsterhouders met deksel. De containers bevatten kleine gaatjes en kleine gewichten (bijv. een schroef) zodat ze worden ondergedompeld in vloeibare stikstof. Afkortingen: SD = saffierschijf; HPF = hogedruk vriezer; LN = vloeibare stikstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Monstervoorbereiding voor elektronenmicroscopie

  1. Invriezen onder hoge druk
    OPMERKING: Dit protocol beschrijft hogedrukvriezen met de gerefereerde hogedrukvriezer (HPF, Tabel met materialen). De beschreven stappen zouden niet veel moeten verschillen voor andere machines, omdat ze hetzelfde doel dienen.
    1. Volg de instructies van de fabrikant om de hogedrukvriezer in te stellen. Zorg voor voldoende toevoer van vloeibare stikstof (afbeelding 2E), schakel de machine in en voer een testrun uit.
    2. Stel een werkruimte in om de schijven in de HPF-houder te laden (Afbeelding 2D). Houd de volgende items bij de hand: een verwarmingsplaat (1), een stereomicroscoop (2), stukjes filterpapier (3), reactiebuis met hexadeceen als vulmiddel (4), pincet (5), lege/ongecoate saffierschijven voor het invriezen van een oneven aantal SD's met cellen (6), gouden afstandhouders (7) en de HPF-houder (8, detail in figuur 2C).
    3. Bereid een werkruimte voor voor het verwerken van bevroren monsters (Figuur 2E,F). Voordat u begint met invriezen onder hoge druk, moet u de volgende apparatuur voorbereiden:
      1. Maak de LN-doos klaar en vul deze met vloeibare stikstof (Figuur 2E,F) ter voorbereiding op het hanteren en overbrengen van de bevroren saffierschijven van de HPF-houder naar opslagcapsules.
      2. Maak een kleine dewar (3 in figuur 2E) klaar en vul deze met vloeibare stikstof: wees voorbereid om de LN-box tijdens het invriezen meerdere keren bij te vullen met vloeibare stikstof.
      3. Houd een geïsoleerd pincet (2 in Figuur 2F) bij de hand.
      4. Bereid monstercontainers voor die de saffierschijven kunnen bevatten na het invriezen onder hoge druk (opslagcapsules, 3 in Figuur 2F). Zorg ervoor dat ze een deksel hebben en verschillende gaten waar vloeibare stikstof in kan worden gegoten en kleine gewichten (bijv. kleine schroeven of iets dergelijks) om ervoor te zorgen dat ze niet drijven. Label de containers voor gebruik en koel ze voor in de LN-doos.
        LET OP: We gebruiken BEEM-capsules als bewaarcapsules.
    4. Bewaar de monsters in een incubator in de buurt van de hogedrukvriezer als de cellen niet vooraf zijn gefixeerd, of als dat niet mogelijk is, op een verwarmde plaat (1 in figuur 2D), om de fysiologische omstandigheden (37°C, 5% CO2) zo lang mogelijk te behouden.
    5. Zorg voor een voldoende aantal cellen op de saffierschijven en een goede celkwaliteit voordat u begint met invriezen onder hoge druk. Inspecteer hiervoor de schijven met een omgekeerd lichtmicroscoop.
    6. Voer bevriezing onder hoge druk uit.
      1. Neem met een pincet een saffierschijf uit de kweekschaal en plaats deze in de HPF-houder (Figuur 2C) met de met koolstof beklede kant naar boven ("2" is leesbaar). Verwijder daarvoor overtollig materiaal door de schijf snel op filterpapier te dompelen, maar zorg ervoor dat de cellen niet uitdrogen.
      2. Doop een gouden afstandhouder in hexadeceen en plaats deze voorzichtig op de saffierschijf. Neem een tweede saffierschijf en plaats deze bovenop de gouden afstandhouder met de met koolstof beklede kant naar beneden, en vorm een sandwich van saffierschijf - gouden afstandhouder - saffierschijf met de cellen naar elkaar gericht. Zorg ervoor dat er geen lucht in de sandwichholte zit.
      3. Sluit de HPF-houder. Voer deze stap zorgvuldig maar snel uit om de spanning op het monster te minimaliseren, vooral voor levende cellen die niet zijn voorgefixeerd.
        OPMERKING: Voor monsters die kankerverwekkende, mutagene of reprotoxische (CMR) stoffen bevatten, zoals chemische fixeermiddelen, plaatst u de HPF-houder onder een zuurkast om de blootstelling te minimaliseren.
      4. Start het invriesproces. Plaats de HPF-houder snel in de hogedrukvriezer, vergrendel deze volgens de instructies van de fabrikant en start het vriesproces.
    7. Verwijder de verglaasde monsters uit de HPF-houder. Breng snel de punt van de HPF-houder die de nu bevroren saffierschijven draagt over naar de voorgekoelde LN-box. Verwijder de schijven voorzichtig uit de HPF-houder in de centrale trog in de LN-box (stippellijn in Figuur 2F). Warm daarna de HPF-houder op en verwijder eventuele resterende ethanol of hexadeceen voordat u begint met het samenstellen van de volgende sandwich.
      OPMERKING: Zorg er vanaf nu voor dat alles wat in aanraking komt met de schijven is voorgekoeld met vloeibare stikstof. Voer de overdrachtsstappen snel uit in een stikstofatmosfeer en bewaar de schijven in vloeibare stikstof om ontdooien van het monster te voorkomen. Oefen van tevoren de overdracht van de houder van de HPF naar de LN-box om een soepele en snelle overgang te garanderen. Het opwarmproces van de houder kan na het invriezen worden versneld met behulp van een föhn (2 in Figuur 2E).
    8. Nadat u de saffierschijven uit de houder hebt gehaald, plaatst u ze in de geëtiketteerde containers voor overdracht naar het vriesvervangingsapparaat of voor opslag van vloeibare stikstof tot verdere verwerking. Als de saffierschijven na HPF dicht op elkaar zijn gestapeld, gebruik dan een scalpel om de saffierschijven te scheiden voordat u ze bevriest.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de schijven niet breken en vermijd schuifkrachten. Plan voldoende tijd voor deze stap.
  2. Freeze-substitutie
    1. Stel het vriesvervangingsapparaat in volgens de instructies van de fabrikant. Vul de vloeibare stikstof dewar en start het programma om de monsterkamer voor te koelen tot -90 °C. Zorg ervoor dat er voldoende vloeibare stikstof is voor het hele vervangingsproces.
      OPMERKING: De betrokken chemicaliën zijn gevaarlijk. Voer alle stappen uit onder een zuurkast en voldoe aan de lokale richtlijnen voor milieu, gezondheid en veiligheid (EHS).
    2. Bereid de vriessubstitutieoplossing die 0,1% (m/v) uranylacetaat, 0,2% (m/v) osmiumtetroxide (OsO4) en 5% (v/v) water in aceton bevat. Volg deze stappen om een volume van 6 ml voor te bereiden (voldoende om 24 cryovials te vullen, wat gelijk is aan de maximale capaciteit van het hier gebruikte vervangingsapparaat):
      1. Weeg 6 mg uranylacetaat af in een glazen vat met een goed sluitend deksel.
      2. Voeg 300 μL 4% (m/v) osmiumtetroxide toe aan water.
      3. Sluit het vat en sonificeer gedurende 5 minuten om het uranylacetaat op te lossen.
      4. Voeg 5,7 ml aceton toe, meng en verdeel de oplossing gelijkmatig in cryovials die compatibel zijn met het vriesvervangingsapparaat.
    3. Plaats de gesloten cryovières met de vriessubstitutieoplossing bij -90 °C in de voorgekoelde vriessubstitutie-inrichting en wacht tot de oplossing ook is afgekoeld tot -90 °C (gedurende ongeveer 20 minuten).
    4. Vul de LN-box met vloeibare stikstof. Om de saffierschijven over te brengen naar het vriessubstitutieapparaat, koelt u een pincet, een scalpel en een tang (of een groot pincet) voor in vloeibare stikstof.
    5. Gebruik het voorgekoelde grote pincet om de bewaarcapsules met de onder hoge druk ingevroren monsters uit de opslagtank over te brengen naar de LN-doos.
      OPMERKING: Werk snel om ontdooien van de monsters te voorkomen. Bij het verwerken van monsters direct na het invriezen onder hoge druk kan deze stap worden overgeslagen.
    6. Breng de bevroren monsters onder hoge druk over in het vriessubstitutieapparaat. Scheid de saffierschijven één voor één terwijl ze in vloeibare stikstof worden bewaard. Breng elke schijf snel afzonderlijk over in een cryovial met vriessubstitutieoplossing en zorg ervoor dat de schijf volledig wordt ondergedompeld. Sluit de cryovial en plaats deze onmiddellijk terug in het vriesvervangingsapparaat.
      OPMERKING: Bewaar de cryovial tijdens het overbrengen in de atmosfeer van vloeibare stikstof om te voorkomen dat de vervangingsoplossing opwarmt, maar niet in vloeibare stikstof om te voorkomen dat deze bevriest. Houd de injectieflacon met de vingers dicht bij het deksel om te voorkomen dat de vervangingsoplossing opwarmt. Ga voorzichtig om met de vervangingsoplossing, want deze bevat giftige stoffen.
    7. Zodra alle schijven zijn overgebracht naar het vervangingsapparaat, start u het vervangingsproces voor bevriezing. Stel het apparaat in om de temperatuur gedurende 16 uur geleidelijk te verhogen van -90 °C naar 0 °C, met een incubatiestap van 1 uur bij 0 °C, gevolgd door een geleidelijke verhoging tot 20 °C gedurende 1 uur.
    8. Zodra de monsters 20 °C bereiken, ga je direct verder met het wassen van de monsters gedurende 3 x 30 minuten met 100% aceton.
      OPMERKING: Laat de cellen op de schijven niet droog vallen. Voer alle volgende stappen uit onder een zuurkast. Verzamel al het afval in een geschikte container en gooi het weg volgens de lokale EHS-voorschriften.
  3. Insluiten
    1. Bereid epoxyhars vers volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Voer alle stappen uit met epoxyhars onder een zuurkast. We raden aan om voor elke inbeddingsprocedure verse hars te bereiden vanwege de lagere viscositeit en dus een betere monsterinfiltratie.
    2. Om de monsters vooraf in te bedden, incubeert u de monsters gedurende 1 uur in een oplossing met 1/3 epoxyhars en 2/3 aceton. Vervang de oplossing door 2/3 epoxyhars en 1/3 aceton en incubeer gedurende 3 uur. Vervang de oplossing door 100% epoxyhars en laat het een nacht incuberen met het deksel van de injectieflacon open om de resterende aceton te laten verdampen.
    3. Breng de volgende dag de saffierschijven over naar nieuwe, gelabelde reactiebuizen gevuld met vers bereide epoxyhars. Plaats de schijven horizontaal, ondersteund door de wand van de reactiebuis, en zorg ervoor dat de kant met de cellen naar boven wijst in de reactiebuis (de "2" is leesbaar onder een stereomicroscoop). Plaats de reactiebuizen met open deksel in een oven op 60 °C en laat de epoxyhars minimaal 48 uur polymeriseren.
      OPMERKING: Als een fragment van een saffierschijf moet worden ingebed, sluit het dan in met behulp van een gepolymeriseerde punt van een harsblok van een eerder experiment: Plaats de punt in de reactiebuis, vul de buis met verse hars en plaats de gebroken schijf op de gepolymeriseerde punt.
      Alle met epoxyhars verontreinigde verbruiksartikelen voor eenmalig gebruik moeten in een oven bij 60 °C worden geplaatst om de hars volledig te laten polymeriseren voordat ze worden weggegooid. Pincetten en andere voorwerpen kunnen vooraf met ethanol worden afgeveegd.
    4. Dompel de punt van een gesloten reactiebuis ongeveer 10 s onder in vloeibare stikstof. Verwijder vervolgens het harsblok uit de reactiebuis door de reactiebuis op de tafel te slaan. De saffierschijf maakt zich gemakkelijk los van de koolstoflaag die bovenop de ingebedde cellen blijft.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat uw inbeddingsmedium de temperatuurveranderingen verdraagt die worden veroorzaakt door behandeling met vloeibare stikstof.
  4. Voorbereiding van STEM-tomografiesecties
    1. Bereid secties voor die veel dikker zijn dan ultradunne secties voor TEM-beeldvorming, meestal tussen 800 nm en 1 μm.
      OPMERKING: De voorbereiding van secties voor STEM-tomografie verschilt enigszins van conventionele ultramicrotomie. Voor een gedetailleerd protocol dat de voorbereiding van STEM-tomografiesecties beschrijft, zie Walther et al.15 en Villinger et al.10.
      Voordat u doorgaat met de voorbereiding van STEM-tomografiesecties, moet u ervoor zorgen dat de kwaliteit van de cellen goed is. Voer hiervoor ultradunne doorsnede (~70 nm) en TEM-analyse uit (Figuur 3D,E).
    2. Verzamel de secties op koperen roosters met parallelle staven, zodat er geen roosterstaven zijn die de elektronenbundel blokkeren bij het kantelen van het monster naar hoge hoeken. Voor een betere hechting van de secties behandelt u de roosters met 0,01% poly-L-lysine: bereid een kleine hoeveelheid 0,01% poly-L-lysine voor uit een 0,1% stockoplossing, dompel de roosters in de aliquot, droog ze voorzichtig af door de rand van het rooster over een filterpapier te slepen. Ontlaad de roosters en gebruik ze om de secties te verzamelen.
    3. Behandel secties met colloïdaal goud als fiduciale markeringen voor de uitlijning van kantelreeksen (zie sectie 3).
    4. Breng een carbonlaag aan op de secties om ze te stabiliseren en ze meer geleidend te maken.

figure-protocol-2
Figuur 3: Kwaliteitscontrole door TEM-verschillende verschijningsvormen van cellen na inbedding, trimmen en ultradunne secties. (A) In epoxyhars ingebedde cellen nadat de SD is verwijderd. De koolstoflaag met de bekraste '2' blijft op de in hars ingebedde cellen zitten en is duidelijk zichtbaar. De bijna transparante cellen zijn gelijkmatig verdeeld over het blokvlak. (B) Bijgesneden blokoppervlak vóór microtomie. Een deel van de bekraste 2 is nog zichtbaar op het oppervlak van het harsblok. (C) 70 nm dunne profielen gemonteerd op een TEM-raster. (D) TEM-overzicht van een volledige ultradunne sectie. Let op de gaten in de sectie (witte pijlpunten) die het gevolg zijn van onvolledige harsinfiltratie en een veelvoorkomend artefact zijn. (E) Vergrote weergave van een geselecteerde cel gemarkeerd met een witte rechthoek in (D). Net als bij (D) is onvolledige inbedding zichtbaar bij het plasmamembraan (witte pijlpunten); De rest van de cel vertoont echter een goede conservering en inbedding. Schaalbalken = 100 μm (D), 10 μm (E). Afkortingen: SD = saffierschijf; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Beeldvorming

  1. Acquisitie van de STEM-tilt-serie
    1. Stel de microscoop in volgens de richtlijnen van de fabrikant. Zorg voor een goede uitlijning van de straal.
    2. Vul de vloeibare stikstof dewar voorzichtig bij de microscoop.
    3. Selecteer de juiste tomografiehouder in de besturingssoftware van de microscoop.
    4. Plaats het rooster in de houder. Let erop dat de staven van het raster loodrecht op de kantelas staan om te voorkomen dat de staven de elektronenbundel blokkeren bij hoge kantelhoeken.
    5. Plaats de houder in de microscoop.
    6. Lijn de ligger uit door de volgende stappen uit te voeren:
      1. Laad het uitlijningsbestand dat door de fabrikant is geleverd. Open de straalklep en werk voorlopig in de TEM-modus . Stel een vergroting in van ongeveer 20.000x en stel de standaardfocus in door op STD Focus te drukken.
      2. Zoek naar een gat in het monster. Dit is gemakkelijker in de modus voor lage vergroting (druk op LowMag).
      3. Zorg ervoor dat er geen diafragma is ingevoegd. Stel de spotgrootte in op 1 en Alpha op 3. Minimaliseer de straal op het weergavescherm door de helderheidsknop tegen de klok in te draaien en te centreren met de straalverschuivingsknoppen.
      4. Juiste uitlijning van het pistool: Selecteer in het uitlijnpaneel van de besturingssoftware van de microscoop de optie Pistool en de anodewobbler. Pas de symmetrie van de straal aan met de DEF/SIG-knoppen . Controleer of de beweging van de straal op het fluorescerende scherm homogeen is. Verplaats de helderste plek naar het midden van het scherm met de SHIFT-knoppen ; Schakel alles uit als u klaar bent.
      5. Stempelstampers van de condensor corrigeren: Selecteer in hetzelfde uitlijnpaneel CLA en de HT-wobbler. Pas aan met DEF/SIG-knoppen om een homogene beweging te bereiken.
      6. Stel het diafragma van de condensorlens in: Maximaliseer de straal op het fluorescerende scherm door de helderheidsknop met de klok mee te draaien. Plaats de kleinste condensorlensopening en zorg ervoor dat deze correct in de straal is uitgelijnd door de helderheid af te wisselen. Als de lichtbundel asymmetrisch beweegt op het weergavescherm, past u het diafragma handmatig aan met behulp van de handmatige diafragmaaandrijvingen. Als het diafragma vervormd lijkt op het fluorescerende scherm, corrigeert u de CLA van de condensorstigmators opnieuw met DEF/STIG (vorige stap 3.1.6.5).
      7. Schakel over naar de STEM-modus (selecteer ASID).
        OPMERKING: U kunt de dialoog over lensontspanning na 5-10 s onderbreken.
      8. Verplaats de fase naar een dun, contrastrijk gebied van het monster. Druk op STD Focus en verwijder alle diafragma's. Verander naar 25.000 vergroting met spotgrootte 1,5 nm, stel de cameralengte in tussen 80 en 120 cm en selecteer de spotmodus.
      9. Verander de z-waarde van de goniometer totdat het ronchigram zichtbaar is op het weergavescherm. Wijzig de cameralengte als het ronchigram zwak is. Als het niet rond is, gebruik dan de COND Stig-knop om het aan te passen.
      10. Plaats de kleinste condensorlensopening. Gebruik de handmatige diafragmaaandrijvingen om het diafragma rond het ronchigram te centreren.
    7. Plaats de juiste detector. Gebruik op basis van de onderzoeksvraag de heldervelddetector en/of de donkervelddetector. Activeer de scanmodus en verkrijg een eerste testbeeld van het monster.
    8. Selecteer een vergroting die groter is dan de gewenste vergroting voor het tomogram (hoger dan 800.000x). Juiste focus en astigmatisme: doe dit dichtbij, maar niet direct bij het interessegebied (ROI) om straalbeschadiging van kritieke monstergebieden te voorkomen.
      OPMERKING: De gouden fiduciale markers kunnen deze stap gemakkelijker maken.
    9. Stel de eucentrische hoogte in om ervoor te zorgen dat de ROI gecentreerd blijft over het gehele kantelbereik (d.w.z. -72 ° tot 72 °). Selecteer een functie in de buurt van de ROI, breng deze naar het midden, stel scherp, corrigeer astigmatisme en kantel de tafel stapsgewijs naar - 72 °. Pas de z-positie van de houder aan om de functie gecentreerd te houden en pas het contrast en de helderheid indien nodig aan. Herhaal dit eventueel door stapsgewijs te kantelen naar +72°.
    10. Kies het gezichtsveld door terug te navigeren naar de ROI, stel scherp en verkrijg een overzichtsafbeelding (Afbeelding 4). Stel de gewenste vergroting in voor het verkrijgen van kantelseries.
    11. Stel automatische kantelserie-acquisitie in van beelden van -72° tot +72° en beeld elke 1,5°.
    12. Om mechanische effecten tegen te gaan die optreden bij het veranderen van de richting van de kanteling van de objecttafel, begint u de tilt-serie met een grotere hoek dan de hoek waarmee u met de beeldvorming moet beginnen. Als u een beeld maakt van -72° tot 72°, begint u met het kantelen van de objecttafel van 0° naar -74° en begint u vervolgens met het verzamelen van beelden op weg naar +72°, waarbij u het eerste beeld bij -72° verkrijgt.
    13. Start de automatische acquisitie van kantelseries. Zorg ervoor dat dynamische focus in de acquisitiesoftware is ingeschakeld.
      OPMERKING: Als de acquisitie van de kantelserie voortijdig wordt beëindigd, corrigeer dan de eucenterhoogte. Vooral bij een hogere vergroting kan dit problemen veroorzaken met de geautomatiseerde acquisitie van tilt-series als gevolg van migratie van de ROI uit het gezichtsveld.
      Een veelgebruikte software voor STEM- en TEM-tomografie is SerialEM. Kirchweger et al.20 hebben een videoprotocol gepubliceerd voor cryo-STEM-tomografie met behulp van SerialEM, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor STEM-tomografie op kamertemperatuur.

figure-protocol-3
Figuur 4: Acquisitie van kantelreeksen. (A) 200 kV STEM. (B) STEM-overzicht van een onder hoge druk ingevroren, gevriessubstitueerde cel ingebed in epoxyhars. De in (C-E) getoonde hellingsreeks is verkregen op de positie die is gemarkeerd met de witte rechthoek. (C-E) Geselecteerde beelden van een kantelreeks verkregen van -72° tot +72°. Gouden fiducialen aan beide zijden van de sectie worden gebruikt voor computationele tomogramreconstructie. Geclusterde fiducials zoals die gemarkeerd met de witte ellipsen kunnen niet worden gebruikt voor reconstructie van het tomogram, maar zijn goed herkenbaar bij hoge kantelhoeken. Die of soortgelijke structuren buiten het interessegebied zijn nuttig voor het instellen van de eucentrische hoogte. Schaalbalk = 1 μm (B). Afkorting: STEM = scanning transmission electron microscopy. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Reconstructie en segmentatie van tomogrammen

  1. Voer tomogramreconstructie uit (bijv. met Etomo-software van het IMOD-softwarepakket23).
    1. Voer de eerste uitlijning van de kantelreeks uit en reconstrueer het tomogram met behulp van gewogen achterprojectie.
      OPMERKING: Een gedetailleerd protocol is te vinden op de IMOD-website: IMOD Tomography Guide (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Voor de verwerking van beelden verkregen met de donkervelddetector, zie eerder gepubliceerd werk 11,13.
  2. Segmenteer cellulaire structuren (bijvoorbeeld met software zoals 3DMOD uit het IMOD-pakket of op AI gebaseerde oplossingen).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM-tomografie biedt de mogelijkheid om dikkere secties af te beelden dan TEM-tomografie met een isotrope resolutie in het nanometerbereik en biedt - in vergelijking met FIB-SEM-tomografie - een relatief tijdbesparende beeldvormingsworkflow. In de virologie is dit vooral nuttig omdat het beeldvorming mogelijk maakt van een groot aantal ultrastructurele kenmerken voor statistische analyse in 3D, of bij het zoeken naar zeldzame gebeurtenissen. Hier tonen we twee representatieve resultaten die aantonen hoe STEM-tomografie kan worden gebruikt met betrekking tot deze twee aspecten.

Visualisatie van ontluikende recombinante VSV-virionen

Er is een grote verscheidenheid aan virussen die deeltjes in verschillende vormen en maten vormen. Om de vorm van virionen in een virussuspensie te analyseren, is vaak een eenvoudige methode zoals negatieve kleuring TEM voldoende. Het karakteriseren van de morfologie van virionen in de cellulaire context is moeilijker. Dit geldt met name voor virussen die deeltjes vormen met een anisotrope morfologie, zoals rhabdoviridae. VSV is een rhabdovirus dat kogelvormige virionen vormt met een lengte van ~180 nm. In suspensiecellen zijn de virionen willekeurig georiënteerd, waardoor het moeilijk is om altijd de vorm van de kogel in 2D-beelden te onderscheiden (Figuur 5A-C). Om de kogelvorm van alle recombinante VSV-virionen in een monster correct te definiëren, is een 3D-methode met isotrope resolutie nodig - een methode die ook volumetrische informatie kan verschaffen over een voldoende groot monstergebied. Een STEM-tomogram kan veel complete virionen bevatten in een enkele dataset (Figuur 5D,E). Daardoor is het mogelijk om een groot aantal virionen in beeld te brengen voor statistische analyse, zelfs als er slechts één tomogram per cel wordt verkregen. Ter vergelijking: een TEM-tomogram van een 200 nm dikke doorsnede zou slechts een paar volledige recombinante VSV-virionen vastleggen (zoals aangegeven in figuur 5E).

figure-results-1
Figuur 5: STEM-tomografie van recombinante VSV-ontluikende plaatsen. (A-C) Details van een virtuele doorsnede van een STEM-tomogram verkregen uit een 800 nm dikke doorsnede laten zien dat de vorm van de kogel niet altijd zichtbaar is vanwege (A,B) verschillende oriëntaties van de virionen. (C) Alleen virionen die evenwijdig aan het kijkvlak zijn georiënteerd, worden weergegeven als goed gedefinieerde kogels. (D) Ontluikende plaatsen van recombinant VSV lijken op grote clusters van virionen zonder voorkeursoriëntatie. (E) Het zijaanzicht van het tomogram demonstreert het vermogen om veel volledige recombinante VSV-virionen in één sectie vast te leggen met behulp van STEM-tomografie. De virtuele beeldstapel heeft op deze positie een dikte van ongeveer 600 nm. De stippellijnen geven ongeveer de dikte weer van een doorsnede voor TEM-tomografie (200 nm), waar slechts een paar volledige kogelvormige virionen zouden worden opgenomen. Schaal balk = 500 nm (D). Afkortingen: STEM = scanning transmission electron microscopy; VSV = vesiculaire stomatitisvirus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbraak van EF-C peptide nanofibrillen

In de context van gentherapie zijn transductieversterkende peptide-nanofibrillen een onderwerp van belangstelling geworden. In een recent gepubliceerde studie24 werd correlatieve beeldvorming met behulp van Foerster Resonance Energy Transfer (FRET) beeldvorming en STEM-tomografie (FRET-3D-CLEM) gebruikt om de opname en demontage van EF-C peptide nanofibrillen te onderzoeken. Hoge FRET-efficiënties, die overeenkomen met FRET-paren die dicht bij elkaar liggen, zenden rode fluorescentie uit die overeenkomt met geassembleerde fibrillen. Lage FRET-efficiënties, die overeenkomen met FRET-paren die ver van elkaar verwijderd zijn, zenden groene fluorescentie uit, wat staat voor gedemonteerde fibrillen. Beide signalen verschijnen in cellen wanneer ze bezig zijn met het opnemen en afbreken van EF-C-peptide nanofibrillen. Gebieden waar hoge en lage FRET-efficiënties worden gevonden, worden in geel weergegeven (Figuur 6A).

figure-results-2
Figuur 6: Beeldvorming van EF-C peptide nanofibrilafbraak door correlatieve FRET-beeldvorming en STEM-tomografie (FRET-3D-CLEM). (A) Confocale microscopie van een cel die is geïncubeerd met EF-C-nanofibrillen die zijn gelabeld met een FRET-paar. Groene seinen komen overeen met vermoedelijk gedemonteerde fibrillen. Rood komt overeen met vermoedelijk intacte fibrillen. Geel komt overeen met gebieden waar een combinatie van het rode en het groene signaal wordt gedetecteerd. Nu nucleus. (B) STEM-overzicht van een 800 nm dik gedeelte van dezelfde cel. (C) De positie van het tomogram wordt aangegeven. De afbeelding is een samenstelling van twee afbeeldingen die op verschillende secties zijn verkregen, omdat de cel gedeeltelijk werd geblokkeerd door het staafraster op een van de secties. De kern is gelabeld met Nu in A, B en C. (C) Virtuele doorsnede van het tomogram. Rode pijlpunten markeren gebieden die overlappen met rode fluorescentiesignalen. STEM-tomografie bevestigt de aanwezigheid van intacte fibrillen. De groene pijlpunt wijst naar een gebied met gedemonteerde fibrillen. (D) Segmentatie van het tomogram. Een endocytosed filopodium knijpt het blaasjesmembraan af (witte pijl). Het grote volume dat met een STEM-tomogram kan worden onderzocht (hier ongeveer: 7 μm x 7 μm x 550 nm) maakt het gemakkelijker om zo'n zeldzame gebeurtenis waar te nemen. (E) Virtuele secties 19, 24 en 29 van het tomogram. Bij een pixelgrootte van 6,8 nm liggen de secties elk 27,2 nm uit elkaar. Het cijfer is gereproduceerd op basis van de gegevens gepubliceerd door Rauch-Wirth et al.24 . Schaalbalken = 5 μm (A), 1 μm (C). Afkortingen: STEM = scanning transmission electron microscopy; FRET = Foerster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Visualisatie werd uitgevoerd door deze correlatieve benadering om te bevestigen dat EF-C-fibrillen door de cel worden opgenomen en vervolgens worden afgebroken. Met lichtmicroscopie kunnen we cellen kiezen voor elektronenmicroscopie die rode en groene signalen geven, om het ultrastructurele uiterlijk te vergelijken dat correleert met de verschillende fluorescentiesignalen. STEM-tomogrammen van dezelfde cel laten zien dat het rode signaal afkomstig kan zijn van fibrillen die zich nog buiten de cel bevinden of schijnbaar vers geïnternaliseerd zijn door macropinocytose (Figuur 6C). Bovendien verifieerde CLEM dat het groene signaal inderdaad afkomstig was van gedegradeerde fibrillen (Figuur 6B,C die te vinden is in lysosomen (Figuur 6C, grootste blaasje). Door het grote volume dat toegankelijk is voor STEM-tomografie en de 3D-visualisatie van de structuren, is het gemakkelijker om het signaal van lichtmicroscopie te correleren met ultrastructurele kenmerken en deze te interpreteren. Bovendien kunnen zeldzame gebeurtenissen, zoals het afknijpen van filopodia in het lysosoom (Figuur 6D,E, witte pijl) met deze benadering worden gedetecteerd.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM-tomografie biedt een resolutie die vergelijkbaar is met TEM-tomografie in combinatie met de mogelijkheid om volumes met een dikte tot 1 μm te onderzoeken. We beschouwen het daarom als ideaal voor het in beeld brengen van door virussen geïnduceerde veranderingen van intracellulaire structuren, zoals membraanremodellering 4,6,25, knopvorming van virionen7 of endocytose5. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen andere VolumeEM-technieken worden overwogen. Voor een techniek die een groter gezichtsveld biedt met een vergelijkbare resolutie, raden we FIB-SEM-tomografie aan. FIB-SEM-tomografie zal langzamer zijn dan STEM-tomografie bij beeldvorming van een vergelijkbaar volume met vergelijkbare resolutie, aangezien de beeldvormingstijd toeneemt wanneer de resolutie toeneemt. Vaak wordt dit vervolgens gecompenseerd door kleinere gezichtsvelden in beeld te brengen. Bovendien zou een z-resolutie van 6,8 nm (Figuur 6) technisch uitdagend zijn bij het frezen van ionenbundels. Daarom is FIB-SEM optimaal voor het afbeelden van grotere structuren zoals hele cellen en weefsel 9,10,26,27, zij het meestal met (isotrope) pixelgroottes van enkele tientallen nanometers. Bovendien vertonen FIB-SEM-tomogrammen geen "ontbrekende wig"-effecten, wat typisch is voor tomogrammen die zijn gereconstrueerd uit een tilt-reeks. Bovendien worden met de ontwikkeling van plasma FIB-machines momenteel alternatieven in het veld geïntroduceerd die sneller en nog steeds nauwkeurig frezen mogelijk maken.

Als een hoge resolutie in z niet cruciaal is, kan TEM- of SEM-beeldvorming van seriële doorsneden een alternatief zijn dat het mogelijk maakt om in korte tijd een zeer groot gezichtsveld te onderzoeken28,29, echter meestal met anisotrope resolutie. In TEM-tomografie kunnen verschillende tomogrammen van seriële dikke secties worden gecombineerd30,31. Hetzelfde is mogelijk bij STEM-tomografie; Gezien de dikte van de secties die kunnen worden onderzocht, is het echter minder nodig om een aantal tomogrammen te combineren. In de virologie wordt TEM-tomografie vaak gebruikt om door virus geïnduceerde membraanremodellering te karakteriseren 32,33,34,35. Hoewel TEM-tomografie zelf waardevolle inzichten biedt in de replicatiecyclus van virussen, zouden de meeste use-cases baat hebben bij het vermogen van STEM-tomografie om dikkere volumes in beeld te brengen. Dit geldt met name voor virionen met een anisotrope morfologie, zoals rhabdoviridae, waar TEM-tomografie slechts een paar volledige virionen kan vastleggen in één tomogram35 of voor het afbeelden van verschillende omhullende virionen in een replicatiecompartiment met een grootte van het cytoplasmatisch viraal assemblagecomplex (cVAC) van het humaan cytomegalovirus (HCMV)4.

STEM-tomografie onder cryogene omstandigheden biedt verdere functionele inzichten19 en er is een videoprotocol beschikbaar20. Ons protocol verschilt in de workflow voor monstervoorbereiding, die, in plaats van het monster in de oorspronkelijke staat te bewaren, zorgt voor een bijna-native ultrastructurele bewaring. Hoewel STEM-tomografie van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters niet de ultrastructurele conservering en atomaire resolutie kan bereiken die wordt gezien in cryogene EM, profiteert het van de voordelen van eenvoudigere apparatuur, stabielere monsters en een hogere doorvoer.

De volgende stappen zijn cruciaal voor het succes van de methode:

Eerst een duidelijk doel van het beeldvormingsexperiment. Vanwege het arbeidsintensieve karakter van de techniek is een goed gepland experiment met een duidelijk doel voor beeldvorming nodig. Gedetailleerde kennis van het modelsysteem - cellijn en virus - moet vooraf worden gegenereerd door andere methoden te gebruiken die minder moeilijk uit te voeren zijn. Daarom moedigen we het optimaliseren van de infectiviteitspercentages aan in pre-experimenten op basis van lichtmicroscopie en het aanpassen van de experimentele omstandigheden aan het biologische systeem. Optimalisatieparameters omvatten het aantal cellen, de multipliciteit van de infectie (MOI) en tijdstippen op basis van het virus en de gebeurtenis die moet worden afgebeeld. Dit zorgt voor een hoog aandeel evalueerbare cellen in het monster.

Ten tweede, hoogwaardige monstervoorbereiding. We benadrukken het belang van een goede monstervoorbereiding. Op dit moment beschouwen we vitrificatie door bevriezing onder hoge druk als de gouden standaard voor dikke exemplaren zoals cellen. Bevriezingssubstitutie, inbedding en daaropvolgende beeldvorming bij kamertemperatuur is een robuuste manier om resultaten van hoge kwaliteit te verkrijgen in combinatie met STEM-tomografie. Daarom is het van cruciaal belang om een stabiele routine voor de monstervoorbereiding op te zetten. Hiervoor willen we de literatuur over bevriezing onder hoge druk belichten 14,21. Als een minder giftige vriessubstitutieoplossing moet worden gebruikt, raden we aan kaliumpermanganaat te gebruiken als vervanging voor osmiumtetroxide, zoals beschreven door Schauflinger et al.36.

Ten slotte moet een soepel lopende workflow voor het verkrijgen van kantelseries, inclusief een goed uitgelijnde microscoop, worden opgezet in overeenstemming met de gebruikersinstructies van de STEM en zal deze van microscoop tot microscoop verschillen. Het opzetten van een soepele workflow hangt ook af van de scangenerator en de software voor het verzamelen van afbeeldingen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR en MD zijn werknemers van Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, een farmaceutisch bedrijf dat geïnteresseerd is in het ontwikkelen en produceren van op virussen gebaseerde producten. Dit had geen invloed op de vormgeving van het papier; Daarom melden we geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze publicatie maakt deel uit van de Global Development Technology Strategy en werd ondersteund door het Global Technology Management van Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. We danken Renate Kunz en Jana Apolloni voor hun uitstekende technische assistentie en nuttige discussie over de voorbereiding van monsters. Wij danken Reinhard Weih voor zijn uitstekende hulp bij technische problemen en het onderhoud van het apparaat. We danken Torsten Friedrich voor zijn nuttige discussie en voor zijn hulp bij het instellen van de microscoop. Het werk van Clarissa Read, Julia LaRoche en Jan Münch is gefinancierd door een Cooperative Research Centre Grant van de Duitse Onderzoeksstichting (SFB1279).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-HexadeceneMerck KGaA8220640500
200 koperrooster met parallelle stavenPlano GmbHG2014C
37 °C droogkamerBinder GmbH9010-0323
AcetonVWR international GmbH20066330
DDSAElectron Microscopy Sciences13710
DiamantmesDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Electron Microscopy Sciences13600
Embed-812 ResinElectron Microscopy Sciences14900
EM toolsTVIPS GmbHTVIPS Software: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Ethanol 100%Merck KGaA1.00983.2511
FilterpapierVWR international GmbH516-0812
Flessen met klikdekselglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarElectron Microscopy Sciences15830-25
Freeze substitution unit Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmAURION Immuno Gold Reagents & Accessoires425.011
Goudpinehole ø 2000 μmScience Services GmbHGA2000-Au
Gratiekels letters-netje koperPlano GmbHNH6C
VerwarmingsplaatMEDAX GmbH & Co. KG12501
Hogedrukapparaat BAF 300BAL-TEC AG
Hogedrukvriezer Wohlwend HPF Compact 01Engineering Office M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
Vloeibare stikstoftankH.Erben GmbH94500
Stikstof (vloeibaar)VWR international GmbH-
NMAElectron Microscopy Sciences19000
OsmiumtetraoxideChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Oven 120 °CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poly-L-Lysine 0,1% w/v aq. oplossingTed Pella, Inc.18026
Safe-Lock Tubes 0,5 mLEppendorf SE0030 121.023
Staalbewerkingscontainers (Beem capsules)Plano GmbHG360-1
Saffier schijf dia. 3 x 0,16 mmEngineering Office M. Wohlwend GmbH500
Ultramicrotome Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
Uranyl acetateRiedel de Haën AG31697
UV lichtkamerDiniesELG100S

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

STEM tomografiehogedrukvriezenvries substitutie3D beeldvormingvirusge nfecteerde cellenharsinbeddingvesicular stomatitis viruscorrelatieve licht elektronenmicroscopievirionmorfogenese

Gerelateerde artikelen