Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Alu RNA-getransfecteerd primair retinaal pigmentepitheel van muizen: een pathologisch relevant in-vitromodel voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

563 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol beschrijven we het volledige proces van het opstellen van een pathologierelevant model voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) in primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) van muizen met behulp van Alu RNA-transfectie.

Samenvatting

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), met name niet-exsudatieve AMD, vereist experimentele modellen die de menselijke pathologie beter repliceren. De huidige in vivo modellen blijven technisch veeleisend en tijdrovend, terwijl conventionele in vitro systemen er niet in slagen ziektespecifieke pathologische triggers samen te vatten. Hier presenteren we een methode om een retinaal pigmentepitheliaal (RPE) degeneratiemodel op te zetten met behulp van primaire muis-RPE-cellen getransfecteerd met Alu-RNA, een retrotransposon dat rechtstreeks betrokken is bij geografische atrofiepathologie.

Dit protocol beschrijft de enzymatische isolatie van primaire RPE-cellen van muizen, gevolgd door Alu RNA-transfectie om RPE-degeneratie te induceren. Validatie integreert morfologische (zeshoekige architectuur), functionele (polariteitsverlies en verstoring van muiseiwit ZO-1) en moleculaire analyse (kwantitatieve PCR). Als gevolg hiervan zagen we multifactoriële veranderingen veroorzaakt door Alu RNA-transfectie: inflammatoire cytokinesecretie (muisgenen Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) en cellulaire senescentie (muizengenen p21 en p53 upregulatie; p < 0,05). Vergeleken met traditionele acute stressmodellen, recapituleert dit systeem chronische inflammatoire-degeneratieve cascades van AMD door middel van gestandaardiseerde technieken, waardoor reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd. Door aspecten van vereenvoudigde in vitro assays en complexe in vivo modellen te combineren, zou deze aanpak kunnen dienen als een voorlopig platform voor het verkennen van retrotransposon-gestuurde mechanismen en het screenen van potentiële therapeutische kandidaten.

Inleiding

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een veel voorkomende oorzaak van wereldwijde visuele beperking. Effectieve behandelingen voor niet-exsudatieve AMD blijven echter beperkt. Er is dus dringend behoefte aan reproduceerbare en efficiënte onderzoeksmodellen om ziektemechanismen bloot te leggen en therapeutische doelen te identificeren 1,2. Centraal in deze inspanning staat het retinale pigmentepitheel (RPE), een monolaag tussen het membraan van Bruch (choroïd) en fotoreceptoren (netvlies), die een cruciale rol speelt bij het in stand houden van de retinale homeostase door de fotoreceptorfunctie te ondersteunen, de bloed-retinale barrière te reguleren en de afvoer van afvalstoffen te vergemakkelijken 3,4.

Disfunctie of verlies van RPE-cellen is een opvallend kenmerk van veel retinale degeneratieve ziekten, vooral bij AMD, waar RPE-disfunctie een vroege en kritieke stap in de progressie is 2,4,5. Met name bij patiënten met geografische atrofie (GA), de gevorderde fase van AMD, resulteren verlaagde niveaus van het microRNA-verwerkende enzym Dicer 1 ribonuclease III (DICER1) in toxische accumulatie van Alu-RNA, een retrotransposon-transcript dat rechtstreeks verband houdt met RPE-degeneratie en betrokken is bij menselijke pathologie6.

Traditionele in vivo modellen, zoals het natriumjodaat (NaIO3) model en het amyloïde-β (Aβ) model, behouden de systemische complexiteit van de ziekte, maar hebben te maken met kritieke beperkingen. Het NaIO3-model induceert snel retinale oxidatieve stress en RPE-schade, maar de acute toxiciteit verstoort zowel RPE als fotoreceptoren, waardoor de chronische pathologiegerelateerde progressie van AMD niet kan worden nagebootst en de therapeutische evaluatie van subtiele RPE-disfunctie wordt verdoezeld7. Evenzo introduceert het Aβ-model ziektespecifieke stressoren, maar vereist het uitgebreide technische expertise en langere tijdlijnen in vergelijking met in vitro-benaderingen 8,9. Conventionele in vitro RPE-modellen, zoals H2O2 en hydrochinonblootstellingsmodellen, missen daarentegen pathologische relevantie en slagen er niet in om ziektespecifieke stressoren zoals toxische eiwitaggregaten of ontstekingstriggers te recapituleren1.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het opzetten van een RPE-degeneratiemodel in primaire RPE-cellen van muizen met behulp van Alu-RNA, een retrotransposon-afgeleid niet-coderend RNA dat rechtstreeks betrokken is bij de pathogenesevan GA 6. Alu RNA activeert ontstekingsroutes en brengt de integriteit van de RPE-barrièrein gevaar 10,11, waardoor de pathologische kenmerken worden nagebootst die geassocieerd zijn met niet-exsudatieve AMD. Deze methode maakt gebruik van de enzymatische isolatie en kweek van RPE-cellen, gevolgd door de inductie van RPE-degeneratie met behulp van Alu-RNA. Daarnaast bieden we een uitgebreid validatiesysteem, dat morfologische (zeshoekige architectuur), functionele (barrière-integriteit en polariteitsverlies) en moleculaire (ontstekings- en senescentiemarkers) uitlezingen combineert om dit degeneratiemodel te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Shanghai General Hospital, verbonden aan de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Dit protocol volgt strikt het Reglement voor het beheer van zaken met betrekking tot proefdieren (uitgevaardigd door de Staatscommissie voor Wetenschap en Technologie) en de richtlijnen voor het ethisch gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek opgesteld door de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over de materialen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Isolatie van primaire RPE-cellen van muizen

  1. Voorbereiding van gecoate platen
    1. Verdun Matrigel in een verhouding van 150 μl Matrigel tot 13 ml DMEM/F12 (eindconcentratie ongeveer 1,14%).
    2. Smeer de bodem van de plaat gelijkmatig in met de verdunde Matrigel (ongeveer 150 μl voor een plaat met 48 putjes). Incubeer een nacht bij 37 °C om een gel te vormen.
  2. Voorbereiding van de oplossing
    1. Bereid het volledige RPE-kweekmedium voor met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
    2. Bereid papaïnemix voor door 4,5 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) toe te voegen aan een papaïneflacon (100 eenheden/injectieflacon).
    3. Bereid DNase I Mix voor door 500 μl EBSS toe te voegen aan een injectieflacon DNase I (1.000 eenheden/injectieflacon).
    4. Bereid de oplossing voor de vertering van papaïne voor door 250 μL DNase I Mix toe te voegen aan 4,5 ml Papain Mix (pas het door de leverancier verstrekte protocol aan om een uiteindelijke papaïneconcentratie van 22 IE/ml te bereiken), waardoor het uiteindelijke volume 4,75 ml wordt.
  3. Euthanasie en weefselafname
    1. Euthanaseer muizen van 2-3 weken oud via intraperitoneale injectie van 5% natriumpentobarbital bij 150-200 mg/kg lichaamsgewicht. Bevestig diepe anesthesie en overlijden door te controleren of de hartslag en ademhaling zijn gestopt.
    2. Spuit het ooggebied grondig met 70% ethanol voorafgaand aan enucleatie om oppervlakteverontreinigingen te verwijderen 12,13,14. Druk voorzichtig op de periorbitale rand om de bol uit te steken. Gebruik vervolgens een tang om de oogbol te extraheren, waardoor de oogzenuw behouden blijft voor gemakkelijkere dissectie.
      OPMERKING: Alle gereedschappen (bijv. pincet, schaar) worden geautoclaveerd en procedures worden uitgevoerd onder een laminaire stromingskap om de steriliteit te behouden.
    3. Dompel de oogbollen onmiddellijk onder in steriel volledig RPE-kweekmedium dat is voorverwarmd tot 37 °C.
  4. Enzymatische spijsvertering
    OPMERKING: Alle stappen, inclusief enzymatische vertering en daaropvolgende procedures, moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stroomkap om de steriliteit te behouden.
    1. Breng de oogbol over naar een schaaltje en gebruik een tang om het aanhangende bindweefsel en de resterende extraoculaire spieren onder een stereomicroscoop te verwijderen.
    2. Spoel de ogen 2x voorzichtig met de voorgekoelde Dulbecco's Fosfaatgebufferde Zoutoplossing (D-PBS; geen Ca2+/Mg2+; bij 4 °C).
      OPMERKING: Resterend compleet RPE-kweekmedium kan de enzymatische activiteit van papaïne in gevaar brengen.
    3. Dompel de ogen volledig onder in 1 ml papaïne-digestieoplossing en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C.
  5. Scheiding van RPE-cellen
    1. Neutraliseer na de spijsvertering de enzymatische activiteit met een volledig RPE-kweekmedium.
    2. Breng de oogbol over naar een schaal en snijd onder een stereomicroscoop het hoornvlies, de iris en de lens weg en bewaar de achterste oogschelp.
      OPMERKING: RPE-cellen werden gedurende het hele proces geïsoleerd en onderhouden als intacte vellen (in plaats van te dissociëren in afzonderlijke cellen).
    3. Scheid het netvlies-RPE-complex van het vaatvlies en pel vervolgens de RPE-laag weg van het netvlies als doorlopende vellen in een volledig RPE-kweekmedium. Verzamel de losgeraakte RPE-lagen gelijkmatig tot vers compleet RPE-kweekmedium als een mengsel en kweek ze vervolgens op met Matrigel beklede oppervlakken.
  6. Celcultuur
    1. Zaai het mengsel in een met Matrigel beklede plaat met 24 putjes (8-10 oogbollen per putje op dekglaasje, voor immunokleuring), een met Matrigel beklede plaat met 48 putjes (6-8 oogbollen per putje, voor qPCR) of een met Matrigel gecoate plaat met 96 putjes (5-6 oogbollen per putje).
    2. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2. Voer de eerste mediumwissel na 48 uur uit met behulp van een volledig RPE-kweekmedium. Vervang het medium elke 48 uur na de eerste verversing.
      OPMERKING: Om de polariteit van RPE-cellen zoveel mogelijk te behouden, moet u ze waar mogelijk niet passeren, aangezien herhaalde subcultuur kan leiden tot verlies van differentiatie en functionele integriteit.
  7. Monitoring van de celmorfologie
    1. Laat cellen een monolaag vormen met een karakteristieke zeshoekige morfologie. Monitor op morfologie onder een omgekeerde celcultuurmicroscoop.

2. Inductie van het RPE-degeneratiemodel

  1. Synthese en verificatie van Alu-RNA
    1. Synthese van Alu-RNA met behulp van een in vitro transcriptiesysteem.
      OPMERKING: De synthese van Alu-RNA die in onze studie werd gebruikt, was gebaseerd op het protocol beschreven door het Ambati Lab6.
    2. Zuiver het RNA en bevestig de kwaliteit ervan met behulp van een microspectrofotometer.
  2. Alu RNA transfectie
    OPMERKING: We hebben de dag van het zaaien van primaire RPE-cellen aangewezen als dag 0. Op dag 5 vertoonden de aanhangende primaire RPE-cellen een uniforme morfologie en bereikten ze meer dan 50% cellulaire samenvloeiing, op welk punt Alu RNA-transfectie werd uitgevoerd met behulp van een kationisch lipide-gebaseerd transfectiereagens, volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    Twee controlegroepen werden opgenomen om de resultaten te valideren: i) een negatieve controle (NC), waarin noch Alu-RNA noch het transfectiereagens werd toegevoegd en een laag serummedium als substituut werd gebruikt; ii) liposoomcontrole (LC), waarin Alu RNA werd weggelaten, maar dezelfde hoeveelheid transfectiereagens werd gemengd met een laag serummedium en op cellen werd aangebracht om te controleren op lipofectie-geassocieerde effecten. De volgende stappen schetsen de procedure van de transfectie van Alu RNA.
    1. Vervang het bestaande medium door 300 μL volledig RPE-kweekmedium per putje (plaat met 48 putjes) vóór transfectieprocedures.
    2. Bereid transfectiecomplexen met Alu RNA en kationisch lipide-gebaseerd reagens in laag-serum middel voor.
      1. Bereid Meng 1 met 1,2 μl reagens op basis van kationische lipiden en 18,8 μl van het serum arme medium. Meng voorzichtig (niet vortexen) en incubeer het 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Bereid Meng 2 met 6 μL Alu RNA (100 μg/ml) en 14 μL medium met een laag serumgehalte.
      3. Bereid transfectiecomplexen voor door 20 μL Mix 2 druppelsgewijs toe te voegen aan 20 μL Mix 1.
        OPMERKING: Alu RNA werd getransfecteerd in een uiteindelijke concentratie van 0,6 μg per putje met behulp van 1,2 μL kationisch lipide-gebaseerd reagens per putje (1,2 μL reagens: 0,6 μg RNA-verhouding).
      4. Veeg voorzichtig om te mengen. Laat het vervolgens 20 minuten op kamertemperatuur staan.
    3. Voeg 40 μL/putje van de transfectiecomplexen toe aan elk putje van een plaat met 24 putjes. Plaats de plaat gedurende 48 uur in een incubator van 37 °C/5% CO2 .
    4. Voer qPCR-, immunokleurings- en andere experimentele procedures uit 48 uur na transfectie.

3. Validatie van het degeneratiemodel

OPMERKING: Op dag 7 werden uitgebreide modelvalidatie-experimenten uitgevoerd.

  1. Immunofluorescentiekleuring voor evaluatie van polariteit en barrière-integriteit
    1. Fixeer gekweekte RPE-cellen met 4% methanolvrij formaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was 3 x 10 min met 1x PBS.
    2. Blokkeer niet-specifieke binding met 5% runderserumalbumine (BSA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur.
    3. Incubeer met primaire antilichamen anti-ZO1 (verdunning 1:1.000 in 3% BSA) en Phalloidin 488 (1:1.000 verdunning in 3% BSA) 's nachts bij 4 °C, vermijd licht.
    4. Was de cellen 3 x 10 minuten voorzichtig met PBS.
    5. Incubeer met secundaire antilichamen (1:1.000 verdunning in 3% BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Was de monsters 3 x 10 minuten met 1x PBS.
    7. Tegenvlekken met DAPI (1:1.000 verdunning in PBS) gedurende 10 min.
    8. Was de monsters 3 x 10 minuten met 1x PBS.
    9. Verwijder het dekglaasje voorzichtig van de plaat met 24 putjes en plaats het op een glazen schuif die vooraf is geladen met een druppel montagemedium. Leg confocale beelden vast met een 40x/0,95 objectief.
  2. Kwantitatieve PCR (qPCR) voor senescentie en ontstekingsmarkers
    OPMERKING: Glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (muizengen Gapdh) werd gebruikt als het interne referentiegen voor normalisatie van drempelcycluswaarden (Ct). Alle kwantitatieve PCR (qPCR) reacties omvatten drie biologische replicaten per experimentele groep. Primersequenties worden gegeven in aanvullende tabel S1.
    1. RNA-extractie
      1. Voeg lysisbuffer (Total RNA Kit) toe aan de kweekplaat (1 ml per 10 cm² oppervlakte) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng het bovenstaande over in een nieuwe RNase-vrije buis.
        NOTITIE: Sla deze stap over als monsters vrij zijn van vuil (bijv. clear cell lysate).
      3. Voeg 200 μL chloroform toe aan de supernatant, vortex gedurende 15 s en incubeer 3 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng de bovenste waterige fase (~500 μL) over naar een nieuwe buis.
      5. Voeg 0,5 volume ethanol toe aan de waterige fase. Meng voorzichtig door te pipetteren.
      6. Laad het mengsel op een silicamembraankolom (inbegrepen in de Total RNA Kit). Centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
      7. Voeg 500 μL eiwitverwijderingsbuffer (Total RNA Kit) toe aan de kolom. Centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
      8. Voeg 500 μL wasbuffer (Total RNA Kit) toe aan de kolom. Centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s. Gooi de doorstroom weg.
      9. Herhaal de vorige stap 3.2.
      10. Centrifugeer de lege kolom bij 13.400 × g gedurende 2 minuten om het membraan te drogen.
      11. Elute RNA door 30-100 μL RNasevrij water aan het membraan toe te voegen. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer op 13.400 × g gedurende 2 min.
    2. Complementaire DNA (cDNA) synthese
      1. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm en 280 nm.
        OPMERKING: Een A260/A280-verhouding tussen 1,8 en 2,0 wordt beschouwd als geassocieerd met een acceptabele RNA-zuiverheid.
      2. Bereid het reactiemengsel voor in een RNase-vrije buis: RNA-sjabloon (500-1.000 ng): X μL (gerelateerd aan de concentratie), 5x reverse transcriptiebuffer: 4 μL, RNase-vrij water: tot 20 μL.
      3. Incubeer het reactiemengsel in een thermische cycler met behulp van het volgende programma: 37 °C gedurende 15 min, 85 °C gedurende 5 s en voor onbepaalde tijd bij 4 °C.
    3. qPCR
      1. Bereid qPCR-mastermix voor elke reactie (10 μL totaal): TB Groen (inbegrepen in Premix Taq): 5 μL, ROX kleurstof (inbegrepen in Premix Taq): 0,2 μL, Voorwaartse primer (1 μM): 0,2 μL, Omgekeerde primer (1 μM): 0,2 μL, RNasevrij water: 3,4 μL, cDNA-sjabloon: 1 μL.
      2. Voeg 10 μL van het mastermengsel toe aan elk putje van een plaat met 96 putjes.
      3. Sluit de plaat af met een zelfklevende optische afdekking. Centrifugeer op 300 × g gedurende 1 min.
      4. Voer het volgende programma uit op een real-time PCR-systeem: Fase 1: 95 °C gedurende 30 s; Fase 2: 40 cycli van: 95 °C gedurende 5 s, 60 °C gedurende 30 s; Fase 3: Analyse van de smeltcurve.
      5. Bereken de relatieve expressieniveaus van doel-mRNA's met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Primaire muis RPE-cellen vóór Alu RNA-transfectie
Op dag 0 (Figuur 1) werden primaire RPE-cellen van muizen geïsoleerd en vertoonden ze de karakteristieke zeshoekige morfologie, die typerend is voor gezonde RPE-cellen. Deze cellen behielden een goed georganiseerde monolaag. De cellen werden gekweekt om een initiële structurele organisatie en vorming van tight junctions mogelijk te maken, zoals blijkt uit de zeshoekige vorm en goed gedefin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ons doel was om een reproduceerbaar en toegankelijk RPE-letselmodel op te zetten dat beeldvorming met hoge resolutie en mechanistische analyse mogelijk maakt met minimale beperkingen van de middelen. Deze benadering bood een duidelijke visualisatie van door Alu RNA geïnduceerde structurele verstoring in vergelijking met de controlegroep, inclusief apicale tight junction-fragmentatie en basale cytoskeletale desorganisatie door middel van confocale Z-stack-beeldvorming (stapgrootte van 0,5...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Actieplan voor Wetenschaps- en Technologie-Innovatie Speciaal Project voor Medische Innovatie (23Y11901300), de National Natural Science Foundation of China (82171076) en de Shanghai Municipal Education Commission (2023ZKZD18). We danken professor L.Z voor de vriendelijke gift van Alu RNA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety CabinetThermo Scientific
37 °C/5% CO2 incubatorThermo Scientific
4% Paraformaldehyde (PFA)ServicebioG1101-500ML
human Alu RNAGifted by L.Z.
Anti-rabbit secondary antibody,Alexa Fluor 568(goat)Invitrogen Thermo ScientificA11011
Applied Biosystems MicroAmp adhesive optical coverThermo Fisher Scientific
Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlatesThermo Fisher Scientific
Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificReal-time PCR system voor kwantitatieve genexpressieanalyse
Bovine Serum Albumin(BSA, Fraction V)BeyotineST023-50g
Carl Zeiss Primovert inverted cell culture microscopeZeissVoor monitoring van celmorfologie
Centrifuge 5424 Reppendorf
ChloroformSigmaFasescheiding bij RNA-extractie.
Confocal laser scanning microscope(LSM900+Cell discover 7)ZeissBeeldvorming met hoge resolutie van immunofluorescence markers (bijv. ZO-1 en F-actin).
Costar 24/48/96 well plateCorning
coverslipThermo Fisher ScientificGebruikt op 24-well plate voor immunofluorescence beeldvorming.
DAPIThermo62248
Digital dry bathMulab
DMEM/F12gibcoMedia om RPE cellen te kweken
Dulbecco's Phosphate-Buffered(D-PBS)ShareBioSB-CR017
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)gibcoGebalanseerd zout oplossing gebruikt voor papaine en DNase I verdunning tijdens RPE isolatie.
Ethanol (Absolute)SigmaRNA precipitatie en kolomwassing.
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaVoor complete RPE celkweekmedium
forcepsVoor dissectie
Lipofectamine 3000 (Cationic Lipid-Based Transfection Reagent)Thermo FisherL300015Om Alu RNA in RPE cellen te transfecteren
matrigelCorning356234Matrix (1,14% verdunning) voor het coaten van platen om RPE adhesie en polarisatie te ondersteunen.
Methanol-Free FormaldehydeThermo ScientificAlternatief fixatief (4%) voor het conserveren van epitopen in immunofluorescence
Micropipetteeppendorf
Nanodrop 2000 spectrophotometerThermo ScientificMeet RNA concentratie en zuiverheid
Nikon ECLIPSE Ti-S fluorescent Inverted microscopeNikonFluorescentie beeldvorming van gekleurde monsters
Olympus SZX16 stereomicroscopeOlympusVoor dissectie van muis oogbollen en RPE isolatie
Opti-MEMgibcomedium met laag serumgehalte voor bereiding van transfectiecomplex
Papain dissociation systemWorthingtonLK003150Voor werkende enzym
Penicillin-StreptomycingibcoVoor complete RPE celkweekmedium
Pentobarbital sodium saltSigmaEuthanasie middel
Phalloidin 488Abcam176753Voor polariteitsbeoordeling
PrimeScript RT reagent KitTaKaRaRR037AReverse transcriptie kit voor cDNA synthese (qPCR sjabloonvoorbereiding)
RNAsimple Total RNA KitTIANGENDP419Voor RNA extractie
TB GreenPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR420AVoor qPCR
ZO-1 Rabbit Polyclonal AntibodyProteintech21773Voor morfologische evaluatie

Referenties

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Alu RNA-transfectieprimaire muis-RPERPE-degeneratieenzymatische isolatieinflammatoire cytokinesecretiecellulaire senescentiekwantitatieve PCRchronische ontsteking

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.