Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microdissectie op meerdere niveaus en functioneel-structurele profilering van menselijke renale arteriële takken

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

5 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol voor de isolatie en functionele evaluatie van menselijke renale arteriële takken, waardoor preklinische studies voor farmaceutische ontwikkeling worden vergemakkelijkt.

Samenvatting

Renale vasculaire disfunctie speelt een cruciale rol in de pathogenese van meerdere klinische aandoeningen, waaronder acuut nierletsel, nierischemie en hypertensie, wat aanzienlijke uitdagingen met zich meebrengt bij de klinische behandeling en een negatieve invloed heeft op de patiëntresultaten. De isolatie en functionele karakterisering van intrarenale slagaders zijn cruciaal voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan renale vasculaire disfunctie, met name gerelateerd aan nierbeschadiging, en voor het begeleiden van gerichte therapeutische ontwikkeling. Ondanks het klinische belang ervan, blijven gestandaardiseerde benaderingen voor het isoleren en functioneel beoordelen van menselijke intrarenale slagaders over verschillende vertakkingsniveaus onderontwikkeld. Dit protocol biedt een uitgebreid kader voor de systematische isolatie en multimodale evaluatie van intrarenale arteriële takken, met inbegrip van functionele en structurele beoordelingen onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. De methodologie omvat drie belangrijke componenten: (1) nauwkeurige anatomische identificatie en microdissectie van intrarenale slagaders van donornieren, vergezeld van hematoxyline (H&E)-kleuring voor structurele bevestiging; (2) rigoureuze normalisatieprocedures in draadmyografie om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van metingen te verbeteren; en (3) kwantitatieve analyse van vasomotorische responsen met behulp van precisiedraadmyografietechnieken. Normalisatie is gebaseerd op de relatie tussen spierlengte en spanning, waarbij incrementele rekking van arteriële segmenten een optimale rustspanning tot stand brengt om de overlap tussen actine en myosine te maximaliseren, waardoor piekcontractiele reacties worden opgewekt. Bij draadmyografie worden geïsoleerde vaatsegmenten opgehangen tussen twee parallelle draden, waardoor een nauwkeurige meting van de vasculaire spanning mogelijk is. Door strikte normalisatieprotocollen toe te passen, maakt deze techniek reproduceerbare en betrouwbare kwantificering van vasculaire reactiviteit bij diverse pathofysiologische aandoeningen en farmacologische interventies mogelijk.

Inleiding

De nier is een vitaal orgaan dat verantwoordelijk is voor het handhaven van de menselijke homeostase door de opruiming van metabolische afvalstoffen, de elektrolytenbalans en de vochtregulatie - functies die een uitzonderlijk hoge bloedstroom vereisen. Onder fysiologische omstandigheden ontvangen de nieren ongeveer 25% van het totale bloedvolume dat elke minuut door het hart wordt gepompt (hartminuut), wat hun substantiële rol in de systemische bloedstroom en het cruciale belang van nierperfusie voor het behoud van het algehele fysiologische evenwicht onderstreept1. Het renale arteriële systeem reguleert deze massale bloedafgifte nauwkeurig om de GFR te behouden en zich aan te passen aan systemische hemodynamische veranderingen. Bijgevolg vertegenwoordigt verslechtering van de nierperfusie een kritisch pathologisch mechanisme dat bijdraagt aan een verminderde glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) bij aandoeningen zoals acuut nierletsel en nierischemie. Bovendien komt het vaak voor als secundair aan systemische aandoeningen die de nierbloedstroom in gevaar brengen, waaronder shock, hartdisfunctie en sepsis 2,3,4,5. De nierslagader ondergaat een sequentiële vertakking in de nier en verdeelt zich eerst in interlobaire slagaders die door de nierkolommen tussen medullaire piramides lopen. Bij het bereiken van de corticomedullaire overgang geven deze bloedvaten aanleiding tot boogvormige slagaders, die langs de grens tussen cortex en medulla buigen. Uit deze kromlijnige vaten komen interlobulaire slagaders voort die radiaal doordringen in het corticale parenchym en uiteindelijk bloed leveren aan de glomerulaire haarvaten via afferente arteriolen om individuele nefronen te perfuseren 1,6,7. Interlobaire, boogvormige en interlobulaire slagaders vormen het belangrijkste resistentievaatstelsel in de nier en dienen als primaire regulatoren van intrarenale hemodynamica en drukregeling 1,8. Nauwkeurige isolatie en karakterisering van deze vaten zijn cruciaal voor het ophelderen van de fundamentele mechanismen die de nierperfusiehomeostaseregelen 9. Bovendien biedt hun heterogene vasculaire reactiviteit onder verschillende pathofysiologische omstandigheden een strategisch kader voor de ontwikkeling van nieuwe vaatverwijdende middelen met nierbeschermend potentieel10,11.

Momenteel worden klinische beeldvormingstechnieken (bijv. echografie) routinematig gebruikt om veranderingen in de nierbloedstroom te controleren; Experimentele methodologieën in fundamenteel onderzoek voor het direct beoordelen van renale vasculaire spanning, een belangrijke bepalende factor voor nierperfusie, blijven echter beperkt 12,13,14,15. Het draadmyografiesysteem is een gerenommeerd experimenteel platform dat spanningsveranderingen meet in kleine biologische weefsels in vitro, waaronder bloedvaten, luchtpijp 16,17,18, met diameters variërend van 50 μm tot 10 mm 16,19,20. Hoewel draadmyografie op grote schaal is toegepast in dierstudies, beperken verschillen tussen soorten in vasculaire structuur en functie de mate waarin knaagdiervaten de menselijke vasculaire fysiologie kunnen vertegenwoordigen21. Daarom is nauwkeurige identificatie en isolatie van menselijke intrarenale slagaders op verschillende anatomische niveaus (interlobar, boogvormig en interlobulair) cruciaal om uitgebreid in vitro onderzoek mogelijk te maken naar hun fysiologische eigenschappen, evenals ziektegerelateerde functionele veranderingen en pathologische letselmechanismen. In combinatie met farmacologische interventies met behulp van verschillende vasoactieve verbindingen, maakt dit systeem de dynamische beoordeling en kwantitatieve registratie van vasoconstrictie/vasodilatatieresponsen in geïsoleerde arteriële ringen mogelijk, wat een krachtig hulpmiddel biedt voor het onderzoeken van vasculaire reactiviteit onder gecontroleerde experimentele omstandigheden 19,22,23.

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methodologie voor de precieze anatomische lokalisatie en microdissectie van de vertakkingen van de menselijke intarenale slagaders (interlobaire, boogvormige en interlobulaire slagaders), gevolgd door functionele karakterisering met behulp van een in vitro vasculair spanningsbewakingssysteem om hun differentiële reactiviteit op vasoactieve geneesmiddelen te beoordelen, waardoor zowel structurele als functionele verschillen tussen deze vasculaire segmenten worden vastgesteld. Door anatomische lokalisatie te combineren met farmacologische reactiviteitsprofilering en histopathologische analyse, creëren we een ex vivo platform dat een uitgebreide evaluatie van regiospecifieke vasculaire reacties op vasoactieve middelen mogelijk maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol en de voorbeelden die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de afdeling Urologie van het First Hospital van de Universiteit van Peking (goedkeuring nr. 2023yan500-002) en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Alle deelnemers gaven voorafgaand aan deelname schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Voorbereiding van de oplossing

  1. Bereid Krebs-Ringer-oplossing (Krebs) met 119,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 25,0 mM NaHCO3, 1,2 mM KH2PO4 en 11,0 mM D-glucose bij pH 7,4.
  2. Bereid een zoutoplossing met een hoog kaliumgehalte (60K+) die 64,0 mM NaCl, 60 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 25,0 mM NaHCO3, 1,2 mM KH2PO4 en 11,0 mM D-glucose bij pH 7,4 bevat.

2. Bereiding van reagens

OPMERKING: Bewaar medicijnen volgens de gegevens in het Material Safety Data Sheet (MSDS) onmiddellijk na ontvangst.

  1. Bereid de fenylefrine (Phe, 10-1 M op voorraad) door 167,21 mg fenylefrine op te lossen in 10 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar de stockoplossing bij -80 °C, verdun tot 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M als werkconcentratie op de dag van gebruik.
  2. Bereid de acetylcholine (ACh, 10-2 M op voorraad), door 18.166 mg acetylcholine op te lossen in 10 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar de voorraadoplossing bij -80 °C, verdun tot 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M als werkconcentratie op de dag van gebruik.

3. Verzameling van nierweefsel en isolatie van de intranierslagader

  1. Rekruteer volwassen patiënten bij wie niercelcarcinoom is vastgesteld, zoals histologisch bevestigd door preoperatieve kernnaaldbiopsie of intraoperatieve diepvriessectie.
    OPMERKING: Patiënten die zijn ingepland voor radicale nefrectomie worden specifiek gekozen omdat hun chirurgische monsters toegang bieden tot intacte intrarenale arteriële segmenten die zich distaal van de tumorranden bevinden. Deze segmenten kunnen nauwkeurig worden ontleed en geïsoleerd, waardoor een gedetailleerde studie van de menselijke renale vasculaire fysiologie mogelijk is zonder tussenkomst van kwaadaardig weefsel. Histologische bevestiging zorgt voor een nauwkeurige identificatie van carcinoom en een duidelijke afbakening van tumorgrenzen, waardoor de selectie van normale, tumorvrije arteriële segmenten voor experimenteel onderzoek wordt vergemakkelijkt.
    1. Sluit patiënten met significante comorbiditeiten (hypertensie, diabetes mellitus of andere systemische ziekten) uit om verstorende invloeden op de vasculaire functie te voorkomen, waardoor de betrouwbaarheid en relevantie van fysiologische beoordelingen wordt verbeterd.
      OPMERKING: De monsters voor dit experiment werden verzameld bij patiënten die gepland waren voor radicale nefrectomie in het First Hospital van de Universiteit van Peking.
  2. Verzamel tijdens radicale nefrectomie vers uitgesneden menselijke niermonsters en dompel ze onmiddellijk onder in ijskoude Krebs-oplossing om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Alleen macroscopisch normaal ogende gebieden distaal van de tumormarges worden behouden voor arteriële dissectie (Figuur 1A).
    OPMERKING: Voor een optimale isolatie van de intrarenale slagader moet aangrenzend gezond weefsel worden geoogst als een corticomedullaire wig over de volledige dikte tijdens radicale nefrectomie, waardoor de volledige arteriële boom van corticale tot medullaire vasculatuur behouden blijft.
    1. Bewaar het weggesneden weefsel onmiddellijk in 200 ml koude Krebs-oplossing. Plaats de container op ijs en vervoer deze binnen 2 uur na afname in een geïsoleerde koeltas naar het laboratorium. Zorg ervoor dat het weefsel tijdens het transport volledig ondergedompeld blijft om de levensvatbaarheid en structurele integriteit te behouden voor daaropvolgende dissectie en functionele analyse.
      OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van het weefsel en de fysiologische functie te behouden, moet het hele proces van isolatie en daaropvolgende opslag in Krebs-oplossing bij 4 °C binnen 6 uur 24,25,26,27 zijn voltooid. De oplossing moet regelmatig worden vervangen tijdens procedures om de oxygenatie en levensvatbaarheid van het weefsel te behouden, terwijl de klaring van bloedcomponenten uit het vasculaire lumen wordt vergemakkelijkt.
  3. Identificeer het coronale vlak visueel door het nierhilum te lokaliseren en de snede uit te lijnen om zowel het nierbekken als de laterale convexe rand te passeren. Gebruik een steriel scalpel om de nier langs het coronale vlak in tweeën te snijden om twee symmetrische helften te produceren. Deze benadering legt de interne architectuur bloot, inclusief de nierpiramides en -kolommen, waardoor een nauwkeurige identificatie en daaropvolgende dissectie van de intrarenale slagaders mogelijk wordt (Figuur 1A).
    OPMERKING: Om de scheiding van de nierslagaders te vergemakkelijken, moet eerst een deel van het nierbekken, de nierpiramides en het vet op het oppervlak van de dwarsdoorsnede worden verwijderd om meer bloedvaten bloot te leggen (Figuur 1B). Pas op dat u de bloedvaten niet doorsnijdt.
  4. Scheid onder een stereomicroscoop de interlobaire, boogvormige en interlobulaire slagaders zorgvuldig met behulp van een microdissectieschaar en een tang in een kweekschaal van 10 cm met zwarte bodem (Figuur 1C).
    OPMERKING: In de menselijke nier loopt de interlobulaire slagader door de nierpiramides, met de dikste vaatwand van de drie arteriële takken 1,8, met een gemiddelde diameter van ongeveer 1-2 mm. Bij de corticomedullaire overgang gaat de interlobaire slagader over in de boogvormige slagader en vormt een halfcirkelvormige boog langs de corticomedullaire rand, met een gemiddelde diameter van ongeveer 500 μm. De bloedvaten vertakken zich verder in de nierschors, de interlobulaire slagader, met de dunste vaatwand en de kleinste diameter van de drie, ongeveer 200 μm (Figuur 1C). Bovendien levert anatomische lokalisatie bij het differentiëren van de drie vasculaire takken meer kritische informatie op dan absolute vasculaire diametermetingen 1,8.
    1. Verwijder voorzichtig al het omringende weefsel en vet van de slagaders en zorg ervoor dat u ze grondig schoonmaakt in een kweekschaal met zwarte bodem van 10 cm (Figuur 1B).
  5. Gebruik de geïsoleerde nierslagaders (interlobulaire, boogvormige en interlobaire slagaders) voor de volgende experimenten:
    1. Bereid arteriële segmenten voor op histologische verwerking door geïsoleerde weefsels zorgvuldig bij te snijden tot een gestandaardiseerde lengte van ongeveer 3 mm, die geschikt is voor paraffine-inbedding en histologische secties. Fixeer elk monster gedurende 1 uur in 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur om de weefselmorfologie te behouden. Na fixatie verwerken met standaard protocollen voor dehydratatie, reiniging en paraffine-inbedding voor daaropvolgende hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring volgens gevestigde histologische protocollen (Figuur 2).
      OPMERKING: Voor mogelijke histologische beoordelingen kunnen de monsters de trichrome kleuring van Masson ondergaan om de collageenafzetting te evalueren of Verhoeff-Van Gieson (EVG) kleuring voor visualisatie van elastische vezels, volgens gevestigde histologische protocollen28,29.
    2. Bewaar voor vasculaire functiestudies intrarenale ringen in ijskoude Krebs-oplossing tot het testen. De arteriële ringen moeten volledig onder water staan.
      OPMERKING: Voor daaropvolgende moleculaire tests zoals western blot/qPCR, vriest u verse monsters na dissectie onmiddellijk in vloeibare stikstof in en bewaart u ze vervolgens bij -80 °C volgens eerder gepubliceerde procedures om de RNA-integriteit te behouden en eiwitafbraak te voorkomen30,31.

4. Arteriële ring montage

  1. Identificeer de interlobaire, boogvormige en interlobulaire slagader aan de hand van hun verschillende anatomische posities (Figuur 1C) en diameterbereiken (Figuur 2), en verdeel ze vervolgens voorzichtig in ongeveer 2 mm lange ringen met behulp van een microdissectieschaar voor vasculaire functiestudies (Figuur 3A).
    NOTITIE: Bewaar elke geïsoleerde arteriële ring onmiddellijk afzonderlijk in 5 ml ijskoude Krebs-oplossing totdat de functionaliteit is getest. Selecteer voor functionele tests onvertakte vaatringen met een lengte van 1,5-2,0 mm met zuivere loodrechte sneden. Sluit ringen van meer dan 2.0 mm uit om montageproblemen te voorkomen of ringen van minder dan 1.5 mm om onstabiele spanningsopnames te voorkomen.
  2. Bereid alle arteriële ringen voor (van interlobaire, boogvormige en interlobulaire slagaders afzonderlijk) zoals vermeld in stap 4.1 en breng zowel Krebs- als 60K+- oplossingen op kamertemperatuur. Schakel vervolgens de aangesloten computer in, gevolgd door het draadmyograafsysteem, en zorg ervoor dat alle componenten correct zijn geïnitialiseerd voordat u verder gaat met experimenten.
  3. Voordat u de arteriële ringen in de draadmyograafkamers monteert, spoelt u elke kamer twee keer met 5 ml Krebs-oplossing om reinheid te garanderen en resterende stoffen te verwijderen, en voegt u vervolgens 5 ml Krebs-oplossing toe aan elke kamer.
    1. Verwarm de oplossing tot 37 °C met behulp van het ingebouwde temperatuurregelsysteem van de myograph. Belucht de oplossing tegelijkertijd continu met gas (een mengsel van 95% O2 en 5% CO2) via een aangesloten gasleiding om de juiste zuurstofvoorziening en pH-balans tijdens het experiment te behouden.
  4. Bereid voor elke arteriële ring twee voerdraden van 3 cm lang met een diameter van 40 μm voor en breng de geïsoleerde arteriële ringen voorzichtig over naar een andere kweekschaal met zwarte bodem van 10 cm die Krebs-oplossing bevat.
    NOTITIE: Voor bloedvaten met verschillende diameters moeten verschillende diameters voerdraden worden gekozen. Voor de arteriële ring met een diameter van ongeveer 100 μm of minder is een voerdraad van 15 μm vereist; als de diameter tussen 100 μm en 200 μm ligt, wordt een voerdraad van 25 μm gebruikt; Als de diameter groter is dan 200 μm, kan een voerdraad van 40 μm worden gebruikt. Voor de consistentie van het experiment wordt aanbevolen om dezelfde diameter te gebruiken voor alle vaten van hetzelfde type binnen een enkel experiment. 19. okt.
  5. Steek voorzichtig de eerste voerdraad in de arteriële ring in de schaal, buig een kant van de voerdraad 90° en breng deze vervolgens over in de kamer voor bevestiging op de monsterhouder van het klemtype met behulp van de door het instrument meegeleverde speciale schroeven voor het rechtsom schroeven (Figuur 3B).
    OPMERKING: De voerdraad wordt ingebracht om structurele ondersteuning te bieden tijdens de overdracht van de arteriële ring wanneer deze op de monsterhouder wordt gemonteerd, waardoor door hantering veroorzaakte schade of vervorming tot een minimum wordt beperkt.
  6. Voordat u de arteriële ring op de houder bevestigt, moet u de lengte en breedte van het vat noteren. Plaats de arteriële ring tussen de twee houders (Figuur 3C) en lees de micrometerschaal af, waarbij 1 schaal staat voor 10 μm. Trek de schaalwaarde af die wordt gemeten wanneer de houders elkaar nauwelijks raken (Figuur 3D) om de lengte en breedte van de arteriële ring te bepalen.
  7. Rijg nog een voerdraad door het bloedvat en bevestig deze tenslotte aan de andere kant. Wikkel de voerdraad met de klok mee rond de bevestigingsschroeven aan beide zijden en zorg ervoor dat deze stevig is bevestigd aan het oppervlak van de monsterhouder.
    OPMERKING: Tijdens het gehele fixatieproces is het noodzakelijk om te voorkomen dat aan het bloedvat wordt getrokken of dat de binnenwand van het bloedvat met de voerdraad wordt bekrast om beschadiging van het vasculaire endotheel te voorkomen. De voerdraad moet in een enkele laag om de bevestigingsschroef worden gewikkeld zonder elkaar te overlappen. De twee voerdraden moeten zich op hetzelfde horizontale vlak bevinden, evenwijdig aan elkaar en mogen elkaar niet kruisen. Stel bovendien na het bevestigen van de voerdraad de monsterhouder aan beide zijden dichterbij af; ze moeten echter dicht bij elkaar zijn zonder daadwerkelijk contact te maken, om kracht te voorkomen, zoals weergegeven in Figuur 3E en Figuur 3F.
  8. Installeer de kamer terug in het draadmyograafsysteem. Dek vervolgens het deksel af en ventileer het gas. Sluit de sensor aan en open de data-acquisitiesoftware voor vasculaire spanningstesten.

5. Vatspecifieke normalisatie voor optimale initiële spanningsbepaling

OPMERKING: Het vaststellen van stabiele basisomstandigheden, gedefinieerd als de optimale rustspanning voor maximale contractiele responsiviteit, is van cruciaal belang voor reproduceerbare functionele metingen. Vanwege inherente interindividuele fysiologische verschillen vertonen menselijke bloedvaten echter een grotere variabiliteit in mechanische eigenschappen bij aanvang in vergelijking met dierlijke bloedvaten 32,33,34,35,36. Deze factoren, gecombineerd met intrinsieke vasculaire heterogeniteit (bijv. structurele en functionele verschillen in diameter, wanddikte en contractiele eigenschappen), leiden gezamenlijk tot significante variaties in de uitgangsspanning. Om de experimentele reproduceerbaarheid te garanderen, wordt daarom aanbevolen om elk bloedvat afzonderlijk te normaliseren. Het draadmyograafsysteem bevat een speciale normalisatiemodule, waarmee de basisspanning voor elk vat nauwkeurig kan worden bepaald.

  1. Monteer de arteriële ringen in de kamer zoals beschreven in stap 4.1 tot 4.8. Begin met het opnemen van de grafiek, zet het kanaal op nul (Figuur 4A), laat stabilisatie gedurende ten minste 30 minuten staan en zet het kanaal vervolgens opnieuw op nul voordat u verder gaat met normalisatie.
  2. Selecteer Normalisatie-instellingen in het DMT-menu (Figuur 4B) en stel de parameters als volgt in (Figuur 4C):
    1. Kalibratie oculair (mm/div): 1; Doeldruk (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Online gemiddelde tijd (seconden): 3; Vertragingstijd (seconden): 60.
      OPMERKING: IC1 geeft de interne vaatomtrek aan bij maximale actieve krachtproductie, terwijl IC100 de omtrek vertegenwoordigt die overeenkomt met 100 mmHg transmurale druk. Menselijke nierslagaders vertonen een aanzienlijke variabiliteit tussen monsters, wat standaardisatie vereist, in tegenstelling tot diermodellen die consistente vasculaire eigenschappen hebben voor experimentele bepaling en hergebruik van IC1/IC100-ratio's. Vanwege aanzienlijke variaties in vatdiameter, wanddikte en mechanische eigenschappen tussen individuele menselijke monsters, moet elk vat een onafhankelijke normalisatie ondergaan om zijn unieke basiskenmerken vast te stellen. De verhouding van 0,9 is daarom hier vastgesteld als tijdelijke aanduiding voor protocolinitialisatie en in de praktijk niet in dit protocol gebruikt.
  3. Selecteer het kanaal dat overeenkomt met de doelslagader en open het normalisatiescherm vanuit het DMT-menu (Figuur 4C), vul het met de juiste gegevens:
    1. Eindpunten van het weefsel: a1 moet 0 zijn, a2 moet de lengte van het bloedvat zijn (in mm); draaddiameter: 40 μm (voer de diameter van de gebruikte draad in); micrometerstand: de waarde van de micrometerschaal, klik op Punt toevoegen om het punt vast te leggen.
  4. Als u klaar bent, klikt u op Punt toevoegen om het eerste punt vast te leggen en de normalisatieprocedure te starten.
  5. Pas passieve rek toe, wacht 3 minuten, voer de micrometerwaarde in als het volgende punt en voeg dan 5 ml 60K+ toe om een kaliumgemedieerde vaatcontractie op te wekken (Figuur 5).
  6. Wacht tot de samentrekking een plateau bereikt. Was vervolgens de 60K+ oplossing 3 keer uit met 5 ml Krebs-oplossing en bereken de actieve krachtgegevens van het spoor door de passieve kracht bij elke rek af te trekken van de door kalium geactiveerde kracht (Figuur 5).
  7. Herhaal stap 5.5 tot 5.6 ("Stretch-60K+ stimulatie-Wash"-stappen) totdat de actieve kracht zijn maximum bereikt en bepaal vervolgens de optimale basisspanning waarbij de actieve krachtproductie van het vat maximaal is (Figuur 5).
  8. Breng de arteriële ring in de kamer gedurende 10 minuten in evenwicht voordat u doorgaat naar de volgende stappen van het experiment.

6. Detectie van reactiviteit van de nierslagaderring

  1. Zorg ervoor dat het volume Krebs in elke kamer 5 ml is voor aanvang van het experiment.
  2. Om de door fenylefrine geïnduceerde concentratieafhankelijke contractie te evalueren, wordt cumulatieve Phe toegepast in stappen van half log (10-9 tot 10-4 M)37.
  3. Begin met de laagste Phe-concentratie (10-9 M). Voeg 5 μL Phe-bouillon (10-6 M) toe aan de kamer met 5 ml Krebs-buffer, controleer continu en wacht tot de contractie stabiliseert (2-3 minuten ongewijzigde spanning), markeer het punt en voeg vervolgens de volgende concentratie toe in een stap van een halve log. Herhaal dit tot het bereiken van de uiteindelijke concentratie (10-4 M), waarbij u de hele tijd een consistente monitoring handhaaft (Figuur 6).
  4. Was voor aanvullende drugstests de kamer minstens 5 keer met warme 5 ml Krebs-oplossing totdat de spanning terugkeert naar de basislijn en gedurende ten minste 10 minuten stabiel blijft.
  5. Om door acetylcholine geïnduceerde concentratieafhankelijke vasodilatatie te evalueren, wordt cumulatief ACh toegepast in stappen van half log (10-8 tot 10-5,5 M).
    OPMERKING: In normale vasculatuur dient de respons op acetylcholine (ACh) als een functionele indicator van de endotheliale integriteit37,38. De vaatverwijdende respons op ACh weerspiegelt de endotheelfunctie door NO-gemedieerde ontspanning in gezonde bloedvaten. Onder pathologische omstandigheden kan deze respons echter worden verzwakt of afgeschaft als gevolg van een verminderde biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide (NO) en/of gewijzigde receptorsignaleringsroutes.
  6. Pre-contract vaten met 10-4 M Phe, voeg 5 μL Phe-voorraad (10-1 M) toe aan de kamer met 5 ml Krebs-buffer en incubeer gedurende 15 minuten. Begin bij de laagste ACh-concentratie en voeg 5 μL Ach-bouillon (10-5 M) toe aan de kamer met 5 ml Krebs-buffer, controleer en wacht continu op de vasodilatatierespons (bevestigd door aanhoudende detectie van sporen), markeer het punt en ga dan verder met de volgende concentratie. Herhaal dit totdat ze allemaal zijn getest (Figuur 7).
  7. Voltooi het experiment door het bestand op te slaan en de arteriële ringen te verwijderen. Reinig de kamer grondig door gedurende 3 minuten te incuberen met 10 ml 8% azijnzuuroplossing en spoel vervolgens 3 keer af met 10 ml water. Incubeer vervolgens 3 minuten in 10 ml 95% ethanol en spoel opnieuw 3 keer met 10 ml water. Schakel ten slotte zowel de verwarming als het gas uit en zorg ervoor dat alle vloeistof is verwijderd voordat u het gas afsluit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In de menselijke nier loopt de interlobaire slagader tussen nierpiramides langs de overeenkomstige ader. Gekenmerkt door een relatief dikke vaatwand en een aanzienlijke omhulling van vetweefsel, vereist deze slagader een bijzonder zorgvuldige dissectie. Het omringende vetweefsel moet zorgvuldig worden verwijderd om te voorkomen dat er overmatige kracht wordt uitgeoefend tijdens de isolatieprocedure (Figuur 1C).

De boogvormige slag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Nierperfusiestabiliteit dient zowel als een cruciaal therapeutisch doelwit als een venster op hemodynamische pathofysiologie 39,40. We presenteren een protocol voor hiërarchische isolatie en functionele beoordeling van menselijke nierslagaders uit verse nefrectomiemonsters, waarbij belangrijke hiaten in de huidige methodologieën worden aangepakt. In tegenstelling tot bestaande benaderingen die beperkt zijn tot kadaverspecimens of...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de vrijwilligers bedanken voor hun deelname aan deze studie, en ook het chirurgisch personeel van de afdeling Urologie van het Peking University First Hospital voor het verstrekken van nierweefsel. Dit werk werd ondersteund door de Beijing Municipal Natural Science Foundation (F251013 aan Y. Z., 7232096 aan Y. L.); National Science Foundation of China (82325004, 92168114 aan Y. Z., 82170422 aan Y. L.); Nationaal belangrijk R&D-programma van China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 tot Y. Z., 2021YFF0501404 tot Y. L., 2023YFC2415500 tot L. Y.); Onderzoeksproject van het derde ziekenhuis van de Universiteit van Peking in het State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling (Universiteit van Peking; 2024-VHR-SY-07 tot Y.Z.); 2023 Beijing Municipal Health Commission Capital Medical Science and Technology Innovation Achievement Transformation Excellent Promotion Program Project (YC202301QX0162 naar L. Y.); Nationale financiering voor klinisch onderzoek op hoog niveau in ziekenhuizen (Scientific and Technological Achievements Transformation Incubation Guidance Fund Project van het eerste ziekenhuis van de Universiteit van Peking, 2024CX24 tot L. Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acetylcholine chlorideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyA6625
Kweekschaal met zwarte bodemDanish Myo Technology, Aarhus, Denemarken300412
CaCl2Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA501330
D-glucoseSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA610219
Dumont pincetDanish Myo Technology, Aarhus, Denemarken300413
Geuder dissectieschaarDanish Myo Technology, Aarhus, Denemarken400431
LeidingdraadDanish Myo Technology, Aarhus, Denemarken400447Diameter 40 µm
KClSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100781
LabChart Professional versie 8.3 ADInstruments, Australië-
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100288
Multi myograph systeem Danish Myo Technology, Aarhus, Denemarken620M
NaClSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100865
FenylephrineSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP6126

Referenties

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

MicrodissectietechniekDraadmyografieVasculaire DisfunctieIsolatie van de Intrarenale ArterieVasomotore ReactiesSpierlengte-spanningHematoxyline-eosin-kleuringFenylefrine-contractieArteriele Normalisatie
Microdissectie op meerdere niveaus en functioneel-structurele profilering van menselijke renale arteriële takken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.