Het ontwerp en de toepassing van remmend peptide voor snelle in vitro downregulatie van posttranslationele modificatieniveaus op een specifieke plaats

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat de ontwerpspecificaties, kwaliteitscontrolenormen en het functionele verificatiesysteem van TAT-PIP, een posttranslationeel modificatieremmend peptide, schetst.

Samenvatting

Eiwitten zijn de primaire uitvoerders van levensactiviteiten en worden gereguleerd op transcriptioneel, translationeel en posttranslationeel modificatie (PTM) niveau. Bovendien vertegenwoordigt PTM een ingewikkelder mechanisme voor het reguleren van eiwitactiviteiten, aangezien een eiwit over het algemeen verschillende soorten PTM's en meerdere plaatsen voor een specifieke PTM heeft. Plasmidetransfectie of lentivirus en adenovirus kunnen worden gebruikt bij de eerste screening van de functioneel belangrijke PTM-site van alle geïdentificeerde sites; Deze methoden worden echter altijd geconfronteerd met uitdagingen zoals een lage efficiëntie bij het invoeren van cellen en weefsels, tijdrovende en hoge kosten, mogelijke immuunreactie, enz. Om dit aan te pakken, hebben we onlangs een type gerecombineerd peptide ontwikkeld en met succes toegepast, TAT-PIP, TAT-geconjugeerd PTM-remmend peptide. TAT-PIP bestaat uit een TAT-module die de toegang tot cellen en weefsels vergemakkelijkt en een PIP-module die de PTM op gerichte plaatsen specifiek downreguleert door middel van concurrerende binding. Hier presenteren we een protocol dat de ontwerpspecificaties, kwaliteitscontrolenormen en het functionele verificatiesysteem van TAT-PIP schetst. In het ontwerpgedeelte beschrijven we de consistentie, de optionele lengte, specificiteit en het behoud van TAT-PIP. Vervolgens introduceren we de kwaliteitstestvereisten van TAT-PIP, die de werkzaamheid en veiligheid garanderen. In de toepassing van het TAT-PIP deel introduceerden we de concentratiegradiënttest van TAT-PIP, het incubatieproces van de geteste cellen en de daaropvolgende fenotypische detectie. Samenvattend beschrijven we een effectieve methode voor het screenen van PTM-sites door selectief een specifieke site neer te halen en het resulterende fenotype te observeren om de functie ervan af te leiden. Vanwege de lage synthetische kosten en hoge efficiëntie overwint deze methode de beperkingen van bestaande technologieën, zoals plasmidetransfectie.

Inleiding

Eiwitten zijn de primaire uitvoerders van levensactiviteiten en hun biologische regulatieprocessen omvatten twee kernaspecten van genexpressieregulatie: gentranscriptie en mRNA-translatie. In de afgelopen decennia is posttranslationele modificatie (PTM) echter een ander onmisbaar mechanisme geworden voor het reguleren van cellulaire functies¹. Fosforylering, de meest bekende PTM voor onderzoekers, speelt een bijzonder belangrijke rol in fysiologische functies. Nadat extracellulair signaalgereguleerd kinase (ERK) bijvoorbeeld is gefosforyleerd door MEK-kinase op de Thr202- en Tyr204-plaatsen, verandert de conformatie ervan, waardoor de actieve plaats wordt blootgelegd, die stroomafwaartse doeleiwitten, zoals transcriptiefactoren², activeert. Wanneer daarentegen de N-terminale Ser9 van GSK-3β wordt gefosforyleerd door Akt/PKB-kinase, wordt de substraatbindende pocket geblokkeerd, wat leidt tot een verlies van kinase-activiteit³. Ubiquitinatie is een andere belangrijke PTM die verschillende cellulaire processen reguleert door de covalente hechting van ubiquitinemoleculen aan substraateiwitten. Ubiquitine bevat 7 lysineresiduen (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) en een N-terminaal methionine (M1). De koppeling van ubiquitineketens op verschillende plaatsen geeft verschillende lotsbestemmingen aan substraateiwitten. De primaire functie van K48-gekoppelde ubiquitinatie is het markeren van substraateiwitten voor afbraak door het proteasoom⁴. Omgekeerd is de primaire functie van K63-gekoppelde ubiquitinatie het uitvoeren van niet-afbrekende signaaltransductie, zoals herstel van DNA-schade, ontstekingsreacties en endocytose⁵. In de afgelopen jaren, met de snelle vooruitgang van proteomics-technologieën, is een toenemend aantal nieuwe PTM's ontdekt. Naast klassieke acetylering zijn nieuwe acylaties zoals propionylering, crotonylering en glutarylering geïdentificeerd⁶. Op het gebied van histonmodificaties interfereert histonlactosylering met RNA m⁶A-modificatie en de homeostase van de immuunmicro-omgeving⁷. Op het gebied van niet-histonmodificaties is de vermindering van ATP5O-crotonylering een belangrijke nadelige factor bij de neerwaartse regulatie van het fosfolipidenmetabolisme⁸.

Het uitvoeren van onderzoek naar PTM vereist het systematisch bevorderen van de analyse van het PTM-proteoom⁹. Dit veld omvat twee belangrijke onderzoeksrichtingen: de analyse van PTM-profielen op het hele proteoomniveau en de uitgebreide identificatie van de PTM-plaatsen van een specifiek eiwit. Hoewel moderne massaspectrometrie verschillende soorten PTM's en de specifieke locaties effectief kan identificeren, blijft de screening en validatie van belangrijke functionele locaties een belangrijke wetenschappelijke uitdaging die de voortgang van het onderzoek beperkt. Het opstellen van efficiënte strategieën voor het screenen van locaties is de eerste stap naar het oplossen van de functie van belangrijke regelgevende sites. Traditionele methoden omvatten het construeren van mutante plasmiden voor specifieke plaatsen (inactiverende mutaties, activerende mutaties), het introduceren ervan in doelcellen door middel van in vitro transfectietechnieken en het systematisch evalueren van veranderingen in fenotypische indicatoren zoals celproliferatie, apoptose en oxidatieve stress. Deze strategie stuit echter op aanzienlijke technische obstakels in transcriptioneel stille celmodellen zoals eicellen en primaire weefselkweeksystemen. Hoewel het lentivirale of adenovirustransductiesysteem het probleem van de transfectie-efficiëntie gedeeltelijk kan overwinnen, staat de toepassing ervan voor dubbele uitdagingen: hoge economische kosten en lage penetratie-efficiëntie van virale deeltjes in vitroweefselmodellen . Terwijl de strategie van het bouwen van mutante knock-in-muizen extreem duurzaam en kostbaar is. In het algemeen is het dringend noodzakelijk dat er economische en efficiënte strategieën worden ontwikkeld voor de eerste screening van functioneel belangrijke PTM-sites.

In de afgelopen jaren heeft ons team met succes een snelle PTM-downregulatietechniek ontwikkeld en toegepast, TAT-PIP, TAT-geconjugeerd PTM-remmend peptide, gebaseerd op polypeptide-competitieve remming. Het belangrijkste voordeel is de universaliteit en hoge efficiëntie voor het uitvoeren van een voorlopige screening van functioneel belangrijke PTM-sites, wat een cruciale basis vormt voor diepgaande analyses van de moleculaire mechanismen van belangrijke PTM-sites. Deze studie verduidelijkt systematisch het belangrijkste kader en het implementatieproces van TAT-PIP en toont de effectiviteit ervan aan bij het reguleren van het PTM-niveau op een specifieke locatie door middel van representatieve experimentele gegevens.

Protocol

1. Ontwerpen van de TAT-PIP sequentie

OPMERKING: TAT-PIP bestaat uit twee delen peptiden (Figuur 1): Het N-terminale deel is TAT, CYGRKKRRRRR, dat ongewijzigd blijft voor elke TAT-PIP en kan helpen bij het efficiënt binnendringen van in vitro gekweekte cellen of in vivo weefsels; het C-terminale deel is een polypeptidesequentie rond de specifieke PTM-plaats (Figuur 1, meestal lysine in symbool "K", rood gemarkeerd) van een objecteiwit. De lengte van PIP is ongeveer 10-15 AA-residuen (als ze langer zijn, nemen de kosten toe; als ze korter zijn, neemt de specificiteit aanzienlijk af).

1. Optimaliseer de sequentie van PIP door middel van Blast-analyse (Figuur 2).
   1. Log in om te https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, klik op de blastp zoeken naar eiwitsequenties.
   2. Kopieer de doeleiwitsequentie naar het venster voer de querysequentie in.
   3. Selecteer bij Zoeken kiezen de optie Standaarddatabases . Selecteer de blastp (eiwit-eiwit BLAST) optie in de programmaselectie. Klik ten slotte op de knop BLAST (Figuur 2B).
   4. Selecteer peptidesegmenten met de hoogste specificiteit als kandidaat-PIP's.
2. Voer een homologievergelijking uit tussen mensen en muizen voor de uiteindelijke PIP.
   1. Log in om te https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, klik op de blastp zoeken naar eiwitsequenties.
   2. Kopieer de sequenties van het eiwit van zowel menselijke als muizensoorten en plak ze in het invoersequentievak.
   3. Klik op de verzendknop om de resultaten te krijgen.
   4. Selecteer een PIP met 100% homologie tussen mens en muis (Figuur 2C).
3. Bepaal de samenstelling van TAT-PIP, die bestaat uit de N-terminal TAT en C-terminal PIP.

2. Synthese en kwaliteitsverificatie van TAT-PIP

1. Selecteer een bedrijf met uitgebreide projectervaring om een peptidezuiverheid van niet minder dan 98% te garanderen met massaspectrometrie, waarbij onzuiverheden worden vermeden die van invloed kunnen zijn op latere experimenten.
   OPMERKING: Het endotoxinegehalte van het polypeptide moet ≤10 zijn en het moet vrij zijn van ziekteverwekkers.

3. De toepassing van TAT-PIP

1. Gebruik pathogeenvrij, ultrazuiver water om TAT-PIP op te lossen om een voorraadconcentratie van 10 mg/ml te bereiken. Doseer de bouillon in kleine buisjes om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen, die een gedeeltelijke denaturatie veroorzaken.
   OPMERKING: Het toevoegen van 1% dimethylsulfoxide (DMSO) helpt de structuur van TAT-PIP te beschermen.
2. Behandel cellen met TAT-PIP.
   1. Kweek menselijke embryonale nier 293T-cellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine onder standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO₂).
      OPMERKING: Na het zaaien werden de cellen ongeveer 12 uur gekweekt en werd een TAT-PIP-behandeling uitgevoerd wanneer de samenvloeiing ongeveer 70% bereikte.
   2. Verdun de opgeloste TAT tot 1 mg/ml met behulp van PBS en voeg vervolgens direct toe aan het celkweekmedium in de juiste dosering (aanbevolen eindconcentratie van het kweekmedium: 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml) gedurende 24 uur.
   3. Was de cellen 3 keer met het originele kweekmedium.
   4. Voer een western blot-analyse uit om de mate van downregulatie van de PTM te verifiëren.
      OPMERKING: Op basis van ervaring en daaropvolgende experimentele resultaten is de optimale eindconcentratie van TAT-PIP 0,1 mg/ml.

4. Westerse vlek

1. Bereid celeiwitmonsters voor.
   1. Was de cellen 3 keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 200 μL sterke radio-immunoprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer (met toevoeging van fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF]-proteaseremmer) toe aan de celpellet en incubeer gedurende 5 minuten voor voorbereidende lysis, schraap ze af met een celschraper.
   2. Sonificeer het mengsel met behulp van een ultrasone breker met een energie-intensiteit van 12% gedurende 5 s.
   3. Koel het cellysaat 30 minuten op ijs en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13400 g bij 4 °C.
   4. Breng het bovenstaande dat eiwitten bevat over in een voorgekoelde centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 1/4 volume van 5x monsterbuffer toe aan het bovenstaande (eindconcentratie 1x).
   5. Draai het mengsel, verwarm het 5 minuten op 95 °C in een droge thermostaat en laat 2 minuten op ijs afkoelen.
   6. Meet de totale eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-assay op een Nanodrop.
2. Voer natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) uit.
   1. Gebruik voor de SDS-PAGE een 12% oplossende gel en een 4% stapelgel.
   2. Pipetteer de eiwitmonsters in de putjes volgens het aangegeven volume.
   3. Schakel het elektroforese-apparaat in en laat het eerst 30 minuten op 80 V, 300 mA draaien om de banden uit te lijnen op het raakvlak tussen de stapel- en oplossende gels. Laat vervolgens 45 minuten op 120 V, 300 mA draaien om de eiwitten op te lossen.
   4. Breng de eiwitten van de gel over naar het membraan van polyvinylideenfluoride (PVDF) met behulp van een snel overdrachtsapparaat.
3. Voer blokkering, antilichaamincubatie en visualisatie uit.
   1. Blokkeer het PVDF-membraan in 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBST) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
   2. Incubeer het membraan met het primaire antilichaam verdund 1:1000 in 5% magere melk/PBST 's nachts bij 4 °C op een rotator.
   3. Was het membraan drie keer met TBST (elk 10 minuten).
   4. Incubeer het membraan met het secundaire antilichaam verdund 1:1000 in 5% magere melk/TBST bij RT gedurende 1 uur.
   5. Was het membraan drie keer met TBST (elk 10 minuten).
   6. Belicht het membraan in een tijdreeks (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s) om het optimale beeld te verkrijgen onder een elektrogenereerde chemiluminescentie (ECL) -apparaat.

5. Functionele validatie van TAT-PIP in in vitro gekweekte cellen

1. Detecteer niveaus van cellulaire reactieve zuurstofspecies (ROS).
   1. Plaat 293T cellen met een optimale dichtheid van 1 x 10⁵ cellen/putje in een kweekplaat met 24 putjes.
   2. Behandel cellen met TAT-geconjugeerd histon3-lysine 116 Crotonyleringsremmend peptide (THCIP) (0,1 mg/ml) gedurende 24 uur en was de cellen vervolgens met PBS.
   3. Incubeer de cellen met 10 μM dichloordihydro-fluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) in serumvrije DMEM bij 37 °C in het donker gedurende 20 minuten.
   4. Leg beelden vast met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop en meet de fluorescentie-intensiteit met behulp van de functie Meten in ImageJ.
      LET OP: Er is gebruik gemaakt van de FITC-filterset, met een emissiefilter van 465-495 nm, een dichroïsche spiegel 505A en een tweede emissiefilter van 512-550 nm.
2. Test op celproliferatie
   1. Zaai 293T-cellen met een optimale dichtheid van 1 x 10⁵ cellen per putje in een kweekplaat met 24 putjes.
   2. Voeg 10 μL CCK-8-reagens toe aan elk putje.
   3. Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij 37 °C.
   4. Registreer de extinctie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer en trek het achtergrondsignaal af van de lege putjes (medium + CCK-8).
   5. Normaliseer de gegevens om de levensvatbaarheid van cellen te berekenen.
3. Detectie van cellulaire ATP-niveaus
   1. Lyseer de cellen met een lysisbuffer. Centrifugeer het lysaat bij 12.000 g × gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verzamel het bovenstaande voor verdere analyse.
   2. Verdun de ATP-standaardoplossing met de lysisbuffer om een concentratiegradiënt te creëren van 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM en 5 μM.
   3. Voeg 20 μl ATP-detectieoplossing toe aan elk putje dat het celsupernatans of de ATP-standaard bevat.
   4. Meet het lichtgevende signaal onmiddellijk met behulp van een microplaatlezer.
      1. Klik op Plaatlay-out, selecteer de bijbehorende plaatsjabloon in Plaatsjabloon wijzigen om monsters (standaarden en monsters) in te stellen.
      2. Klik vervolgens aan de linkerkant op Protocol , kies de knop Chemiluminescentie en klik vervolgens op Start om de detectie te starten.
   5. Genereer een standaardcurve op basis van de luminescente signalen van de ATP-standaarden en gebruik deze om de ATP-concentratie in de celsupernatant te kwantificeren.

Resultaten

Deze studie beschrijft een strategie die TAT-PIP gebruikt om het PTM-niveau van een doeleiwit op een specifieke plaats te verlagen op basis van competitieve remming. In een typisch voorbeeld wordt de TAT-PIP hier specifiek hernoemd als THCIP. Het bestaat uit twee functionele modules: (1), het N-terminale celpenetrerende peptide TAT (CYGRKKRRQRRR), waardoor THCIP cellen kan binnendringen; (2) de C-terminale sequentie rond K116 van H3, AIHAKRVTIMPKD, die specifiek concurreert met de endoge...

Discussie

In dit protocol zijn de volgende stappen van cruciaal belang. Ten eerste gaat het TAT-PIP-ontwerp in op de specificiteit van het peptide. Ten tweede, optimaliseer de toepassing en uiteindelijke concentratie; De geoptimaliseerde concentratie moet zorgvuldig worden getest om een efficiënte en snelle knockdown te bereiken. Ten derde, om het effect van de TAT-PIP te verifiëren, worden meerdere experimenten aanbevolen in plaats van te vertrouwen op een enkel experiment om de aanvullende effec...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Automatisch multifunctioneel beeldvormingssysteem	Tanon	4600	De belichtingsmeter identificeert en visualiseert de doelwit-eiwitbanden door de fluorescentie- of chemiluminescentiesignalen op de membraan te detecteren na de ontwikkelingsbehandeling.
Celtellingskit-8	GLPBIO	GK10001	Op basis van de correlatie tussen cellulaire metabolische levensvatbaarheid en celaantal, evalueert deze methode het proliferatievermogen van cellen door de reductievermogen van cellen naar CCK-8 reagentia te meten
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM)	Gibco	11995065	Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) is een veelgebruikt basaal medium om de groei van een breed scala aan zoogdiercellen te ondersteunen.
ECL chemiluminescentie substraat	Biosharp	BL520B	ECL substraten genereren lichtsignalen door chemiluminiscenereacties die detectie van specifieke eiwitten of nucleïnezuren mogelijk maken.
Elektroforese apparaat	Tanon	EPS600	De hoofdrol van het elektroforese apparaat is om biologische macromoleculen te scheiden en te analyseren ‌
Verbeterde ATP assay kit	Beyotime	S0027	De kit kan effectief het ATP-niveau van monsters detecteren
Foetaal bovien serum (FBS)	Gibco	16000-044	Foetaal bovien serum (FBS) levert essentiële voedingsstoffen en groeifactoren voor celonderhoud en -groei.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	Het apparaat is zeer efficiënt en het kan snel eiwitoverdracht van polyacrylamidegel naar PVDF-membraan binnen 15 minuten bereiken
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Olympus Corporation	IX73	Fluorescentiemicroscopie gebruikt ultraviolet licht als lichtbron om het onderzochte object te belichten om het fluorescentie te laten uitstralen, en vervolgens de vorm en locatie van het object onder de microscoop te observeren.
NanoDrop2000 microvolume UV-Vis spectrofotometer	Thermo Scientific	2000	NanoDrop werd gebruikt om de concentratie van DNA of RNA te bepalen
PVDF membraan	BioRAD	1620177	Dit type PVDF membraan heeft uitstekende chemische weerstand en hoge eiwitbindende vermogen
ROS assay kit	Beyotime	S0033S	De kit kan nauwkeurig het niveau van reactieve zuurstofsoorten in cellen detecteren
TAT-conjugater H3K16 Crotonylation remmende peptide	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD	CN218107533U	Het kan specifiek concurreren met de endogene H3 om gecrotonyleerd te worden bij K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST kan irrelevante stoffen op de membraan schoonmaken, experimentele fouten verminderen en de nauwkeurigheid van experimentele resultaten verzekeren ‌
Ultrasoon breker	LICHEN	LC-AUD-150P	De hoofdfuncties van het apparaat omvatten celfragmentatie, deeltjesdispersie en emulgering
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Microplaatlezers kunnen hoge-doorvoer kwantitatieve analyse van biologische monsters bereiken door de optische signalen (zoals absorptie, fluorescentie of luminescentie) van monsters in microplaten te detecteren