Nierslagaderfunctie en histopathologie gekoppeld aan plasma en fecale metabolieten bij patiënten met hartfalen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van een multimodaal platform voor het ophelderen van cardiale metaboliet-gedreven renale vasculaire disfunctie bij cardiorenaal syndroom.

Samenvatting

De darmmicrobiota en de geassocieerde gastheer-microbe co-metabolieten worden steeds meer erkend als belangrijke regulatoren van de systemische metabole balans en de cardiorenale as, vooral in de context van cardiorenaal syndroom. Hoewel klinisch bewijs aangeeft dat cardiale disfunctie renale pathologische veranderingen kan initiëren of verergeren, blijven de belangrijkste metabole signaalmoleculen die de cardiorenale as mediëren en hun onderliggende mechanismen ongrijpbaar. Deze studie richt een nieuw systematisch onderzoeksplatform op dat cardiometabolische handtekeningen integreert met renale vasculaire functieanalyse, bestaande uit: (1) Isolatie en extractie van plasma/fecale metabolieten van patiënten met hartfalen; (2) Ex vivo renale vasculaire isolatie en primaire kweektechnieken; (3) Een multimodaal evaluatiekader voor cardiorenale metabole interacties, met inbegrip van vasculaire functionele assays, moleculaire biochemische tests voor niervasculaire letselmarkers en histopathologische analyses. Vergeleken met gezonde controles verstoorden metabolieten van patiënten met hartfalen de niervasculaire functie en induceerden ze ontstekingsreacties, wat hun potentieel als functionele biomarkers bij cardiorenaal syndroom benadrukt. Deze studie richt zich niet op een specifieke metaboliet; daarom zal verdere identificatie en validatie van de specifieke types van metabolieten die pathogene effecten uitoefenen nodig zijn in toekomstige studies met behulp van analytische technieken zoals LC-MS/MS en NMR. Toepassing van dit platform toonde aan dat met hartziekten geassocieerde metabolieten de renale vasculaire functie en homeostase aantasten. Deze bevindingen bieden mechanistisch inzicht in de metabole drijfveren van cardiorenale interacties en bieden een translationeel hulpmiddel voor het identificeren van nieuwe biomarkers en therapeutische doelen.

Inleiding

Cardiorenaal syndroom (CRS) is een complexe pathologische aandoening die wordt gekenmerkt door bidirectionele schade tussen het hart en de nieren. De ingewikkelde onderlinge afhankelijkheid tussen deze twee organen werd voor het eerst beschreven door Robert Bright in 1836, die systematisch significante structurele veranderingen in het hart documenteerde die verband hielden met gevorderde nierziekte¹. De prevalentie van CRS is sterk verbonden met het naast elkaar bestaan van hart- en vaatziekten (HVZ) en chronische nierziekte (CKD). Studies tonen aan dat ongeveer 30% van de patiënten met hartfalen ook CKD heeft, terwijl 44%-51% van de sterfgevallen bij CKD-patiënten direct wordt toegeschreven aan cardiovasculaire gebeurtenissen².

Het beheer van CRS brengt een aantal belangrijke uitdagingen met zich mee. Ten eerste blijft de klinische zorg gefragmenteerd, met een gebrek aan interdisciplinaire coördinatie en mechanismen voor vroegtijdige waarschuwing, wat vaak leidt tot vertraagde interventies tijdens de decompensatiefase³. Ten tweede staan de huidige behandelstrategieën voor een paradoxaal dilemma. Conventionele therapieën, zoals diuretica en remmers van het renine-angiotensine-aldosteronsysteem (RAAS), kunnen de symptomen van hartfalen verlichten⁴; langdurig of hooggedoseerd gebruik kan echter het RAAS en het sympathische zenuwstelsel (SNS) activeren, waardoor nierhypoxie en fibrose verergeren, wat uiteindelijk bijdraagt aan diuretische resistentie en verslechtering van de nierfunctie⁵. Evenzo, hoewel angiotensine-converterende enzymremmers (ACEI's) en angiotensinereceptorblokkers (ARB's) cardiorenale schade kunnen verminderen, is hun klinische gebruik vaak beperkt vanwege bezorgdheid over verhoogd serumcreatinine of hyperkaliëmie, waarbij slechts 30%-40% van de patiënten in staat is om langdurige therapie te verdragen⁶.

Gezien deze uitdagingen is er een dringende behoefte om effectieve vroege biomarkers te identificeren en een beter begrip van de pathogenese van CRS te bereiken om de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen te vergemakkelijken. De huidige beperkingen bij het identificeren van bruikbare mediatoren van cardiorenale overspraak - met name ziektespecifieke metabolieten die hartdisfunctie direct koppelen aan niervasculair letsel - belemmeren echter de vooruitgang bij het oplossen van deze onvervulde klinische behoeften. Opkomend bewijs suggereert dat met hartaandoeningen geassocieerde metabolieten kunnen dienen als zowel diagnostische biomarkers als mechanistische aanjagers van CRS door de renale vasculaire homeostase te herprogrammeren, maar hun spatiotemporele rol bij het initiëren of versterken van nierbeschadiging blijft slecht gekarakteriseerd ^7,8,9. Recente studies hebben aangetoond dat endogene metabolieten zoals ceramiden vasculaire ontsteking en hermodellering actief kunnen verergeren, met name onder cardiorenale aandoeningen, wat de bredere relevantie van metabolietdetectie in vasculaire pathologie benadrukt¹⁰.

Onder de niercompartimenten die bij CRS zijn aangetast, wordt het vaatstelsel steeds meer erkend als een primair en vroeg doelwit van letsel. Endotheliale disfunctie in de renale microcirculatie - gekenmerkt door verminderde biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide, oxidatieve stress en verhoogde expressie van pro-inflammatoire en pro-trombotische mediatoren - draagt bij aan microvasculaire verdunning, verhoogde vasculaire permeabiliteit en regionale hypoxie¹¹. Tegelijkertijd zijn vasculaire gladde spiercellen (VSMC's), die essentieel zijn voor het reguleren van de arteriële tonus en compliantie, ook kwetsbaar voor metabole ontregeling bij CRS. Accumulerend bewijs geeft aan dat ziekte-geassocieerde metabolieten de contractiliteit van VSMC kunnen verstoren, onaangepaste remodellering kunnen bevorderen en kunnen bijdragen aan verhoogde vasculaire stijfheid en verminderde nierperfusie. Ondanks hun fundamentele rol blijven de door gladde spieren aangedreven mechanismen van vasculaire disfunctie onderbelicht in de huidige CRS-modellen ^8,12. Deze pathofysiologische veranderingen verergeren niet alleen nierschade, maar bevorderen ook onaangepaste neurohormonale activering en systemische hemodynamische stoornissen, waardoor de hartfunctie verder wordt aangetast en de progressie van CRS wordt bestendigd¹³. Het aanpakken van niervasculair letsel biedt dus een mechanistisch informatief venster op de vroege pathogenese van CRS en biedt een rationele focus voor het onderzoeken van metabole interacties tussen hart en nier.

Om deze lacunes aan te pakken, geeft onze studie prioriteit aan de systematische identificatie en functionele validatie van hartfalen-geassocieerde metabolieten als centrale regulatoren van CRS-progressie. Dit werk overbrugt de kritieke ontkoppeling tussen observationele ontdekking van biomarkers en onderzoek naar mechanistische pathogenese door af te bakenen hoe deze metabolieten renale vasculaire disfunctie induceren, ontstekingscascades activeren en weefselherstelmechanismen in gevaar brengen. Traditionele modellen die worden gebruikt om CRS te bestuderen - inclusief diermodellen, in vitro celculturen en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide organoïden - hebben elk beperkingen¹⁴. Diermodellen lijden aan verschillen tussen soorten die de klinische relevantie beperken. In vitro culturen missen integratie op orgaanniveau, terwijl iPSC-afgeleide organoïden - hoewel in staat om cardiomyocyt-tubulaire epitheelcelinteracties te modelleren - functioneel onvolwassen blijven en beperkt zijn tot vroege ontwikkelingsstadia¹⁵. Bovendien bestaan de huidige vasculaire organoïde systemen voornamelijk uit endotheliale monolagen of primitieve microvaten, die de contractiele gladde spierlaag en functionele uitlezingen missen die nodig zijn om de reacties op bloedvatniveau op metabole schade te beoordelen¹⁶.

Ons platform maakt daarentegen gebruik van van mensen afgeleide hartmetabolieten en ex vivo menselijke niervasculatuur, waardoor fysiologisch relevante en structureel intacte ex vivo menselijke nierslagaders mogelijk zijn, waardoor fysiologisch relevante en mechanistisch informatieve analyse van cardiorenale metabole interacties op het vasculaire grensvlak mogelijk is. Dit biedt een uniek voordeel bij het modelleren van de metabole communicatie tussen organen die ten grondslag ligt aan de progressie van het cardiorenaal syndroom. Ons baanbrekende geïntegreerde cardiorenale onderzoeksplatform combineert drie kerninnovaties: metabolomische profilering van plasma-/fecale metabolieten afkomstig van hartfalen, ex vivo renovasculaire isolatie-/kweeksystemen en multimodale functioneel-moleculair-histopathologische evaluatie. Elk onderdeel van dit platform werd geoptimaliseerd voor reproduceerbaarheid en translationele relevantie, inclusief het gebruik van 200 μL plasma of 0,1 g fecaal materiaal per monster, incubatie van 2 mm segmenten van de menselijke nierslagader bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende maximaal 24 uur, en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR)-gebaseerde detectie van vasculaire letselmarkers. Dit systeem ontcijfert niet alleen het diagnostisch potentieel van metabolietsignaturen, maar koppelt ook direct hun causale bijdragen aan CRS-pathologie, waardoor therapeutische doelwitidentificatie mogelijk wordt door middel van het in kaart brengen op moleculair niveau van metabole ontregeling tussen organen. Door een brug te slaan tussen mechanistische ontdekking en klinische vertaling, verschuift dit tweeledig gerichte paradigma CRS-beheer van reactieve symptoomcontrole naar proactieve biomarkergestuurde interventies.

Protocol

De experimentele protocollen en casusmethodologieën die in deze studie zijn gebruikt, zijn ethisch goedgekeurd door de afdeling Urologie van het Peking University First Hospital (Ethical Review Code: 2023yan500-002) en het Peking Union Medical College Hospital (goedkeuring nr. I-23PJ585), met strikte naleving van de principes die zijn uiteengezet in de Verklaring van Helsinki. Voor deze studie hebben we mannelijke of vrouwelijke patiënten gerekruteerd die vanaf juli 2019 in het ziekenhuis zijn opgenomen in het Peking Union Medical College Hospital (PUMCH), gediagnosticeerd met hartfalen (HF) door ten minste twee ervaren cardiologen. In totaal werden vier HF-patiënten (HF1-HF4) geïncludeerd voor extractie van plasma- en fecale metabolieten. Van alle proefpersonen werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen voordat ze in het onderzoek werden opgenomen. De experimentele apparatuur en reagentia zijn weergegeven in de Materiaaltabel.

1. Verwerking van plasma- en fecale monsters - extractie van polaire metabolieten

1. Stalen collectie
   1. Verzamel alle plasma- en fecale monsters in steriele, voorgekoelde verzamelbuisjes en vries ze na afname onmiddellijk in met vloeibare stikstof. Bewaar de monsters bij -80 °C tot verwerking.
   2. Om de stabiliteit van de metaboliet te garanderen, moeten alle monsters binnen één vries-dooicyclus worden verwerkt en moet het tijdsinterval tussen het verzamelen en extraheren van het monster niet langer zijn dan 2 weken.
      OPMERKING: Deze maatregelen zijn genomen om de afbraak van metabolieten tot een minimum te beperken en de reproduceerbaarheid in stroomafwaartse metabolomische analyses te waarborgen.
   3. Extraheer metabolieten uit fecale en plasmamonsters volgens respectievelijk protocolstap 1.3 of 1.4.
2. Studie bevolking
   1. Voer basisbloeddrukmetingen uit en registreer de medicatiegeschiedenis van alle deelnemers.
   2. Verzamel patiëntenmonsters vóór elke acute klinische verslechtering, met uitzondering van personen met ernstige metabole comorbiditeiten (bijv. diabetes, primaire hypertensie) om verstorende factoren in metabolomische analyse te minimaliseren (Aanvullende Tabel S1).
   3. Verkrijg klinische informatie voor elke proefpersoon met behulp van standaardprocedures.
3. Plasma-extractie
   1. Centrifugeer het ruwe serum bij 14.000 × g gedurende 10 minuten (4-8 °C). Verzamel het bovenstaande in nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
   2. Voeg gekoelde (-80 °C) methanol van HPLC-kwaliteit toe om een methanolconcentratie van 80% (v/v) te bereiken. Meng voorzichtig door inversie en incubeer bij -80 °C gedurende 6-8 uur.
   3. Centrifugeer bij 14.000 × g gedurende 10 minuten (4-8 °C). Breng het methanolische supernatans over in verse buisjes voor metabolomische profilering.
      OPMERKING: Plaats de plasmamonsters na afname binnen 2 uur in een vriezer van -80 °C en minimaliseer vries-dooicycli om de stabiliteit van de metaboliet te garanderen.
4. Fecale extractie
   1. Voeg 500 μl methanol van HPLC-kwaliteit (voorgekoeld tot -80 °C) toe aan verse of bevroren fecale monsters in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Homogeniseer met behulp van een microstamper/weefselhomogenisator op droogijs gedurende 1-2 min, gevolgd door vortexing (1 minuut bij 4-8 °C) en incubatie bij -80 °C gedurende 4 uur.
   2. Centrifugeer bij 14.000 × g gedurende 10 minuten (4-8 °C) met behulp van een gekoelde centrifuge. Breng het bovenstaande over in nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 ml; bewaren bij -80 °C tot stap 1.4.4.
   3. Resuspendeer de pellet met 400 μl voorgekoelde (-80 °C) methanol van HPLC-kwaliteit. Draai grondig (1 minuut bij 4-8 °C) en incubeer gedurende 30 minuten bij -80 °C.
   4. Herhaal de centrifugatie (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Combineer de supernatanten uit beide extractiefasen.
   5. Voer een laatste klaringscentrifugatie uit (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Breng het gezuiverde supernatans over in steriele buisjes van 1,5 ml voor stroomafwaartse analyse.
      OPMERKING: Plaats de fecale monsters na afname binnen 2 uur in een vriezer van -80 °C en minimaliseer vries-dooicycli om de stabiliteit van de metaboliet te garanderen.

2. Isolatie van de nierslagader

1. Selectie van deelnemers en weefselafname
   1. Screen patiënten die een radicale nefrectomie ondergaan op niercelcarcinoom. Omvat alleen degenen ≥ 18 jaar zonder metabole comorbiditeiten (bijv. primaire hypertensie, diabetes mellitus). Verzamel tijdens de operatie histologisch normaal nierparenchym op ten minste 3 cm van de tumorranden.
   2. Dompel de geoogste monsters onmiddellijk onder in zuurstofrijke Krebs-Henseleit-buffer (4 °C, pH 7,4; samenstelling in mM: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 25,0 NaHCO₃, 1,2 KH₂PO₄, 11,0 glucose). Voltooi de isolatieprocedures binnen 6 uur na de operatie.
2. Preparaat nierweefsel
   1. Voer coronale doorsnede uit in de Krebs-buffer van 4 °C om heminfrische exemplaren te verkrijgen die intacte hilaire structuren bevatten. Voer microdissectie uit met behulp van een stereomicroscopisch systeem (40x vergroting) om nierboogvormige slagadertakken bloot te leggen en boogvormige slagaders te identificeren.
3. Microvasculaire dissectie
   1. Bereik nauwkeurige isolatie van arteriële segmenten door sequentiële verwijdering van perivasculair adventitiaal weefsel met behulp van een micro-corneaschaar.
   2. Behoud de arteriële segmenten met een diameter van ongeveer 500 μm.
   3. Minimaliseer de endotheliale schuifspanning door spanningsvrije manipulatie met een microtang. Voer de dissectie uit onder onderkoelde omstandigheden (4 °C) met Krebs-buffer die elke 15 minuten wordt vernieuwd om de fysiologische pH en ionische homeostase te behouden.
      OPMERKING: Expliciete kwantificering van arteriële afmetingen en buffersamenstelling, een thermisch gereguleerde workflow van afname (4 °C) tot verwerking (4 °C) en volledige microvasculaire dissectie binnen 6 uur na monsterafname zorgen voor optimale levensvatbaarheid van het weefsel en functionele integriteit.

3. Incubatie van de nierslagader met metabolieten voor hartbeschadiging

1. Preparatie van vaatweefsel: Ontleed de nierslagaders microchirurgisch onder steriele omstandigheden en verwijder het aanhangende perivasculaire bindweefsel zorgvuldig met behulp van een fijne oogheelkundige tang. Snijd de geïsoleerde nierslagaders in segmenten van 2 mm met behulp van een steriele microschaar voor daaropvolgende organotypische cultuur.
2. Ontsmetting van antibiotica: Was de vasculaire segmenten gedurende 3 x 5 minuten met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met een drievoudige antibiotica/antimycotische cocktail om microbiële besmetting te minimaliseren en steriliteit te garanderen voorafgaand aan blootstelling aan metabolieten.
3. Experimentele groepering: Wijs vasculaire segmenten willekeurig toe aan vier experimentele cohorten en breng ze over naar kweekplaten met 24 putjes die 500 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium per putje bevatten.
4. Metaboliet interventie
   1. Voeg metabolieten uit de volgende groepen toe: 1) Gezonde controleplasma-afgeleide metabolieten (HC-P); 2) Plasma-afgeleide metabolieten (HF-P) van patiënten met hartfalen; 3) Gezonde controle-ontlastingsafgeleide metabolieten (HC-F); 4) Van hartfalen afgeleide metabolieten (HF-F) van patiënten met hartfalen.
   2. Reconstitueer metabolietextracten in methanol (HPLC-kwaliteit) en dien 10 μl van elk extract toe aan het overeenkomstige putje van de kweekplaat met 24 putjes, die 500 μl van Dulbecco's Modified Eagle Medium en nierslagadersegmenten bevat (uiteindelijke oplosmiddelconcentratie van 2% (v/v)). Voeg equivalente hoeveelheden medium (methanol/PBS-mengsel) toe aan de controleputjes.
5. Kweekomstandigheden: Incubeer de plaatassemblages gedurende 24 uur onder de standaard celkweekomstandigheden (37 °C, 5% CO₂, 95% vochtigheid) met behulp van een bevochtigde incubator.

4. Test van de nierslagaderring

1. Renale arteriële ring suspensie en fixatie
   1. Draadvoorbereiding: Rijg twee parallelle roestvrijstalen draden van 2 cm (voorgebalanceerd in Krebs, 95% Ø₂/5% CO₂) door het arteriële lumen onder optische microscopie, zorg voor een gelijkmatig draaduitsteeksel aan beide uiteinden.
   2. Myograph-montage: Zet het verwarmingssysteem en het gas aan om de fysiologische temperatuur en oxygenatie te behouden. Zet de draden horizontaal vast in een temperatuurgecontroleerd draadmyograafbad (Krebs, 95% Ø₂/5% CO₂). Pas de schroefknoppen aan om de natuurlijke ontspanning van het vat te behouden.
2. Bepaling van de optimale beginspanning met vatspecifieke normalisatie
   OPMERKING: De spanning in rust werd aangepast met behulp van een normalisatieprocedure om de basislijnomstandigheden te standaardiseren, het reactievermogen van het vat te optimaliseren en de reproduceerbaarheid te garanderen. Breng 30 minuten in evenwicht voordat u verder gaat met de normalisatie.
   1. Selecteer Normalisatie-instellingen in het DMT-menu met behulp van de volgende parameters: oculairkalibratie: 1 mm/div; doeldruk: 13,3 kPa; IC1/IC100-verhouding: 0,9 C; online gemiddelde: 3 s; Vertragingstijd: 60 s.
      OPMERKING: Aanvullende achtergrond- en systeemconfiguratiedetails worden verstrekt in het document waarnaar wordt verwezen¹⁷.
   2. Als u een vaartuig wilt normaliseren, selecteert u het gewenste kanaal en vult u het normalisatiescherm met gegevens. Stel weefseleindpunten in op basis van de micrometerwaarde en draaddiameter van 40 μm.
   3. Breng passieve stretch aan en wacht 3 minuten. Dien 60K⁺ toe om een kalium-gemedieerde contractie op te wekken en wacht tot de contractie een plateau bereikt. Spoel het preparaat 3 x 5 min af met Krebs oplossing om de 60K⁺ uit te spoelen. Bereken de actieve kracht door de passieve kracht op elk rekniveau af te trekken van de door kalium geïnduceerde kracht die op het spoor is geregistreerd.
   4. Herhaal stap 4.2.3 totdat de maximale actieve kracht is bereikt. Definieer optimale spanning in rust als het niveau dat maximale actieve spanning oplevert in elke slagader, waarbij piekreacties op hoge K⁺ worden gebruikt als referentiecontracties.
   5. Breng de arteriële ring 10 minuten in evenwicht voordat u verder experimenteert.
      OPMERKING: Vanwege de aanzienlijke interindividuele variabiliteit in vatkwaliteiten, diktes en oorsprong, normaliseert u elk bloedvat afzonderlijk om reproduceerbaarheid te garanderen. Gebruik de normalisatiemodule van het draadmyograafsysteem om de juiste basislijnspanning te bepalen op basis van de passieve diameter en mechanische eigenschappen van elk vat. Pas de procedure consequent toe op alle monsters voordat de functie wordt getest.
3. Reactiviteitsdetectie van nierslagaderringen
   1. Om de effecten van verschillende metabolieten op de vasculaire contractiliteit te onderzoeken, voert u vasculaire contractiefunctietests uit met behulp van nierslagaders die gedurende 12 uur zijn geïncubeerd met geëxtraheerd plasma en fecale metabolieten van gezonde vrijwilligers en HF-patiënten. Zie sectie 3 voor specifieke details.
   2. Gebruik 60K⁺ om een kalium-gemedieerde contractie op te wekken. Zorg ervoor dat elke kamer 5 ml Krebs-oplossing bevat.
   3. Om fenylefrine (Phe)-geïnduceerde, concentratieafhankelijke contracties in slagaderringen te bepalen, voegt u Phe toe in stappen van ^10-9 tot 10-4 M. Begin met de laagste ^{Phe-concentratie} , breng deze in de kamer en wacht op een gestage samentrekking.
   4. Markeer de plek waar een gestage samentrekking wordt bereikt (d.w.z. noteer de spanningswaarde op het plateau) en ga dan verder met de volgende concentratie. Herhaal dit totdat de laatste concentratie met succes is toegevoegd.
   5. Sla na het voltooien van het experiment het gegevensbestand op en verwijder de slagaderringen. Reinig de kamer goed met een 8% azijnzuuroplossing en incubeer vervolgens gedurende 3 minuten.
   6. Schakel het verwarmingssysteem en het gas uit en zorg ervoor dat alle vloeistof is verwijderd voordat u het gas uitschakelt.

5. Histopathologisch onderzoek van de nierslagader: hematoxyline-eosine kleuring

OPMERKING: Gooi gevaarlijke reagentia en biologisch afval weg in overeenstemming met de institutionele protocollen voor bioveiligheid en chemische hygiëne. In het bijzonder moeten xyleen en paraformaldehyde worden verzameld in geëtiketteerde, afsluitbare containers voor chemisch afval en worden opgeslagen in een aangewezen zuurkastgebied voordat ze worden weggegooid door gecertificeerde verwerkers van gevaarlijk afval. Azijnzuur dat wordt gebruikt voor het reinigen van de myografiekamer moet worden geneutraliseerd en verwijderd volgens de standaard procedures voor de verwijdering van zuur afval. Leeg geen van deze reagentia in gootstenen voor laboratoria.

1. Was de slagaders in koude PBS en fixeer ze een nacht met 4% paraformaldehyde (pH 7,4). Snijd seriële secties bij 4 μm en verwerk voor histologie.
2. Incubeer weefselsecties die op glazen objectglaasjes zijn gemonteerd in een diadroger bij 60 °C gedurende 1 uur en breng ze vervolgens onmiddellijk over op xyleen. Dompel de secties onder in xyleen (3 x 5 min).
3. Onderwerp de secties aan graduele ethanolhydratatie: 100% ethanol (2 x 5 min), 95% ethanol (1 x 5 min), 90% ethanol (1 x 5 min), 80% ethanol (1 x 5 min), 70% ethanol (1 x 5 min), spoelen met ultrapuur water (1 x 5 min).
4. Kleur met hematoxyline (0,5% w/v) gedurende 5 min; Spoel vervolgens af onder stromend water.
5. Differentiëren met 1% zure alcohol (HCl-ethanol) gedurende 5-10 s en spoelen onder stromend water.
6. Blauw de coupes in 0,6% ammoniakwater en spoel af onder stromend water.
7. Dompel de secties 2 minuten onder in eosineoplossing (1% m/v).
8. Dehydrateer en verwijder de secties in 95% ethanol (2 x 5 min), 100% ethanol (2 x 5 min) en xyleen (2 x 5 min).
9. Laat kort aan de lucht drogen totdat optische transparantie is bereikt, monteer in het montagemedium, dek af met dekglaasjes en verzegel de dekglaasjes met een neutraal montagemedium.
10. Voer helderveldbeeldvorming en histomorfometrische evaluatie uit.

6. Detectie van nierbeschadiging-geassocieerde moleculaire biomarkers

1. MRNA-extractie van de nierslagader
   1. Voeg het gecryopreserveerde vaatweefsel in vloeibare stikstof toe aan 1 ml RNA-extractiereagens en breng het over naar een voorgekoelde weefselhomogenisator voor grondige homogenisatie.
   2. Voeg 250 μl chloroform per 100 μl extractiereagens toe, draai krachtig gedurende 30 s en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 °C.
   3. Centrifugeer bij 12.000 × g (10 min, 4 °C) en breng de waterige fase over in een verse buis.
   4. Voeg 500 μl isopropanol toe aan de waterige fase, meng door inversie en incubeer gedurende 20 minuten bij 25 °C.
   5. Centrifugeer bij 12.000 × g (10 min, 4 °C) en gooi het bovenstaande weg.
   6. Was de pellet met 1 ml 75% ethanol (2 x 5 min), laat de RNA-pellet aan de lucht drogen en resuspendeer opnieuw in DEPC-H₂O (0,1% v/v).
      OPMERKING: Controleer de RNA-zuiverheid (OD₂₆₀/OD₂₈₀ = 1.9-2.0) en bevestig intacte 28S/18S rRNA-banden.
2. cDNA-synthese
   1. Meng 2 μg mRNA + 1 μL oligo(dT) primer, breng aan op 8 μL met DEPC-H₂O (0,1% v/v), verwarm 5 minuten op 70 °C en laat 5 minuten afkoelen op ijs.
   2. Bereid de reverse transcription mastermix voor in 10 μL 2x TS Reaction Mix, 1 μL RT/RI Enzyme Mix en 1 μL gDNA Remover. Voeg de 12 μL mastermix toe aan de 8 μL RNA/primer mix uit stap 6.2.1 om een totaal reactievolume van 20 μL te verkrijgen.
   3. Verwarm het mengsel uit stap 6.2.2. bij 42 °C gedurende 60 minuten en beëindig het proces door 5 minuten te verwarmen bij 85 °C.
   4. Verdun de 20 μL omgekeerde transcriptiereactie door 80 μL nucleasevrije H₂O toe te voegen, wat resulteert in een eindvolume van 100 μL (4x verdunning). Gebruik het verdunde cDNA als sjabloon voor kwantitatieve PCR.
3. Kwantitatieve PCR-analyse
   1. Stel de reactie in door 2.0 μL cDNA-sjabloon, 0.5 μL voorwaartse primer (10 μM), 0.5 μL omgekeerde primer (10 μM), 10 μL SYBR Green mastermix (2x) en 7 μL ddH₂O te mengen.
   2. Voer de PCR uit met de volgende instellingen: eerste denaturatie: 95 °C/3 min; 40 cycli: 95 °C/30 s; Tm-5 °C/30 s; 72 °C/30 s; smeltcurve: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
   3. Analyseer genexpressie met behulp van de 2-ΔΔct-methode. De primersequenties worden weergegeven in aanvullende tabel S2.

Resultaten

Het cohort bestond uit twee vrouwen en twee mannen, met een leeftijdscategorie van 46 tot 73 jaar (gemiddelde leeftijd: 64,0 jaar). Baseline bloeddrukmetingen toonden een systolische bloeddruk variërend van 109 tot 168 mmHg en diastolische druk van 68 tot 115 mmHg. Alle HF-patiënten hadden een geregistreerde medicatiegeschiedenis, waaronder gangbare cardioprotectieve middelen zoals bètablokkers, statines en plaatjesaggregatieremmers met individuele variaties in remmers van het renine-ang...

Discussie

Recent onderzoek naar CRS heeft metabole herprogrammering geïdentificeerd als een belangrijk pathologisch mechanisme, waarbij metabolieten de renale vasculaire homeostase reguleren ^7,8,9. Hoewel VSMC's een cruciale rol spelen bij het reguleren van de vasculaire tonus en therapietrouw bij CRS, levert onze studie direct bewijs dat met hartletsel geassocieerde metabolieten de contractiliteit van de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM High Glucose	Gibco	Cat# 06-1055-57-1-ACS
PBS	Solarbio	Cat# P1010
Penicillin-Streptomycin-amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15240062
Phenylephrine	MCE	Cat#HY-B0769
Reverse transcription system	Promega	Cat# A5001
Stereomicroscopisch systeem	Leica	M80
SYBR Green master mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4309155
Vasculaire spanningsmeetsysteem	DMT	620M