Methodenartikel

Een liposoommembraanpermeabiliteitstest voor het onderzoeken van de effecten van fosfatidylinositolfosfaatgroepen op de membraneutrope werking van gif PLA2

827 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68594

⸱

26 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een kosteneffectieve methode voor het beoordelen van liposomale membraanpermeabiliteit met een superieure gevoeligheid en resolutie ten opzichte van conventionele technieken. Met behulp van een nieuwe ingekapselde ligandsubstitutiereactie detecteert deze techniek fosfolipase A 2-geïnduceerde veranderingen in modelmembranen. Deze toegankelijke benadering kan eenvoudig worden geïntegreerd met standaardanalyses en verbetert de resolutie voor het bestuderen van membraanbiofysica en toxine-interacties.

Samenvatting

We ontwikkelden een nieuwe, kosteneffectieve en zeer gevoelige test voor het beoordelen van liposomale membraanpermeabiliteit op basis van ligandsubstitutiereacties met liganden ingekapseld in het inwendige volume van liposomen, die we combineerden met een hydrolytische activiteitstest (met behulp van co-enzym A-acylering) en moleculaire modelleringssimulatie om te onderzoeken of fosfaten van de inositolring in fosfatidylinositol membranen beschermen tegen de schadelijke effecten van afwijkend tot expressie gebrachte enzymen. Afwijkende expressie van fosfolipasen A2 (PLA2) leidt tot demyelinisatie van axonen die de ontwikkeling van multiple sclerose en de ziekte van Alzheimer veroorzaakt. Om de effecten van afwijkend tot expressie gebrachte PLA₂ na te bootsen, gebruikten we de basissubeenheid van addergif PLA₂, HDP-2P. De HDP-2P werd getest op fosfatidylcholine (PC) liposomen verrijkt met fosfatidylinositol, fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI-4-P) of fosfatidylinositol-4,5-difosfaat (PI-4,5-P2). Terwijl HDP-2P minimale hydrolytische activiteit vertoonde en slechts licht verhoogde permeabiliteit in PC-liposomen, verbeterde verrijking van PC-liposomen met PI zowel de hydrolyse als de permeabiliteit. Opmerkelijk is dat PI-4-P en PI-4,5-P₂ de hydrolytische activiteit van HDP-2P dramatisch remden en de permeabiliteit volledig verminderden. Moleculaire modelleringssimulaties toonden aan dat fosfaten van de inositolring in fosfatidylinositol de toegang van fosfolipiden tot de actieve plaats van HDP-2P sterisch blokkeren, waardoor hydrolyse wordt voorkomen. Zowel in vitro als in silico gegevens suggereren dat gefosforyleerde fosfatidylinositolen geassocieerd zijn met verminderde PLA₂-activiteit, wat wijst op een potentieel mechanisme om overmatige PLA2-activiteit te verminderen - vermoedelijk als een middel om celmembranen te beschermen tegen degeneratie.

Inleiding

Fosfatidylinositol (PI) is een anionisch fosfolipide dat bestaat uit een fosfatidinezuurruggengraat die via een fosfaatgroep is gekoppeld aan inositol, een hexahydroxyring van zes koolstofatomen. Inositol kan omkeerbaar worden omgezet in fosfoinositiden door fosforylering op de koolstofposities 2, 3, 4, 5 en 61. PI en fosfoinositiden worden aangetroffen in plasmamembranen en organellen van verschillende cellen bij dieren, planten en micro-organismen. Zeventig jaar na hun ontdekking door Mable en Lowell Hokin 2,3,4 blijven PI en fosfoinosididen het onderwerp van uitgebreid onderzoek gericht op het begrijpen van hun moleculaire mechanismen en hun relevantie voor de menselijke gezondheid 5,6,7.

Afgezien van hersenweefsel zijn fosfoinosididen doorgaans aanwezig in lage concentraties, goed voor ongeveer 0,5 tot 1% van de totale lipiden in het binnenste blad van het plasmamembraan. De gepubliceerde gegevens geven aan dat het onwaarschijnlijk is dat PI onder fysiologische omstandigheden een belangrijke structurele rol zal spelen1. Tijdens ziektetoestanden nemen de niveaus van PI en fosfoinosididen echter toe en gaan ze naar de buitenste folder van het plasmamembraan, wat aangeeft dat deze fosfolipiden mogelijk verband houden met ziekteresistentie1. Hoewel lang werd gedacht dat PI een minder significante fysiologische rol speelt in vergelijking met fosfoinositiden, benadrukt opkomend bewijs het belang van PI-4-P en PI-4,5-P2 in verschillende fysiologische processen1. Deze processen omvatten intracellulaire signalering, intercellulaire signaaltransductie 8,9,10, membraantransport 11,12,13, modulatie van genexpressie1, evenals celproliferatie14 en overleving1. Desondanks blijven de moleculaire mechanismen waarmee PI en fosfoinositiden deze processen aansturen slecht begrepen.

PI en fosfoinosididen zijn overvloedig aanwezig in hersenweefselcellen, waar ze ongeveer 10% van de totale fosfolipiden uitmaken, hoewel hun niveaus tijdelijk kunnen toenemen in de vroege stadia van hersenziekten, wat suggereert dat fosfoinosididen de ontwikkeling van neurologische pathologieën kunnen tegengaan1 zoals multiple sclerose en de ziekte van Alzheimer veroorzaakt door axonale demyelinisatie veroorzaakt door afwijkende activiteit van PLA215, 16,17. Deze enzymen behoren tot de verschillende klassen en groepen, waaronder groep IIA secretoire fosfolipase A2 (sPLA2)15. Verhoogde niveaus van deze groep enzymen worden aangetroffen in het hersenvocht van patiënten met multiple sclerose en de ziekte van Alzheimer, waar ze bijdragen aan de afbraak van myelinemembranen, wat leidt tot demyelinisatie15. Er is ook gemeld dat sPLA2'svan slangengif de overdracht van neuromusculaire synapsen remmen18,19, waardoor aandoeningen van het centrale zenuwstelsel ontstaan en het perifere neuromusculaire systeem nadelig wordt beïnvloed20.

In deze studie hebben we onderzocht of PI en fosfoinosididen modelfosfolipidemembranen kunnen beschermen tegen de effecten van afwijkend tot expressie gebrachte sPLA2-enzymen . Modelmembranen werden gemaakt van fosfatidylcholine (PC), de meest voorkomende fosfolipide in alle celmembranen van zoogdieren21, verrijkt met een molaire verhouding van 20% van PI, PI-4-P of PI-4,5-P2. Om de effecten van afwijkend tot expressie gebrachte sPLA2-enzymen op modelmembranen na te bootsen, gebruikten we de basissubeenheid HDP-2P van het groep IIA secretoire addergif neurotoxisch PLA2-enzym 22, waarvan de hydrolytische activiteit eerder is bestudeerd op modelmyelinemembranen23.

Voor dit werk hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld om veranderingen in de permeabiliteit van liposomale membranen die worden aangetast door HDP-2P te onderzoeken. De nieuwe methode is gebaseerd op een ligandsubstitutiereactie in CuSO4-oplossing buiten de liposomen, waarbij een NH3-ligand in de liposomen gevangen zit. Als HDP-2P-geïnduceerde membraanpermeabiliteit NH3-lekkage van liposomen mogelijk maakt, zal de vrijgekomen ammoniak via de reactie kwantitatief vier watermoleculen in gehydrateerde koperionen vervangen: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). Deze liganduitwisseling produceert een karakteristieke toename van de optische dichtheid van de oplossing, meetbaar door spectrofotometrie (λ = 600 nm), die dient als onze kwantitatieve uitlezing voor veranderingen in de membraanpermeabiliteit. Onze op ligandsubstitutie gebaseerde benadering toont een superieure gevoeligheid voor het beoordelen van membraanpermeabiliteit in vergelijking met conventionele technieken zoals 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 en ionentransporttesten29, terwijl het extra voordeel biedt dat er geen dure instrumentatie nodig is. Deze eenvoudige en kosteneffectieve methode, toegepast in combinatie met HDP-2P hydrolytische activiteitsmetingen en de in silico simulatie van PI, PI-4-P en PI-4,5-P2 binding aan het moleculaire oppervlak van HDP-2P, stelde ons in staat om te concluderen dat de fosfaten van de inositolring in PI de verstorende effecten van HDP-2P op PC-membranen verrijkt met PI-4-P of PI-4 opheffen, 5-P2. Mocht deze bevinding in verdere studies worden bevestigd, dan kan het vermogen van de inositolringfosfaten in PI om te beschermen tegen de schadelijke effecten van abnormaal werkende cellulaire eiwitten, die mogelijk bijdragen aan membraanstabiliteit bij ziekteaandoeningen met afwijkende eiwitactiviteit, de weg vrijmaken voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en multiple sclerose.

Protocol

1. In silico simulatie van HDP-2P interactie met PI en fosfoinositiden met behulp van moleculaire modelleringssoftware

  1. Installatie en voorbereiding van de software
    1. Installeer de editor voor chemische tekeningen waarnaar wordt verwezen voor het construeren van ligandmoleculen, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S1A.
    2. Installeer de moleculaire modelleringssoftware voor moleculaire koppeling van ligand aan de receptor.
    3. Installeer de geautomatiseerde dockingtools voor ligand- en receptorvoorbereiding.
    4. Aangezien de simulatiesoftware voor moleculaire modellering afhankelijk is van de Python-omgeving, moet u Python installeren.
  2. Ligand preparaat
    1. Gebruik eerst de chemische tekeneditor om de atomaire coördinaten te bouwen voor moleculaire structuren van PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, cardiolipine en fosfatidylserine.
      OPMERKING: Het voorbeeldprotocol in de volgende stappen van de ligandvoorbereiding beschrijft de stappen alleen voor PI.
    2. Bouw de moleculaire structuur van PI met behulp van de chemische tekeneditor, zoals geïllustreerd in Aanvullend bestand 1-Aanvullende Figuur S1B en sla het bestand op in PDB-formaat zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1-Aanvullende Figuur S2.
    3. Open het PDB-bestand in de software van de geautomatiseerde dockingtool, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S3A.
    4. Voeg waterstofatomen toe zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S3B en selecteer polaire of alle waterstofatomen zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S4A.
      OPMERKING: Na voltooiing van de PI-koppeling met HDP-2P, selecteert u alleen polaire waterstofatomen om de visualisatie van polaire of waterstofbruggen te vereenvoudigen.
    5. Stel het PI-molecuul in als het ligand voor de software van de geautomatiseerde dockingtool, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S4B.
    6. Sla de ligand op als een PDBQT-bestand zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S5A. Zorg ervoor dat alle bindingen draaibaar zijn.
  3. Receptor preparaat
    1. Download het PDB-bestand van fosfolipase A2 HDP-2 (PDB-code 2I0U), bestaande uit twee monomeren, de ene is zuur, enzymatisch inactief, A, en de andere is basisch, enzymatisch actief, E. Om enzymatisch inactief monomeer A te verwijderen, importeert u het 2I0U-bestand in de moleculaire modelleringssoftware (aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S5B), selecteert u alle atomen van monomeer A (aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S6A) en gaat u vervolgens naar bewerken en verwijdert u alle atomen van monomeer A (aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S6B). Houd enzymatisch actief monomeer E, dat nu wordt aangeduid als de receptor.
    2. Open het HDP-2P-receptor PDB-bestand in de software van de geautomatiseerde dockingtool, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S7.
    3. Verwijder alle watermoleculen zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S8A.
    4. Voeg waterstofatomen toe zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende figuur S8B. Houd er rekening mee dat na voltooiing van de HDP-2P-koppeling met PI alleen polaire waterstofatomen hoeven te worden geselecteerd om de visualisatie van polaire en waterstofbruggen te vereenvoudigen.
    5. Stel de HDP-2P in als de receptor, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S9A, en sla het op als een PDBQT-bestand. Zorg ervoor dat de receptor is ingesteld zonder draaibare bindingen.
  4. Instelling van dockingparameters
    1. Open zowel de ligand- als de receptor-PDBQT-bestanden.
    2. Voer de interface voor het instellen van het rastervak in, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1-Aanvullende Figuur S9B, en definieer de grootte van het rastervak (grootte x = 44.644; grootte y = 74.939; grootte z = 43.050) en centrum (midden x = 25.626; midden y = 9.582; centrum z = 41.825) coördinaten, die het hele oppervlak van het receptormolecuul volledig omsluiten, zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1-Aanvullende Figuur S10A.
    3. Sluit de interface voor het instellen van het rastervak met de huidige instellingen zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1-Aanvullende Afbeelding S10B en sla de dockingparameters op in een config.txt bestand zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1-Aanvullende Afbeelding S11A.
  5. De moleculaire docking-software uitvoeren
    1. Start de moleculaire dockingsoftware met behulp van het config.txt-bestand zoals weergegeven in aanvullend bestand 1-aanvullende afbeelding S11B.
    2. Voer de dockingberekening uit (~30-90 min; Aanvullend bestand 1-Aanvullende figuur S12).
    3. Controleer het docking_log.txt bestand om de dockingscores (bindingsaffiniteit) te bekijken.
    4. Selecteer het dockingresultaat met de laagste energieconformatie.
  6. Analyse van dockinggegevens
    1. Gebruik de geautomatiseerde docking-toolsoftware om het PDBQT-bestand met dockingresultaat te openen.
    2. Analyseer de ligand-receptorbindingsplaatsen, met de nadruk op het actieve centrum van de receptor en intermoleculaire interacties, waaronder ionische, ionpolaire, polaire en waterstofbindingsinteracties. Maak een tabel voor PI en fosfoinositide, die interageren met de actieve plaats van de receptor, om bindingsplaatsaffiniteiten in kcal/mol, geladen en polaire delen in PI/fosfoinositide-polaire kop en HDP-2P-residuen die betrokken zijn bij intermoleculaire binding, en soorten bindingen te beschrijven zoals weergegeven in Tabel 1 en Tabel 2. Herhaal het docken voor elk receptor-ligandpaar 3x om er zeker van te zijn dat er geen afwijking is in bindingsplaatsen, bindingsaffiniteiten, geladen en polaire delen van PI/fosfoinositide- en HDP-2P-residuen en het type bindingen.

2. Hydrolytische activiteit van HDP-2P in PC-liposomen verrijkt met PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS of CL gecontroleerd met behulp van het co-enzym A geacyleerd met vrije vetzuren

OPMERKING: Chloroform, methanol, NH3 en CuSO4 zijn gevaarlijk. Gebruik altijd nitrilhandschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Behandel alle protocollen met deze reagentia onder de zuurkast. Bewaar chloroform in een amberkleurige glazen fles. Bewaar methanol in brandbare kasten, uit de buurt van oxidatiemiddelen. Houd methanol uit de buurt van vlammen en vonken. Label alle afvalcontainers voor deze reagentia en voer ze af volgens de plaatselijke voorschriften voor de verwijdering van gevaarlijk afval.

  1. Bereid 100 ml bufferoplossing voor de HDP-2P-gekatalyseerde fosfolipidehydrolyse door 5,55 mg CaCl2 op te lossen in 0,10 M Tris-HCl-buffer (pH 7,4).
  2. Bereid 50 ml 1,0 M EDTA-stockoplossing door 7,31 g EDTA op te lossen in gedeïoniseerd gedestilleerd water (ddH20).
  3. Bereid 0,54 mM HDP-2P stockoplossing in 0,10 M Tris-HCl buffer (pH 7,4). De molaire massa van HDP-2P is 13.827 kDa.
  4. Bereid de volgende voorraadoplossingen van fosfolipiden in een concentratie van 10,0 M in een mengsel van chloroform en methanol (2/1 volume): eigeel L-α-fosfatidylcholine (PC), runderhartcardiolipine (CL), runderhersenen L-α-fosfatidyl-L-serine (PS), PI, PI-4-P en PI-4,5-P2. Molaire massa's van PC, CL, PS, PI, PI-4-P en PI-4,5-P2 zijn respectievelijk 768 Da, 1,466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da en 1,057 Da, zoals hieronder verder beschreven.
  5. Bereid vijf monsters van PC-liposomen voor. Om een monster van PC-liposomen te bereiden, voegt u 75 μL chloroform/methanol stockoplossing van PC toe aan een glazen reageerbuis en droogt u de lipiden bij 25 °C onder 10 Pa vacuüm gedurende 1 uur tot er een lipidenfilm is gevormd. Hydrateer de lipidenfilm gedurende 1 uur met 15 ml bufferoplossing voor fosfolipidenhydrolyse bij 25 °C in een thermostaat. Steek vervolgens het titanium pistool van een ultrasone dispenser van 100-150 W in de lipidensuspensie in de glazen reageerbuis die in een ijsbad is geplaatst en sonificeer de suspensie gedurende 22 minuten op de frequentie van 10 kHz, met een maximum van 50% van het maximale vermogen. Om titaniumstofdeeltjes te verwijderen, centrifugeert u liposomen bij 200 × g (1.270 tpm met een rotor van 10 cm) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Bereid monsters voor van PC-liposomen verrijkt met CL, PS, PI, PI-4-P of PI-4,5-P2 op de PC en andere lipidemolaire verhouding 4 tot 1 door chloroform/methanolfosfolipidevoorraadoplossingen - 60 μL PC te mengen met 15 μL CL, PS, PI, PI-4-P of PI-4,5-P2 - in een glazen buis. Droog vervolgens de lipiden in een vacuüm van 10 Pa of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur, hydrateer de lipidenfilm in een bufferoplossing voor fosfolipidenhydrolyse en sonificeer met ultrasone golven zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: Bereid voor elk type liposomen vijf monsters voor.
  7. Breng 1,0 ml van vijf monsters van elk type liposomen die hierboven zijn beschreven in afzonderlijke buisjes en voeg 10 μl kleurloze co-enzym-A-oplossing uit de NEFA-kit toe aan elk buisje en voeg vervolgens 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 of 3,72 μl 0,54 mM HDP-2P stockoplossing toe aan afzonderlijke buisjes om in liposoommonsters de HDP-2P/fosfolipide-molaire verhoudingen van 0,000 te verkrijgen, respectievelijk 0,001, 0,002, 0,003 en 0,004.
  8. Onmiddellijk na het toevoegen van HDP-2P aan de liposomen, incubeer liposoommonsters gedurende 15 minuten bij 37 °C in een thermostaat en stop vervolgens de fosfolipidehydrolyse geïnduceerd door HDP-2P door 100 μL voorraad EDTA-oplossing toe te voegen. Draai daarna de monsters gedurende 1 minuut.
  9. Kwantificeer de hydrolytische activiteit van HDP-2P door de optische dichtheid van liposomale monsters bij 550 nm te meten met behulp van een spectrofotometer, die zou meten in hoeverre kleurloze co-enzym-A-oplossing paars wordt wanneer deze wordt geacyleerd met vrije vetzuren.
  10. Herhaal de bovenstaande procedure nog twee keer, zodat de gemiddelde optische dichtheidswaarden worden afgeleid uit drie onafhankelijke proeven.
    OPMERKING: Elk gegevenspunt dat in deze experimentele proef wordt verkregen, is de gemiddelde waarde van de optische dichtheid. Idealiter zou de standaarddeviatie van experimentele datapunten binnen ±5% van het gemiddelde moeten liggen.

3. Effecten van HDP-2P op de permeabiliteit van PC liposomale membranen verrijkt met PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS of CL gemeten door een ligandsubstitutiereactie in CuSO4-oplossing waarbij een NH 3-ligand gevangen in de liposomen betrokken is

OPMERKING: Chloroform, methanol, NH3 en CuSO4 zijn gevaarlijk. Gebruik altijd nitrilhandschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Behandel alle protocollen met deze reagentia onder de zuurkast. Bewaar chloroform in een amberkleurige glazen fles. Bewaar methanol in brandbare kasten, uit de buurt van oxidatiemiddelen. Houd methanol uit de buurt van vlammen of vonken. Label alle afvalcontainers voor deze reagentia en voer ze af volgens de plaatselijke voorschriften voor de verwijdering van gevaarlijk afval.

  1. Bereid 20 ml stockoplossingen van 0,03 M voor elk van de zes fosfolipiden - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- in chloroform/methanol (2 tot 1 volume). De molecuulmassa's van PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 zijn respectievelijk 768, 1466, 792, 867, 962 en 1057 Da.
  2. Bereid 100 ml 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) buffer voor met een eindconcentratie van 0,05 M CuSO4.
  3. Bereid 4 ml 1,5 × 10-3 M HDP-2P bouillon in 0,05 M CuSO4, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) buffer. De molaire massa van HDP-2P is 13.827 kDa.
  4. Gebruik voor de bereiding van 100 ml 0,5 M NH3-oplossing 25% NH3-oplossing (dichtheid 905 g/l30, gelijk aan 13,30 m [905 g/l × 0,25 M ÷ 17,00 g/l = 13,30 M]). Gebruik dus voor de bereiding van 100 ml 0,5 M NH3 3,76 ml 25% NH3-oplossing : (0,5 M × 1.000 ml ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 ml 25% NH3-oplossing . Breng 3,76 ml 25% NH3-oplossing in een maatkolf van 100 ml en breng het volume op 100 ml met 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) buffer.
  5. Om liposomen met NH3 in het binnenste volume van liposomen te bereiden, plaatst u 12,5 ml 0,03 M voorraad fosfolipidenoplossing in chloroform/methanol in een buis en droog fosfolipiden in 10 Pa vacuüm of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Hydrateer de fosfolipidenfilm gedurende 1 uur met 12,5 ml 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) bij 25 °C in een thermostaat; sonificeer vervolgens de lipidensuspensie bij een frequentie van 22 kHz zoals beschreven in stap 2.5 om gesonificeerde liposomen te produceren.
    OPMERKING: In de oplossing met gesonificeerde liposomen bevindt NH3 zich binnen en buiten de liposomen.
  6. Om NH3 buiten de liposomen te elimineren, dialyseert u de liposomen met behulp van een dialysemembraan (moleculaire afkapping 1,0 kDa) gedurende 5 hoeden kamertemperatuur tegen 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) met behulp van een magnetische roerder.
    OPMERKING: Dialyse gedurende 5 uur was voldoende om NH3 volledig te verwijderen, aangezien de toevoeging van 0,5 ml gedialyseerde liposomen aan 0,5 ml 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4-buffer dezelfde optische dichtheid opleverde bij 600 nm als die van liposomen die zonder NH3 waren bereid en met dezelfde buffer waren gemengd.
  7. Na dialyse centrifugeren de liposomen bij 200 × g gedurende 90 minuten zoals beschreven in stap 2.5 om de liposomen te pelleteren. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de liposomen opnieuw met 5,0 ml 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4) buffer en verdeel de geresuspendeerde liposomen in vijf monsters van elk 1,0 ml. Voeg aan deze vijf monsters van 1,0 ml afzonderlijk 60, 40, 20 en 0 μl 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4) buffer en vervolgens 0, 20, 40, 60, 80 μl HDP-2P-voorraadbuffer toe om in de liposoommonsters de HDP-2P/fosfolipide-molaire verhoudingen 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 en 0,004 respectievelijk aan te passen.
  8. Incubeer de liposoommonsters gedurende 30 minuten in een thermostaat bij 37 °C; Meet vervolgens de optische dichtheid van de liposoommonsters bij 600 nm met behulp van een spectrofotometer. Volg de stappen beschreven in sectie 3 voor alle zes liposoommonsters en herhaal 3x om drievoudige metingen van de optische dichtheid voor elk gegevenspunt te garanderen.
    OPMERKING: De standaarddeviatie van experimentele gegevenspunten moet altijd binnen ±5% van het gemiddelde liggen.

Resultaten

Moleculaire modelleringssimulatie van HDP-2P interactie met PI en fosfoinositiden
Het moleculaire modelleringsprogramma berekent de beste negen bindingsplaatsen op het moleculaire oppervlak van een receptor (groter molecuul), waarop een ligand (kleiner molecuul) zich richt. Deze plaatsen worden bepaald door het vrijkomen van de negen hoogste enthalpieën, die de plaatsen met de beste bindingsaffiniteiten aanduiden. De bindingsaffiniteiten worden uitgedrukt als negatieve waarden, wat aangeeft dat de intermoleculaire binding een exotherm proces is. In het geval van een interactie tussen HDP-2P en PI voorspelde de simulatie vier bindingsplaatsen (#3, #6, #7 en #8) voor PI op het moleculaire oppervlak van HDP-2P in het actieve centrum (Tabel 1). Bovendien werden de vijf bindingsplaatsen voor PI gevonden buiten het actieve centrum van HDP-2P. De notaties van de geladen en polaire delen in de polaire kop van PI worden geïllustreerd in Figuur 1.

Het actieve centrum van HDP-2P bestaat uit vijf belangrijke aminozuurresiduen: Gly30, Gly32, His48, Asp49 en Lys69, die de juiste uitlijning van het fosfolipidesubstraat in het actieve centrum vergemakkelijken om katalytische hydrolyse te garanderen. Sommige representatieve aangemeerde structuren vertonen de binding van PI aan enkele aminozuurresiduen van het actieve centrum, terwijl PI op bindingsplaats #6 zich bezighoudt met alle vijf de belangrijkste aminozuurresiduen van het actieve centrum via ionische, ionpolaire en waterstofbruggen (Tabel 1). Figuur 2 illustreert hoe PI interageert met alle vijf belangrijke aminozuurresiduen in het actieve centrum van HDP-2P binnen bindingsplaats #6.

De docking-simulatie van de interactie tussen HDP-2P en PI-4-P, die een fosfaatgroep bevat op positie 4 van de inositolring, voorspelde alleen bindingsplaats #1 als de locatie waar PI-4-P bindt aan het actieve centrum van HDP-2P. In het bijzonder interageert PI-4-P op deze site met drie belangrijke aminozuurresiduen van het actieve centrum - Gly30, Gly32 en Lys69 - via ionische, ionpolaire en waterstofbruggen (Tabel 2). Figuur 3 illustreert de interactie van PI-4-P met het actieve centrum van HDP-2P. In de overige acht bindingsplaatsen op het moleculaire oppervlak van HDP-2P bindt PI-4-P aan locaties buiten het actieve centrum.

De moleculaire docking-simulaties van HDP-2P-interacties met PI-4,5-P₂ (met fosfaatgroepen op posities 4 en 5 van de inositolring) toonden geen binding aan het actieve centrum van het enzym op alle negen voorspelde bindingsplaatsen. In plaats daarvan bindt PI-4,5-P₂ zich consequent aan een groefachtige holte naast het actieve centrum (Figuur 4), waarbij ionpolaire en waterstofbruggen worden gevormd met de drie HDP-2P-residuen, Trp31, Gly33 en Gln34).

Hoewel de binding van PI-4,5-P₂ aan een groefachtige holte nabij het actieve centrum van cellulair of gif PLA2s niet eerder is gedocumenteerd, zijn structureel analoge kenmerken goed ingeburgerd in pleckstrin homologie31 (PH) en epsine N-terminale homologie32 (ENTH) domeinen. Deze signaaldomeinen maken gebruik van vergelijkbare hydrofobe-polaire-kationische groefarchitecturen voor specifieke PI-4,5-P2-herkenning 31,32, ondanks hun niet-enzymatische aard. De aanwezigheid van een vergelijkbaar structureel motief in HDP-2P roept intrigerende mogelijkheden op van evolutionaire nabootsing of convergente evolutie om membraandomeinherkenning door HDP-2P te vergemakkelijken. Indien verder geverifieerd door andere methoden, kan deze studie het eerste gerapporteerde geval zijn van een gif PLA2 dat een dergelijk mechanisme voor fosfoinositideherkenning gebruikt.

Interessant is dat moleculaire dockingsimulaties van CL en PS die interageren met HDP-2P de binding van beide fosfolipiden aan het actieve centrum van HDP-2P voorspelden in acht van de negen bindingsplaatsen, terwijl de enige bindingsplaats van CL en PS buiten het actieve centrum zich niet in de groefachtige holte bevond (gegevens niet getoond). Het is ook vermeldenswaard dat, net als PI, PC bindt aan het actieve centrum van HDP-2P in vier van de negen bindingsplaatsen, en zowel PI als PC, zoals CL en PS, binden niet aan de groefachtige holte (gegevens niet weergegeven). Deze bevindingen suggereren dat de fosfaatgroepen op de inositolring van PI een hoge bindingsaffiniteit hebben met de groefachtige holte die zich naast het actieve centrum bevindt. Structurele analyses hebben analoge groefachtige holtes geïdentificeerd met hydrofobe-polaire-kationische oppervlaktevlekken nabij het katalytische centrum in zowel cellulaire33- als gif34 PLA 2-enzymen. De binding van fosfoinositiden aan deze holtes kan fysiologisch significante conformatieveranderingen veroorzaken, waardoor de enzymatische activiteit mogelijk wordt geremd. Met name onder fosfoinositiden vertoont PI-4,5-P2 bijzonder slechte substraatkenmerken - menselijke PLA2-isovormen (cytosolische, calciumonafhankelijke en uitgescheiden typen) vertonen minimale tot niet-detecteerbare hydrolytische activiteit in de richting van PI-4,5-P235. Dit suggereert dat fosfoinositidebinding aan deze geconserveerde structurele kenmerken een duidelijke fysiologische functie kan hebben (bijv. allosterische remming) in plaats van katalytische functies in de PLA2-superfamilie, waarvoor toekomstige experimentele verificatie vereist is.

Hydrolytische activiteit van HDP-2P in PC-liposomen verrijkt met PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS of CL gecontroleerd met behulp van co-enzym A geïrcyleerd met vrije vetzuren
De hydrolytische activiteit van HDP-2P op liposomale monsters werd beoordeeld met behulp van co-enzym A-oplossing. De co-enzym A-oplossing is kleurloos, maar wordt paars bij acylering door vrije vetzuren die vrijkomen tijdens de hydrolyse van fosfolipiden, gekatalyseerd door HDP-2P. De resulterende toename van de optische dichtheid, die overeenkomt met de mate van co-enzym A-acylering, werd spectrofotometrisch gemeten bij 550 nm. Daarom is de toename van de optische dichtheid in liposomale monsters die zijn behandeld met co-enzym A en HDP-2P recht evenredig met de hydrolytische activiteit van HDP-2P.

Figuur 5 toont de hydrolytische activiteitscurven als functie van de HDP-2P/fosfolipide-molaire verhouding in verschillende liposomale monsters. De hydrolytische activiteit van HDP-2P wordt uitgedrukt in willekeurige eenheden (a.u.) van optische dichtheid (OD) gemeten bij 550 nm. We hebben geen kalibratiecurve opgesteld om au-waarden te relateren aan de molaire concentraties van vrije vetzuren, omdat onze experimentele proeven aantoonden dat vetzuren in organische oplosmiddelen, wanneer toegevoegd aan waterige oplossingen die co-enzym A en acyl-co-enzym A-synthetase bevatten, geen detecteerbare OD-verandering veroorzaakten bij 550 nm. Dit geeft aan dat dergelijke vetzuren micellen vormen in plaats van zich te binden aan co-enzym A. Daarentegen binden alleen membraangegenereerde vetzuren (geproduceerd door PLA2-activiteit ) aan membraangeassocieerd co-enzym A, wat resulteert in een meetbare OD-verandering. De amfipathische aard van co-enzym A - met zowel hydrofobe als hydrofiele gebieden op het moleculaire oppervlak - lokaliseert het bij voorkeur op het membraan-watergrensvlak, wat de binding van vetzuren geproduceerd door PLA2-activiteit aan co-enzym A vergemakkelijkt. Onder deze testomstandigheden is het echter niet mogelijk om de molaire concentratie van vetzuren te bepalen. Om deze reden drukken onderzoekers met behulp van de co-enzym A-test de hydrolytische activiteit van PLA2 uit in willekeurige eenheden van OD gemeten bij 550 nm20.

De hoogste toename in optische dichtheid, wat overeenkomt met de grootste hydrolytische activiteit van HDP-2P, werd waargenomen in PC-liposomen verrijkt met CL of PS. Deze bevinding komt goed overeen met het hoogste aantal bindingsplaatsen voor CL en PS in het actieve centrum van HDP-2P. De hydrolytische activiteit van HDP-2P in PC-liposomen verrijkt met PI was respectievelijk 3,0 en 2,5 keer lager dan in liposomen verrijkt met CL of PS, maar hoger dan in pure PC-liposomen. Dit suggereert dat de bindingsaffiniteit naar het actieve centrum van HDP-2P van PI hoger is dan die van PC, ondanks dat beide lipiden hetzelfde aantal bindingsplaatsen in het actieve centrum hebben.

Deze schijnbare discrepantie kan worden verklaard door structurele verschillen in de polaire kopgroepen van PI en PC. Hoewel PC een neutraal molecuul is, strekt de kationische trimethylammoniumgroep zich uit tot in de oplossing, terwijl de anionische fosfaatgroep zich dichter bij het hydrofobe gebied van het membraan bevindt. Deze ladingsverdeling in de PC-kopgroep kan een elektrostatische afstoting tegen de basis HDP-2P veroorzaken, waardoor de bindingsaffiniteit wordt verminderd. De zure aard van PI maakt het daarentegen een aantrekkelijkere lipidesoort voor interactie met de basische HDP-2P, wat de hogere hydrolytische activiteit zou kunnen verklaren in vergelijking met pure PC-liposomen.

De hydrolytische activiteit van HDP-2P in PC-liposomen verrijkt met PI-4-P, zoals weergegeven in figuur 5, suggereert minimale katalytische hydrolyse van fosfolipiden. Opmerkelijk is dat de optische dichtheidscurve verkregen uit PC-liposomen verrijkt met PI-4,5-P een volledige eliminatie van hydrolytische activiteit door HDP-2P in dit liposoommonster aangeeft. Deze bevindingen sluiten goed aan bij de dockingsimulaties, die één bindingsplaats voor PI-4-P in het actieve centrum van HDP-2P voorspellen, terwijl PI-4,5-P2 helemaal geen bindingsaffiniteit vertoont met het actieve centrum. Dit suggereert dat de fosfaatgroepen die aan de inositolring zijn gebonden, de binding van het fosfolipide aan het actieve centrum van HDP-2P belemmeren. We stellen voor dat de fosfaatgroepen op de inositolring zich naar buiten uitstrekken in de oplossing, en door zich te binden aan HDP-2P via ionische en ionpolaire intermoleculaire interacties, houden ze HDP-2P op afstand van het membraanoppervlak, waardoor het membraan wordt beschermd tegen de hydrolytische activiteit van HDP-2P. Dit komt overeen met recente bevindingen die aantonen dat menselijke cytosolische, calciumonafhankelijke en uitgescheiden PLA2-enzymen nauwelijks detecteerbare of geen hydrolytische activiteit vertoonden in de richting van de PI-4-P- en PI-4,5-P2-substraten 35.

HDP-2P-geïnduceerde permeabiliteitsveranderingen in PC liposomale membranen verrijkt met PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS of CL: beoordeling via ligandsubstitutiereactie in CuSO4-oplossing met ingekapseld NH₃

De impact van HDP-2P hydrolytische activiteit op de membraanpermeabiliteit van PC-liposomen verrijkt met PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS of CL werd onderzocht met behulp van een ligandsubstitutiereactie in een complex ionensysteem, waarbij het vervangende ligand werd ingekapseld in het inwendige volume van de liposomen. Deze eenvoudige en betrouwbare methode is gebaseerd op de verplaatsing van vier watermoleculen die als liganden fungeren in het complexion [Cu(H2O)6]2+ door NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Tijdens het proces van NH3 die watermoleculen in het complexion [Cu(H2O)6]2+ vervangt, gaat de lichtblauwe kleur van [Cu(H2O)6]2+ over in de donkerblauwe kleur van [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. In een systeem waar NH3 is ingekapseld in het inwendige volume van liposomen en [Cu(H2O)6]2+ aanwezig is in de externe oplossing, duidt deze kleurverandering - spectrofotometrisch gecontroleerd - op een toename van de liposomale membraanpermeabiliteit tot NH3.

Om een dergelijk systeem op te zetten, hebben we een fosfolipidedispersie gesonificeerd in Tris-HCl-buffer die NH3 bevat, waardoor gesonificeerde liposomen met NH₃ binnen en buiten de liposomen worden gevormd. Extern NH3 werd verwijderd door dialyse, waarna CuSO4-oplossing werd toegevoegd aan het liposoommonster met NH3 in het inwendige volume. Vervolgens behandelden we de liposomen met HDP-2P en volgden we de veranderingen in de optische dichtheid spectrofotometrisch.

Om de optimale golflengte voor het meten van optische dichtheidsveranderingen te bepalen, hebben we de absorptiespectra van [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ geregistreerd in een 0,025 M CuSO4, 0,100 M NH3-oplossing en [Cu(H2O)6]2+ in een 0,025 M CuSO4-oplossing , met behulp van zichtbaar licht in het bereik van 500 nm tot 900 nm. Zoals te zien is in figuur 6, leverde bestraling bij 600 nm een maximale absorptie op voor [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ en een minimale absorptie voor [Cu(H2O)6]2+, wat ons ertoe bracht 600 nm te selecteren als de optimale golflengte voor onze membraanpermeabiliteitsexperimenten.

Figuur 7 laat zien dat de membraanpermeabiliteit naar NH₃ het hoogst is bij PC-liposomen verrijkt met anionische CL en PS. Deze waarneming komt overeen met onze eerder gerapporteerde gegevens die aantonen dat HDP-2P, een groep IIA PLA2, efficiënt interageert met de anionische fosfolipide palmitoyloleoyl-glycerofosfoglycerol, wat leidt tot substraathydrolyse - een effect dat niet wordt waargenomen met de neutrale fosfolipide palmitoyloleoylglycerofosfocholine36. Over het algemeen vertonen de meeste groep IIA PLA2-enzymen een significant hogere hydrolytische activiteit ten opzichte van anionische fosfolipiden 33,37,38. De permeabiliteit van PC+PI liposomen is lager dan die van PC+CL en PC+PS liposomen, maar blijft hoger dan die van pure PC liposomen. Deze bevindingen sluiten goed aan bij de resultaten van dockingsimulaties en HDP-2P hydrolytische activiteitstesten. Met andere woorden, lyposomale monsters die een lage permeabiliteit vertonen, zullen naar verwachting structureel stabiel zijn vanwege het onvermogen van HDP-2P om fosfolipiden te hydrolyseren en vanwege een lagere affiniteit van HDP-2 om te binden aan PI en fosfoinositiden, zoals voorspeld door de moleculaire dockinggegevens (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4). Daarom zouden de hydrolytische activiteit van het enzym door HDP-2P (figuur 5) en membraanpermeabiliteit, zoals weergegeven in figuur 7, positief gecorreleerd moeten zijn.

In PC+PI-4-P en PC+PI-4,5-P2 liposomen nam de permeabiliteit echter niet toe na behandeling met HDP-2P. Hoewel de permeabiliteitsresultaten in PC+PI-4,5-P 2-liposomen goed correleren met docking-simulaties en HDP-2P hydrolytische activiteitsgegevens voor dezelfde liposomen, komt de afwezigheid van verhoogde permeabiliteit in PC+PI-4-P-liposomen niet volledig overeen met de resultaten van hydrolytische activiteit, aangezien een kleine mate van hydrolytische activiteit werd geregistreerd in deze liposomen. Deze bevindingen suggereren dat een lichte plaatselijke toename van de hydrolytische activiteit in PC+PI-4-P-liposomen de dubbellaagse pakking van fosfolipiden niet zodanig verstoort dat de membraanpermeabiliteit zou veranderen in NH3.

figure-results-2
Figuur 1: Notaties van geladen en polaire delen van de polaire kop van fosfatidylinositol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 2: Interactie van PI met het actieve centrum van HDP-2P voorspeld voor bindingsplaats #6 door moleculaire dockingsoftware. PI wordt gegeven in stokrepresentatie en HDP-2P wordt gegeven in lijnrepresentaties (diagram links) en moleculair oppervlak (diagram rechts). Voor de stokvoorstellingen staat smaragd voor koolstof, oranje voor fosfor, rood voor zuurstof en wit voor waterstof. Voor het moleculaire oppervlak en de lijnen staat groen voor koolstof, blauw voor stikstof, rood voor zuurstof, wit voor waterstof en geel voor zwavel. Gele onderbroken lijnen identificeren intermoleculaire bindingen. Pijlen wijzen naar aminozuurresiduen in het actieve centrum. Afkortingen: PI = Fosfatidylinositol; HDP-2P = basissubeenheid van addergiffosfolipase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 3: Interactie van PI-4-P met het actieve centrum van HDP-2P voorspeld voor bindingsplaats #1 door moleculaire dockingsoftware. PI-4-P wordt gegeven in stokrepresentatie en HDP-2P wordt gegeven in lijnen (diagram aan de linkerkant) en moleculair oppervlak (diagram aan de rechterkant) representaties. Voor de stokken staat smaragd voor koolstof, oranje voor fosfor, rood voor zuurstof en wit voor waterstof. Voor moleculair oppervlak en lijnen staat groen voor koolstof, blauw voor stikstof, rood voor zuurstof, wit voor waterstof en geel voor zwavel. Gele onderbroken lijnen identificeren intermoleculaire bindingen. Pijlen wijzen naar aminozuurresiduen in het actieve centrum. Afkortingen: PI-4-P = Fosfatidylinositol-4-fosfaat; HDP-2P = basissubeenheid van addergiffosfolipase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 4: Interactie van PI-4,5-P2 met het moleculaire oppervlak van HDP-2P voorspeld voor bindingsplaats #6 door moleculaire dockingsoftware. PI-4,5-P2 bindt zich aan een groefachtige grot onder het actieve centrum van HDP-2P. De vijf belangrijkste aminozuurresiduen in het actieve centrum worden gegeven in de drieletterige notatie. PI-4,5-P2 wordt gegeven in stokrepresentatie en HDP-2P wordt gegeven in lijnrepresentaties (diagram links) en moleculair oppervlak (diagram rechts). Voor de stokken staat smaragd voor koolstof, oranje voor fosfor, rood voor zuurstof en wit voor waterstof. Voor moleculair oppervlak en lijnen staat groen voor koolstof, blauw voor stikstof, rood voor zuurstof, wit voor waterstof en geel voor zwavel. Afkortingen: PI-4,5-P2 = Fosfatidylinositol-4,5-difosfaat; HDP-2P = basissubeenheid van addergiffosfolipase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 5: Hydrolytische activiteitscurven van monsters van liposomen bij verschillende HDP-2P/fosfolipide-molaire verhoudingen. Liposomen gemaakt van PC+CL (donkergroen), PC+PS (oranje), PC+PI (donkerblauw), PC+PI-4-P (blauw), PC+PI-4,5-P2 (groen) en PC (paars). De optische dichtheidswaarden in willekeurige eenheden vertegenwoordigen het gemiddelde van drievoud metingen bij 550 nm. Foutbalken geven de SD van de drievoudige metingen aan. De statistische significantie van de verschillen in optische dichtheidswaarden tussen de liposoommonsters werd beoordeeld met behulp van ANOVA, waarbij alle p-waarden ruim onder de 0,05 bleken te liggen. Afkortingen: PC = fosfatidylcholine; CL = cardiolipine van het runderhart ; PS = fosfatidylserine; PI = Fosfatidylinositol; PI-4-P = Fosfatidylinositol-4-fosfaat; PI-4,5-P2 = Fosfatidylinositol-4,5-difosfaat; a.u. = willekeurige eenheden; HDP-2P = basissubeenheid van addergiffosfolipase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 6: Absorptiespectra van waterige oplossingen van kopercomplexen. Kopercomplexen [Cu(H2O)6]2+ (oranje lijn) en [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (blauwe lijn), bestraald door zichtbaar licht in het bereik van 500 nm tot 900 nm. Kopercomplex [Cu(H,2, O)6]2+ werd gemaakt in een oplossing van 0,025 M CuSO4 , en kopercomplex [Cu(H,2O)2(NH3)4]2+ werd gemaakt in een oplossing van 0,025 M CuSO4, bevattende 0,100 M NH3. De absorptiewaarden in deze figuur voor elk gegevenspunt zijn het gemiddelde van de absorptiemetingen in drievoud. Foutbalken vertegenwoordigen de SD van de drievoudige metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 7: Membraanpermeabiliteitscurven van monsters van liposomen. Liposomen gemaakt van PC+CL (paars), PC+PS (blauw), PC+PI (donkerblauw), PC+PI-4-P (donkergroen), PC+PI-4,5-P2 (oranje) en PC (groen) in verschillende HDP-2P/fosfolipide molaire verhoudingen. Membraanpermeabiliteitswaarden worden uitgedrukt als optische dichtheidswaarden in willekeurige eenheden (a.u.) gemeten bij 600 nm. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van drievoudsmetingen. Foutbalken geven de SD van de drievoudige metingen aan. De statistische significantie van de verschillen in optische dichtheidswaarden tussen de liposoommonsters werd beoordeeld met behulp van ANOVA, waarbij alle p-waarden ruim onder de 0,05 bleken te liggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Voorspelde affiniteitsbindingsenergieën voor kandidaat-moleculaire complexen van HDP-2P met PI. Moleculaire modelleringssimulaties werden gebruikt om de soorten bindingen en bindingsplaatsaffiniteiten te voorspellen, evenals de geladen en polaire delen van zowel de fosfatidylinositolkopgroep als de HDP2P-aminozuurresiduen die deelnemen aan hun intermoleculaire interacties. De geladen en polaire groepen van fosfatidylinositol zijn gemarkeerd in figuur 1. Merk op dat Pb in NHpbδ+ een peptidebinding aangeeft. Afkortingen: PI = Fosfatidylinositol; HDP-2P = basissubeenheid van addergiffosfolipase. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Voorspelde affiniteitsbindingsenergieën voor kandidaat-moleculaire complexen van HDP-2P met PI-4-P. Moleculaire modelleringssimulaties werden gebruikt om de soorten bindingen en bindingsplaatsaffiniteiten te voorspellen, evenals de geladen en polaire delen van zowel de fosfatidyl-inositol-4-fosfaat (PI-4-P) kopgroep als de HDP2P-aminozuurresiduen die deelnemen aan hun intermoleculaire interacties. Merk op dat Pb in NHpbδ+ een peptidebinding aangeeft. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Moleculaire docking-workflow. Overzicht van de moleculaire dockingprocedure met behulp van AutoDock, inclusief ligandconstructie, receptorvoorbereiding, gridbox-opstelling en uitvoering van dockingsimulaties om PI-HDP-2P-interacties te voorspellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze studie hebben we onderzocht of fosfaatgroepen die covalent aan de inositolring in fosfatidylinositol (PI) zijn gebonden, de afbraak van fosfolipidemembranen door het enzym fosfolipase A2 (PLA2) kunnen voorkomen. Om de progressie van de afbraak van het fosfolipidemembraan veroorzaakt door de hydrolytische activiteit van PLA2 te beoordelen, hebben we een eenvoudige maar zeer gevoelige en nauwkeurige methode ontworpen om veranderingen in membraanpermeabiliteit te meten, die zouden moeten toenemen naarmate de structurele degradatie vordert.

De methode is gebaseerd op een ligandsubstitutiereactie waarbij het hexaaquakoper(II)-complex, [Cu(H2O)6]2+, gesuspendeerd is in de waterige omgeving buiten fosfolipide-liposomen, terwijl ammoniak (NH3) is ingekapseld in de liposomen. Ammoniak heeft een hogere affiniteit voor Cu2+ dan watermoleculen, maar NH3 moet door het liposomale membraan dringen om toegang te krijgen tot de externe waterige fase, waar het H2O-moleculen vervangt in [Cu(H2O)6]2+. Als de structurele integriteit van het liposomale membraan wordt aangetast als gevolg van PLA 2-gekatalyseerde fosfolipidehydrolyse, zal een verhoogde membraanpermeabiliteit tot NH3 ligandsubstitutie vergemakkelijken, wat leidt tot een kleurverandering van het lichtblauw van [Cu(H2O)6]2+ naar het donkerblauw van [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. We hebben deze transformatie kwantitatief gevolgd door spectrofotometrie te gebruiken om de verandering in optische dichtheid bij 600 nm vast te leggen.

We hebben eerder 1H-NMR met paramagnetisch ion ferrocyanide, [Fe(CN)6]3-, gebruikt om veranderingen in membraanpermeabiliteit te bestuderen die worden beïnvloed door HDP-2P24 en door cobragifcardiotoxinen 24,25,26,27,28,39. We hebben ook een reeks fluorescerende en fosforescerende sondes gebruikt om de effecten van cobragifcardiotoxinen op de permeabiliteit van liposomale membranen te bestuderen 20,23,40. Ferrocyanide en fluorescerende/fosforescerende sondes zijn echter grote niet-fysiologische moleculaire entiteiten die lipidemembranen binnendringen wanneer de integriteit van het membraan aanzienlijk wordt beschadigd. Daarentegen maakt onze nieuwe ligandsubstitutietest gebruik van NH₃ - een kleine, natuurlijke cellulaire metaboliet die in staat is om lipidemembranen te doordringen bij subtiele verstoringen van de lipidenverpakking. Deze verbeterde gevoeligheid van onze nieuwe membraanpermeabiliteitsmethode blijkt uit het vermogen om veranderingen in membraanpermeabiliteit te detecteren bij een HDP-2P/lipidemolaire verhouding van 0,001, vergeleken met 0,004 vereist voor ¹H-NMR/ferrocyanidedetectie23.

In dezelfde studie gebruikten we erythrosinefosforescentie-afschrikking door ferroceen om de effecten van HDP-2P op de intermembraanlipidenuitwisseling te onderzoeken, beoordeeld aan de hand van de verandering in de verhouding tussen de levensduur van erythrosine in testmonsters (τn) en die in het controlemonster (τ0)23. Bij een HDP-2P/lipide-molaire verhouding van 0,004 daalde de τn/τ0-waarde tot 0,423, wat wijst op een toestand van membraanvloeibaarheid die doorlaatbaar is voor tweewaardige kationen24. Onze op NH₃ gebaseerde ligandsubstitutietest detecteert dus membraanpermeabiliteit bij een HDP-2P/lipide-molaire verhouding van 0,001, terwijl conventionele testen (1H-NMR/ferrocyanide en fosforescentiesonde-quenching) membraanpermeabiliteit alleen detecteren bij een molaire verhouding van 0,004. Dit toont aan dat onze op NH3 gebaseerde test vier keer gevoeliger is dan conventionele testen.

De uitzonderlijke gevoeligheid van onze op NH3 gebaseerde test leverde permeabiliteitsgegevens op die nauw correleerden met hydrolytische activiteitsmetingen, met slechts één duidelijke discrepantie: PC+PI-4-P-liposomen vertoonden onbeduidende hydrolyse zonder veranderingen in de permeabiliteit, wat suggereert dat minimale lokale productie van lysofosfolipide/vetzuur geen invloed heeft op de globale lipidenverpakking, wat geen invloed heeft op de structurele integriteit en permeabiliteit van het membraan. Deze studie toonde dus aan dat de ligandsubstitutiereactie in een complex ionensysteem, waarbij een ligand betrokken was die was ingekapseld in het binnenste volume van liposomen, resultaten opleverde die uitstekend overeenkwamen met de hydrolytische activiteitsgegevens van HDP-2P. Deze bevindingen kwamen op hun beurt sterk overeen met in-silico-studies over de binding van PI en fosfoinosididen aan het moleculaire oppervlak van HDP-2P.

Over het algemeen onthulde de AutoDock-simulatie in de huidige studie dat PI op vier van de negen geïdentificeerde bindingsplaatsen aan het actieve centrum bindt, terwijl PI-4-P op slechts één van de negen voorspelde plaatsen aan het actieve centrum bindt. De hydrolytische activiteit van HDP-2P in PC+PI-4-P liposomen was ongeveer 5x lager dan in PC+PI liposomen. Bovendien voorspelden in-silico studies geen binding van PI-4,5-P2 aan het actieve centrum van HDP-2P. Consequent toonden PLA 2-activiteitstesten en ligandsubstitutiereactie-experimenten aan dat PI-4,5-P2 zowel de fosfolipidehydrolyse als de toename van de membraanpermeabiliteit volledig remde, terwijl PI-4-P minder, niet-significante hydrolytische activiteit vertoonde en veranderingen in de membraanpermeabiliteit volledig verhinderde. Deze waarnemingen komen goed overeen met in vitro activiteitsstudies van humane cytosolische, calciumonafhankelijke en uitgescheiden PLA2-enzymen in de richting van PI, PI-4-P en PI-4,5-P235. Deze studies toonden aan dat alleen Groep IVA cytosolisch PLA2 een relatief hoge katalytische activiteit vertoonde in de richting van PI en PI-4-P, terwijl de activiteit in de richting van PI-4,5-P2 nauwelijks detecteerbaar was. Alle andere geteste PLA2-enzymen vertoonden geen activiteit in de richting van PI-4,5-P235. Dit gebrek aan activiteit is toegeschreven aan de zeer hydrofiele fosfaatgroepen op de inositolring, die interfereren met productieve interacties tussen het membraanoppervlak en PLA2-enzymen 35. We suggereren dat de uitwendige uitbreiding van fosfaatgroepen op de inositolring in de oplossing en hun vermogen om ionpolaire en waterstofbruggen te vormen met residuen van de groefachtige holte van HDP-2P waarschijnlijk voorkomt dat HDP-2P het membraanoppervlak dicht genoeg nadert om zijn hydrolytische activiteit uit te oefenen, waardoor het membraan wordt gestabiliseerd en de afbraak van fosfolipidemembranen door HDP-2P wordt verminderd, wat schadelijk kan zijn voor cellen door celdoodroutes te activeren. Dit mechanisme lijkt aan te sluiten bij de potentiële beschermende rol van fosfoinositiden bij ziektetoestanden met afwijkende enzymactiviteit.

De sterke correlatie tussen de resultaten verkregen uit membraanpermeabiliteitstesten, hydrolytische activiteitsmetingen en in silico moleculaire dockingstudies benadrukt de betrouwbaarheid van de ligandsubstitutiereactiemethode. Deze benadering, waarbij gebruik wordt gemaakt van een ligand ingekapseld in liposomen, blijkt een nauwkeurig en effectief hulpmiddel te zijn voor het beoordelen van veranderingen in de membraanpermeabiliteit veroorzaakt door structurele verstoringen in de stabiele dubbellaagse organisatie van fosfolipiden. Hoewel we erkennen dat moleculaire dockingstudies met behulp van AutoDock die in dit artikel worden gepresenteerd, geen grondig begrip bieden van hoe fosfolipiden op een dynamische en longitudinale manier kunnen interageren met HDP-2P, moeten in de toekomst moleculaire dynamicastudies worden uitgevoerd om aanvullende moleculaire mechanismen te identificeren van hoe HDP-2 fosfolipidedubbellagen kan permeabiseren die zijn samengesteld uit verschillende fosfolipiden. Het is belangrijk op te merken dat het uitvoeren van moleculaire dynamica-studies veel rekenkracht vereist, zoals krachtige computers en clusters, die niet beschikbaar zijn bij veel academische instellingen die beperkte middelen en onderzoeksfinanciering hebben. Ten slotte erkennen we het gebruik van een stijve receptor (HDP-2P) in het huidige techniekendocument en het ontbreken van een oplosmiddel/membraanomgeving. We willen echter benadrukken dat het uitvoeren van moleculaire dockings van HDP-2P met verschillende fosfolipiden met behulp van een stijve receptor de conventionele benadering is om initiële dockingstudies uit te voeren om een eerste doorgang van gedockte kandidaat-structuren te identificeren die in de toekomst kunnen worden opgevolgd met een flexibele receptor zodra de kritische aminozuurresiduen in de katalytische zijde die aan substraten binden, zijn geïdentificeerd om zich te concentreren op moleculaire regio's die flexibel kunnen worden gemaakt in Volg moleculaire dockingstudies en in een opgeloste omgeving. Daarom kan het benutten van samenwerkingen met andere instellingen die over meer middelen beschikken, een manier zijn om enkele van de eerste bevindingen van AutoDock te bevestigen en aanvullende moleculaire mechanismen van substraat-enzyminteracties te identificeren.

Concluderend tonen de bevindingen van deze studie aan dat de ligandsubstitutiereactiemethode, waarbij gebruik wordt gemaakt van een ligand ingekapseld in liposomen, effectief kan worden toegepast op studies naar membraanpermeabiliteit in verschillende membraangemedieerde processen. Deze omvatten onder andere ligand-receptorinteracties, lipide-eiwitinteracties, intermembraanuitwisseling, membraanfusie en -splijting en neuromusculaire contracties. Bovendien heeft deze benadering een aanzienlijk potentieel voor het onderzoeken van membraneutrope geneesmiddelen. Tegelijkertijd erkennen we dat, hoewel nieuwe methoden in modelmembranen van onschatbare waarde zijn voor het ontleden van specifieke mechanismen van membraaninteracties, hun inherente vereenvoudigingen hun vermogen beperken om de structurele, compositorische en functionele complexiteit van biologische membranen in vivo volledig te repliceren. Het is daarom essentieel om gegevens uit modelsystemen met de nodige voorzichtigheid te interpreteren en bevindingen waar mogelijk te valideren met behulp van cellulaire of organismale modellen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De studies in dit artikel zijn ondersteund door de startsubsidie van de Beijing Chaoyang KaiWen Academy (E.S.G.) en door de SEPA Award, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). Het werk met betrekking tot de voorbereiding van HDP-2 werd ondersteund door een subsidie van de Russische Wetenschappelijke Stichting No. 24-15-00280 (Y.N.U.). De auteurs willen graag Dr. Maryam Barancheshmeh bedanken voor het schrijven van het script en het ontwikkelen van de video over de toepassing van moleculaire dockingsimulatie, die werd opgesteld na de publicatie van dit onderzoeksartikel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Basic subunit HDP-2P of V. nikolskii viper venom PLA2, HDP-2, 98.5% purity Institute of Bioorganic Chemistry, MoscowHDP-2 isolated according to potocol in PMID:18083205. HDP-2P purified from HDP-2 by DEAE Sephadex A-50  
Cardiolipin (Heart, Bovine) (sodium salt),>99%MacklinC916138
Coenzyme A, FUJIFILM Wako’s NEFA kit Lexington, MA, USA
Dialysis tubing cellulose membrane molecular weight cut-off 1.0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Shanghai, China 
Digitally controlled water-tank thermostat YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Beijing, China 
Electronic high precision analytical balance FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., China
JingHua 752 UV-Visible range spectrophotometer Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Shanghai, China
L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken),≥95%MacklinL799415
L-α-phosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt),≥99%MacklinL780292
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt),≥99%MacklinL996223
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), 99%MacklinL970250
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt),>99%MacklinL864755
Magnetic Stirrer JB-3 Shanghai Leici JB-3
pH Meter PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., China
TGL-16B microcentrifuge Shanghai 3 Anting Co., Shanghai, China
Ultrasonic Dispenser Yt-JY96-IIN Shanghai Yetuo technology Co., Ltd., China
Vacuum Pump TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, China

Referenties

  1. De Matteis, A., De Camilli, P. Phosphoinositides. Biochim Biophys Acta Lipids. 1851 (6), 697-918 (2015).
  2. Hokin, M. R., Hokin, L. E. Enzyme secretion and the incorporation of P32 into phospholipids of pancreas slices. J Biol Chem. 203 (2), 967-977 (1953).
  3. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Effects of acetylcholine on the turnover of phosphoryl units in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortex slices. Biochim Biophys Acta. 18, 102-110 (1955).
  4. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Phosphoinositides and protein secretion in pancreas slices. J Biol Chem. 233, 805-810 (1958).
  5. Lolicato, F., Nickel, W., Haucke, V., Ebner, M. Phosphoinositide switches in cell physiology: from molecular mechanisms to disease. J Biol Chem. 300, 105757(2024).
  6. Powis, G., et al. Pleckstrin homology (PH) domain, structure, mechanism, and contribution to human disease. Biomed Pharmacother. 165, 115024(2023).
  7. Burke, J. E., Triscott, J., Emerling, B. M., Hammond, G. R. V. Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease. Nat Rev Drug Discov. 22, 357-386 (2023).
  8. Palamiuc, L., Ravi, A., Emerling, B. M. Phosphoinositides in autophagy: current roles and future insights. FEBS J. 287, 222-238 (2020).
  9. Calvillo-Robledo, A., Cervantes-Villagrana, R. D., Morales, P., Marichal-Cancino, B. A. The oncogenic lysophosphatidylinositol (LPI)/GPR55 signaling. Life Sci. 301, 120596(2022).
  10. Madsen, R. R., Vanhaesebroeck, B. Cracking the context-specific PI3K signaling code. Sci Signal. 13, eaay2940(2020).
  11. Wills, R. C., Hammond, G. R. V. PI(4,5)P2: signaling the plasma membrane. Biochem J. 479, 2311-2325 (2022).
  12. Epand, R. M. Features of the phosphatidylinositol cycle and its role in signal transduction. J Membr Biol. 250, 353-366 (2017).
  13. De Craene, J. O., Bertazzi, D. L., Bär, S., Friant, S. Phosphoinositides, major actors in membrane trafficking and lipid signaling pathways. Int J Mol Sci. 18, E634(2017).
  14. Ivanova, A., Atakpa-Adaji, P. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and calcium at ER-PM junctions: complex interplay of simple messengers. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1870, 119475(2023).
  15. Premrajan, P., Abhithaj, J. A., Variyar, E. J. PLA2: implications in neurological disorders as a prospective therapeutic target. Phospholipases in Physiology and Pathology. 2, Academic Press. 139-158 (2023).
  16. André, S., et al. Modulation of cytosolic phospholipase A2 as a potential therapeutic strategy for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis Rep. 7 (1), 1395-1426 (2023).
  17. Trotter, A., et al. The role of phospholipase A2 in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Mult Scler Relat Disord. 27, 206-213 (2019).
  18. Schaloske, R. E., Dennis, E. A. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system. Biochim Biophys Acta. 1761 (11), 1246-1259 (2006).
  19. Petrovic, U., et al. Ammodytoxin, a neurotoxic secreted phospholipase A2 can act in the cytosol of the nerve cell. Biochem Biophys Res Commun. 324 (3), 981-985 (2004).
  20. Gasanov, S. E., Dagda, R. K., Rael, E. D. Snake venom cytotoxins, phospholipase A2s, and Zn-dependent metalloproteinases: mechanisms of action and pharmacological relevance. J Clin Toxicol. 4 (1), 1000181(2014).
  21. Harris, J. B., Scott-Davey, T. Secreted phospholipases A2 of snake venoms: effects on the peripheral neuromuscular system with comments on the role of phospholipases A2 in disorders of the CNS and their uses in industry. Toxins (Basel). 5 (12), 2533-2571 (2013).
  22. Ramazanova, A. S., et al. Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2: the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. 51 (4), 524-537 (2008).
  23. Chaudary, A. S., et al. Sphingomyelin inhibits hydrolytic activity of heterodimeric PLA2 in model myelin membranes: pharmacological relevance. J Membr Biol. 258, 29-46 (2025).
  24. Li, M., Gasanoff, S. E. Cationic proteins rich in lysine residue trigger formation of non-bilayer lipid phases in model and biological membranes: biophysical methods of study. J Membr Biol. 256 (4-6), 373-391 (2023).
  25. Gasanoff, E. S., Dagda, R. K. Cobra venom cytotoxins as a tool for probing mechanisms of mitochondrial energetics and understanding mitochondrial membrane structure. Toxins. 16, 287(2024).
  26. Li, F., Shrivastava, I. H., Hanlon, P., Dagda, R. K., Gasanoff, E. S. Molecular mechanism by which cobra venom cardiotoxins interact with the outer mitochondrial membrane. Toxins. 12 (7), 425(2020).
  27. Zhang, B., et al. Naja mosambica mossambica cobra cardiotoxin targets mitochondria to disrupt mitochondrial membrane structure and function. Toxins. 11, 152(2019).
  28. Gasanov, S. E., et al. Naja naja oxiana cobra venom cytotoxins CTI and CTII disrupt mitochondrial membrane integrity: implications for basic three-fingered cytotoxins. PLoS One. 10 (6), 1-28 (2015).
  29. Akosah, Y., Yang, J., Pavlov, E. Inorganic polyphosphate and ion transport across biological membranes. Biochem Soc Trans. 52 (2), 671-679 (2024).
  30. Weast, R. C. CRC Handbook of Chemistry and Physics. , 62nd ed, CRC Press. (1982).
  31. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M. Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem J. 350 (Pt 1), 1-18 (2000).
  32. Ford, M. G., et al. Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin. Nature. 419 (6905), 361-366 (2002).
  33. Khan, S. A., Ilies, M. A. The phospholipase A2 superfamily: structure, isozymes, catalysis, physiologic and pathologic roles. Int J Mol Sci. 24 (2), 1353(2023).
  34. De Oliveira, A. L. N., Lacerda, M. T., Ramos, M. J., Pedro, A. F. Viper venom phospholipase A2 database: the structural and functional anatomy of a primary toxin in envenomation. Toxins. 16 (2), 71(2024).
  35. Hayashi, D., Dennis, E. A. Differentiating human phospholipase A2's activity toward phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate and phosphatidylinositol bisphosphate. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1869, 159527(2024).
  36. Alekseeva, A. S., et al. Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer. Toxicon. 133, 169-179 (2017).
  37. Burke, J. E., Dennis, E. A. Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling. J Lipid Res. 50, S237-S242 (2009).
  38. Dennis, E. A., et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chem Rev. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  39. Gasanov, S. E., Kim, A. A., Yaguzhinski, L. S., Dagda, R. K. Non-bilayer structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1860, 586-599 (2018).
  40. Aripov, T. F., Gasanov, S. E., Salakhutdinov, B. A., Rozenshtein, I. A., Kamaev, F. G. Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen Physiol Biophys. 8, 459-474 (1989).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Liposoompermeabiliteitfosfatidylinositolfosfatenfosfolipase activiteitmoleculaire modelleringliposoomhydrolysefosfatidylcholine liposomeninositolfosfaatgroepenmembraanbescherming
Een liposoommembraanpermeabiliteitstest voor het onderzoeken van de effecten van fosfatidylinositolfosfaatgroepen op de membraneutrope werking van gif PLA2
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.