Mogelijke rol van de PGE 2-EP4-CA2+ signaalas bij posttraumatische artrose

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om systematisch de opstellings- en evaluatiemethoden van artrose-rattenmodellen te schetsen, door middel van vergelijking, en wetenschappelijk bewijs te leveren voor de verschillende pathogenese tussen acuut mechanisch letsel geïnduceerd en chronisch metabole/omgevingsfactor-geïnduceerde artrose. Het ACLT-model is de belangrijkste focus, met de nadruk op veranderingen in de EP4-Ca²⁺-mitochondriale disfunctie-signaleringsroute.

Samenvatting

Posttraumatische artrose (PTOA) is een degeneratieve gewrichtsaandoening die wordt veroorzaakt door trauma of intense mechanische stress, wat leidt tot degeneratie van gewrichtskraakbeen en functionele beperkingen. Prostaglandine E2 (PGE₂) draagt aanzienlijk bij aan de afbraak van kraakbeen na mechanisch letsel door de receptor, prostaglandine E-receptor 4 (EP4), op chondrocytmembranen te activeren. De homeostase van gewrichtskraakbeen berust voornamelijk op de dynamische balans tussen afbraak en herstel van kraakbeen, een proces dat fijn wordt gereguleerd door chondrocyten. Het is aangetoond dat de Ca²⁺/Calmoduline-afhankelijke Proteïnekinase II (CAMKII)-signaleringsroute een cruciale rol speelt bij het mediëren van het herstel van de chondrocytenfunctie. In deze studie zagen we een verhoogde expressie van EP4, inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptor (IP3R) en gefosforyleerd CaMKII in interleukine-1 bèta (IL-1β) gestimuleerde chondrocyten, wat een mogelijk verband suggereert tussen EP4-signalering en calciumontregeling. Er is echter nog geen direct bewijs dat de betrokkenheid van de EP4-Ca²⁺/CaMKII-as bij PTOA bevestigt. Verder onderzoek met behulp van genetische of farmacologische interventies is nodig om dit potentiële mechanisme te verduidelijken. Deze bevindingen vormen een voorlopige basis voor het onderzoeken van calciumhomeostase en EP4-signalering als doelen voor PTOA-behandeling.

Inleiding

Hoewel fysieke activiteit op grote schaal wordt gepromoot vanwege de gezondheidsvoordelen, blijft het een belangrijke oorzaak van musculoskeletale letsels aan de onderste ledematen, wat tot verschillende nadelige gevolgen kan leiden¹. Onder deze is PTOA een toenemende last geworden voor adolescenten en jonge volwassenen die op jonge leeftijd gewrichtsblessures ervaren². Alarmerend is dat ongeveer 48-52% van de personen die sportgerelateerde gewrichtsblessures oplopen, PTOA ontwikkelt binnen 11-17 jaar ^3,4. Het kniegewricht, een van de meest voorkomende geblesseerde gewrichten bij jeugdsport en recreatieve activiteiten, is bijzonder kwetsbaar bij de overgang van gewrichtsblessure naar PTOA. Een prospectieve studie meldde dat personen met knieblessures 12-20 jaar na het letsel een 10-voudig hoger risico hebben op het ontwikkelen van radiografisch bevestigde knieartrose in vergelijking met niet-gewonde personen⁵. Bovendien hebben radiografische evaluaties bij jonge volwassenen aangetoond dat vrouwelijke voetballers met blessures aan de voorste kruisbanddoorsnede (ACLT) een risico van 51% hebben om PTOA te ontwikkelen binnen 12 jaar, terwijl mannelijke spelers een risico van 41% hebben binnen 14 jaar⁵. Deze bevindingen benadrukken de negatieve impact op de lange termijn van sportgerelateerde gewrichtsblessures op de gezondheid van het bewegingsapparaat. Daarom is het begrijpen van de onomkeerbare pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van PTOA cruciaal voor het identificeren van geschikte interventiestrategieën die gericht zijn op het verminderen van ziekteprogressie.

Vroege ontregeling van de homeostase van Ca²⁺ is een van de belangrijkste indicatoren voor PTOA-initiatie⁶. Ca²⁺ bindt zich aan calmoduline (CaM) om een Ca²⁺/CaM-complex te vormen dat kan interageren met CaMKII, waardoor de autoremmende conformatie wordt verlicht en de kinase-activiteit wordt gereguleerd⁷. Bij zowel humane als muriene artrose is de expressie van gefosforyleerd CaMKII (de geactiveerde vorm van CaMKII) verhoogd, terwijl het gebruik van CaMKII-remmers deze verhoging van fosforyleringsniveaus blokkeert, wat leidt tot vernietiging van gewrichtskraakbeen⁸, wat de belangrijke regulerende rol van Ca²⁺/CaMKII bij het mediëren van artrosecarlegagehomeostase aantoont. Normaal gesproken worden deze veranderingen cruciaal beïnvloed door de activering van ontstekingsmechanismen bij de ontwikkeling van PTOA. Hoge niveaus van PGE₂, als een belangrijke pro-inflammatoire pijnmediator, beïnvloeden de progressie van artrose door de EP4-receptor te activeren. In het bijzonder verbetert voorwaardelijke knock-out van EP4 in gewrichtskraakbeen de vorming van kraakbeen en het anabole metabolisme, terwijl hypertrofie en katabolisme van chondrocyten worden geremd, waardoor de regeneratie van stabiel, rijp gewrichtskraakbeen in plaats van fibrokraakbeen wordt bevorderd en gewrichtspijn wordt verlicht⁹. Gezien de cruciale rol van de Ca²⁺/CaMKII-signaleringsroute in de fysiologie van chondrocyten en de erkende betrokkenheid van de EP4-receptor bij de progressie van artrose, was deze studie gericht op het onderzoeken of EP4-activering geassocieerd is met veranderingen in calciumsignalering en mitochondriale disfunctie tijdens PTOA-ontwikkeling. Hoewel het oorzakelijk verband tussen EP4 en Ca²⁺-ontregeling nog moet worden vastgesteld, suggereren de gegevens hier een mogelijk mechanistisch verband dat verder onderzoek rechtvaardigt.

Deze studie richt zich op de mogelijke mechanismen die EP4-receptoractivering koppelen aan Ca²⁺-signalering en mitochondriale disfunctie tijdens PTOA-ontwikkeling. Vergeleken met traditionele diagnostische methoden, zoals beeldvormingstechnieken die PTOA-progressie detecteren, en huidige therapeutische benaderingen, zoals niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) voor symptoomverlichting, is onze aanpak gericht op het onthullen van vroege intracellulaire signaleringsstoornissen in de pathogenese van PTOA. Dit mechanistische inzicht biedt een nauwkeuriger inzicht in het begin en de progressie van de ziekte en biedt nieuwe wegen voor vroege diagnose en gerichte interventies. Daarom heeft deze studie een PTOA-rattenmodel opgesteld dat wordt geïnduceerd door transsectie van de voorste kruisband (ACLT) om mechanische verwondingen na te bootsen die vaak worden gezien bij atleten met verminderde motorische controle tijdens acute of chronische fysieke activiteit. Dit model dient als een optimale weergave van posttraumatische mechanische gewrichtsschade en biedt een reproduceerbaar platform om zowel histopathologische veranderingen als onderliggende moleculaire mechanismen te onderzoeken. Een vetrijk dieet plus blootstelling aan een vochtige omgeving (FD) dient als een positieve controle, met als doel metabole en omgevingsrisicofactoren die verband houden met chronische artrose te simuleren. De eerste modelleert acuut letsel veroorzaakt door mechanisch trauma, terwijl de laatste een natuurlijk voorkomend ziektemodel vertegenwoordigt dat wordt veroorzaakt door stofwisselingsstoornissen en omgevingsfactoren, hoewel de uiteindelijke pathogenese in deze groep mogelijk niet de EP4-Ca²-mitochondriale as volgt.

Protocol

Alle experimentele procedures met dieren werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (ethisch goedkeuringsnummer: 2024014-2). Het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften voor het ethisch gebruik van proefdieren die zijn opgesteld door de Staatsraad van de Volksrepubliek China.

1. Dieren

1. Gebruik Sprague-Dawley (SD) gekruiste SPF-ratten om mogelijke verstorende effecten die verband houden met de oestrische cyclus te verminderen. Selecteer in totaal negen mannelijke SD-ratten van 4 weken oud en met een gewicht tussen 90 g en 100 g voor dit experiment.
   OPMERKING: Deze ratten zijn afkomstig van een erkende leverancier van proefdieren in China (certificaatnummer: 20240410Aazz0619000774).
2. Houd alle dieren in een specifieke pathogeenvrije (SPF) omgeving. Zorg voor een gecontroleerde omgeving bij een temperatuur van 24 ± 2 °C met een gemiddelde luchtvochtigheid van 60 ± 1% en een licht/donkercyclus van 12 uur.
3. Zorg ervoor dat de ratten vrije toegang hebben tot verzuurd water en een standaard knaagdiervoerdieet.

2. Constructie en interventie van diermodellen

1. Acclimatiseer de ratten gedurende een periode van 2 weken in het voedercentrum. Wijs de ratten willekeurig toe in drie groepen op een leeftijd van 6 weken: controlegroep, PTOA-groep en FD-groep, met drie ratten in elke groep.
2. Onderhoud de controlegroep onder standaardomstandigheden.
3. Verdoof de PTOA-groep met isofluraan (4% voor inductie en 1%-2% voor onderhoud).
4. Leg de bilaterale kniegewrichten operatief bloot via een longitudinale incisie in de huid met behulp van een mediale parapatellaire benadering.
5. Voer ACLT uit met een scalpel en bevestig volledige transsectie door een positieve anterieure ladetest uit te voeren.
   OPMERKING: Bilaterale ACL-transsectie werd uitgevoerd om de consistentie van het model te garanderen en de individuele variabiliteit te verminderen. Gegevens van beide knieën werden gemiddeld om één waarde per dier voor analyse te verkrijgen.
6. Breng ratten in de FD-groepen periodiek over naar een geklimatiseerde kamer, die zich in dezelfde faciliteit bevindt. Onderwerp deze ratten aan een vetrijk dieet.
   OPMERKING: Het vetrijke dieet bevatte 20% sucrose, 15% reuzel, 1,2% cholesterol, 0,2% natriumcholaat, 10% caseïne, 0,6% calciumwaterstoffosfaat, 0,4% kalksteenpoeder, 0,4% premix en 52,2% basaal voer. Het voedingsprofiel van het controlevoer was als volgt: 19% eiwit, 31% vet en 50% koolhydraten, met een calorische verhouding van 17% eiwit, 37% vet en 46% koolhydraten.
7. Houd de omgevingscondities in de klimaatkast op een temperatuur van 24 ± 2 °C, een luchtvochtigheid van 90 ± 4% en een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur.
   OPMERKING: Vanwege het verhoogde risico op bacteriegroei in een omgeving met zo'n hoge temperatuur en hoge luchtvochtigheid, steriliseert u drinkwater en voedsel en vult u ze dagelijks aan om besmetting tot een minimum te beperken. De totale duur van de experimentele interventie was 12 weken.

3. Loopanalyse (voetafdrukken)

1. Voer 12 weken na de start van de behandeling een voetafdrukanalyse uit bij de modelratten, met behulp van een eerder beschreven methode¹⁰.
2. Smeer de buikoppervlakken van de achterpoten van de ratten in met rode inkt en ze mochten over een pad van 100 cm lang en 8 cm breed lopen, dat was bedekt met wit papier.
3. Om de ratten aan te moedigen om te bewegen, plaats je een donkere kamer aan het einde van het pad om voorwaartse beweging aan te moedigen.
4. Voer drie opeenvolgende metingen uit om gemiddelde waarden te verkrijgen voor elke parameter, inclusief paslengte en staplengte, die werden gebruikt om onregelmatigheden te beoordelen.
5. Bepaal de paslengte (cm) door de afstand te meten die dezelfde achterpoot heeft afgelegd tussen twee opeenvolgende stappen.
6. Definieer de staplengte (cm) als de horizontale afstand tussen de linker- en rechterachterpoten.
7. Meet de hoek van de poot (°) als de hoek tussen de tweede teen en de calcaneus, ten opzichte van een horizontale lijn¹¹.
8. Meet de paslengte, staplengte en poothoek rechtstreeks op de gescande voetafdrukafbeeldingen met behulp van Image-Pro Plus-software (versie 6.0), met behulp van de ingebouwde tools voor afstands- en hoekmeting.
   OPMERKING: Deze loopparameters zijn cruciaal voor het identificeren van subtiele functionele beperkingen in de vroege stadia van artrose. Patiënten kunnen een verminderde pas- en staplengte vertonen om pijnlijke gewrichten te beschermen, terwijl een grotere teenuitvalhoek en loopasymmetrie vaak optreden als compenserende reacties op gewrichtsinstabiliteit veroorzaakt door pijn.

4. Meting van de gezamenlijke diameter

1. Meet de gewrichtsdiameter met behulp van een gekalibreerde spiraalmicrometer (mm) na het modelleren in elke groep.
   OPMERKING: Naarmate artrose vordert, vertonen patiënten doorgaans zwelling en pijn van de gewrichten. Een hogere mate van zwelling kan duiden op een ernstiger stadium van de ziekte.

5. Meting van de grijpkracht

1. Meet de grijpkracht van de achterpoot met behulp van een digitale grijpkrachtmeter uitgerust met een tractierooster, krachtmeter uitgerust met een tractierooster (90 mm × 90 mm).
   1. Houd de rat voorzichtig vast bij de staart en de huid op de achterkant van de nek.
   2. Laat het dier zakken totdat zijn achterpoten het rooster stevig vastpakken en trek het dier dan gestaag horizontaal langs de as van de krachtsensor totdat het zijn greep loslaat.
   3. Herhaal de test drie keer per dier. Noteer de hoogste waarde als maximale grijpkracht.
      OPMERKING: Immobiliseer tijdens het testen van de grijpkracht van de achterpoten de voorpoten door ze op een kartonnen oppervlak te plakken om te voorkomen dat de voorpoten per ongeluk in het tractierooster terechtkomen. Verminderde grijpkracht is een indicatie van een verminderde spierfunctie en mogelijke pijngerelateerde motorische stoornissen die verband houden met progressie van artrose.

6. Isolatie en cultuur van primaire chondrocyten

1. Isoleer primaire chondrocyten van 6 weken oude mannelijke Sprague-Dawley-ratten.
2. Ontleed de heupkoppen en tibiale plateaus om ongeveer 100-150 mg kraakbeenweefsel te verzamelen.
3. Was de tissue twee keer met PBS met 1% penicilline-streptomycine.
4. Verwerk het kraakbeen in 5 ml 0,25% trypsine-EDTA bij 3 °C gedurende 30 min.
5. Snijd het kraakbeen in³ stukken van 1-2 mm en verteer verder in 10 ml 0,2% collagenase II bij 37 °C gedurende 4 uur op een shaker met constante temperatuur.
6. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 μm, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g en gooi het bovenstaande weg.
7. Resuspendeer de celpellet in DMEM/F12-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
8. Incubeer de cellen bij 3 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ .

7. Celbehandeling

1. Tel de geïsoleerde chondrocyten met behulp van een hemocytometer.
2. Zaai de chondrocyten in platen met 6 putjes met een dichtheid van 2 × 10⁵ cellen per putje in 0,1 ml compleet kweekmedium (DMEM/F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine).
3. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een 5% CO₂-incubator om hechting mogelijk te maken.
4. Om een in vitro inflammatoir PTOA-model op te zetten, behandelt u adherente chondrocyten met IL-1β (10 ng/ml) gedurende 48 uur zodra de celsamenvloeiing ongeveer 80% bereikt.
5. Los voor de positieve FD-controle palmitinezuur (PA, CAS-nr. 57-11-4) in chloroform op in een verdunning van 1:1000 tot een stockoplossing van 500 μM.
   1. Wanneer de celsamenvloeiing ongeveer 80% heeft bereikt, voegt u 1 μL PA-voorraadoplossing per 1 ml kweekmedium toe om een uiteindelijke PA-concentratie van 500 nM te bereiken. Behandel chondrocyten met deze oplossing gedurende 48 uur.
6. Voeg 1 μL chloroform (voertuigbesturing) per 1 ml kweekmedium toe om cellen zonder PA te controleren.

8. Monsterverzameling, ontkalking en voorbereiding van de inbedding

1. Euthanaseer dieren 12 weken na de interventie door inhalatie van een overdosis isofluraan (≥5%) in een afgesloten kamer gedurende ten minste 5 minuten, en bevestig dat de ademhaling en hartslag volledig zijn gestopt.
   LET OP: Deze methode is goedgekeurd door de Dierethische Commissie en voldoet aan de landelijke richtlijnen voor humane euthanasie van proefdieren.
2. Verzamel beide kniegewrichten van drie ratten per groep (n = 3, totaal = 6 knieën) voor histologische evaluatie.
3. Fixeer monsters in 4% paraformaldehyde (PFA) in een weefsel/fixatieve volumeverhouding van meer dan 1:20 gedurende meer dan 48 uur op een shaker bij °C.
4. Spoel tissues 1-2 uur af onder stromend kraanwater om achtergebleven fixeermiddel te verwijderen.
5. Ontkalk weefsels in 0,5 M EDTA-oplossing (pH 7,4, ~15%) in een weefsel-tot-oplossingsverhouding van 1:20 gedurende 21 dagen bij 3 °C en vervang ze om de 3 dagen door een verse oplossing.
6. Beoordeel de voltooiing van de ontkalking door het bot met een naald te onderzoeken om het zacht te maken.
7. Was ontkalkte tissues gedurende 2 uur onder stromend kraanwater en plaats ze in inbeddingscassettes.
8. Dehydrateer de monsters door middel van een gegradueerde ethanolreeks: 75% ethanol gedurende 2 uur (of 's nachts), 80% ethanol gedurende 2 uur, 95% ethanol gedurende 0,5 uur en absolute ethanol tweemaal gedurende 60 minuten. Dompel vervolgens 20 minuten onder in 1:1 xyleen:ethanol.
9. Helder weefsel in xyleen twee keer (10 minuten en 60 minuten).
10. Infiltreer weefsels met paraffine in de volgende volgorde: xyleen:paraffine (1:1) gedurende 15 min, zachte paraffine bij 52-5 °C gedurende 1 uur (tweemaal), daarna harde paraffine bij 56-5 °C gedurende 30 min.
11. Veranker weefsels met behulp van een paraffine-inbeddingssysteem (bijv. Leica, ingesteld op 6 °C) en breng de blokken gedurende 2 uur over op een koude plaat van -2 °C.
12. Snijd paraffineblokken sagitaal met een dikte van μm door met behulp van een microtoom.
13. Drijflinten in een waterbad van 4 °C en monteer ze op schone glazen geleiders.
14. Droog de gemonteerde delen aan de lucht en bak ze 2 uur in een oven van 60 °C om achtergebleven paraffine te verwijderen.
15. Deparaffiniseer secties door achtereenvolgens onder te dompelen in xyleen (10 min), vers xyleen (10 min), absolute ethanol (5 min), verse absolute ethanol (5 min), 90% ethanol (5 min) en 75% ethanol (5 min), en spoel vervolgens af met kraanwater voordat u gaat kleuren.

9. Hematoxyline en eosine (HE) kleuring

1. Dompel gedeparaffiniseerde en gerehydrateerde weefselsecties onder en werd ondergedompeld in 0,5% hematoxylinekleuringsoplossing gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur (RT; ~2 °C), gevolgd door grondig spoelen onder stromend kraanwater.
2. Behandel secties kort met hematoxylinedifferentiatieoplossing gedurende 2-5 s en spoel af onder stromend kraanwater.
3. Voer het blauwen uit door secties 2-5 s onder te dompelen in hematoxyline-blauwoplossing, gevolgd door spoelen.
4. Dehydrateer de secties in 85% en 95% ethanol gedurende elk 5 minuten en kleur vervolgens gedurende 5 minuten in 0,05% eosine Y (alcoholisch).
5. Dehydrateer tweemaal in absolute ethanol (elk 5 min), vervolgens helder in xyleen (5 min), gevolgd door vers xyleen (5 min).
6. Monteer secties met neutrale balsem en dek af met een dekglaasje.
   OPMERKING: In goed bewaard gebleven kraakbeen kleurt hematoxyline de kern blauw en eosine de matrix roze. Beschadigd kraakbeen vertoont verlies van chondrocyten, fibrillatie en ongeorganiseerde matrix.

10. Safranine O - snelle groene (SOFG) kleuring

1. Kleur secties met 2% Fast Green-oplossing gedurende 1-5 minuten bij RT. Spoel onder stromend kraanwater tot het kraakbeen kleurloos wordt.
2. Differentieer kort secties in 1% zoutzuur gedurende 10-15 s en spoel vervolgens grondig af met stromend water.
3. Kleur de coupes 5-10 s met 0,2% Safranin O-oplossing en dehydrateer vervolgens snel door vier veranderingen van absolute ethanol (elk 3-5 s).
4. Heldere secties in xyleen (5 min), gevolgd door vers xyleen (5 min).
5. Monteer dia's met neutrale balsem en dek af met een dekglaasje.
   OPMERKING: Safranin O kleurt kraakbeenproteoglycanen rood, terwijl Fast Green bot-/vezelige weefsels groen kleurt. Verlies van rood duidt op uitputting en degeneratie van proteoglycanen.
6. Evalueer histologische veranderingen met behulp van het scoresysteem van de Osteoarthritis Research Society International (OARSI). Meet de breedte van de gewrichtsruimte en de dikte van het kraakbeen om structurele degeneratie te beoordelen. Leg beelden vast onder een lichtmicroscoop (bijv. ECLIPSE Ti2-E) op 4× (schaalbalk = 50 μm) en 20x (schaalbalk = 10 μm).
   OPMERKING: Gebruik de beeldvormingssoftware van het systeem voor het vastleggen van beelden en ImageJ (v1.48v) voor analyse. Kalibreer beelden via Analyze > Set Scale met een micrometer. Kwantificeer voor elk gewricht vijf willekeurige velden uit drie sagittale secties met behulp van geblindeerde analyse door drie onafhankelijke waarnemers.

11. Micro-μ CT

1. Ontleed de kniegewrichten van ratten 12 weken na de interventie en fixeer ze onmiddellijk in 4% paraformaldehyde bij RT gedurende 24 uur om de weefselmorfologie te behouden.
2. Spoel de vaste monsters af met PBS en bewaar ze tot het scannen in 70% ethanol.
3. Monteer elk kniegewrichtmonster op een speciale monsterhouder voordat u gaat scannen. Lijn het gewricht uit langs de lange as om bewegingsartefacten te minimaliseren.
4. Voer micro-μCT-scans uit met behulp van een micro-μCT-systeem met de volgende scanparameters: röntgenspanning 70 kV, stroom 100 μA en vermogen 7 W.
5. Verkrijg vier frames per projectie en stapel ze om de beeldkwaliteit te verbeteren, met een rotatiestapgrootte van 0,72°, waarmee een volledige rotatie van 360° wordt voltooid.
6. Stel de resulterende voxelgrootte (plakdikte) in op 15 μm en krijg beelden met een hoge resolutie die geschikt zijn voor trabeculaire botanalyse.
7. Definieer het interessegebied (ROI) tussen de proximale tibiale groeischijf en het tibiaplateau, met de nadruk op het subchondrale bot van zowel het dijbeen als het scheenbeen.
8. Reconstrueer de onbewerkte scangegevens in dwarsdoorsnedebeelden met behulp van reconstructiesoftware.
9. Importeer de gereconstrueerde beeldstapels in een geschikte software voor kwantitatieve morfometrische analyse.
10. Beoordeel de belangrijkste parameters, waaronder botvolumefractie (BV/TV, %), botmineraaldichtheid (BMD, g/cm³) en trabeculaire scheiding (Tb.Sp, mm).
11. Gebruik voor kwalitatieve en driedimensionale visualisatie 3D-visualisatiesoftware om volumetrische weergaven van botmicroarchitectuur te genereren.
12. Voer een visuele evaluatie uit om de structurele integriteit en morfologische veranderingen te bevestigen die in de kwantitatieve gegevens zijn waargenomen.
    OPMERKING: Alle beeldverwerking en -analyse werden uitgevoerd door geblindeerde operators om onbevooroordeelde resultaten te garanderen.

12. Elisa

1. Verdoving de ratten 12 weken na de interventie. Leg de abdominale aorta voorzichtig bloot en ontleed deze om bloedmonsters te verzamelen.
2. Laat het afgenomen bloed 30 minuten stollen bij RT en centrifugeer het vervolgens bij 755 × g (overeenkomend met 3000 tpm, met behulp van een centrifuge met een rotorstraal van 7,5 cm) bij °C gedurende 15 min.
3. Scheid en bewaar het serum voor latere meting van PGE₂-spiegels met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-kit.
4. Zaai tegelijkertijd primaire chondrocyten en kweek ze gedurende 24 uur, gevolgd door behandeling met IL-1β en PA gedurende 48 uur, volgens het vastgestelde celbehandelingsprotocol. Verzamel en analyseer na de interventie de kweeksupernatanten op PGE₂-concentratie met behulp van dezelfde ELISA-kit.

13. Kwantitatieve RT-PCR

1. Extraheer totaal RNA uit celmonsters met behulp van commercieel RNA-extractiereagens (TRIzol).
2. Synthetiseer cDNA met behulp van een Reverse Transcription Kit (met gDNA Remover) en bewaar het resulterende cDNA bij -8 °C voor latere analyse.
3. Voer kwantitatieve PCR uit met behulp van SYBR Green en bereken de relatieve expressieniveaus met behulp van de 2−ΔΔCt-methode.
   OPMERKING: De gebruikte primersequenties waren als volgt: β-actine vooruit: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-actine omgekeerd: CTGACCCATACCCACCATCAC; EP4 vooruit: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 vooruit: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; COX-2 vooruit: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 omgekeerd: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Analyse van Western blotting

1. Lyseer de cellen met RIPA buffer op ijs gedurende 30 min.
2. Scheid de eiwitmonsters gedurende 90 minuten met SDS-PAGE en breng ze vervolgens gedurende 2 uur over op nitrocellulosemembranen.
3. Blokkeer de membranen met 5% BSA en was ze met een fosfaatgebufferde oplossing.
4. Voer immunoblotting uit met behulp van specifieke antilichamen.
   OPMERKING: De antilichamen en hun respectievelijke verdunningen waren als volgt: anti-MMP9 (1:1000), anti-collageen II (1:1000), anti-COX2 (1:1000), anti-CaMKII (1:1000), anti-p-CaMKII (1:1000), anti-IP3R (1:1000), anti-Cyt-C (1:1000) en anti-β-actine (1:2000).
5. Na een nacht incubatie met primaire antilichamen, wast u de vliezen met TBST en incubeert u gedurende 1 uur met secundaire antilichamen: muis-HRP (1:2000) of konijn-HRP (1:2000) in het donker.
6. Voer na een nieuwe wasbeurt met TBST eiwitdetectie uit met behulp van een verbeterde chemiluminescentiekit.
7. Analyseer de gegevens met ImageJ software (versie 1.48v).

15. Immunofluorescentie kleuring

1. Kweek chondrocyten op dekglaasjes in platen met 12 putjes totdat ze 80% samenvloeiing bereikten.
2. Na behandeling met IL-1β en PA gedurende 48 uur, of geen behandeling als controle, fixeert u de cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij RT.
3. Permeabiliseer de cellen met PBS met 0,2% Triton X-100 gedurende 15 minuten.
4. Was de cellen driemaal met PBS (elk 5 minuten) en incubeer ze vervolgens een nacht met primair antilichaam (anti-IP3R, verdunning 1:200) in antilichaamverdunningsbuffer bij °C.
5. Stel de cellen gedurende 1 uur bloot aan een verdunning van 1:500 van fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld geitenanti-konijn IgG secundair antilichaam.
6. Bestkleur de cellen met 5 μg/ml DAPI-oplossing gedurende 10 minuten.
   OPMERKING: Fluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een 40x objectieflens (schaalbalk = 2 μm). Alle beelden werden verwerkt met ZEN-software en gekwantificeerd met ImageJ (versie 1.48v), volgens consistente kalibratieprocedures.

16. Statistische analyse

1. Voer statistische analyses uit met behulp van GraphPad Prism (versie 8.0.2).
2. Alvorens parametrische tests toe te passen, evalueert u de gegevens op normale verdeling met behulp van de Shapiro-Wilk-test en op homogeniteit van variantie met behulp van de Brown-Forsythe- en Bartlett's-tests.
3. Gebruik eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest voor vergelijkingen tussen meerdere groepen, en pas een tweezijdige ongepaarde Student's t-test toe voor vergelijkingen met twee groepen.
4. Beschouw een P-waarde van minder dan 0,05 als statistisch significant.
5. Presenteer alle gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van ten minste drie onafhankelijke experimenten.

Resultaten

ACLT-geïnduceerde PTOA vertoont voortijdige kraakbeenvernietiging en gedragsstoornissen ten opzichte van FD-geïnduceerde chronische KOA (Figuur 2 en Figuur 3)
Vernauwing van de gewrichtsruimte en kraakbeendegeneratie zijn de primaire resultaten van artrose. Eerdere studies hebben overgewicht en omgevingsfactoren (bijv. vochtig klimaat) geïdentificeerd als mogelijke bijdragen ...

Discussie

Vergeleken met chronische artrose veroorzaakt door omgevings- en voedingsfactoren, leidt ACLT-geïnduceerd gewrichtstrauma tot een snellere progressie van de ziekte. Onze resultaten, gebaseerd op gedragsbeoordelingen, waaronder gewrichtszwelling, grijpkracht van de achterpoten en loopanalyse, onthulden significante verschillen tussen de controlegroep, de PTOA-groep en de positieve controlegroep geïnduceerd door omgevings- en voedingsfactoren. Na 12 weken interventie werd in de PTOA-groep ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2% Collagenase II	Sigma-Aldrich, USA	CAS No.: 9001-12-1	Primaire chondrocyte isolatie en cultuur
0.2% Triton X-100	Beyotime, China	ST795	Immunofluorescence
0.25% trypsin-EDTA	Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.	AR1071	Decalficatie
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco, USA	25200072	Primaire chondrocyte isolatie en cultuur
4% Paraformaldehyde Fixatieoplossing	Biyuntian, China	P0099-3L	Weefselfixatie
Anti-CaMKII Antilichaam	Huabio, China	ET1608-47	Western blot (1:1000)
Anti-Collagen II Antilichaam	Abcam, UK	ab34712	Western blot (1:1000)
Anti-COX2 Antilichaam	Abcam, UK	ab179800	Western blot (1:1000)
Anti-Cyt-C Antilichaam	Selleck, China	F2534	Western blot (1:1000)
Anti-IP3R Antilichaam (B-2)	Santa Cruz, USA	sc-377518	Western blot (1:1000)
Anti-MMP9 Antilichaam	Abcam, UK	ab76003	Western blot (1:1000)
Anti-p-CaMKII Antilichaam	Selleck, China	F0342	Western blot (1:1000)
Anti-β-actin Antilichaam	Cell Signaling Technology (CST), USA	8H10D10	Western blot (1:2000)
BSA Blocking Oplossing	Sigma Aldrich, USA	N/A	5% BSA voor Western blot blocking
Centrifuge (5424 R)	Eppendorf, Germany	N/A	755 × g centrifugatiesnelheid
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	N/A	Oplosmiddel voor PA
Klimaatgestuurde kamer (RXZ-158A)	Binnenlandse fabrikant, China	N/A	Vochtig omgevingsmodel
Color Reverse Transcriptie Kit	Invitrogen, Suzhou, China	N/A	cDNA-synthese
CTAn software	Bruker	versies 1.9 en 4.1	Voor kwantitatieve morfometrische analyse
CTVol software	Bruker	versie 2.0	Voor kwalitatieve en driedimensionale visualisatie
DAPI Kleuring Oplossing	Beyotime, China	N/A	Kernkleuring (5 µg/mL)
Digitaal Grip Strength Meter	Puxin Instrument	N/A	Meet de achterpoot grijpkracht
DMEM/F12 Medium	Corning, USA	N/A	Celcultuurmedium
EDTA (Ethyleendiaminetetraazijnzuur)	Aladdin	N/A	Decalficatie van botweefsels
ELISA Kit voor PGE2	Elabscience, Wuhan, China	PGE2E-EL-0034	ELISA detectie
Enhanced Chemiluminescence Kit	Millipore, USA	WBKLS0500	Western blot detectie
Ethanol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Weefseldrogering
Foetaal Runderserum (FBS)	Corning, USA	N/A	10% concentratie voor cultuur
FITC-gelabeld Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime, China	P0179 kit	Immunofluorescence (1:500)
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	Versie 8.0.2	Gegevensanalyse
Hematoxyline en Eosine (H&E) Kleuring Kit	Servicebio, Wuhan	G1005	Histologie
IL-1β	PeproTech, USA	400-01B	10 ng/mL voor PTOA celmodel
ImageJ	NIH, USA	Versie 1.48v	Beeldanalyse
Image-Pro Plus software	Media Cybernetics	Versie 6.0	Kwantitatieve loopanalyse van gescande voetafdrukken
Isofluraan	Shanghai Yaji Biologisch	YS1412C	Anesthesie voor dierchirurgie
Leica Inbeddingscentrum	Leica Microsystems	EG1160	Paraffine inbedding
Leica Microtoom	Leica Microsystems	RM2235	Snijden van paraffine-ingebedde weefsels
Leica Waterbad	Leica Microsystems	HI1210	Drijvende paraffine secties
Lichtmicroscoop (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Japan	N/A	Histologische observatie
Micro-CT Scanner (ZKKS-MCT-Sharp)	Binnenlandse fabrikant, China	N/A	Botafbeelding
Mouse-HRP Secundair Antilichaam	Cell Signaling Technology (CST), USA	7076	1:2000 verdunning
NIS-Elements Beeldvorming Software	Nikon	N/A	Vastleggen en analyseren van microscoopbeelden
NRecon software	Bruker, Germany	Versie 1.6	CT reconstructie
Palmitinezuur (PA)	Sigma Aldrich, USA	P0500	500 µM stock voor FD celmodel
Paraffinewas voor Snijwerk, Pathologiekwaliteit, Smeltpunt 52-54 °C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500g	Gebruikt voor paraffine inbedding tijdens weefselverwerking
Paraffinewas voor Snijwerk, Pathologiekwaliteit, Smeltpunt 56-58 °C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500g	Gebruikt voor eind harde was inbedding bij weefselsnijden
PBS (Fosfaat Gebufferde Saline)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Cel wassen en weefselspoelen
Penicilline-Streptomycine	Corning, USA	N/A	1% voor celcultuur
PVDF Membraan (0.45 µm)	Millipore, USA	IPVH00010	Western blot membraan
Rabbit-HRP Secundair Antilichaam	Cell Signaling Technology (CST), USA	7074	1:2000 verdunning
Rode Inkt	HERO	HERO 204	Voetafdruk tracking in loopanalyse
RIPA Lysis