Methodenartikel

RNA in situ hybridisatie met sequentiële eiwitimmunofluorescentie in tandemtest

914 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68615

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft RNA in situ hybridisatie met sequentiële eiwitimmunofluorescentie in weefsel op een geautomatiseerd platform om gerichte ruimtelijke meervoudige omics op cellulair niveau te karakteriseren.

Samenvatting

De functionaliteit van cellen in een gastheer is niet afhankelijk van geïsoleerde signalen. In plaats daarvan moeten alle componenten, van de kleinste RNA-moleculen tot de grootste eiwitten, in harmonie en coördinatie in het menselijk lichaam werken. Als zodanig is het belang van benaderingen die ruimtelijk onderzoek op cellulair niveau over meerdere omics integreren, van het grootste belang voor het begrijpen van cel-celinteracties en de progressie van ziekte. Het ontleden van het proteoom en transcriptoom in dezelfde ruimtelijke test helpt ons te begrijpen hoe niet alleen wat een cel wordt opgedragen uit te voeren (RNA), maar ook hoe hij die instructies uitvoert in de context van de micro-omgevingsniche waarin hij zich bevindt (eiwit). Dit manuscript is gericht op het integreren van sequentiële immunofluorescentie (SeqIF) met RNA in situ hybridisatie (ISH) met een on-tissue microfluïdica gestuurd systeem voor high-throughput eiwit- en RNA-onderzoek in een ruimtelijke context (seqRNA-ISH+seqIF) dat het mogelijk maakt om tot 12 RNA- en 24 eiwitdoelen in een enkele run te gebruiken, met extra eiwitdoelen die mogelijk kunnen worden toegevoegd via opeenvolgende runs. Deze methode biedt een sequentieel gericht multiomics-platform dat geen rekening hoeft te houden met fluorofoorcompatibiliteit en uitgebreide optimalisatie voor hogere plexing. Dit stelt iemand in staat om te begrijpen welke berichten de cel aan het voorbereiden is of naar zijn micro-omgeving stuurt. Deze gerichte aanpak helpt om volledige transcriptoommethoden te valideren en tegelijkertijd de interacties tussen het RNA en eiwitten op een preciezere manier te onderzoeken.

Inleiding

De complexe werking van cellen in het menselijk lichaam is afhankelijk van een ingewikkeld samenspel van signalen, van kleine RNA-moleculen tot grote eiwitten, die allemaal in coördinatie werken1. Deze interactie onderstreept het belang van integratieve benaderingen die ruimtelijke interacties op cellulair niveau over verschillende omics-lagen onderzoeken 2,3. Dergelijke methodologieën zijn essentieel voor het begrijpen van de complexiteit van cel-celinteracties en ziekteprogressie. Veel traditionele methoden, zoals flowcytometrie4 en single-cell sequencing5, celisolaten worden gebruikt om uitgesplitste monsters te onderzoeken om bulkverhoudingen van fenotypes die in een specifiek monster aanwezig zijn, te identificeren. Het isoleren van cellen voor analyse kan echter activering of fenotypische veranderingen veroorzaken die mogelijk niet nauwkeurig hun oorspronkelijke biologie en functie in situ weerspiegelen 6. Geavanceerde methoden in de ruimtelijke biologie bieden nieuwe strategieën om cellen en hun micro-omgeving te bestuderen zonder de context van weefselarchitectuur en ruimtelijke relaties met naburige cellen in meerdere moleculaire typen in gevaar te brengen 2,7.

Het integreren van transcriptoom- en proteoomanalyses binnen dezelfde ruimtelijke test, zonder individuele cellen te isoleren, biedt een uitgebreid beeld van de cellulaire functie8. Deze methode bouwt voort op single-molecule RNA fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) methoden, maar omvat geen proteïnase-digesties die sequentiële eiwitondervragingen bemoeilijken8. De flexibiliteit van de aanpak die op een enkele sectie kan worden gebruikt, zorgt voor een ruimtelijke hogere resolutie en minder beeldverwerking om secties te integreren en uit te lijnen. Deze benadering geeft inzicht in zowel de instructies die een cel ontvangt (RNA) als de uitvoering ervan (eiwit) binnen zijn specifieke micro-omgevingsniche. Door deze informatielagen te combineren, kunnen onderzoekers diepere inzichten krijgen in cellulair gedrag en communicatie.

Hoewel er handmatige methoden bestaan, hebben recente ontwikkelingen in ruimtelijke omics-technologieën complexere analyses mogelijk gemaakt met een groter aantal proteomische markers die zijn onderzocht met behulp van handmatige multiplexing9. Deze benaderingen omvatten vooruitgang in zowel eiwit- als RNA-ISH-assays 10,11,12,13,14, en geautomatiseerde methodologieën die systeemspecifieke geconjugeerde antilichamen vereisen 15,16,17, beeldvorming massacytometrie (IMC) 18,19,20 en andere geautomatiseerde fluorescerende sequentiële proteomische methodologieën die gebruik maken van kant-en-klare primaire en secundaire antiboedies 2,21,22. Deze technologieën hebben proteomics of gecombineerde transcriptomics en proteomics mogelijk gemaakt met behulp van gerichte benaderingen en visualiseren deze meestal zowel het RNA via sondes als eiwitten via antilichamen op basis van vergelijkbare conjugaten, waardoor gelijktijdig of sequentieel RNA en eiwit samen kunnen worden gedetecteerd met behulp van dezelfde methodologie of instrumenten. Door een uitgebreid beeld te geven van cellulaire activiteit, zijn dit soort benaderingen bedoeld om ons begrip van cellulaire communicatie tussen cellen en hun micro-omgeving te vergroten. Het biedt een waardevol hulpmiddel voor het ontcijferen van de complexiteit van cellulaire interactie, en biedt mogelijk nieuwe inzichten in normale fysiologische processen en ziektemechanismen.

Dit protocol biedt richtlijnen voor het integreren van RNA in situ hybridisatie (ISH) met sequentiële immunofluorescentie (SeqIF) met een door microfluïdica aangedreven systeem op weefsel. Dit biedt een high-throughput tool voor het onderzoek naar RNA en eiwit binnen hun oorspronkelijke ruimtelijke context. Deze methode (seqRNA-ISH+seqIF) maakt het mogelijk om tot 12 RNA- en 24 eiwitdoelen in één run te gebruiken, waarbij extra eiwitdoelen mogelijk kunnen worden toegevoegd via opeenvolgende runs. Hoewel dit protocol zich richt op één specifiek microfluïdisch systeem, kunnen de verstrekte richtlijnen voor weefselbehandeling, RNA-kwaliteitsborging en antilichaamselectie en titratie worden aangepast aan andere methodologieën. Deze methode maakt echter gebruik van pH 9.0-antigeenextractie voor efficiënte, proteasevrije epitoopextractie, waardoor de stabiliteit van de proteomics wordt verbeterd en tegelijkertijd een aantal gerichte transcriptomics wordt geboden, in tegenstelling tot traditionele RNA-ISH bij pH 6.0 met protease om de toegankelijkheid van de RNA-sonde te vergroten, maar slaagt er niet in het proteoom te behouden8. De seqRNA-ISH+seqIF-methode wordt visueel geschetst in figuur 1, waarbij de RNA FISH-amplificatie wordt gedemonstreerd, gevolgd door splitsing voordat een primair-secundaire antilichaamkoppelingsmethode wordt gebruikt die gebruik maakt van een zachte chemische verwijdering van primairen en secundaire. Het sequentiële karakter van de seqIF en detectie overwint veel van de beperkingen met betrekking tot fluorofoorcompatibiliteit door gebruik te maken van sequentiële methodologieën23. Dit vermindert de noodzaak van uitgebreide optimalisatie die nodig is bij gelijktijdige kleuring in high-plex-methodologieën die compensatie vereisen voor spectrale overlap23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselsecties die zijn verzameld bij niet eerder behandelde patiënten met hooggradig sereus ovariumcarcinoom die primaire cytoreductieve chirurgie hebben ondergaan. Alle klinische gegevens zijn verkregen uit de repository voor eierstokkanker van de afdeling Gynaecologische Oncologie en Reproductieve Geneeskunde volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de MD Anderson van de Universiteit van Texas. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen door het receptiepersoneel en de onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met erkende ethische richtlijnen.

OPMERKING: Alle reagentia worden, tenzij anders vermeld, verdund in nucleasevrij gedeïoniseerd water.

1. Voorbeelden repareren en insluiten

OPMERKING: De keuze van fixatief en fixatieduur heeft een sterke invloed op de prestaties van assays, en over het algemeen worden ruimtelijke assays meestal gedaan met FFPE omdat het de pathologische architectuur behoudt. Dit protocol schetst het gebruik van FFPE-weefsel, als zodanig wordt het volgende protocol voorgesteld voor FFPE-weefselmonsters. De RNA-kwaliteit wordt echter beïnvloed door de fixatieprocessen, net als eiwitepitopen, maar in mindere mate. Deze fixatiemethoden, onvolledige fixatie en degradatie van monsters kunnen de niet-specifieke binding in op antilichamen gebaseerde proteomica verhogen. Ten derde wordt constitutieve fluorescentie meestal gedoofd tijdens FFPE-verwerking, maar sommige fluoroforen zullen matig aanhouden en moeten worden getest om er zeker van te zijn dat ze worden gedoofd.

  1. Snijd het weefsel in delen tot een dikte van ≤ 5 mm om een uniforme fixatie te garanderen en door vet geïnduceerde diffusiebarrières te voorkomen. Fixeer de secties onmiddellijk in 10% fosfaatgebufferde formaline (pH 7,0) bij 4 °C gedurende 24 uur om RNA en eiwit24 te optimaliseren.
  2. Verwerk gefixeerde weefsels in een weefselverwerker of handmatig verwerkt met behulp van de volgende stappen
    1. Uitdrogen van weefselcoupes in ethanol van moleculaire kwaliteit in nucleasevrij water van (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x gedurende 1 uur elk).
    2. Dompel het weefsel vervolgens 2 keer gedurende 1 uur onder in xyleen bij kamertemperatuur (~23 °C).
  3. Verwarm paraffinewas tot 60 °C. Dompel de tissuedoos 2 keer gedurende 1 uur onder in paraffinewas.
  4. Plaats opgeblazen tissue en oriënteer tissues in de vorm, vul ze met verse paraffinewas en laat snel afkoelen tot 4 °C25.
    OPMERKING: De beste resultaten voor RNA worden verkregen door alle stappen binnen 48 uur te voltooien.

2. Beoordeling van de RNA-kwaliteit

  1. Gebruik drie seriële secties, waarbij u alle drie de dia's parallel laat lopen of bedieningsdia's voor het beoogde paneel uitvoert om ervoor te zorgen dat de blokkering voldoende is. De gepaarde positieve controlesondes richten zich op huishoudgenen om de weefselkwaliteit en ruimtelijke integriteit in het weefsel te beoordelen, die kunnen worden beïnvloed door verschillen in doorzettingsvermogen. Veelgebruikte controles zijn UBC (een gen met hoge expressie), PPIB (matige expressie) en POLR2A (lage expressie)26. Gebruik negatieve controlesondes, zoals Dab1 (een RNA van bodembacteriën) op elk detectiekanaal. Optioneel kunt u alle positieve en negatieve controlesondes op hetzelfde monster opnemen naast de doelsondes. Plaats in deze opstelling Dab1 negatieve regelaars in de kanalen T2-T4, wijs positieve regelaars van laagste naar hoogste expressie toe aan T1, T5 en T9 en zorg ervoor dat de doelsondes de resterende kanalen bezetten.
    OPTIONEEL: Daarnaast kan het voor monsters met onbekende RNA-kwaliteit nuttig zijn om een Distribution Value 200 (DV200 score) te bepalen. DV200-scores van meer dan 30 worden sterk aanbevolen, waarbij monsters van hogere kwaliteit van 50 of hoger de voorkeur hebben van27. Deze score is een indicatie van de kwaliteit van het RNA, en een hogere monsterkwaliteit verhoogt de kans dat RNA-ISH effectief werkt27.

3. Voorzorgsmaatregelen en preparaten voor RNA

OPMERKING: Het is het beste om het gebied van RNases te ontsmetten en af te vegen en vervolgens het werkgebied te besproeien met 70% ethanol voordat het wordt verwerkt, naast het gebruik van een RNase-vrij gebied, draag altijd schone handschoenen, een laboratoriumjas en een masker om de introductie van RNases uit huid of adem te minimaliseren. Gebruik alleen RNase-vrij water en verbruiksartikelen en grijp niet in voorraadzakken. Deze voorzorgsmaatregelen, evenals het koel en droog houden van weefsel/objectglaasjes, zijn essentieel voor het behoud van de RNA-integriteit tijdens experimenten.

  1. Snijd de secties met een microtoom op positief geladen glasplaatjes en plaats het interessegebied in het midden van het objectglaasje, dat coördineert met het beeldvormingsgebied (verschilt per systeem; hier is het ongeveer 12,5 mm x 12,5 mm).
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat de ideale dikte voor elke sectie tussen 4-6 μm ligt voor FFPE-weefsels.
  2. Bak FFPE-objectglaasjes in een droge RNASE-vrije oven, weefsel naar boven gericht, bij 60 °C gedurende minimaal 1 uur en maximaal een nacht voor vetweefsel of weefsel dat anders vatbaar is voor loslating.
  3. OPTIONELE voorbehandeling
    OPMERKING: Hoewel voorbehandeling optioneel is, zijn bepaalde stappen ook optioneel, zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid 3% waterstofperoxide: Voeg in een conische buis van 50 ml 5 ml 30% waterstofperoxide toe aan 45 ml 1x PBS. Bewaar de resterende waterstofperoxide maximaal drie maanden bij kamertemperatuur (~23 °C), het deksel afgesloten met parafilm.
      OPMERKING: Waterstofperoxide is een sterke oxidatiemiddel. Blijf uit de buurt van brandbare materialen, warmtebronnen en metalen. Gebruik in een chemische zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM; bijv. veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas). Vermijd contact met huid, ogen en inademing. Spoel de huid gedurende 15 minuten met water als deze is blootgesteld. Zoek medische hulp bij inslikken of inademen. Hogere concentraties kunnen ernstige brandwonden veroorzaken en kunnen ontbranden of exploderen met organische materialen of bepaalde metalen. Voeg altijd waterstofperoxide toe aan water om heftige reacties te voorkomen.
    2. Bereid 3,7% formaldehyde: Voeg in een chemische zuurkast 1 ml 16% formaldehyde toe per 3,3 ml 1x PBS. Bewaar formaldehyde verpakt met parafilm gedurende maximaal drie maanden.
      OPMERKING: Formaldehyde kan ernstig oogletsel en irritatie van de luchtwegen veroorzaken en wordt ervan verdacht kanker te veroorzaken. Langdurige of herhaalde blootstelling kan leiden tot huidsensibilisatie en allergische reacties. Alleen gebruiken in een chemische zuurkast en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, veiligheidsbril/gelaatsscherm, masker, laboratoriumjas, enz.). Vermijd huidcontact, oogcontact en inademing. Verwijderd houden van warmtebronnen en open vuur. Gooi paraformaldehyde en verontreinigde materialen weg als gevaarlijk afval en bereid indien mogelijk alleen de hoeveelheid voor die nodig is voor onmiddellijk gebruik.
    3. Deparaffineer door het weefselglaasje te wassen door het in conische buisjes van 50 ml te plaatsen die het volgende bevatten: Xyleen (40 ml) voor 3 wasbeurten van elk 5 minuten in een chemische zuurkast.
      OPTIONEEL: In plaats van xyleen kan een histologisch klaringsmiddel op basis van niet-xyleen worden gebruikt, maar dit zal mogelijk residu van paraffine achterlaten en de beeldkwaliteit beïnvloeden. Dit houdt in dat de plakjes in conische tubes van 50 ml worden geplaatst die het volgende bevatten: Niet-xyleenbase histologisch klaringsmiddel (40 ml) voor twee wasbeurten van elk 15 minuten. Secties van blokken die zijn gemaakt met bijenwas kunnen moeilijk te ontwaxen zijn met niet-xyleen. Voor onbekende was/paraffinemengsels wordt aanbevolen om Xyleen te gebruiken met de juiste veiligheidsmaatregelen. Xyleen is een gevaarlijke en ontvlambare stof en langdurige blootstelling kan schade aan het centrale zenuwstelsel, de lever en de nieren veroorzaken. Alleen gebruiken in een chemische zuurkast en draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, maskers en laboratoriumjassen). Gooi xyleen en verontreinigde materialen weg als gevaarlijk afval. In geval van blootstelling onmiddellijk medische hulp inroepen.
    4. Rehydrateer door de tissuedia te wassen door deze in een conische buis van 50 ml te plaatsen die het volgende bevat: 100% ethanol (40 ml) voor 2 wasbeurten van elk 3 minuten; 95% ethanol (40 ml) voor 2 wasbeurten van elk 3 minuten; 70% ethanol (40 ml) voor 2 wasbeurten van elk 3 minuten; 50% ethanol (40 ml), voor 2 wasbeurten van elk 3 minuten; 30% ethanol (40 ml) voor 2 wasbeurten van elk 3 minuten; 1x PBS-wasbeurt (40 ml) voor 1 wasbeurt op 2 min.
    5. Peroxidase blokt weefsel door het in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur (~23 °C) te plaatsen en het weefsel te bedekken met ongeveer 100-200 μL 3% waterstofperoxide, gedurende 1 wasbeurt om 10 minuten en vervolgens het weefsel te wassen met 1x PBS-wasbeurt (40 ml), gedurende 2 wasbeurten van elk 2 minuten.
      OPMERKING: Peroxidaseblokkering is optioneel en dooft resterende peroxidase-enzymen in weefsel om niet-specifieke kleuring te verminderen en kan autofluorescentie van weefsel verminderen. Dit is vooral belangrijk voor weefsels met een hoge autofluorescentie, zoals beenmerg, nieren, lever, longen, darmen en hersenen, waar sterke achtergrondsignalen de beeldvorming in de TRITC- en FITC-emissiebanden 28,29,30,31,32 kunnen verstoren.
    6. Voer formaldehydefixatie uit door het weefsel in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur te plaatsen en het weefsel te bedekken met ongeveer 100-200 μl 3.7% formaldehyde, gedurende 1 wasbeurt op 10 minuten, en vervolgens het weefsel te wassen met 1x PBS-wasbeurt (40 ml), gedurende 2 wasbeurten van elk 2 minuten.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar wordt aanbevolen voor vetrijke weefsels of andere weefsels die problemen hebben met het hechten aan glazen objectglaasjes.

4. Antigeen ophalen

OPMERKING: De methode voor het verwijderen van was en het ophalen van antigeen die hier wordt aanbevolen en beschreven, verschilt van de methode die door de fabrikant wordt aanbevolen voor seqRNA-ISH+seqIF, die gebruikmaakt van een apparaat voor het ophalen van gecontroleerde warmte-antigeenen met grote capaciteit.

  1. Warmte geïnduceerd antigeen ophalen (HEIR) met behulp van microgolf
    1. Voeg met behulp van een magnetron met temperatuurcontrole voldoende in de handel verkrijgbare pH 9.0 HEIR Buffer-oplossing (ongeveer 250 ml) toe om de dia's in de glaasjeshouder onder de thermometer te bedekken, indien van toepassing.
      OPMERKING: Het ophalen van antigeen voor RNA gebeurt meestal bij pH 6.0, maar de volgende methodologieën zijn voor pH 9.0 voor een hogere efficiëntie van antilichaambinding.
  2. Plaats de glaasjes in bufferoplossing in de magnetron en compenseer eventuele lege kamers indien van toepassing met dubbel gedestilleerd water. Verwarm dia's in de magnetron gedurende 15 minuten bij 107 °C (de totale tijd is meestal 30 minuten voordat de HEIR-buffer op temperatuur is).
  3. Koel de dia's af door ze ongeveer 20 minuten onder een chemische zuurkast bij kamertemperatuur te plaatsen.
  4. Was de dia's in 1x PBS in een conische tube van 50 ml (40 ml), voor 1 wasbeurt gedurende 2 min.
  5. Bewaar dia's in een schroefdop diamailer of 50 ml conische buis gevuld met 1x PBS (of een in de handel gebrachte multikleuringsbuffer) en ga onmiddellijk verder, of bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 7 dagen, maar idealiter minder dan 72 uur voordat u verder gaat met seqRNA-ISH+seqIF.

5. Bereid voorraadoplossingen voor

  1. Bereid 40x RNA-beeldvormingsbuffer voor
    1. Bereid 40x RNA-beeldvormingsbuffer voor door 400 mg poeder-RNA-beeldvormingsbuffer te combineren met 25 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water
    2. Draai de resulterende oplossing totdat deze volledig is opgelost en verdeel vervolgens in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml (1 ml per buis)
    3. Vries in en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal drie maanden, vermijd vries-dooicycli.
  2. Bereid 20x zout-natriumcitraatbuffer (SSC) voor
    1. Los 157,3 g natriumchloride (NaCl) en 88,2 g natriumcitraat (Na3C6H5O7) op in 800 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water.
    2. Meet de pH en titreer druppelsgewijs tot pH 7,0 met 1 M zoutzuur (HCl).
    3. Autoclaaf om te steriliseren.
      LET OP: Steriel 20x SSC kan ook bij verschillende bedrijven worden gekocht. Na opening bewaren bij kamertemperatuur tot 4 °C.
    4. Bereid 4x SSC-buffer voor door 1 ml 20x SSC-bouillon te combineren met 4 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water

6. Sequentiële RNA-ISH + sequentiële immunofluorescentie

OPMERKING: Alle hierin beschreven stappen zijn aangepast van het fabrikantprotocol voor de seqRNA-ISH+seqIF zoals beschreven in de materiaaltabel, als zodanig worden de meeste reagentia geïdentificeerd als systeemcompatibele, commerciële reagentia. Deze reagentia worden geïdentificeerd en/of geleverd door de fabrikant en zijn ontworpen om compatibel te zijn met het systeem. Aanpassingen zijn mogelijk en worden beschreven in de discussie, maar kunnen aanvullende tests en vloeistofwassen vereisen om ophoping te voorkomen. De software berekent het totale volume aan reagentia dat nodig is nadat het paneel en het protocol zijn ontworpen en ingevoerd. Er worden echter aanbevolen wijzigingen gepresenteerd. Het totale volume zal altijd variëren op basis van het aantal cycli en doelen dat per protocol wordt gebruikt. Het antilichaam en de RNA-ISH-verdunningen worden echter niet door het systeem berekend, tenzij elke afzonderlijke combinatie als een uniek item in de database wordt ingevoerd. Voor dit protocol is 400 uL antilichaamcocktail nodig per monsterglaasje.

  1. Voorbereiding van het systeem
    1. Voorafgaand aan seqRNA-ISH+seqIF, spoelt u alle microfluïdica grondig met nucleasevrij water.
    2. Spuit buiten het systeem met RNAse-ontsmettingsoplossing, gevolgd door 70% ethanol.
  2. Bereid algemene reagentia voor
    1. Wasbuffer: 50 ml 20x systeemcompatibele, commerciële, multikleurende buffer + 950 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water
    2. Water: 100 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water.
    3. Ethanol: 100 mL of 70% Ethanol.
    4. Beeldvormingsbuffer: 16 ml 10x systeemcompatibele, commerciële, beeldvormingsoplossing + 140 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water + 4 ml systeemcompatibele, commerciële, beeldvormende voorraad.
    5. Elutiebuffer: 152 van systeemcompatibel, commercieel, elutieoplossing 1 + 8 van systeemcompatibel, commercieel, elutieoplossing 2
    6. Afschrikbuffer: 130 ml nucleasevrij gedeïoniseerd water + 14 ml systeemcompatibel, commercieel, afschrikoplossing 1 + 16 ml systeemcompatibel, commercieel, afschrikoplossing 2.
  3. Kleuringsreagentia voorbereiden voor het RNA-ISH-protocol
    OPMERKING: Deze stap kan de avond ervoor worden voltooid en in het donker bij 4 °C worden bewaard. Hoewel in de aanbevelingen van de fabrikant staat dat gepoolde sondes maximaal een jaar kunnen worden gebruikt, wordt het niet aanbevolen om sondes meer dan een week van tevoren te poolen vanwege zorgen over vervuiling. Voor sondes is het het beste om op en neer te tikken of voorzichtig te pipetteren om ze te mengen en ze voorzichtig te centrifugeren om naar beneden te draaien voor gebruik.
    1. Laad systeemcompatibele, commerciële, proteïnasevrije permeabilisatieoplossing bij 500 μL per glaasje in een systeemcompatibele microcentrifugebuis.
    2. Pool RNA-ISH Versterkers op basis van cyclus (tabel 1) voor een totaal van 500 μL per dia per elk van de volgende in een systeemcompatibele microcentrifugebuis: i) ZZ-staartbomen voor staarten T1 tot T4, ii) ZZ-staartbomen voor staarten T5 tot T8, iii) ZZ-staartbomen voor staarten T9 tot T 12.
    3. Zwembadstaartboom specifiek, versterker overeenkomend, fluoroforen voor een totaal van 500 μL per dia per elk van de volgende in een systeemcompatibele microcentrifugebuis: i) Fluorofoor voor boom T1 tot T4, ii) Fluorofoor voor boom T5 tot T8, iii) Fluorofoor voor T9 tot T 12.
      OPMERKING: Deze stap is lichtgevoelig
    4. Bereid 1 ml van een 1:200 verdunning van commerciële DAPI (voorraadconcentratie van 1 mg/ml) in commerciële multikleuringsbuffer gemaakt met nucleasevrij gedeïoniseerd water per dia
      OPMERKING: De procedure is uitgevoerd volgens de fabrikant, die DAPI opneemt als onderdeel van de standaardreagentia. Als aangepaste formuleringen van DAPI worden gebruikt die zijn verdund in N,N-dimethylformamide (DMF), kunnen de verdunningen variëren en moeten titratietests worden uitgevoerd. Het wordt echter aanbevolen om een concentratie te gebruiken rond 1:1000-1:2000 van een voorraadconcentratie van 1 mg/ml. Meestal is dit in een hogere concentratie dan normaal dan handmatige kleuringsprotocollen, omdat het meerdere rondes van beeldvorming en strippen moet duren. DAPI-vers gemaakte formuleringen in DMF zijn over het algemeen helderder dan in de handel verkrijgbare DAPI-formuleringen. Reagentia met formamide, zoals DAPI, moeten onder een chemische zuurkast worden geplaatst. Formamide kan reproductietoxiciteit en orgaanschade veroorzaken en wordt ervan verdacht kankerverwekkend te zijn. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen en laboratoriumjas).
    5. Bereid de RNA-ISH-beeldvormingsbuffer onmiddellijk voor gebruik voor met 12.125 nucleasevrij gedeïoniseerd water, 1.5 ml 10x beeldvormingsbuffervoorraad B en 275 μl 40x beeldvormingsbuffervoorraad A (ontdooid of vers gemaakt)
    6. Bereid maximaal 10 paren primaire antilichamen (de primaire eiwitantilichamen worden beschreven in tabel 2) voor seqIF volgens titratiegeteste verdunningen in commerciële multikleuringsbuffer voor een totaal van 400 μl per glaasje in een systeemcompatibele microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat elke cyclus van seqIF slechts één primair antilichaam per gastheersoort bevat.
    7. Bereid secundaire fluoroforen (tabel 3) plus DAPI volgens primaire antilichaamcombinaties in stap 6.3.7 voor seqIF volgens titratiegeteste verdunningen. Verdun in een meervoudige kleuringsbuffer met een totaal van 400 μl per cyclus in een conische buis van 50 ml met een minimum van 1 ml dood volume. Voorbeeldconcentraties voor secundaire Alexa Fluor-antilichamen en DAPI zijn als volgt: 1:200 verdunning voor Alexa Fluor 555, 1:400 verdunning voor Alexa Fluor 647, 1:1800 verdunning voor DAPI (vanaf 1 mg/ml DAPI in DMF)
      OPMERKING: Deze stap is lichtgevoelig. De toevoeging van DAPI aan de secondaries is niet volgens het protocol van de fabrikant, omdat het kan helpen bij het behouden van DAPI-expressie gedurende meerdere cycli van seqIF, wat helpt bij het uitlijnen van afbeeldingen na het uitvoeren. De meeste beeldverwerkingssoftware, zoals die bij dit systeem wordt geleverd, gebruikt het DAPI-signaal om de uitlijning van cyclische beeldvorming voor fluorescentiecolokalisatie te bevestigen.
  4. Systeem initialisatie
    1. Laad elk van de reagentia uit stap 6.3 in de volgorde die door het systeem is aangegeven. Houd er rekening mee dat de volgorde over het algemeen zal zijn zoals hierboven, maar zorg er altijd voor dat de reagentia overeenkomen met waar ze worden geladen
    2. Plaats het met antigeen opgehaalde glaasje in de houder en zorg ervoor dat het beeldvormingsvenster van het glaasje in het midden van de beeldvormingsruimte is uitgelijnd voordat u de systeemcompatibele microfluïdica-chip erop plaatst en op zijn plaats vergrendelt.
      OPMERKING: Microfluïdische chips kunnen worden hergebruikt voor seqIF-titratietests als ze op de juiste manier worden gereinigd en opgeslagen tot nog een keer, zolang de pakkingen intact blijven. Microfluïdische chips kunnen niet opnieuw worden gebruikt als een RNA-paneel wordt gebruikt vanwege mogelijke besmetting.
    3. Bereid de splijtoplossing voor door 1,35 ml 4x SSC en 150 ml in de handel verkrijgbare 10x splijtoplossing te mengen.
      OPMERKING: De 10x Snijoplossing oxideert snel en wordt bewaard in een glazen ampul die alleen vlak voor gebruik mag worden gebroken in een seqRNA-ISH+seqIF experimentele run.

7. Systeem uitvoeren

  1. Voer het systeem uit volgens de instructies van de fabrikant, de geschatte looptijd voor twee dia's op een 12-plex seqRNA-ISH met een 20-plex eiwit seqIF is 48 uur voor een beeldvormingsvenster van 12,5 cm x 12,5 cm.
  2. Nadat de seqRNA-ISH+seqIF-run is voltooid, kan het objectglaasje worden verwijderd en opgeslagen in 1x PBS of onmiddellijk worden gebruikt voor extra seqIF (voor maximaal 40 eiwitten).
    OPMERKING: Het is belangrijk om de microfluïdica van het systeem voor en na elke run te reinigen en door te spoelen met nucleasevrij water om de kans op besmetting te verkleinen.

8. OPTIONEEL: Beeld- en statistische analyse

  1. Ga verder met beeld- en statistische analyse via beeldanalyse of pathologie-analysetools.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als voorbeeld van deze methode hebben we de volgende seqRNA-ISH (Tabel 1) + SeqIF (Tabel 2 en Tabel 3) uitgevoerd op twee dia's van een humaan hooggradig sereus eierstokcarcinoom.

Figuur 2 illustreert de overlay van seqRNA-ISH+seqIF op een monster van eierstoktumorweefsel. Structurele eiwitmarkers zoals collageen 1 worden gebruikt om tumorregio's te identificeren, terwijl fenotypi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest cruciale stap bij het voorbereiden en behandelen van monsters is het verminderen van RNAse-besmetting. Dit kan worden bereikt door maskers te gebruiken om besmetting door adem te voorkomen en door werkoppervlakken af te vegen met een RNase-ontsmettingsoplossing en 70% ethanol gemaakt met nucleasevrij water. Voor FFPE-objectglaasjes is het het beste om meerdere, aangrenzende objectglaasjes uit FFPE-blokken voor seqRNA-ISH+seqIF te snijden en deze bij 4 °C met droogmiddel op te sl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door de Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 en 891490), de Sie Foundation en het Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met de Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de National Institutes of Health via MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 en Jared Burks' NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.

We willen ook Emily Martersteck van Lunaphore bedanken voor technische assistentie en training.

De auteur(s) ontving(en) een set RNAScope gerichte en controlesondes als onderdeel van een programma voor vroege toegang van Bio-Techne tegen een gereduceerde prijs, en sommige reagentia werden gratis verstrekt voor gebruik in deze studie. De fabrikant had geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Voor nucleaire kleuring (product gebruikt tijdens dit onderzoek, 62247 is stopgezet)
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339652Gebruikt voor aliquoten & gemengde secundaire oplossingen
70% Sterile Isopropanol AlcoholTexwipeTX3270Voor oppervlaktedecontaminatie
AntilichamenVerschillendVerschillendGebruikt voor primaire doelen, varieert op basis van het gebruikte kanaal
APOE - Gastheer: Muis, Kloon: 960318R&DMAB41443-100(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
aSMA - Gastheer: Muis, Kloon: 1A4CST69319SF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
Autocut microtoomLeica14051956472Seceren van weefsel
CD10 - Gastheer: Konijn, Kloon: E5P7SCST65534S(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD11c - Gastheer: Konijn, Kloon: D3V1ECST93233SF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD163 - Gastheer: Konijn, Kloon: D6U1JCST93498S(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD163 - Gastheer: Konijn, Kloon: ja51-30Invitrogenma5-32684(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD20 - Gastheer: Muis, Kloon: L26BethylA500-017ACF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD31 - Gastheer: Muis, Kloon: 3F8E2ProteinTech66065-2-Ig(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD33 - Gastheer: Konijn, Kloon: BLR061GBethylA700-061CF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD4 - Gastheer: Konijn, Kloon: EPR6855Abcamab181724(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD45 - Gastheer: Konijn, Kloon: BL-178-12C7BethylA700-012(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD45RO - Gastheer: Muis, Kloon: UCHL1BethylA500-020ACF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD56 - Gastheer: Konijn, Kloon: BLR152JBethyl99746(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD66b - Gastheer: Konijn, Kloon: BLR111HInvitrogenMA5-44413(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD68 - Gastheer: Muis, Kloon: KP-1Biolegend916104(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD8 - Gastheer: Muis, Kloon: C8/144BBiolegend372902(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
CD86 - Gastheer: Konijn, Kloon: E2G8PCST76755SF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
Col 1A1 - Gastheer: Muis, Kloon: E3E1XCST66948S(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
DNA LoBind Tubes 2mLEppendorf22431048Gebruikt voor gemengde RNA-probe-oplossingen
Drierite 21005 Indicating DesiccantCole-Palmer21005Droogbewaarmiddel voor de droogkolom
Edge-Rite Microtome BladesThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistologie - Gebruikt bij het seceren van monsters
Ethyl Alcohol 100% (200 Proof)Pharmco111000200Voor deparaffinisatie
EZ-AR2 Elegance BufferBioGeneXHK547-XAKGebruikt voor antigeenretrieval van FFPE weefselsecties
FOXP3 - Gastheer: Konijn, Kloon: PolyclonalBethylA700-034CF(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) Primair eiwitantilichaam
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21425(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) F(ab')2-Geit anti-Muis IgG (H+L) Geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor™ 555
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) F(ab')2-Geit anti-Muis IgG (H+L) Geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor™ Plus 647
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21430(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) F(ab')2-Geit anti-Konijn IgG (H+L) Geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor™ 555
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-21246(opmerking: Specifiek voor dit onderzoek) F(ab')2-Geit anti-Konijn IgG (H+L) Geads

Referenties

  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sequenti le immunofluorescentieruimtelijke transcriptomicamulti omics platformcellulaire micro omgevingeiwitdoelwittenRNA hybridisatieon tissue microfluidicacel celinteracties

Gerelateerde artikelen