Methodenartikel

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

DOI:

10.3791/68616

⸱

14 november 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om eiwit en mRNA in dezelfde test te detecteren, helpt ons te begrijpen hoe de cel zich voorbereidt op een aankomst en welke signalen hij ontvangt tijdens zijn reis en interactie in de omgeving waarin hij zich bevindt. Beeldvorming met een hoger plexuur maakt het nu mogelijk om ruimtelijk opgelost mRNA (ruimtelijke transcriptomics) en eiwit (ruimtelijke proteomics) tegelijkertijd te karakteriseren. Om redundantie te voorkomen, kunnen deze analyten in een enkele weefselsectie worden geanalyseerd. Er zijn veel technologieën die veel eiwitten en weinig mRNA's of het omgekeerde mogelijk maken, maar aangezien de centraal werkende analyten eiwitten zijn, is dit manuscript gericht op het integreren van massacytometrie (IMC) met mRNA in situ hybridisatie (ISH) met behulp van metaalsondes. Dit stelt ons in staat om te begrijpen welke berichten de cel aan het voorbereiden is of snel de wereld in stuurt terwijl hij communiceert in zijn micro-omgeving. Het overwint ook beperkingen met betrekking tot de detectie van uitgescheiden eiwitten of uitdagende markers die meestal moeilijk te kwantificeren en te visualiseren zijn met alleen antilichamen. Dit protocol minimaliseert ook de behoefte aan compensaties of nabewerking die wordt gezien bij methoden op basis van hogere plex fluorescentie, aangezien er geen fluorescerende spectrale spillover is in een op metaalsonde gebaseerd detectiesysteem, noch zijn er weefselspecifieke autofluorescentie-overwegingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kankers vertonen structurele en functionele diversiteit bij verschillende patiënten. De micro-omgeving van de tumor (TME), samengesteld uit normale en kwaadaardige cellen, is heterogeen tussen patiënten. Metastase is het gevolg van een residu van de primaire tumor dat in de bloedbaan ontsnapt als celclusters en afzonderlijke cellen, wat aanwijzingen geeft over ziekteprogressie en therapeutische respons 1,2. De complexiteit van deze micro-omgevingen moet worden begrepen1. Hoewel tumoren uit voldoende celtypen bestaan, is de klinische standaard histologisch gebaseerd op een enkele marker, die begint te veranderen 1,2. Gemultiplexte beeldvormingstechnologieën hebben nieuwe richtingen in de pathologie opgeleverd. Ruimtelijk opgeloste proteomics, genomica, metabolomics en lipidomics van menselijke kankers zijn nu mogelijk met of in de buurt van een enkelvoudige celresolutie 3,4,5,6.

Deze technologieën kunnen de heterogene cellulaire locaties en interacties in tumoren ontleden. Door gebruik te maken van de juiste single-cell bioimaging-methodologie kunnen profielen van veel ziektegeassocieerde eiwitbiomarkers in patiëntbiopten worden gegenereerd om het ontwerp van kankertherapieën te informeren. Inzichten uit ruimtelijke cellulaire kaarten zullen als leidraad kunnen dienen voor de keuze voor combinatietherapie die kankers efficiënt kan elimineren met verminderde off-targets, resistentie en terugval1. Het gaat om het vermogen om deze vele gevarieerde technologieën te verenigen die doorgaans niet in harmonie werken op hetzelfde deel van het weefsel7. Dit protocol, visueel geschetst in Figuur 1, biedt de mogelijkheid om zowel proteomics als een gerichte subset van mRNA's in dezelfde weefselsectie en dezelfde cel tegelijkertijd ruimtelijk te onderzoeken met een hogere plexiteit dan wat mogelijk is met gelijktijdig fluorescerend eiwit + RNA-ISH8. Dit kan ook dienen als een brug voor parallelle analyse 3,4,6, met als doel de analyse van de gegevens te deconvolueren. Hoewel dubbele detectie aanwezig is, kan men ook cellen onderzoeken die snel de productie van mRNA hebben geïnitieerd, maar waarvoor het uitgescheiden eiwit niet detecteerbaar blijft vanwege de beperkte gevoeligheid en het gebrek aan signaalversterking die inherent zijn aan direct gelabelde primaire antilichaammethoden, waardoor de detectie van uitgescheiden moleculen bijzonder uitdagend is. Het volgende protocol is aangepast van een 12-plex fluorescentie/chromogene detectie om toepasbaar te zijn voor op metaal gebaseerde detectie via thiolgereduceerde gemodificeerde sondes voor gelijktijdige detectie in IMC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels die zijn verzameld bij niet eerder behandelde patiënten die primaire cytoreductieve chirurgie ondergaan voor hooggradig sereus ovariumcarcinoom. Alle klinische gegevens zijn verkregen uit de repository van de afdeling Gynaecologische Oncologie en Reproductieve Geneeskunde volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de MD Anderson van de Universiteit van Texas. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen en de onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met erkende ethische richtlijnen.

1. Voorzorgsmaatregelen en voorbereidingen

  1. Gebruik altijd nucleasevrij water (NFW) om alle benodigde reagentia te bereiden.
  2. Voer alle stappen uit met behulp van plastic containers en zonder het gebruik van glas om metaalbinding aan glas en metaalvervuiling te verminderen.
  3. Houd het werkgebied zeer schoon en spuit oppervlakken en pipetten in met RNase-decontaminatieoplossing, gevolgd door 70% ethanol bereid met NFW.
  4. Conjugeer gethioleerde mRNA-detectiesondes (T1-T12) aan de juiste metalen via een malemidelinker zoals beschreven door Schulz et al7, verder gedetailleerd in protocol.io in de Materiaaltabel.
    OPMERKING: Eiwitdoelen moeten worden gekozen om de locatie van een cel in het weefsel aan te geven (structurele markers), te identificeren welke cellen aanwezig zijn (fenotypische markers) en wat de cellen doen (functionele markers). Aangezien sommige functionele markers tijdelijk tot expressie worden gebracht, maakt de opname van mRNA-doelen de identificatie mogelijk van cellen die deze doelen genereren.

2. Monstervoorbereiding en voorverwerking

  1. Bak de weefselsecties een nacht in een droge oven op 60 °C.
  2. Voer deparaffinisatie uit: Drie rondes xyleen gedurende 5 minuten per ronde en 10 rondes rehydratatie (100% ethanol (EtOH) x2, 95% EtOH x2, 70% EtOH x2, 50% EtOH x2, 30% EtOH x2), gedurende 3 minuten per ronde. Was één keer met 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 2 min. Afhankelijk van het aantal monsters dat tegelijkertijd wordt verwerkt, gebruikt u conische buizen van 50 ml (max. 2 objectglaasjes) of IHC-kleurcassettes van 350 ml (max. 24 objectglaasjes).
    OPMERKING: Deze stap voor het verwijderen van wax, hoewel aanbevolen, is optioneel en afhankelijk van het weefseltype.
  3. Breng een oplossing van 3,7% paraformaldehyde (PFA) aan gedurende 10 minuten door de weefselglaasjes in een buis van 50 ml te incuberen met voldoende PFA-oplossing om het weefselgedeelte te bedekken.
  4. Heat Induced Antigen Retrieval (HEIR) met behulp van magnetron: Gebruik een magnetron met temperatuurbewaking om een bakje te vullen met pH 6 HEIR Antigen retrieval buffer (350 ml) en de overige trays met NFW. Plaats weefselsecties in een kleurrek voor microscoopglaasjes en voeg ze toe aan de bak met antigeenverwijderingsbuffer.
    NOTITIE: Zorg er bij het ophalen van antigeen voor dat de buffer voor het ophalen van antigeen vóór gebruik op kamertemperatuur (RT) is.
  5. Voer het antigeenpunctie uit bij 107 °C gedurende 15 minuten en laat vervolgens de weefselglijders 20 minuten afkoelen bij RT in een chemische kap.
  6. Spoel tijdens het ophalen van het antigeen bevochtigingspapier af met water, plaats het in een kleurplaat voor vochtigheidscontrole en plaats de bak in een hybridisatieoven op 60 °C.
  7. Spoel de dia's 3 minuten af in RNase-vrije TBS en droog de dia's vervolgens 3 minuten.

3. Protease behandeling

  1. Teken een hydrofobe barrière rond elk weefselgedeelte met een hydrofobe barrièrepen. Laat de huidplak ongeveer 2 minuten volledig drogen.
  2. Plaats de droge dia's in de glaasjeshouder van de vochtbak door de zwenkklem te openen.
  3. Voeg voldoende druppels protease toe om het weefselgedeelte volledig te bedekken. Verwijder de voorverwarmde vochtcontrolebak (60 °C, stap 2.6) uit de hybridisatieoven en plaats de schuifhouder in de vochtigheidscontrolelade. Sluit de vochtcontrolelade opnieuw af en plaats deze terug in de hybridisatieoven. Incubeer gedurende 30 minuten bij 40 °C.
  4. Bereid tijdens deze incubatie RNA-ISH-testmaterialen voor.
    1. Bereid 500 ml 1x RNA-ISH wasbuffer voor door de 50x bouillon te verdunnen met NFW. Bewaren bij RT tot een maand.
      OPMERKING: Als er neerslag optreedt in de 50x wasbuffer, suspendeer dan door de buffer 10-20 minuten te verwarmen tot 40 °C voordat u de 1x wasbuffer bereidt.
  5. Bereid 1 L DTBS-T (0.5% Tween) in NFW door 5 ml Tween toe te voegen aan 1 L DPBS-T.
  6. Bereid RNA-ISH ZZ-gekoppelde doelsensorsondes voor:
    1. Verwarm mRNA-sondevoorraden en RNA-ISH verdunningsmiddel bij 40 °C in een droge oven gedurende 10 minuten. Draai de sondes en draai ze naar beneden in een minicentrifuge op een werkblad.
    2. Bereid 1x mengsel (maximaal 12 sondes, tabel 1) door 50x sondes te verdunnen in RNA-ISH-verdunningsmiddel, zorg ervoor dat u voldoende eindvolume heeft om het hele weefselgedeelte te bedekken.
    3. Draai goed en laat de gemengde sondes en RNA-ISH verdunningsmiddel bij RT staan tot gebruik.
  7. Verwijder de vochtcontrolelade uit de hybridisatieoven en verwijder de schuifhouder. Zet de bakplaat terug in de oven.
  8. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in NFW met licht roeren gedurende 5 minuten.
  9. Herhaal de wasstap met verse NFW gedurende 5 minuten.

4. Hybridisatie van doelsondes

  1. Verwijder overtollige vloeistof van de glaasjes. Haal de vochtcontrolebak uit de oven en plaats de schuifhouder in de bak.
  2. Voeg voldoende van de juiste sondemix toe om elk weefselgedeelte volledig te bedekken. Sluit de bakplaat en plaats deze 2 uur in de oven op 40 °C.
  3. Plaats RNA-ISH Amplifier 1 (ZZ-staartbomen voor staarten T1 tot T4) reagens 30 minuten voor het einde van de incubatie in evenwicht op RT, om te gebruiken in stap 5.2.
  4. Zodra de incubatie is voltooid, verwijdert u de vochtcontrolelade uit de hybridisatieoven en verwijdert u de schuifhouder. Zet de bakplaat terug in de oven.
  5. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in 1x wasbuffer met licht roeren gedurende 2 min.
  6. Herhaal de wasstap met verse 1x Wash Buffer gedurende 2 minuten bij RT.

5. RNA-ISH versterker hybridiseren 1

  1. Verwijder overtollige vloeistof van de glaasjes en plaats de dia's in de glaasjeshouder van de vochtlade. Plaats de glaasjeshouder in de vochtcontrolelade.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 en voeg het toe om elke sectie volledig te bedekken. Sluit de bakplaat en plaats deze 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40 °C. Plaats RNA-ISH Amplifier 2 (ZZ-staartbomen voor staarten T5 tot T8) reagens op RT, om te gebruiken in stap 6.2.
  3. Verwijder de vochtcontrolelade uit de hybridisatieoven en verwijder de schuifhouder. Zet de bakplaat terug in de oven.
  4. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in 1x wasbuffer met licht roeren gedurende 2 min.
  5. Herhaal de wasstap met verse 1x wasbuffer gedurende 2 minuten bij RT.

6. RNA-ISH versterker hybridiseren 2

  1. Verwijder overtollige vloeistof van de glaasjes. Haal de vochtcontrolebak uit de oven en plaats de diahouder in de bak
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 en voeg het toe om elke sectie te bedekken. Sluit de bakplaat en plaats deze 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40 °C.
  3. Plaats RNA-ISH Amplifier 3 (ZZ-staartbomen voor staarten T9 tot T 12) reagens bij RT, om te gebruiken in stap 7.2. Verwijder de schuifhouder van de lade. Plaats de bakplaat terug in de oven.
  4. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in 1x wasbuffer met licht roeren gedurende 2 min.
  5. Herhaal de wasstap met verse 1x wasbuffer gedurende 2 minuten bij RT.

7. RNA-ISH versterker hybridiseren 3

  1. Verwijder overtollige vloeistof van de glaasjes. Haal de vochtcontrolebak uit de oven en plaats de diahouder in de bak
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 en voeg het toe om elke sectie volledig te bedekken. Sluit de bakplaat en plaats deze 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40 °C.
  3. Bereid tijdens de incubatie het metaaloligosmengsel voor op stap 8. Elke oligo wordt gebruikt in een concentratie van 1:15 (vanaf 10uM voorraad, zorg ervoor dat er voldoende eindvolume is om het hele weefselgedeelte te bedekken). Draai goed en laat de gemengde metaaloligo's bij RT staan tot gebruik. Haal de vochtcontrolebak uit de oven en verwijder vervolgens de schuifhouder van de bakplaat. Zet de bakplaat daarna terug in de oven
  4. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in 1x wasbuffer met licht roeren gedurende 2 min.
  5. Herhaal de wasstap met verse 1x Wash Buffer gedurende 2 minuten bij RT.

8. Hybridiseer metalen oligo's

  1. Verwijder overtollige vloeistof van de glaasjes. Haal de vochtcontrolebak uit de oven en plaats de schuifhouder in de bak. Voeg gemengde metaaloligo's toe die zijn voorbereid in stap 7.3 (vortex voor gebruik).
  2. Sluit de bakplaat en plaats deze 45 minuten in de hybridisatieoven bij 40 °C.
  3. Verwijder de vochtcontrolelade uit de hybridisatieoven en verwijder de schuifhouder. Zet de bakplaat terug in de oven.
  4. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in 1x wasbuffer met licht roeren gedurende 2 min.
  5. Herhaal de wasstap met verse 1x Wash Buffer gedurende 2 minuten bij RT.

9. Metaal geconjugeerde antilichamen

  1. Om niet-specifieke plaatsen te blokkeren, brengt u voldoende hoeveelheid blokkeerbuffer aan om het hele weefselgedeelte te bedekken en incubeert u gedurende 30 minuten bij RT.
  2. Bereid tijdens de incubatie de antilichaammix voor gebruik in stap 10.1 door de antilichamen (tabel 1) te verdunnen in de buffer van het antilichaamverdunningsmiddel.

10. Incubatie met metaal geconjugeerde antilichamen

  1. Gooi na het blokkeren van de bufferincubatie de blokkeerbuffer van de weefselglaasjes weg en doseer voldoende volume van het Ab-mengsel (vanaf stap 9.2) om het hele weefselgedeelte te bedekken.
  2. Plaats het glaasje in een vochtigheidskamer en broed een nacht (~16 uur) bij 4 °C.

11. DNA-kleuring

  1. Bereid verse Ir-Intercalator-oplossing.
    1. Bereid uit een stockoplossing van 500 μM een werkoplossing van 1:2000 in RNase-vrije TBS. Werkoplossing kan worden verdeeld en bewaard bij -20 °C (niet invriezen en ontdooien).
  2. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in TBS-T buffer met licht roeren gedurende 5 min.
  3. Herhaal de was in TBS-T.
  4. Kleurdia's met Ir-werkoplossing (vanaf stap 11.1.1) gedurende 5 minuten bij RT.
  5. Plaats de dia's in een doorzichtige diahouder die voorgewassen is met NFW. Was de dia's in TBS-T buffer met licht roeren gedurende 5 min.
  6. Herhaal de was in TBS-T.
  7. Was twee keer in TBS, 5 min (roer langzaam).
  8. Dompel het objectglaasje snel in ddH2O om kristallisatie van de zouten in de TBS op het weefsel te voorkomen.
  9. Droog het objectglaasje onder een chemische kap (10 min) en bewaar het bij 4 °C tot de beeldacquisitie.

12. Beeldacquisitie

  1. Laad de dia in de ablatiekamer van IMC.
  2. Maak een panoramabeeld om de interesseregio (ROI) te identificeren.
  3. Breng ROI's in kaart in de software voor het verzamelen van afbeeldingen.
  4. Pas de acquisitiesjabloon toe.
  5. Pas het laservermogen (ablatie-energie) aan op basis van het monstertype. De standaardinstelling is ingesteld op 0 dB.
    OPMERKING: Het wordt aangeraden om de ablatie-energie te testen met meerdere kleine weefselgebieden (30 μm x 30 μm), waarbij het vermogen elke keer met 1 dB wordt verhoogd. Selecteer de laagste ablatie-energie die het preparaat opruimt zonder in het objectglaasje te branden. Normaal gesproken resulteert dit in een laservermogen van 3-4 dB. Af en toe, als het weefsel dikker is dan geadviseerd, zal het laservermogen toenemen tot 5 dB.
  6. Start laserablatie. Het systeem stuurt de laser naar de ROI en ableert de metaalgelabelde eiwitten, waardoor aërosolpluimen worden gegenereerd die worden overgebracht naar de inductief gekoppelde plasma (ICP) toorts, waar de pluimen worden verdampt, verneveld en geïoniseerd in plasma.
  7. Meet de hoeveelheid van elke isotoop die door de detector wordt gemeten en omgezet in gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om eiwitten en mRNA in dezelfde test te detecteren, helpt ons te begrijpen hoe de cel zich voorbereidt op een aankomst, maar ook welke wachtrijen hij ontvangt terwijl hij reist en interageert met zijn omgeving. Zoals te zien is in de representatieve gegevens, zijn mRNA- en eiwitdetectie cruciale componenten in ruimtelijk biologisch onderzoek, aangezien de ondergrenzen van detectie behoorlijk uitdagend kunnen zijn op basis van de manier waarop de label-, detector- en/of beeld...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex multi-omics is een cruciale evolutie in de verzamelde gegevens, gericht op cel-tot-cel en cel-tot-buurt interacties die van invloed zijn op ziekteprogressie en behandeling. Het analyseren van deze gegevens in hetzelfde monster en dus dezelfde cel is van cruciaal belang, aangezien veel eiwitdoelen tijdelijk tot expressie worden gebracht of verschillen in mRNA- en eiwitexpressieniveau, waardoor een gerichte mRNA-detectie in combinatie met eiwit mogelijk maakt om moeilijk te detec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jared K. Burks is een consultant voor Standard BioTools.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met de Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de National Institutes of Health via MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk ondersteund door de MD Anderson's Cancer Center's Cancer Center's Support Grant Development Award, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. De inspanningen van JKB werden gedeeltelijk ondersteund door de P30 CA016672 en de NCI Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1. De inspanningen van SFB werden gedeeltelijk ondersteund door de Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 en 891490), The Honorable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research, het MDACC Ovarian Cancer SPORE Developmental Research Program, NIH 1R01CA261952-01A1. De inspanningen van SFB, JKB en BG werden gedeeltelijk ondersteund door een subsidie van 1U01CA294459-01. De auteurs willen graag Samuel Mok erkennen, die de gebruikte monsters heeft doorgesneden en verstrekt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Oligonucleotide-polymer conjugation for imaging mass cytometry V.2 
10x TBS RNAse-FreeThermo Fisher Scientific J62780.K7Voor intermitterende wasbeurten tussen stappen
ACD HybEZ II Hybridization SystemACD Biotechne321711Oven voor het bakken van weefselschuiven
Antibody DiluentDakoS0809 Antilichaamverdunningsbuffer
Antibody: B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFClone: BLR025F, BLR026F
Antibody: B7-H4Thermo Fisher Scientific 14-5949-82Clone: H74
Antibody: BRD4(6F11)BethylA700-005CFClone: BL-151-6F11
Antibody: CCR6R&DMAB195-100Clone: 53103
Antibody: CD11bAbcam ab209970Clone: EPR1344
Antibody: CD25Abcam ab215378Clone: EPR6452
Antibody: CD278/ICOSCST 89601BFClone: D1K2T
Antibody: CD31Abcam ab207090Clone: EPR3094
Antibody: CD33Abcam ab238784Clone: SP266
Antibody: CD3e CST85061BFClone: D7A6E
Antibody: CD4Abcamab181724Clone: EPR6855
Antibody: CD44Thermo Fisher Scientific MA1-10225Clone: IM7
Antibody: CD45Thermo Fisher Scientific 14-9457-82Clone: CD45-2B11
Antibody: CD8aCST 85336BFClone: D8A8Y
Antibody: CXCL13R&DAF801Clone: Polyclonal
Antibody: CXCR5R&DMAB190-100Clone: CXCR5
Antibody: gamma-H2AXBethylA700-053CFClone: BLR053F
Antibody: Granzyme BSanta Cruzsc-8022 xClone: 2C5
Antibody: KAP1BethylA700-014CFClone: BL-248-2G6
Antibody: Ki67BethylA700-021CFClone: BLR021E
Antibody: LCK CST2984BFClone: D88
Antibody: MFAP5N/AN/APMID: 31332047 / Clone: 130A  (Opmerking: op maat ontworpen) 
Antibody: SMACST56856BFClone: 1A4
Antibody: VEGFSTB-Fluidigm3163028DClone: G153-494
Antibody: VISTACST64953BFClone: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKAntigeenretrievalbuffer
Ethyl Alcohol 100% (200 Proof)Pharmco111000200Voor deparaffinisatie
EZ – Retriever IRBioGeneXMW016-IRAntigeenretrievalsysteem voor FFPE weefselsecties
HybEZ II Hybridization SystemACD Biotechne321710Het systeem bestaat uit: HybEZ oven (PN 321710/321720), een vochtheidcontrolelade (PN 310012) en HybEZ Bevochtigingspapier (2 vellen PN 310025), EZ-Batch Waslade (PN 321717), EZ-Batch Schuifhouder (PN 321716)
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen VectorLabsH-4000Hydrofobe Barrière Pen
Ir Intercalator SolutionThermo Fisher Scientific NC1038184Wordt gebruikt voor het identificeren van genucleeerde cellen
KERATIN 8/18CST 4546BFClone: C51
Metal OligosVariousVariousMetaaltag variërend van T1 tot T12, afhankelijk van wat nodig is
Nuclease-free water (NFW)Corning 46-000-CM Om alle apparatuur schoon te maken en voor te bereiden, en om te gebruiken als verdunningsmiddel wanneer nodig
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 Wordt gebruikt om celmembranen van monsters te permeabiliseren
RNAscope EZ-Batch Slide HolderACD Biotechne310017Ontworpen om tot 20 slides efficiënt handmatig batch te verwerken
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 ACD Biotechne324409Reagentia voor RNAScope
RNAscope HiPlex Probe - Target ProbesACD BiotechneVariousVariërend van T1 tot T12, afhankelijk van wat nodig is
RNaseZap RNase Decontamination SolutionThermo Fisher ScientificAM9782Een oppervlaktedecontaminatieoplossing die RNases vernietigt
Staining Rack Microscope Slide Basket Holder 24 Place Chemical Resistant PlasticOptimal Scientific3028Voor het kleuren van meerdere slides
Tween 20Thermo Fisher Scientific AAJ20605APVoor intermitterende wasbeurten tussen stappen
Ultravision Protein BlockThermo Fisher Scientific TA125PBQBlokkingsbuffer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ruimtelijke transcriptomicain situ hybridisatiedetectie van metaalprobesbiomarkers voor eierstokkankerCD8 T cellenkankergeassocieerde fibroblastenruimtelijke proteomica

Gerelateerde artikelen