Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

744 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68617

⸱

7 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

Samenvatting

Bij gebruik van traditionele, op sondes gebaseerde in situ hybridisatie (ISH) beeldvormingsdetectiemethoden, zijn microRNA's (miRNA's) moeilijk vast te leggen vanwege hun grootte, die varieert van 19 tot 25 nucleotiden. Aangezien miRNA's echter belangrijke epigenetische regulatoren zijn die bijdragen aan de normale fysiologie en tal van pathologische aandoeningen, is het belangrijk om het spatiotemporele gedrag van miRNA's te begrijpen om hun functie op cellulair en subcellulair niveau te ontrafelen. Dit creëert een duidelijke behoefte aan adequate detectie- en visualisatietechnieken. Daarom hebben we MicroRNA-amplificatie en -herkenning gecreëerd door middel van vergrendeld nucleïnezuur in situ hybridizatioN (MARLIN), dat is ontwikkeld en geoptimaliseerd met behulp van multiplex-immunofluorescentiekleuring en vergrendelde nucleïnezuur (LNA) -sondes gericht op een miRNA. Deze methode kan miRNA kwantificeren met gemultiplexte eiwitexpressie, waardoor intracellulair en extracellulair miRNA binnen de tumormicro-omgeving (TME) met hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid kan worden gekwantificeerd. Het gecombineerde gebruik van miRNA-detectie en eiwitafvangassays kan ook een uitgebreid begrip opleveren van cellulaire functies en regulatiemechanismen binnen die TME.

Inleiding

microRNA's
Hoewel microRNA's (miRNA) ongelooflijk klein zijn, met een lengte van 19-25 nucleotiden, zijn deze enkelstrengs RNA-moleculen krachtige regulatoren in genexpressie, waarbij boodschapper-RNA's (mRNA's) post-transcriptioneel worden gemoduleerd door middel van sequentiespecifieke interacties1. In wezen fungeren miRNA's als negatieve regulatoren door zich te binden aan doel-mRNA's, ofwel hun translatie te voorkomen of hun afbraak door mRNA-splitsing te bevorderen, afhankelijk van de mate van complementariteit, wat uiteindelijk leidt tot verminderde eiwitoutput van het beoogde gen. Hoewel miRNA's in feite niet-coderend RNA zijn, wordt ongeveer 40% van alle miRNA's nog steeds aangetroffen in introns of exonen van eiwitcoderende genen2. Het functionele doel van miRNA's omvat verschillende belangrijke biologische processen, zoals celproliferatie, angiogenese, apoptose, enz. Met name de ontregeling van miRNA's is betrokken bij het ontstaan van tumoren, aangezien afwijkende expressie van specifieke miRNA's en miRNA-gemedieerde genregulatie in verband is gebracht met oncogene transformatie bij meerdere kankertypes3.

Sinds hun ontdekking zijn miRNA's uitgebreid onderzocht bij verschillende ziekten vanwege hun weefselspecifieke expressie- en regulerende functies, waarbij hun ontregeling verband houdt met vele ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, auto-immuunziekten en verschillende vormen van kanker 4,5,6. De expressiepatronen van miRNA's kunnen worden gecorreleerd met kankertype, stadium en klinische variabelen, waardoor miRNA-profilering een waardevol hulpmiddel is voor de diagnose en prognose van kanker 4,5,6,7. De ontdekking van nieuwe miRNA's is ook versneld door vooruitgang in high-throughput sequencing-technologieën, waardoor het begrip van miRNA-betrokkenheid bij diverse biologische processen is verbeterd8. Het belang van miRNA's werd onderstreept door de Nobelprijs voor de geneeskunde in 2024 die werd toegekend aan Victor Ambros en Gary Ruvkun voor hun ontdekking van de functie van miRNA in posttranscriptionele regulatie9.

Als waardevolle biomarkers voor de diagnose en prognose van ziekten is het therapeutisch potentieel van miRNA's onderzocht, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van miRNA-gerichte geneesmiddelen. Het therapeutisch potentieel van miRNA's bij de behandeling van kanker ligt in hun vermogen om modules van genen te coördineren, waardoor mogelijk de normale cellulaire functies worden hersteld10. Eerder zijn op miRNA gebaseerde antikankertherapieën ontwikkeld, hetzij als monotherapie, hetzij in combinatie met bestaande gerichte therapieën om de behandelingsrespons te verbeteren en de genezingspercentages te verhogen11. Het dynamische spectrum van miRNA's heeft ze gepositioneerd als essentiële bronnen voor innovatieve strategieën voor de behandeling van kanker. In de context van therapeutische resistentie is het richten op miRNA's veelbelovend gebleken bij het verminderen van recidief en resistentie tegen traditionele kankerbehandelingen, waardoor de overleving van de patiënt mogelijk wordt verbeterd door zich te richten op kankercellen12. Door de rol van miRNA's bij het moduleren van de activiteiten van verschillende celtypen in de tumormicro-omgeving (TME) te onderzoeken, kunnen mogelijk unieke en klinisch relevante kankerbehandelingen worden ontdekt.

Beschikbare tests om miRNA's te detecteren
Momenteel is de meest gebruikelijke methode voor miRNA-meting gebaseerd op geëxtraheerd RNA voor kwantitatieve real-time PCR (q-RT-PCR) of Next Generation Sequencing (NGS), waardoor ruimtelijke context verloren gaat. Er zijn bedrijven die TaqMan-microRNA-assays zullen leveren, die doelspecifieke stamlusprimers gebruiken voor cDNA-synthese, en SYBR Green-kleurstof-gebaseerde chemie met universele cDNA-synthese. Deze testen kunnen een hoge gevoeligheid en specificiteit bieden en kunnen worden uitgevoerd op een reeks q-RT-PCR-instrumenten. Helaas kunnen TaqMan-tests geen absolute kwantificering bieden, wat kan leiden tot problemen zoals valse positieven en variabiliteit in resultaten13. Ondanks hun hoge gevoeligheid kan de toepassing van deze tests in verschillende soorten monsters ook worden beperkt door de noodzaak van uitgebreide monstervoorbereiding en mogelijke interferentie van andere componenten in het monster.

Next-Generation Sequencing (NGS): miRNA-seq wordt steeds populairder voor differentiële expressieanalyse over het gehele miRNome van biovloeistoffen. Een voordeel van NGS-technologieën zoals miRNA-seq is dat ze massale parallelle analyses van de genoombrede expressie van miRNA's mogelijk maken, waardoor de kwantificering van individuele miRNA's, identificatie van sequentievariaties en ontdekking van nieuwe miRNA's mogelijk wordt14. Een aanzienlijk nadeel van op sequencing gebaseerde methoden, zoals IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit, is de inductie van kwantitatieve vertekeningen, die de nauwkeurigheid van differentiële expressieanalyses beïnvloeden, grotendeels als gevolg van de homologie en kleinere leeslengtes van miRNA's14. Niet alleen dat, maar de aanwezigheid van isomiR's (varianten die in sequentie of lengte verschillen van de canonieke miRNA-sequentie) en technische artefacten kunnen de interpretatie van gegevens bemoeilijken, wat mogelijk kan leiden tot verkeerde detecties en verstorende factoren in biomarkertests14. Ook kunnen verschillende tools voor miRNA-seq-gegevensanalyse, zoals sRNAbench en miRDeep2, verschillende resultaten opleveren, wat de consistentie en betrouwbaarheid van nieuwe miRNA-ontdekkingen beïnvloedt15,16. Zelfs zoiets als microarray-technologie kan in de meeste gevallen onvoldoende zijn. Hoewel het een krachtig platform met hoge doorvoer kan bieden voor het detecteren van miRNA- of genexpressieniveaus, waardoor het geschikt is voor genoombrede studies, wordt de technologie nog steeds beperkt door het aantal eerder geïdentificeerde miRNA's en kan het miRNA-doelwitinteracties niet direct verifiëren, wat hun bruikbaarheid in functionele studies beperkt17.

De belangrijkste factor die hier kan worden benadrukt bij het vergelijken van al deze beschikbare opties is het gebrek aan ruimtelijke context. Ze bieden geen enkele context met betrekking tot de weefselmorfologie of spatiotemporele verdeling binnen de cellen. Het visualiseren van het spatiotemporele gedrag van miRNA's is nodig om hun functie op cellulair en subcellulair niveau te ontrafelen. Momenteel zijn miRNAscope in situ hybridisatie (ISH)-assays toegankelijk, meestal met behulp van chromogene detectiemethoden. Hoewel deze tests de visualisatie van miRNA met een resolutie van één cel mogelijk maken, zijn de resultaten van slechte kwaliteit, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen de miRNA-expressie en de achtergrond van het monster. Over het algemeen produceren veel van deze tests van lage kwaliteit, die onbetrouwbaar zijn en meestal handmatige kwantificering vereisen.

Daarom hebben we MicroRNA-amplificatie en -herkenning ontwikkeld door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN (MARLIN) met behulp van multiplex immunofluorescentiekleuring (door opaaleiwitkleuring) en locked nucleïnezuur (LNA) sondes gericht op een miRNA, in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. We hebben dit bereikt door een Tyramide Signal Amplification (TSA)-systeem te implementeren dat wordt geactiveerd door een anti-digoxigenine (DIG) mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd antilichaam. De HRP fungeert als een katalysator voor de TSA, terwijl de Anti-DIG zich hecht aan de LNA-sonde. Deze test is met name nuttig om de essentiële aard van miR's te begrijpen bij posttranscriptomische modificatie met eiwitten en mogelijk andere RNA's tegelijkertijd. Bovendien biedt MARLIN een effectieve manier om de in situ relaties van miR's en eiwitten in FFPE-monsters te begrijpen, vanwege het ontbreken van een in de handel verkrijgbare test die zowel miRNA- als eiwitexpressie kan kwantificeren.

De eerste resultaten van de kwantificering van miR-181c-3p met behulp van MARLIN toonden de haalbaarheid aan van parallelle analyse van miRNA's en eiwitten binnen de oorspronkelijke ruimtelijke context van menselijk ovarium-FFPE-weefsel. Naast dit voorbeeld, gebaseerd op de componenten van MARLIN, is het theoretisch mogelijk om uit te breiden tot maximaal vier eiwitten met behulp van commerciële fluorescerende multiplexing-fluoroforen zoals Alexa Fluor of andere kleurstoffen met kleine moleculen18.

Aangezien deze methodologie gebruik maakt van variaties op standaard histologiemethoden, zou deze bovendien compatibel moeten zijn met andere FFPE-weefsels van zoogdieren, mits de juiste sonde en antilichaamselectie wordt gebruikt. Deze methodologie behoudt de ruimtelijke architectuur en maakt de kwantificering van cellulaire en subcellulaire miRNA- en eiwitcolokalisatie mogelijk. Deze benadering pakt een kritieke lacune in de ruimtelijke biologie aan door co-expressiepatronen en ruimtelijke verdeling van miRNA's en eiwitten in kaart te brengen, die direct kunnen worden gecontextualiseerd binnen inheemse weefselarchitecturen. Hier presenteren we MARLIN met een gedetailleerd grafisch overzicht in Figuur 1. Hoewel het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor miR-181c-3p, zijn andere miR's mogelijk om te bestuderen, mits een geschikt sondeontwerp. Kritische parameters voor deze methode zijn onder meer: de beoordeling van de weefselkwaliteit en de optimalisatie van sondeconcentraties. Het wordt aanbevolen om de RNA-integriteit van het weefselblok te beoordelen met behulp van een DV200-metriek door twee secties van 10 μm te gebruiken en het RNA te extraheren met behulp van een protocol dat alle RNA-fragmentgroottes behoudt. Monsters met een DV200-score van meer dan 50 of beter, en protocolconcentraties, moeten systematisch worden getest.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels van menselijke eierstoktumorweefsels van patiënten met HGSC. Deze monsters werden verzameld van niet eerder behandelde patiënten die een primaire cytoreductieve operatie voor eierstokkanker ondergingen. Alle monsters en klinische gegevens werden verkregen uit de repository voor eierstokkanker van de afdeling Gynaecologische Oncologie en Reproductieve Geneeskunde volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Texas MD Anderson. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen door het receptiepersoneel en de onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met erkende ethische richtlijnen.

1. Weefsel preparatie

  1. Bak alle FFPE-monsters een nacht bij 60 °C en reinig elk apparaat en gereedschap met RNAsevrij water. Zorg ervoor dat de secties ongeveer 5 μm dik zijn.
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor eierstoktumoren, maar kan na verder testen mogelijk worden gebruikt met andere weefseltypes.
  2. Voer deparaffinisatie uit met drie rondes xyleen gedurende 5 minuten per ronde en 10 rondes rehydratatie gedurende 3 minuten per ronde (100% ethanol (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). Was één keer met 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 2 min.
    OPMERKING: Deze stap voor het verwijderen van wax, hoewel aanbevolen, is optioneel en afhankelijk van het weefseltype.
  3. Breng na deparaffinisatie en rehydratatie een oplossing van 3% waterstofperoxide (H2O2) aan gedurende 10 minuten. Was gedurende 2 minuten met 1x TBS, 2x. Breng vervolgens gedurende 10 minuten een oplossing van 3,7% paraformaldehyde (PFA) aan. Was gedurende 2 minuten met 1x TBS, 2x.
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en mag alleen worden overwogen voor vetweefsel of monsters die vatbaar zijn voor loslating.
  4. Ga verder met de eerste ronde van het ophalen van antigeen. Dit protocol maakt gebruik van het EZ-Retriever IR Systeem. Volg de instructies van het systeem en zet de monsters in de magnetron terwijl ze gedurende 15 minuten zijn ondergedompeld in een verse EZ-AR1-buffer bij 95 °C. Laat 20 minuten afkoelen.
  5. Was gedurende 2 minuten met 1x TBS. Daarna 2 min met 1x TBS-T (1x TBS met 0,1% Tween), 2x.

2. Eiwit toepassing

  1. Teken een barrière rond elk weefselgedeelte met een hydrofobe barrièrepen.
  2. Voeg 1x antilichaamblokkerende oplossing toe (genoeg om het hele weefselgebied te bedekken) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtigheidskamer (omgevings- en ongecontroleerde vochtigheid).
  3. Verdun vervolgens het eerste primaire antilichaam met dezelfde blokkeeroplossing, breng voldoende aan om het hele weefselgebied te bedekken en laat 1 uur bij kamertemperatuur incuberen in een vochtigheidskamer.
    OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van dit protocol is Anti-CD8 gebruikt in een verdunning van 1:75.
  4. Was gedurende 2 min in 1x TBS-T, 3x. Voeg vervolgens de Anti-Ms + Rb HRP toe en laat de monsters 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur in een vochtigheidskamer (omgevings- en ongecontroleerde vochtigheid).
  5. Was gedurende 2 min in 1x TBS-T, 3x. Verdun de eerste fluorofoor met de versterkingsverdunningsverdunner bij 1:100 en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de vochtigheidskamer.
    OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van dit protocol werd een fluorofoor met een emissie van 690 nm gebruikt. Vanaf dit punt wordt aanbevolen om voor de rest van de procedure minimale verlichting te gebruiken na het aanbrengen van de eerste ronde fluorofoor.
  6. Was gedurende 2 min in 1x TBS-T, 3x. Begin de tweede ronde van antilichaamkleuring met de tweede ronde van antigeenextractie in de magnetron, door de monsters opnieuw onder te dompelen in verse EZ-AR1-buffer bij 95 °C gedurende 15 minuten en vervolgens 20 minuten af te koelen.
  7. Was gedurende 2 minuten met 1x TBS. Was vervolgens 2 minuten met 1x TBS-T, 2x.
  8. Breng de 1x antilichaamblokkerende oplossing opnieuw gedurende 30 minuten aan in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur (omgevings- en ongecontroleerde vochtigheid).
  9. Verdun het tweede primaire antilichaam met dezelfde blokkerende oplossing, breng voldoende aan om het hele weefselgebied te bedekken en laat een nacht bij 4 °C in een vochtigheidskamer gedurende ten minste 16 uur incuberen.
    OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van dit protocol werd Anti-EpCAM gebruikt in een verdunning van 1:200.
  10. Begin de volgende dag met 2 minuten wassen in 1x TBS-T, 3x. Voeg vervolgens de Anti-Ms + Rb HRP toe en laat de monsters 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur in een vochtigheidskamer (omgevings- en ongecontroleerde vochtigheid).
  11. Was gedurende 2 min in 1x TBS-T, 3x. Verdun de tweede fluorofoor met de versterkingsverdunningsverdunning bij 1:100 en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de vochtigheidskamer.
    OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van dit protocol is een fluorofoor met een emissie van 620 nm gebruikt.

3. Toepassing van de sonde

  1. Was gedurende 2 min in 1x TBS-T, 3x.
  2. Begin de derde en laatste antigeenextractie met EZ-AR1 Elegance in de magnetron bij 107 °C gedurende 15 minuten. Laat 20 minuten afkoelen. Was gedurende 3 minuten in 1x TBS.
  3. Breng RNAscope Protease Plus aan (voldoende om het hele weefselgebied te bedekken) en houd gedurende 30 minuten op 40 °C. Gebruik een oven. Was gedurende 5 minuten in 1x TBS, 2x.
  4. Voer de voorbereiding van de sonde uit door denaturatie bij 90 °C gedurende 4 minuten van de miRNA LNA-sonde. Verdun de sonde vervolgens onmiddellijk met behulp van miRNA-ISH-buffer. Draai en draai de sonde-oplossing.
    OPMERKING: Tijdens de ontwikkeling van dit protocol werd miR-181c-3p doelwitsonde gebruikt met een verdunning van 1:250.
  5. Breng de sonde aan (voldoende om het hele weefselgebied te bedekken) en plaats terug in de oven gedurende 1 uur op 60 °C. Was gedurende 5 minuten in 5x zoutoplossing natriumcitraat (SSC) buffer.
  6. Voer vijf strenge wasbeurten uit in SSC voorverwarmd bij 60 °C in de volgende volgorde en verdunningen gedurende 5 minuten per ronde: één ronde van 5x SSC, twee rondes van 1x SSC en twee rondes van 0,2x SSC.
  7. Was gedurende 5 minuten in 0,2x SSC op kamertemperatuur. Incubeer met blokkeerbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Gebruik een combinatie van 1x TBS en 0,5% blokkerend reagenspoeder, zorg ervoor dat u de blokkerende oplossing vortex en draait voordat u deze aanbrengt.
  8. Breng een anti-digoxigenine (muis) HRP-conjugaat aan (voor deze monsters werd een verdunning van 1:500 gebruikt) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
  9. Was gedurende 5 minuten in 1x TBS-T, 3x Breng een aanbevolen verdunning van 1:50 van de Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) fluorofoor aan gedurende 10 minuten in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur (omgevingstemperatuur en ongecontroleerde vochtigheid). Zorg ervoor dat u de TSA+Cy3-oplossing vortex en draait voordat u deze aanbrengt.
  10. Was gedurende 5 min in 1x TBS-T, 3x.

4. Nucleaire kleuring en montage

  1. Breng 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) werkoplossing (voldoende om het hele weefselgebied te bedekken) aan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer (omgevingstemperatuur en ongecontroleerde vochtigheid).
    OPMERKING: Voor dit protocol werd een verdunning van 1:1000 gebruikt, waarbij de werkende DAPI-voorraad werd verdund in TBS.)
  2. Was gedurende 5 min in 1x TBS-T, 3x. Breng na voltooiing dekglaasjes aan met behulp van montagemedia en laat de dia's 10 minuten drogen. Bewaar objectglaasjes bij 4 °C in het donker tussen 24-72 uur vóór de beeldvorming en tot drie maanden erna.

5. Beeldvorming en analyse

  1. Gebruik voor beeldvorming een dia-scanmicroscoop (bij voorkeur) met een vergroting van 40x.
  2. Voer vervolgens kwantitatieve analyse uit om puncta op te sommen met behulp van DAPI en eiwittegenkleuring voor celsegmentatie en fenotypering.
    OPMERKING: Tijdens dit protocol hebben we beeldvorming gebruikt met een Phenoimager HT. Volledige dia's werden gemaakt met een vergroting van 40x met behulp van de juiste filters voor de aanwezige fluoroforen, en gemultiplexte afbeeldingen werden vervolgens geëxporteerd als OME-TIFF-bestanden. De gescande afbeeldingen werden vervolgens geüpload naar Visiopharm Image Analysis Software voor kwantitatieve analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij het testen van dit protocol is het belangrijk om twee seriële secties van hetzelfde representatieve monster te hebben voor nauwkeurigheid en vergelijking. In dit geval werd een monster van hooggradige eierstokkanker (HGSC) gebruikt om de resultaten te vergelijken. Er werd gebruik gemaakt van een controleglaasje (Figuur 2A-B) dat alleen door de miRNA-kleuring zou gaan en een testobjectglaasje dat zowel eiwit- als miRNA-kle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel het belang van miRNA's wordt erkend en begrepen, worden observaties van zowel de normale ontwikkeling als de ziektetoestanden momenteel belemmerd door de moeilijkheid om miRNA's te bestuderen met behulp van standaardmethoden. De schaarste aan in situ methoden leidde tot de ontwikkeling van MARLIN (miRNA FISH assay). Gezien de homologie en de korte lengte van miRNA's, wordt het een uitdaging om hun locatie en effect op post-transcriptomische regulatie te visualiseren. Deze...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen graag de volgende mensen erkennen, Chi Lam Au Yeung en Manjunath Nimmakayalu, die deel uitmaakten van de scriptiecommissie van Basant terwijl de test in ontwikkeling was. Ook Samuel Mok, die de gebruikte monsters doorbracht en leverde. Tot slot gaan we onze dank uit aan Johan Doré en Dan Winkowski, die uitgebreide hulp hebben geboden bij de analyse en het gebruik van de Visiopharm-software. Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door de Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 en 891490), de Sie Foundation en het Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met de Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de National Institutes of Health via MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 en Jared Burks' NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x TRIS-buffered Saline (TBS) pH 7.6 Thermo Fisher Scientific J62662 K7Voor intermitterende wasbeurten tussen stappen
1x Opal Antibody Diluent/Block Akoya BiosciencesARD1001EAEiwitblokkeringsoplossing
1x Plus Automation Amplification DiluentAkoya Biosciences FP1609Gebakken om Opal fluoroforen te verdunnen
20x Concentrate Saline Sodium Citrate (SSC) BufferSigma-AldrichS6639-1LVoor miRNA-wasbeurten na sonde-hybridisatie
4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Voor nucleaire kleuring
ACD HybEZ II HybridisatiesysteemACD Biotechne321711Oven gebruikt om de temperatuur te regelen tijdens het miRNAscope-protocol
Anti-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAbCell Signaling Technologies85336SVoorbeeld van primaire antilichaam gebruikt om dit protocol te optimaliseren
Anti-Digoxigenin (muis) HRP-conjugaatRevvity Health Sciences IncNEF832001EASecundaire reagens gebruikt voor miRNA-detectie
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbCell Signaling Technologies93790Voorbeeld van primaire antilichaam gebruikt om dit protocol te optimaliseren
Blocking Reagent PowderAkoya Biosciences FP1012miRNA-blokkeringsoplossing
Ethyl Alcohol 100% (200 Proof)Pharmco111000200Voor ontvetten
EZ-AR1 BufferBioGeneXHK521-XAKGebakken voor antigeenretrieval van FFPE-weefselsneden in de eiwitstap
EZ-AR1 Elegance BufferBioGeneXHK546-XAKGebakken voor antigeenretrieval van FFPE-weefselsneden in de miRNA-sonde stap
EZ-Retriever IR-systeemBioGeneXMW015-IRMicrogolfoven gebruikt voor antigeenretrieval van FFPE-weefselsneden
Waterstofperoxide-oplossing 30% Sigma-Aldrich HX0640-5 Voor weefselbereiding. Helpt bij het blokkeren van endogene peroxidase-activiteit en om zeer gekleurde producten op te leveren
miR-181c-3p miRNA-sondeQiagen339112Voorbeeld van miRNA-sonde gebruikt om dit protocol te optimaliseren
miRCURY LNA miRNA ISH-bufferset (FFPE)Qiagen339450 Gebakken om miRNA-sonde te verdunnen
Opal 620Akoya Biosciences FP1495001KTFluorofoor om primaire antilichamen te identificeren
Opal 690 Akoya Biosciences FP1497001KTFluorofoor om primaire antilichamen te identificeren
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EASecundair antilichaam gebruikt als detectie-agens
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-vrijThermo Fisher Scientific28908Om 3,7% PFA te maken voor weefselbereiding
ProLong Diamond AntifadeThermo Fisher ScientificP36970Montagemedia
RNAscope Protease PlusACD Biotechne322331Om weefselsneden te permeabiliseren door eiwitten gedeeltelijk te verteren & doel-miRNA-moleculen te blootleggen
RNAse-vrij water Corning 46-000-CM Om alle apparatuur te reinigen en voor te bereiden, en om te gebruiken als verdunning wanneer dat nodig is  
Tween 20Sigma-AldrichP1379-25MLOm TBS-T te maken
Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3Akoya Biosciences NEL744001KTFluorofoor om miRNA te identificeren
U6 en Scramble miRNA-sondesQiagen339459Optionele controlesondes
Xyleen Histologisch graadThermo Fisher ScientificUN1307Voor ontvetten

Referenties

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

MicroRNA detectiemultiplex immunofluorescentietumormicro omgevingeiwitcolocalisatieFFPE weefseltyramidesignaalversterkingruimtelijke transcriptomicaEpCAM antilichaam
MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.