Method Article

Sequentiële detectie van biomoleculen in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters met massaspectrometriebeeldvorming

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een Mass Spectrometry Imaging-protocol voor de detectie van sequentiële metabolieten, N-gebonden glycaan en tryptische peptiden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselmonsters.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefsels zijn complexe cellulaire omgevingen, bestaande uit een breed scala aan celtypen en biomoleculen die allemaal met elkaar in wisselwerking staan om de functies van het orgaan uit te voeren. Traditioneel betroffen technieken voor de analyse van biomoleculen zoals metabolieten, glycanen en eiwitten de homogenisatie van weefsel, waarbij alle ruimtelijke informatie werd vernietigd. Deze traditionele methoden remden het volledige begrip van complexe intra- en extracellulaire moleculaire interacties. Mass Spectrometry Imaging (MSI), aan de andere kant, bewaart niet alleen de ruimtelijke informatie van biomoleculen in weefsel, maar maakt het ook mogelijk om meerdere klassen analyten te detecteren uit hetzelfde weefselgedeelte door middel van sequentiële analyse met een resolutie van bijna één cel. Dit stelt ons in staat om een completer beeld af te leiden van moleculaire interacties tussen verschillende klassen van biomoleculen. Het hier gepresenteerde protocol schetst de stappen voor het uitvoeren van massaspectrometriebeeldvorming van metabolieten, N-gebonden glycanen en tryptische peptiden achtereenvolgens uit hetzelfde weefselgedeelte met een resolutie van 20 μm. Door nauwgezet rekening te houden met de volgorde waarin de klassen analyten worden afgebeeld, samen met een zorgvuldige behandeling van de secties om de integriteit te waarborgen, kunnen meerdere afbeeldingen van hoge kwaliteit uit dezelfde sectie worden verzameld. Deze gegevens kunnen vervolgens worden geïntegreerd met andere ruimtelijke omics-gegevens (transcriptomics, immunohistochemie, enz.) die zijn verzameld uit seriële secties, waar dezelfde cel in deze aangrenzende secties kan worden geanalyseerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massaspectrometrie beeldvorming (MSI) is een krachtige techniek die de detectie en visualisatie van honderden tot duizenden biomoleculen uit dunne weefselsecties mogelijk maakt, zonder dat er a priori kennis nodig is van de exacte moleculen die in het weefsel aanwezig zijn, waardoor het een uitstekend hulpmiddel is voor het ontdekken van biomarkers1. Hoewel verschillende soorten MSI door verschillende laboratoria worden gebruikt, waaronder Desorption ElectroSpray Ionization (DESI)2,3, Infrared Matrix Assisted Laser Desorption ElectroSpray Ionization (IR-MALDESI)4 en Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS)5, blijft Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) de meest gebruikte en meest veelzijdige. De meeste klassen van biomoleculen kunnen door MSI worden gedetecteerd door de monstervoorbereiding aan te passen, inclusief wassen/voorbehandeling van het weefsel, enzymatische vertering en de gebruikte matrix/oplosmiddel 6,7. MALDI MSI is gebruikt voor de detectie van metabolieten, lipiden, glycanen, eiwitten en proteolytische peptiden.

MSI-onderzoeken zijn gebruikt in een verscheidenheid aan klinische en preklinische onderzoeken om onder andere ziektemechanismen beter te begrijpen 8,9, de classificatie en stadiëring van kanker te verbeteren10,11, de behandelingsuitkomstte voorspellen 12, de diagnosete verbeteren 13 en moleculaire tumormargeste bepalen 14. De meeste van deze onderzoeken hebben zich gericht op de detectie van slechts één enkele klasse analyten. Het is echter vaak interessant om meer dan één klasse biomoleculen uit hetzelfde monster te analyseren. Traditioneel wordt dat gedaan met seriële coupes van weefsels. Maar meer recentelijk zijn voorbeelden getoond van het achtereenvolgens analyseren van meerdere analytklassen uit hetzelfde weefselgedeelte. Yagnik et al. hebben bijvoorbeeld lipidenbeeldvorming van bevroren weefsel aangetoond, gevolgd door MALDI Immunohistochemie uit dezelfde sectie voor celtypeclassificatie15. Clift et al. hebben sequentiële toepassing van PNGaseF, collagenase en trypsine aangetoond op formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselsecties voor beeldvorming van respectievelijk N-gebonden glycanen, extracellulaire matrixeiwitten en algemene eiwitten16. Escobar et al. demonstreerden de sequentiële analyse van N-gebonden glycanen, O-GlcNAc en tryptische peptiden uit hetzelfde deel van bevroren weefsel17. Dit soort experimenten worden bereikt door zorgvuldige experimentele planning om eerst de analyten te analyseren die het gemakkelijkst verloren gaan, gevolgd door de analyten die stabieler in het weefsel zijn. In veel gevallen helpen de wasbeurten die worden gebruikt om ongewenste klassen van moleculen te verwijderen, andere klassen van moleculen te verbeteren6, een eigenschap waarvan kan worden geprofiteerd, waarbij elke wasbeurt die de eerder aangebrachte matrix verwijdert, ook helpt om het signaal van de volgende klasse analyten die moeten worden afgebeeld, te verbeteren.

Onlangs hebben we een workflow gepubliceerd voor de sequentiële analyse van metabolieten, N-gebonden glycanen en tryptische peptiden uit hetzelfde deel van FFPE eierstokkankerweefsel18. Hier presenteren we de gedetailleerde workflow voor de analyse van deze drie klassen van biomoleculen uit dezelfde weefselsectie; een overzicht van het protocol is gedetailleerd in figuur 1. Voor zover wij weten, is dit het eerste protocol dat deze workflow voor sequentiële beeldvorming van FFPE-weefsel in detail beschrijft. In het kort worden weefselsecties van was ontdaan met xyleen voordat ze worden gecoat met 1,5-diaminonaftaleenmatrix (10 mg/ml in 50% acetonitril) voor beeldvorming van metabolieten in negatieve ionenmodus. De matrix wordt vervolgens verwijderd, de secties gerehydrateerd en antigeen opgehaald, voordat ze worden besproeid met PNGase F (0,1 μg/μL in ammoniumbicarbonaat) om N-gebonden glycanen in situ vrij te maken. Na incubatie worden de secties gecoat met α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA) (10 mg/ml in 70% acetonitril, 0,1% trifluorazijnzuur) matrix en in positieve ionenmodus afgebeeld. De matrix wordt vervolgens opnieuw verwijderd, de rehydratatie en het ophalen van antigeen worden herhaald en de secties worden besproeid met trypsine (0,075 μg/μl in ammoniumbicarbonaat) en geïncubeerd voordat ze opnieuw worden gecoat met CHCA (10 mg/ml in 70% acetonitril, 0,1% trifluorazijnzuur) matrix en afgebeeld in positieve ionenmodus. Alle oplossingen moeten onmiddellijk voor gebruik vers worden gemaakt en indien mogelijk moeten de experimenten gedurende 3 opeenvolgende dagen worden uitgevoerd. Als er vertragingen optreden, moeten secties worden bewaard in een vriezer van -80 °C onder uitdroging.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels die zijn verzameld bij niet eerder behandelde patiënten die primaire cytoreductieve chirurgie ondergaan voor hooggradig sereus ovariumcarcinoom. Alle klinische gegevens zijn verkregen uit de repository voor eierstokkanker van de afdeling Gynaecologische Oncologie en Reproductieve Geneeskunde volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de MD Anderson van de Universiteit van Texas. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen door het receptiepersoneel en de onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met erkende ethische richtlijnen.

1. Voorbereiding van de metabolietbeeldvormingsmonster

OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat secties van formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed weefsel (4 μm dikte) al op glazen microscoopglaasjes zijn gemonteerd, aangezien klinische monsters over het algemeen door histotechnici in een klinische pathologiekern moeten worden gesneden. Aangezien het hier gepresenteerde werk wordt uitgevoerd op het TOF-instrument waarnaar wordt verwezen, verlicht de orthogonale TOF-meting de behoefte aan geleidende objectglaasjes die traditioneel worden gebruikt in MSI-experimenten. Het gebruik van standaard microscoopglaasjes is ook bevorderlijker voor standaardworkflows in klinische pathologielaboratoria en maakt het gebruik van archiefweefsel dat al op objectglaasjes zit, mogelijk.

  1. Maak betrouwbare markeringen op de vier hoeken van de dia met behulp van een diamanten schrijver.
  2. Deparaffiniseer secties door onderdompeling in xyleen van histologische kwaliteit gedurende 3 minuten.
    OPMERKING: Xyleen is schadelijk en moet worden gebruikt in een chemische zuurkast.
  3. Dompel secties 3 minuten onder in vers xyleen.
  4. Laat het glaasje drogen bij kamertemperatuur.
  5. Plaats de dia in een Slide Adapter Target.
  6. Verkrijg een optisch beeld van de dia met behulp van een flatbedscanner met een resolutie van 4.800 dpi.
  7. Maak een MALDI-matrix door 15 mg 1,5-diaminonaftaleen (DAN) op te lossen in 1,5 ml 50% ACN. Sonificeer tot volledig opgelost, ~5 min. Filtreer de matrixoplossing voordat u deze in de monsterlus laadt.
    OPMERKING: DAN is vermoedelijk kankerverwekkend en moet worden gebruikt met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Matrixspuiten moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.
  8. Spuit de dia met DAN-oplossing met behulp van een robotreagensspuit met de volgende parameters: Baansnelheid - 1.200 mm/s; Afstand tussen de rails - 3 mm; Nozzle temperatuur - 60 °C; Hoogte mondstuk - 40 mm; Debiet - 100 μL/min; Passen - 4; N 2 Druk - 10 psi; Patroon - CC
  9. Breng 0,5 μL rode fosfor gesuspendeerd in methanol aan op een bekende plaats op het objectglaasje.

2. Verzameling van metabolietbeeldvormingsgegevens

  1. Plaats de voorbereide dia('s) in een Slide Adapter II en laad ze in een timsTOF fleX MALDI QTOF massaspectrometer.
  2. Laad de juiste methode voor het verzamelen van gegevens in de negatieve ionenmodus in timsControl met tims UIT. Als het instrument zich nog niet in de negatieve ionenmodus bevond, wacht dan ten minste 25 minuten na het wisselen van polariteit voor evenwicht voordat u kalibratie en gegevensverzameling uitvoert met de volgende instrumentparameters voor metabolieten: m/z-bereik - 50 - 600; Laserscanbereik - 16,0 μm in zowel X als Y; Resulterende veldgrootte - 20,0 μm in zowel X als Y; Laserschoten - 150; Laserfluentie - ~30%; Trechter 1 RF - 150,0 Vpp; Trechter 2 RF - 200,0 Vpp; Meerpolige RF - 200,0 Vpp; Botsingsenergie - 10,0 eV; Botsing RF - 500.0 Vpp; Overdrachtstijd - 55,0 μs; PrePulse-opslag - 5,0 μs (aanvullende afbeelding S1).
  3. Voer een doelprofiel uit (klik op de knop Nu genereren ) en Focusaanpassing (klik op de knop Nu aanpassen ) op het tabblad Voorbeelddrager. Pas de laserpositie aan in X en Y, indien nodig op het lasertabblad om ervoor te zorgen dat de laser precies is uitgelijnd met het dradenkruis.
  4. Verzamel een spectrum van rode fosfor door ten minste vijf sets laserschoten vanaf de plek op de dia op te tellen.
  5. Voer een kalibratie uit door op de knop Kalibreren op het tabblad Kalibratie te klikken. Verwijder alle pieken met een zeer lage intensiteit of een hoge ppm-fout.
    LET OP: Zelfs fosforclusters (P2 en P4) geven over het algemeen een zeer zwak signaal. De kalibratiescore moet 100% zijn voordat u op accepteren klikt. Zo niet, wis dan het opgetelde spectrum en verkrijg een nieuw spectrum.
  6. Start de flexImaging-software . De GUI voor beeldacquisitie start automatisch.
  7. Selecteer Een nieuwe beeldbewerking instellen in het venster Beelduitvoering kiezen .
  8. Kies Klassieke werkstroom in het venster Workflow selecteren .
  9. Geef in het venster voor gegevensopslag een naam voor de beelduitvoeringsuitvoering en een resultatenmap voor de gegevens op.
    OPMERKING: Spaties mogen niet worden gebruikt in bestandsnamen.
  10. Kies in het venster Acquisitie-instellingen de optie Door de gebruiker gedefinieerde meetgebieden en typ 20 in het vak Rasterbreedte . Klik op Bladeren om de timsControl-methode te selecteren die eerder is gemaakt.
  11. Klik in het venster Voorbeeldafbeelding op Bladeren om de optische afbeelding te selecteren die is verkregen met de flatbedscanner.
  12. Voer in het venster Teach Sample een driepuntsuitlijning uit tussen het optische beeld en de dia; verplaats vervolgens de monsterdrager naar de eerste geëtste fiducial op de dia en lijn het dradenkruis uit in timsControl met een duidelijk kenmerk in de ets. Zoom in op de afbeelding (100% zoom aanbevolen), stel de voorbeeldafbeelding in op Teach Points instellen en klik op dezelfde locatie in de optische afbeelding. Herhaal dit proces nog 2x voor een totaal van drie leerpunten. Klik op Volgende om de les te voltooien.
  13. Klik op OK om de wizard Nieuwe beelduitvoering af te sluiten.
  14. Controleer de nauwkeurigheid van de les door in de software op de knop Position Sample Carrier te klikken. Zoom in en klik op een duidelijk kenmerk van het vierde (ongebruikte) fiduciale punt in de afbeelding; De monsterdrager gaat naar deze positie binnen timsControl. Controleer of het dradenkruis overeenkomt met het geselecteerde element. Als ze niet op één lijn liggen, wis dan de les in flexImaging en herhaal het leerproces om de nauwkeurigheid te verbeteren.
  15. Selecteer in de software de tool Polygoon Measurement Region toevoegen en schets het weefsel of de weefsels die moeten worden afgebeeld. Elke muisklik maakt een ankerpunt. Druk op de backspace-knop op het toetsenbord om punten één voor één te verwijderen. Zodra het gebied is getekend, dubbelklikt u op de muis om de veelhoek te sluiten.
  16. Controleer het signaal door de laser op een paar plaatsen in het weefsel af te vuren. Klik op een locatie in de afbeelding met behulp van de knop Positie Voorbeelddrager , zoals in stap 2.14, om het onderwijs te controleren. Het spectrum zal worden gedomineerd door matrixpieken rond m/z 157 en 313; Zoom in op het M/Z-gebied onder 154 en 250-300 om respectievelijk veel metaboliet- en vetzuurpieken met kleine moleculen te laten zien. Pas de laserfluentie indien nodig aan voor een optimaal signaal.
  17. Sla de timsControl-methode op.
  18. Start de beeldacquisitie door te klikken op de knop Start AutoXecute Run in de software
    OPMERKING: Beeldvorming in negatieve ionenmodus met DAN-matrix resulteert in de detectie van onder andere talrijke metabolieten uit de TCA-cyclus, aminozuren en vetzuren.

3. Monstervoorbereiding voor N-gebonden glycaanbeeldvorming

  1. Nadat u het monster uit de massaspectrometer hebt verwijderd, verwijdert u de DAN-matrix door het objectglaasje gedurende 100 minuten onder te dompelen in 100% ethanol (200 proof).
  2. Rehydrateer de dia in Coplin-potten: Verse 100% ethanol gedurende 1 minuut; 95% ethanol gedurende 1 minuut; 70% ethanol gedurende 1 minuut; Water gedurende 3 min; Vers water gedurende 3 min.
  3. Laat de dia ~15 minuten drogen.
  4. Voer het antigeenherstel uit door het objectglaasje onder te dompelen in een Tris-buffer van 100 mM (gemaakt door 6.06 g Tris-basis op te lossen in 500 ml water en de pH indien nodig aan te passen), pH 9, in een Coplin-pot met een deksel dat er losjes op is geplaatst en dat in een decloaking-kamer wordt geplaatst met 500 ml water in de kamer. Verwarm tot 95 °C gedurende 20 min.
  5. Haal de Coplin Jar uit de Decloaking Chamber en plaats deze 20 minuten op het werkblad om af te koelen.
  6. Buffer-wissel de dia om naar water over vijf wisselingen. Giet voor de eerste drie de helft van de oplossing eruit en vervang deze door water. Giet voor de laatste twee alle oplossing eruit en vervang deze door water.
  7. Laat de dia volledig drogen.
  8. Maak een vochtigheidskamer voor incubatie van het objectglaasje na PNGaseF-toepassing. Knip een cirkel van een absorberend doekje om de bodem van een petrischaal met een diameter van 100 mm te bedekken. Rol twee laboratoriumdoekjes om kussens te maken aan weerszijden van de petrischaal (Figuur 2). Voeg 8 ml water toe om deze doekjes te verzadigen en doe het deksel op de petrischaal en plaats deze minimaal 30 minuten in een oven op 37 °C om voor te verwarmen.
    OPMERKING: De binnenkant van de schaal moet er stomend uitzien.
  9. Bereid PNGaseF voor door 100 μg gevriesdroogd enzym te reconstitueren in 200 μL 100 mM ammoniumbicarbonaat, pH 7,8 en vortex om te mengen. Breng de oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en verdun tot 1 ml met water.
  10. Spuit het objectglaasje met PNGaseF met behulp van de robotreagensspuit met de volgende parameters. Gebruik de spuitpomp voor toepassingen met een laag volume/laag debiet: Baansnelheid - 1200 mm/s; Afstand tussen de rails - 3 mm; Nozzle temperatuur - 45 °C; Hoogte mondstuk - 40 mm; Debiet - 25 μL/min; Passen - 15; N 2 Druk - 10 psi; Patroon - CC
  11. Plaats het glaasje in de voorverwarmde petrischaal, met de tissuekant naar boven, met één uiteinde op elk van de laboratoriumdoekjes. Plaats de schuif terug en sluit de petrischaal af met zelfklevende afdichtingsfolie. Plaats in de oven van 37 °C en plaats een reptielenverwarmingskussen ingesteld op 40 °C op de petrischaal.
    OPMERKING: Dit houdt het deksel het warmste deel van het gerecht en voorkomt dat er condensatie op het deksel ontstaat en op het weefsel valt, wat artefacten in de afbeeldingen zal veroorzaken.
  12. Incubeer het objectglaasje gedurende 2 uur om de spijsvertering te laten doorgaan.
  13. Haal het glaasje uit de petrischaal en laat ~5 minuten drogen.
  14. Maak de MALDI-matrix door 15 mg α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA) op te lossen in 1,5 ml 70% ACN, 0,1% TFA, 10 mM ammoniumfosfaat.
    OPMERKING: TFA is bijtend en moet worden gebruikt in een kap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
  15. Sonificeer tot volledig opgelost, ~5 min.
  16. Filtreer de matrixoplossing voordat u deze in de monsterlus laadt.
  17. Spuit de dia met CHCA met behulp van de robotreagensspuit met de volgende parameters: Spoorsnelheid - 1.200 mm/s; Afstand tussen de rails - 3 mm; Nozzle temperatuur - 75 °C; Hoogte mondstuk - 40 mm; Debiet - 120 μL/min; Passen - 3; N 2 Druk - 10 psi; Patroon - HH
  18. Breng 0,5 μL rode fosfor gesuspendeerd in methanol aan op een bekende plaats op het objectglaasje.

4. N -Linked verzameling van gegevens voor glycaanbeeldvorming

  1. Plaats de voorbereide dia('s) in het doel van de dia-adapter en laad ze in de MALDI QTOF-massaspectrometer.
  2. Laad de juiste methode voor het verzamelen van gegevens over de positieve ionenmodus in timsControl. Als het instrument nog niet in de positieve ionenmodus was, wacht dan ten minste 25 minuten na het wisselen van polariteit voor evenwicht voordat u kalibratie en gegevensverzameling uitvoert met de volgende instrumentparameters voor glycanen: m/z-bereik - 700-3500; Laserscanbereik - 16,0 μm in zowel X als Y; Resulterende veldgrootte - 20,0 μm in zowel X als Y; Laserschoten - 200; Laser fluentie - ~25%; Trechter 1 RF - 450,0 Vpp; Trechter 2 RF - 500.0 Vpp; Meerpolige RF - 500,0 Vpp; Botsingsenergie - 10,0 eV; Botsings-RF - 2.700,0 Vpp; Overdrachtstijd - 140,0 μs; PrePulse-opslag - 14,0 μs (aanvullende afbeelding S2).
  3. Voer een doelprofiel uit (klik op de knop Nu genereren ) en focusaanpassing (klik op de knop Nu aanpassen ) op het tabblad Voorbeelddrager . Pas de laserpositie in X en Y aan, indien nodig, op het lasertabblad om ervoor te zorgen dat de laser is uitgelijnd met het dradenkruis.
  4. Verzamel een spectrum van rode fosfor door ten minste vijf sets laserschoten vanaf de plek op de dia op te tellen.
  5. Voer een kalibratie uit door op de knop Kalibreren op het tabblad Kalibratie te klikken. Verwijder alle pieken met een zeer lage intensiteit of een hoge ppm-fout.
    OPMERKING: De kalibratiescore moet 100% zijn voordat u op accepteren klikt. Zo niet, wis dan het opgetelde spectrum en verkrijg een nieuw spectrum.
  6. Open het .mis-bestand dat eerder werd gebruikt voor metabolietbeeldvorming in de software.
  7. Sla het bestand op met een nieuwe naam die aangeeft dat het glycaangegevens zijn.
  8. Onder Bewerken | Imaging Run Properties, verander de acquisitiemethode in de gewenste glycaanmethode.
  9. Wis de vorige les met behulp van Bewerken | Wis leerpunten.
    OPMERKING: De dia bevindt zich niet in exact dezelfde positie nadat u deze uit de dia-adapter hebt verwijderd en opnieuw hebt geladen.
  10. Nieuw onderwijs uitvoeren met Bewerken | Stel leerpunten in; stel 3 punten in zoals in de oorspronkelijke Imaging Wizard (Stap 2.12).
  11. Controleer de nauwkeurigheid van de les door in de software op de knop Position Sample Carrier te klikken. Zoom in en klik op een duidelijk kenmerk van het vierde (ongebruikte) fiduciale punt in de afbeelding. De monsterdrager zal naar deze positie binnen timsControl gaan; Controleer of het dradenkruis overeenkomt met het geselecteerde element.
    OPMERKING: Als het dradenkruis niet op één lijn ligt, wis dan de leer en herhaal het leerproces om de nauwkeurigheid te verbeteren.
  12. Sla het bestand op.
  13. Controleer het signaal door de laser op een paar plaatsen in het weefsel af te vuren. Klik op een locatie in de afbeelding met behulp van de knop Positie Voorbeelddrager zoals in stap 4.11 om de lering te controleren. Bevestig dat het spectrum overvloedige glycaanpieken heeft met dominante pieken, meestal bij m/z 1.663 en 1.809. Pas de laserfluentie indien nodig aan voor een optimaal signaal.
  14. Sla de timsControl-methode op.
  15. Start de beeldverwerving door te klikken op de knop AutoXecute uitvoeren starten .

5. Monstervoorbereiding voor beeldvorming met tryptische peptiden

  1. Verwijder de CHCA-matrix door het glaasje ~1 min onder te dompelen in 100% ethanol (200 proof)
  2. Rehydrateer de dia in Coplin-potten als volgt: Verse 100% ethanol gedurende 1 minuut; 95% ethanol gedurende 1 minuut; 70% ethanol gedurende 1 minuut; Water gedurende 3 min; Vers water gedurende 3 min.
  3. Laat de dia ~15 minuten drogen.
  4. Voer het ophalen van antigeen uit door het objectglaasje onder te dompelen in een Tris-buffer van 100 mM, pH 9, in een Coplin-pot met een losjes geplaatst deksel erop dat in een decloakingkamer wordt geplaatst met 500 ml water in de kamer. Verwarm tot 95 °C gedurende 20 min.
    OPMERKING: Deze tweede antigeenextractie is nodig om de eiwitten te denatureren voor een efficiëntere toegang van de trypsine tot splitsingsplaatsen.
  5. Haal de Coplin Jar uit de Decloaking Chamber en plaats deze 20 minuten op het werkblad om af te koelen.
  6. Buffer-wissel de dia om naar water over vijf wisselingen. Giet voor de eerste drie de helft van de oplossing eruit en vervang deze door water. Giet voor de laatste twee alle oplossing eruit en vervang deze door water.
  7. Laat de dia volledig drogen.
  8. Bereid trypsine voor door 100 μg gevriesdroogd enzym te reconstitueren in 200 μl 100 mM azijnzuur en piponeer op en neer om te mengen. Verdunnen in de juiste grootte voor experimenten (meestal 40 μl) en bewaren bij -20 °C.
  9. Bereid een aliquot van 40 μl trypsine door 350 μl 100 ml ammoniumbicarbonaat, pH 7,8 en 39 μl ACN toe te voegen. Meng goed.
    OPMERKING: Acetonitril (10% ACN) verhoogt de activiteit van trypsine in vergelijking met waterige oplossing en vermindert de oppervlaktespanning van de oplossing voor spuiten19.
  10. Spuit het objectglaasje in met trypsine met behulp van een robotreagensspuit met de volgende parameters. Gebruik de spuitpomp voor toepassingen met een laag volume en een laag debiet: Baansnelheid - 750 mm/s; Afstand tussen de rails - 3 mm; Temperatuur van het mondstuk - 30 °C; Hoogte mondstuk - 40 mm; Debiet - 10 μL/min; Passen - 12; N 2 Druk - 10 psi; Patroon - HH
  11. Plaats een vierkant absorberend doekje op de bodem van een petrischaal met een diameter van 100 mm; zorg ervoor dat de hoeken net de rand van de schaal raken en verdeel 1 ml water over het doekje.
  12. Plaats de dia op het doekje, met de tissuekant naar boven, plaats het deksel op de petrischaal en sluit de petrischaal af met zelfklevende afdichtingsfolie.
  13. Incubeer het objectglaasje gedurende 4 uur bij 37 °C om de vertering te laten doorgaan.
  14. Verwijder het glaasje van de petrischaal en laat het ~5 minuten drogen.
  15. Maak een MALDI-matrix door 15 mg α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA) op te lossen in 1,5 ml 70% ACN, 0,1% TFA, 10 mM ammoniumfosfaat.
  16. Sonificeer tot volledig opgelost, ~5 min.
  17. Filtreer de matrixoplossing voordat u deze in de monsterlus laadt.
  18. Spuit de dia met CHCA met behulp van een robotreagensspuit met de volgende parameters: Baansnelheid - 1200 mm/s; Afstand tussen de rails - 3 mm; Nozzle temperatuur - 75 °C; Hoogte mondstuk - 40 mm; Debiet - 120 μL/min; Passen - 4; N 2 Druk - 10 psi; Patroon - HH
  19. Breng 0,5 μL rode fosfor gesuspendeerd in methanol aan op een bekende plaats op het objectglaasje.

6. Verzameling van tryptische peptidebeeldvormingsgegevens

  1. Plaats de voorbereide dia('s) in een dia-adapter en laad ze in een timsTOF MALDI QTOF-massaspectrometer.
  2. Laad de juiste methode voor het verzamelen van gegevens over de positieve ionenmodus in timsControl. Als het instrument nog niet in de positieve ionenmodus was, wacht dan ten minste 25 minuten na het wisselen van polariteit voor evenwicht voordat u kalibratie en gegevensverzameling uitvoert met behulp van de volgende instrumentparameters voor peptiden: m/z-bereik - 600-4500; Laserscanbereik - 16,0 μm in zowel X als Y; Resulterende veldgrootte - 20,0 μm in zowel X als Y; Laserschoten - 200; Laser fluentie - ~25%; Trechter 1 RF - 450,0 Vpp; Trechter 2 RF - 500.0 Vpp; Meerpolige RF - 600,0 Vpp; Botsingsenergie - 10,0 eV; Botsing RF - 3400.0 Vpp; Overdrachtstijd - 180,0 μs; PrePulse-opslag - 18,0 μs (aanvullende afbeelding S3).
  3. Voer een doelprofiel uit (klik op de knop Nu genereren ) en Focusaanpassing (klik op de knop Nu aanpassen ) op het tabblad Voorbeelddrager. Pas indien nodig de laserpositie aan in X en Y op het lasertabblad om ervoor te zorgen dat de laser is uitgelijnd met het dradenkruis.
  4. Verzamel een spectrum van rode fosfor door ten minste vijf sets laserschoten vanaf de plek op de dia op te tellen.
  5. Voer een kalibratie uit door op de knop Kalibreren op het tabblad Kalibratie te klikken. Verwijder alle pieken met een zeer lage intensiteit of een hoge ppm-fout. Controleer of de kalibratiescore 100% is voordat u op accepteren klikt. Zo niet, wis dan het opgetelde spectrum en verkrijg een nieuw spectrum.
  6. Open het .mis-bestand dat eerder werd gebruikt voor glycaanbeelding.
  7. Sla het bestand op met een nieuwe naam die aangeeft dat het peptidegegevens zijn.
  8. Onder Bewerken | Imaging Run Properties, verander de acquisitiemethode in de gewenste peptidemethode.
  9. Wis de vorige les met behulp van Bewerken | Wis leerpunten.
    OPMERKING: De dia bevindt zich niet in exact dezelfde positie nadat u deze uit de dia-adapter hebt verwijderd en opnieuw hebt geladen.
  10. Nieuw onderwijs uitvoeren met Bewerken | Stel leerpunten in; stel drie punten in zoals in de oorspronkelijke beeldwizard (stap 2.12).
  11. Controleer de nauwkeurigheid van de les door op de knop Positie Sample Carrier te klikken. Zoom in en klik op een duidelijk kenmerk van het vierde (ongebruikte) fiduciale punt in de afbeelding. De monsterdrager zal naar deze positie binnen timsControl gaan; Controleer of het dradenkruis overeenkomt met het geselecteerde element.
    OPMERKING: Als het dradenkruis niet op één lijn ligt, wis dan de leer en herhaal het leerproces om de nauwkeurigheid te verbeteren.
  12. Sla het bestand op.
  13. Controleer het signaal door de laser op een paar plaatsen in het weefsel af te vuren. Klik op een locatie in de afbeelding met behulp van de knop Positie Voorbeelddrager zoals in stap 6.11 om het onderwijs te controleren. Bevestig dat het spectrum overvloedige peptidepieken heeft met dominante pieken, meestal bij m/z 944, 1,105 en 1,198. Pas de laserfluentie indien nodig aan voor een optimaal signaal.
  14. Sla de timsControl-methode op.
  15. Start de beeldverwerving door te klikken op de knop AutoXecute uitvoeren starten .

7. Histologische kleuring

OPMERKING: Er zijn verschillende methoden voor hematoxyline en eosine beschikbaar. Hier wordt een aangepaste Carazzi-methode gepresenteerd die vaak in dit lab wordt gebruikt.

  1. Verwijder de CHCA-matrix door het glaasje 1 minuut onder te dompelen in 100% ethanol.
  2. Beits het glaasje als volgt: 95% ethanol gedurende 30 s; 70% ethanol gedurende 30 s; Water voor 30 s; Hematoxylin gedurende 2 min; Water voor 30 s; 70% ethanol gedurende 30 s; 95% ethanol gedurende 30 s; Eosine gedurende 1 minuut; 95% ethanol gedurende 30 s; 100% ethanol gedurende 30 s; Xyleen gedurende 2,5 min; Afdekglaasje met montagemedium.
  3. Laat het glaasje >1 uur drogen en verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig op het dekglaasje te drukken.
  4. Digitaliseer met een digitale diascanner.

8. Visualisatie van gegevens

OPMERKING: Er is een uitgebreide analyse die kan worden uitgevoerd met SCiLS Lab die buiten het bereik van dit protocol valt. Hier beschrijven we alleen het maken van basisbestanden, gegevensvisualisatie en het zoeken naar pieken aan de hand van databases voor vermeende identificatie.

  1. Start SCiLS Lab 2025b en kies Nieuw.
  2. Selecteer de gegevensbestanden die in de software moeten worden geladen.
    OPMERKING: Met SCiLS Lab Pro kunnen meerdere gegevensbestanden die met dezelfde parameters zijn verzameld, samen worden geladen voor normalisatie naar elkaar en tegelijkertijd worden gevisualiseerd.
  3. Rangschik de voorbeelden in de gewenste lay-out. Verplaats de voorbeelden door met de linkermuisknop te klikken en te slepen. Roteer de samples door met de rechtermuisknop te klikken en te slepen. Selecteer Volgende.
  4. Breng in het venster Instellingen voor massa-as de nodige aanpassingen aan. De standaardwaarden werken over het algemeen goed voor timsTOF-gegevens. Klik op Volgende.
  5. Stel in het venster Functie zoeken de juiste waarden in voor geautomatiseerde piekpicking tijdens het importeren. Klik op Volgende.
    OPMERKING: Dit werkt niet goed voor metabolietgegevens van FFPE-weefsel en moet worden overgeslagen.
  6. Importinstellingen worden gevisualiseerd in het venster Importoverzicht . Klik op Importeren.
  7. Geef een bestandsnaam en een locatie op om het SCiLS-bestand op te slaan.
    OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van het bestand kan het enkele minuten tot enkele uren duren om te importeren.
  8. Als je klaar bent, verschijnt er een overzichtsvenster . Klik op Geïmporteerde gegevensset openen om met het SCiLS-bestand te werken.
  9. Klik in de rechterbovenhoek van de software op de vervolgkeuzelijst naast Normalisatie en selecteer Root Mean Square.
    OPMERKING: Dit is de meest geschikte methode voor timsTOF-gegevens, gezien de schaarste van de geïmporteerde centroïdgegevens, en biedt de beste visualisatie.
  10. Onder Bestand | Bestandseigenschappen, stelt u de intervalbreedte in op een geschikte waarde, meestal 10 - 15 ppm voor timsTOF-gegevens. Controleer of de waarde geschikt is door te evalueren of deze de breedte van een piek in het gemiddelde spectrum beslaat.
  11. Zoom in op het gemiddelde spectrum onderaan de software, door te klikken en te slepen of het muiswiel naar voren te rollen.
  12. Selecteer een piek om te visualiseren door het dradenkruis aan de top te plaatsen en met de linkermuisknop te klikken.
  13. Voeg interessante ionen toe aan de lijst met actieve ionenafbeeldingen door op control + spatiebalk te drukken.
  14. Sla de lijst met gecureerde functies op door te klikken op de knop Opslaan als lijst met functies onder aan het venster met ionenafbeeldingen aan de rechterkant van de software.
  15. Open een lijst met opgeslagen functies door te klikken op Bestand | Functietabel en zoeken met MetaboScape naar vermeende metaboliet- of glycaan-ID's, als MetaboScape op hetzelfde netwerk is geïnstalleerd en geconfigureerd. U kunt ook de SCiLS-bestanden converteren naar .imzML-bestanden om ze te importeren in METASPACE (https://metaspace2020.org/) voor vermeende identificatie.
    OPMERKING: Een volledige beschrijving van de mogelijkheden van SCiLS Lab is te vinden in de gebruikershandleiding onder de menuoptie Help .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De voltooiing van dit protocol zou moeten resulteren in drie robuuste MSI-datasets uit hetzelfde deel van het weefsel. In de visualisatie van het volledige spectrum van de metabolietgegevens zal het spectrum sterk worden gedomineerd door matrixpieken op m/z 157 en 315. Dit is normaal voor FFPE-weefsel. Veel metaboliet- en vetzuursignalen zullen worden waargenomen door in te zoomen op de m/z-bereiken <155 en tussen 250 en 300. Figuur 3 toont voorbeelden van h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verzamelen van sequentiële MSI-gegevens uit een enkele weefselsectie vereist zorgvuldige aandacht voor detail. Er zijn een paar stappen die absoluut cruciaal zijn om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen. Ten eerste moet u voorzichtig zijn als er meer dan één dia tegelijkertijd wordt voorbereid. Wanneer u de dia's in of tussen Coplin-potten plaatst, moet u ervoor zorgen dat u niet twee dia's in dezelfde positie in de pot plaatst. Dit zal resulteren in onvoldoende blootstelling va...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS en de Mass Spectrometry Imaging Facility van de Universiteit van Texas in Austin worden ondersteund door een Cancer Prevention and Research Institute of Texas Award (RP240559). Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door de Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 en 891490), de Sie Foundation en het Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met de Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de National Institutes of Health via MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 en Jared Burks' NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-diaminonaphthaleneFisher ScientificD010125GMALDI Matrix voor metabolietbeeldvorming
AcetonitrileFisher ScientificA955-4LC-MS grad solvent gebruikt voor matrixvoorbereiding
α-cyano-4-hydroxycinnaminezuurSigma-Aldrich70990-1G-FMALDI matrix voor glyco- en peptidebeeldvorming
AmmoniumbicarbonaatFisher ScientificA643-500Buffer voor enzymen
AmmoniumfosfaatSigma-Aldrich467782-50GAdditief om matrixclusters tijdens beeldvorming te verminderen
Decloaking Chamber NxGenBiocare MedicalN/AGebruikt voor antigeenretrieval van weefsel
EthanolFisher Scientific04-355-223LC-MS grad solvent gebruikt voor matrixvoorbereiding en kleuring
M5 Robotische ReagenspuitHTX ImagingN/AGebruikt voor het aanbrengen van enzymen en matrices op weefsel
MethanolFisher ScientificA456-4LC-MS grad solvent voor het maken van rode fosforsuspensie
MS Grad TrypsineFisher ScientificPI90058Enzym voor eiwitvertering
MTP Slide Adapter IIBruker Daltonics8235380Adapter om microscope slides in de massaspectrometer te plaatsen
NanoZoomer SQ Digital Slide ScannerHamamatsu CorpN/AGebruikt voor het genereren van digitale microscoopbeelden van gekleurd weefsel
Perfection V600 Flatbed ScannerEpsonN/AGebruikt voor het genereren van een optische afbeelding van de slide voor MSI dataverzameling
Petri-sealFisher Scientific50-212-518Voor het afdichten van een petrischaal tijdens enzymatische vertering
PNGaseFBulldog BioNZPP550LYEnzym voor splitsing van N-gebonden glycanen van eiwitten
Rode fosforSigma-Aldrich04004-250GMALDI calibratiemiddel voor zowel positieve als negatieve ionenmodus
SCiLS Lab (2025b)Bruker DaltonicsN/ASoftware voor MSI datavisualisatie
timsTOF fleX QTOF MassaspectrometerBruker DaltonicsN/AGebruikt voor massaspectrometrie dataverzameling
TrifluorazijnzuurFisher Scientific85183Matrixadditief om de pH te verlagen voor positieve ionenmodus beeldvorming
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Buffer voor antigeenretrieval
WaterFisher ScientificW64LC-MS grad solvent gebruikt voor matrices, enzymen en kleuring
WypAll X60Fisher Scientific19-413-113Absorbeerdende doek voor bevochtigde enzymincubatie
XYleenFisher ScientificX3P-1GALOpheldermiddel voor kleuring

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles