Method Article

Uitgebreide ruimtelijke profilering van soortagnostische transcriptomen via stereo-seq

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een protocol voor het uitvoeren van uitgebreide ruimtelijke transcriptomische profilering van gastheer-, viraal-, schimmel- en microbioom-RNA uit formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties met behulp van Stereo-seq, waarmee verschillende transcriptomen met hoge resolutie in kaart kunnen worden gebracht met behoud van weefselarchitectuur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ruimtelijke samenstelling van cellen in de gastheer, evenals de bacteriën of virale ladingen in het weefsel, kunnen van invloed zijn op de interactie van celtypen en analyten die de cel door celtype-specifieke processen leiden. Stereo-seq voor FFPE-weefsels maakt gebruik van willekeurige priming naar ruimtelijke barcodes, wat verschilt van standaard ruimtelijke transcriptomics-methoden, die A'tailing gebruiken om messenger-RNA (mRNA) vast te leggen of op sonde gebaseerd om soortspecifieke transcripten vast te leggen. Deze methoden omvatten niet de meer actuele kennis over de impact en het belang van andere soorten RNA van lang niet-coderend RNA, mitochondriaal RNA, microRNA of andere soorten, RNA, zoals microbieel, viraal en schimmel. Hier wordt een stapsgewijze procedure beschreven, van weefselsectie tot bibliotheekvoorbereiding voor ruimtelijke soortagnostische stereo-seq-toepassing met RNA-detectie met behulp van een randomer sondemethodologie, die compatibel is met in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. Deze Stereo-seq-methode heeft een willekeurige opnamekraal van 0,22 μm groot die elke 0,5 μm in een array terugkeert, waardoor subcellulaire resolutie mogelijk is van een op sequencing gebaseerde technologie. Aangezien deze methode zowel gastheer- als niet-gastheer-RNA detecteert, vereist het protocol specifieke overwegingen om te kunnen bepalen wat zich in het weefsel bevindt versus wat er op het weefsel is afgezet tijdens het verzamelings-, conserverings-, knip- en detectieproces (d.w.z. milieu- en hanteringsverontreinigingen). Ten slotte maakt dit protocol het mogelijk om een hoge (single-cell) resolutie van multi-RNA-soorten te hebben binnen een ruimtelijke context, waardoor inzicht wordt verkregen in het intra- en interactoom van celtypen en pathologische soorten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spatial-omics-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van cellulaire heterogeniteit van weefsel door de gelijktijdige kwantificering van meerdere doelen, DNA (genomics), RNA (transcriptomics), metabolieten (metabolomics) of eiwit (proteomics) mogelijk te maken1. De resolutie van deze verschillende testen varieert vaak, wat verschillende beperkingen biedt bij het meten van analyten, hetzij met verhoogde schaarste bij het meten van enkele cel 2,3 of native ruimtelijke context4. Bulkmethoden zoals RNA-sequencing daarentegen bieden alleen gemiddelde genexpressie over hele monsters en verdoezelen cellulaire heterogeniteit2, of eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq)2,3, die weefseldissociatie vereist voor eencellige sequencing, vereist vaak filtering. Daarom sluiten deze methoden grote cellen en aggregaten uit, terwijl bio-informaticamethoden fragmenten en doubletten proberen te verwijderen, die allemaal vertekeningen veroorzaken 5,6,7. Ruimtelijke transcriptomics behoudt de weefselarchitectuur en biedt kritische inzichten in cellulaire organisatie en interacties. De meeste niet-gerichte ruimtelijke sequencingmethoden hebben geen eencellige resolutie, waardoor deconvolutie van ruimtelijke opnamegebieden met 10 tot 100cellen 8,9,10 vereist is. In het afgelopen decennium heeft ruimtelijke transcriptomics echter de behoefte aan deze methoden overtroffen, aangezien er vooruitgang is geboekt op het gebied van resolutie, grotere opnamegebieden en de integratie van multi-omics-benaderingen, hetzij met behulp van experimentele strategie of nieuwe technieken 1,11,12.

Spatial Enhanced Resolution Omics-sequencing (Stereo-seq) biedt een resolutie op nanoschaal (500 nm) en een opnamegebied op centimeterschaal, waarbij soortagnostische transcriptomische opname van het geheel mogelijk is, waardoor coderend, niet-coderend en niet-gastheer-RNA13 kan worden vastgelegd. Deze methode heeft momenteel de hoogste resolutie voor ruimtelijke transcriptomics en heeft opties om de grootste gezichtsvelden te bieden. Toch heeft deze methode enkele opmerkelijke beperkingen, waaronder tijd- en arbeidsvereisten van ongeveer 15 uur hands-on tijd, verspreid over 4 dagen om de bibliotheken die klaar zijn voor sequencing te voltooien. Ter vergelijking: andere op sequencing gebaseerde ruimtelijke transcriptomics-technologieën, zoals op sonde gebaseerde ruimtelijke transcriptomics, op polyA-capture array gebaseerde ruimtelijke transcriptomics, Slide-seq en deterministische barcodering in weefsel voor ruimtelijke omics-sequencing (DBiT-seq) vereisen doorgaans 5 tot 8 uur hands-on tijd gedurende 2 tot 3 dagen (Tabel 1). Voor veel onderzoekers wegen deze vorderingen op tegen de technische uitdagingen en zijn ze ideaal voor het samenstellen van volledige transcriptomics ruimtelijke atlassen om ziekteprogressie op cellulair en subcellulair niveau te bestuderen, vooral als ze worden gelaagd met andere technologieën1.

Het Stereo-seq-protocol heeft mogelijkheden die verder gaan dan traditionele mRNA-transcriptomics, die afhankelijk zijn van poly-T-sondes voor het vastleggen van gepolyadenyleerde mRNA-transcripten. Deze methoden kunnen worden gemodificeerd door polyadenylering toe te voegen aan verse weefsels14 of soortspecifieke sondes voor vooraf gedefinieerde genensets15 voor ruimtelijke expressieanalyse. In plaats daarvan gebruikt Stereo-seq willekeurige nucleotidesondes om diverse RNA's te selecteren, ongeacht de soort, waaronder microbiële RNA's, schimmel-RNA's, virale RNA's en niet-gepolyadenyleerde RNA's zoals enhancer-RNA's, circulaire RNA's en lange niet-coderende RNA's (lncRNA's)16. Theoretisch is het mogelijk om kleinere RNA's of herstellende elementen zoals kleine storende RNA's (siRNA's), microRNA's (miRNA's) en transposons17 vast te leggen. Momenteel blijven de bio-informatica en het in kaart brengen van deze RNA echter een uitdaging en worden ze vaak uitgefilterd tijdens de eerste uitlijning, die doorgaans een afkapping van 30 bp gebruikt.

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven, met onze aanpassingen voor de willekeurige nucleotide-opname van een fabrikant op DNA-nanoballen (DNB)-chips om een beter begrip en behandeling van een Stereo-seq-protocol te garanderen, geïllustreerd in figuur 1. Dit protocol bevat strategieën voor moleculair biologen voor het testen van nieuwe FFPE-weefsels op Stereo-seq met willekeurige nucleotide-opname om meer consistente, hogere opbrengsten te produceren uit gearchiveerde monsters en vetweefsels van mindere kwaliteit. Het geschetste protocol is geoptimaliseerd voor FFPE-monsters van de meeste organen, ongeacht de soort van herkomst. Dit protocol omvat echter niet de huidige aanpassingen die nodig zijn om moeilijke weefsels zoals beenmerg te hanteren, die ontkalking vereisen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit document worden geen klinische gegevens verstrekt voor het niet eerder behandelde hooggradige sereus ovariumcarcinoom patiëntenmonster. De bijbehorende klinische gegevens werden echter verzameld volgens protocollen die waren goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van het MD Anderson Cancer Center van de Universiteit van Texas, afdeling Gynaecologische Oncologie en Reproductieve Geneeskunde, van deelnemers die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven.

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om tijdens het hele protocol een chirurgisch masker en handschoenen te dragen om RNase-besmetting te voorkomen. Onderzoekers met lang haar wordt aangeraden om het naar achteren te trekken of zelfs een haarnetje te dragen. Gebruik altijd steriel nucleasevrij water (NFW) en nucleasevrije, laagbindende DNA/RNA-buisjes om de opbrengst te maximaliseren. Weefsels van niet-zoogdieren, zoals plantenweefsels, kunnen optimalisatie van de hechting vereisen, waarbij poly-L-lysine (PLL) en langere permeabilisatietijden als gevolg van celwanden betrokken zijn. Hoewel moleculaire vangst theoretisch haalbaar blijft, is experimentele validatie nodig omdat plantenweefsels in onze huidige workflow nog niet zijn getest.

1. Beoordeel de RNA-kwaliteit en de RNA-fragmentdistributiewaarde 200 scores

  1. Beoordeel de RNA-kwaliteit met behulp van RNA Fragment Distribution Value 200 (DV200), die het percentage RNA meet dat groter is dan 200 bp.
  2. Gebruik twee secties van 10 μm uit hetzelfde weefselblok dat bedoeld is voor Stereo-seq-verwerking.
    OPMERKING: Onmiddellijke verwerking is optimaal, maar monsters kunnen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard, 4 weken -20 °C of 6 maanden -80 °C.
  3. Extraheer RNA met behulp van een selectief RNA-extractieprotocol zonder grootte, zoals beschreven door Patel et al.18 om een nauwkeurige evaluatie van de verdeling van RNA-fragmentgroottes mogelijk te maken.
  4. Evalueer de RNA-kwaliteit met een van de volgende opties met behulp van een fragmentanalysator om de DV200-score te bepalen, of het percentage van het gebied onder de curve dat RNA-fragmenten langer dan 200 bp vertegenwoordigt. Idealiter zou het weefsel een DV200-score (> 50%) en een concentratie (> 10 ng/μL) moeten hebben.

2. Schoonmaak van de werkruimte

  1. Reinig alle oppervlakken met 30% bleekmiddel. Laat de oppervlakken minimaal 30 minuten drogen om de vorming van chloroform door de combinatie van bleekmiddel en ethanol te voorkomen.
  2. Veeg oppervlakken af met DNA-decontaminatiedoekjes (DDW). Spuit alle oppervlakken af met RNase-decontaminatieoplossing (RDS) en vervolgens 70% ethanol bereid met NFW.
    OPMERKING: Meng nooit bleekmiddel of andere alcohol. Deze combinatie produceerde chloroform, dat zeer giftig is en bewusteloosheid, orgaanschade of de dood kan veroorzaken, zelfs bij lage blootstellingen.

3. Stereo-seq willekeurige oligonucleotide capture chip (N-chip) voorbereiding

  1. Reinig de werkruimte zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2, inclusief alle systemen die in deze stap worden gebruikt.
  2. Haal de Stereo-seq N-chip uit de verpakking, noteer de chip-ID en reinig de randen van de Stereo-seq N-chip en glasplaat met 100% ethanol zonder de chip aan te raken. Laat volledig aan de lucht drogen.
  3. Harstoepassing om de chip aan de dia te bevestigen (optioneel voor gebruikers die xylenen gebruiken).
    OPMERKING: Hoewel niet-xyleenklaringsmiddelen vaak worden aanbevolen door commerciële verkopers, is waargenomen dat niet-xyleenklaringsmiddelen minder effectief kunnen zijn, afhankelijk van het paraffinemengsel. Ze zijn vaak niet compatibel met bepaalde kunststoffen, kunstharsen of in bijenwas ingebedde weefsels en verwijderen zwaar verknoopte paraffines of paraffines met een hoog smeltpunt niet efficiënt. Als u niet zeker bent van de paraffinesamenstelling die is gebruikt voor het inbedden van het monster, wordt aanbevolen xylenen te gebruiken voor een optimale klaring. Bovendien zijn xylenen beter in staat om vetweefsel, zoals borst-, eierstok-, eicel- of hersenweefsel, op te ruimen.
    1. Schud of meng hars goed om er zeker van te zijn dat het homogeen wit is. Breng met behulp van een micropipet voorzichtig 10 μL UV-uithardende keramische hars aan rond de rand van de Stereo-seq N-chip (Figuur 2A).
      OPMERKING: Hars kan huid- en oogirritatie veroorzaken en kan bij herhaalde blootstelling leiden tot allergische huidreacties. Draag bij het pipetteren of hanteren van deze hars altijd nitrilhandschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Werk in een goed geventileerde ruimte en draag een masker bij gebruik van grote volumes of bij verwarmingsoplossing en vermijd direct contact met huid of ogen.
    2. Gebruik een verzegeld schuimstaafje, verwijder overtollige hars en laat slechts een dunne lijn rond de spaanrand over. Plaats de dia in het UV-uithardingsapparaat en zorg ervoor dat u het spaanoppervlak niet aanraakt.
    3. Plaats de met hars aangebrachte chip op een ondoorzichtig masker op de UV-lichtbron van 405 nm om de achterkant van de dia te verlichten en gedurende 5 minuten uit te harden. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2B.
      OPMERKING: Stel de Stereo-seq N-chip niet te veel bloot aan UV-licht en raak geen hars op het chipoppervlak aan, aangezien dit nadelige effecten kan hebben op de nanoballen.
    4. Gebruik na het uitharden verzegelde schuimstaafjes gedrenkt in een van de volgende: 100% ethanol van moleculaire kwaliteit; 70% ethanol; en ten slotte NFW om schoon te maken rond de rand waar hars was geplaatst. Als er witte stippen loskomen, maak de rand dan opnieuw schoon. Raak het spaanoppervlak nooit aan (Figuur 2C).
    5. Laat de glijbaan volledig aan de lucht drogen. Bewaar de frites na inspectie een nacht bij 4 °C met indien nodig een droogmiddel. Het wordt echter aanbevolen om indien mogelijk onmiddellijk door te gaan met het voorbereiden en snijden van spanen.
      OPMERKING: Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief UV-beschermende brillen, wanneer u met UV-licht werkt. Behandel ethanol en hars in een goed geventileerde ruimte, bij voorkeur een zuurkast. Gooi afvalstoffen weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  4. Chipvoorbereiding met Poly-L-lysine (Optioneel voor vetweefsels of weefsels met hechtingsproblemen.)
    1. Reinig de werkruimte zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2, inclusief alle systemen die in deze stap worden gebruikt.
      NOTITIE: Spuit geen chemicaliën rechtstreeks in de PCR-machine. Werk voor alle pre-PCR-stappen, indien mogelijk, in een PCR-kap om besmetting te voorkomen, inclusief eerdere amplificatie van cDNA.
    2. Dompel de chip driemaal onder in vers NFW met behulp van een conische buis van 50 ml.
    3. Droog de spanen met perslucht, met behulp van de volle kracht van perslucht in een hoek van ongeveer 60° tot 80° diagonaal (45°) over het oppervlak van de spanen vanaf ongeveer 5 cm afstand van het oppervlak van de spanen (Figuur 2E). Als het oppervlak troebel lijkt, herhaal dan de was met verse NFW en droog opnieuw af (het wolkenoppervlak betekent meestal dat het keramiek in de vorige stappen niet voldoende is afgewassen of uitgehard).
    4. Breng 150 μL PLL-oplossing aan om het gehele spaanoppervlak te bedekken. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (22 °C tot 25 °C). Dit wordt geïllustreerd in figuur 2D.
    5. Verwijder de PLL-oplossing en was de chip twee keer met nucleasevrij water gedurende 10-15 s.
    6. Droog de randen van de dia zorgvuldig af na de tweede wasbeurt (zonder de chip aan te raken).
    7. Droog de spaan stevig met perslucht, met de volle kracht van perslucht in een hoek van ongeveer 60° tot 45° diagonaal over het oppervlak van de spaan vanaf ongeveer 5 cm afstand van het oppervlak van de spaan (Figuur 2E).
      OPMERKING: De chip moet binnen 30 s of minder volledig droog zijn. Als het langer duurt, wordt de DNB verstoord, wat artefacten in de opname zal veroorzaken.
    8. Ga binnen 1 uur over tot montage en houd de spaan droog.
      OPMERKING: Als het spaanoppervlak na het drogen troebel lijkt, was dan met vers NFW en herhaal het droogproces. Als er na het drogen artefacten op het oppervlak van de chip zijn, kan dit in die gebieden opnameproblemen veroorzaken. Vermijd het gebruik van PLL om te hechten als het weefsel dit niet nodig heeft. Het aanraken van de chip kan krassen en verlies van opnamegebieden veroorzaken vóór de afgifte van cDNA, of ongelijkmatige opname na de release. Hars op het oppervlak van de chip leidt tot gespikkeld verlies van opnamegebieden. Als de chip te dicht bij het persluchtmondstuk wordt geplaatst, kunnen er kristallen en een spray van beschadigde DBN-markeringen over het spaanoppervlak ontstaan; Dit is echter zeldzaam en komt meestal alleen voor als het mondstuk de chip bijna raakt en de persluchtfles te koud is. Het wordt aanbevolen om deze procedure meerdere keren te oefenen met beoordelingschips, omdat deze stap technisch uitdagend is.

4. Weefsel doorsnijden en monteren

  1. Zorg ervoor dat de werkruimte schoon is, zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2. Zorg ervoor dat nieuwe bladen en NFW worden gebruikt voor alle waterbaden en ijs tijdens het snijden en monteren van weefsels. Raak de chip niet rechtstreeks aan en bedek slechts 80% van de chip met tissue.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een dikte van 5 μm te gebruiken voor standaardweefsel of 4 μm voor vetrijk weefsel. Gebruik een lint met seriële secties om modaliteiten in verschillende monsters overeen te laten komen, indien van toepassing.
  2. Droog de glaasjes bij 42 °C gedurende 3 uur in een oven of op een PCR-machine met het deksel open. Breng vervolgens de dia's over of verander de temperatuur op de oven of PCR-machine naar 37 °C en bak een nacht gedurende 12-48 uur. Het wordt aanbevolen om rond 18 uur te gebruiken.
  3. Optioneel stoppunt: Sluit de dia's na het drogen af in aluminium zakken met droogmiddel bij 4 °C gedurende maximaal 1 week voordat u verder gaat.
    OPMERKING: Langere droogtijden kunnen de RNA-integriteit verminderen. Te kort drogen resulteert in een lagere weefselhechting aan het objectglaasje. Bakken op een hogere temperatuur kan de RNA-integriteit verminderen. Dia's kunnen worden verzonden voor externe verwerking (bijv. hostanalyse). Verzending wordt echter niet aanbevolen voor microbioomanalyse vanwege de verhoogde mogelijke besmetting tijdens het transport.

5. Deparaffiniseer glaasjes

  1. Zorg ervoor dat de werkruimte schoon is, zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2.
  2. Bereid reagentia voor op deparaffinisatie en het Stereo-seq-protocol.
    1. Hoeveelheid van de benodigde reagentia: Twee xylenen van 30 ml in conische buisjes van 50 ml, twee keer 100% ethanol van 30 ml in conische buisjes van 50 ml.
    2. Bereid de volgende verdunde reagentia met NFW: 96% ethanol per chip (2 conisch of 1 ml vereist), 90% ethanol per chip, 80% ethanol per chip, 70% ethanol per chip, 50% ethanol per chip, 30% ethanol per chip, 2,5 ml 5x zout-natriumcitraat (SSC) uit een 20x oplossing, 5 ml 0,01 N HCl (verdun 0,1 N HCl met NFW tot pH 2). Voor ethanolverdunningen wordt een oplossing van 30 ml in conische buizen van 50 ml of een oplossing van 500 μl in een buis van 1,5 ml bereid als u siliconenpakkingen gebruikt.
    3. Bereid de volgende oplossingen voor en bewaar ze op ijs: i) 32,5 ml 0,1x SSC uit een 5x oplossing (bewaar 30 ml oplossing in een conische buis en doe de andere 2,5 ml in een buis van 5 ml voor toekomstig gebruik), ii) 400 μl 0,1x SSC met 5% RI, op ijs bewaren.
    4. Bereid de volgende verdunde reagentia met 0,1 N HCl.
      1. Bereid 10x permeabilisatiereagens (PR) oplossing door 1 ml 0,1 N HCl toe te voegen aan het in de handel verkrijgbare gevriesdroogde reagens.
        OPMERKING: Bewaar slechts 1 uur op ijs, zorg ervoor dat u het doseert voor toekomstig gebruik en vries in bij -20 °C.
      2. Bereid 500 μL 1x PR-oplossing (verdun een 10x PR-oplossing aliquot met 0,01 N HCl, bewaar op ijs gedurende maximaal 6 uur).
        OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de pH van de 0.01 N HCl binnen 10% van pH 2.0 ligt, aangezien enzymen op basis van pepsine optimaal presteren bij pH 2.
  3. Deparaffiniseer de glaasjes door de glaasjes in xylenen te weken (aanbevolen) gedurende 2 ronden van elk 20 minuten.
  4. Rehydrateer het monster onmiddellijk met ethanol (100%, 96%, gedurende 2 rondes, elk 5 minuten, gevolgd door 90%, 70%, 50% en 30% gedurende 1 ronde, 2 min). Rehydrateer tot slot 1 minuut met NFW. Gebruik voor ethanolverdunningen 30 ml oplossing in een conische buis van 50 ml voor elk objectglaasje als u monsters voorbereidt voor microbioomstudies, of gebruik 30 ml voor elke twee objectglaasjes als u niet-microbioommonsters bereidt. Bereid voor alle volgende verdunningen 30 ml oplossing in een conische buis van 50 ml of, indien siliconenpakkingen worden gebruikt, gebruik 500 μl oplossing per 1 cm2 spanen om het spaangebied volledig te bedekken.
    OPTIONEEL: Het wordt aangeraden om een siliconenkamer te plaatsen van een verwijderingsschuif met 3 kamers rond de chip om een afdichting te creëren na de stap van 100% ethanol, zoals geïllustreerd in afbeelding 2F-H. Dit maakt het gebruik van kleinere hoeveelheden reagentia mogelijk en vermindert het risico op beschadiging van de chip. Als alternatief kunnen conische buizen van 50 ml worden gebruikt om de Stereo-seq Slide tijdens de procedure volledig onder te dompelen.

6. (Optioneel) Nucleaire beeldvorming en ssDNA-kleuring

OPMERKING: Laat het FFPE-ontknopingsreagens op kamertemperatuur komen ( ~25 °C) voor gebruik in 6.1. Andere kleuringsoplossingen zijn mogelijk, maar fluorescentie-nucleaire kleuring is momenteel vereist voor segmentatie van afzonderlijke cellen en celbinning van transcriptomische gegevens.

  1. Fluorescentiekleuring met behulp van enkelstrengs DNA (ssDNA) kleurstof
    1. Bereid 2 μL ssDNA-kleuringsoplossing in SSC-buffer door het Qubit ssDNA-reagens te verdunnen met 5x SSC-buffer in een verdunning van 1:1 per 1 tot 2 chips.
      OPMERKING: De ssDNA-verdunning kan veranderen op basis van de microscoop die bij de beeldvorming wordt gebruikt.  Daarom moeten nieuwe microscopen worden getest met een ssDNA-kleurstofverdunningsset met behulp van een beoordelingschip en testweefsel om het beste dynamische bereik te bepalen.
    2. Maak een mastermix van de kleuringsoplossing (200 μL per chip) met behulp van een 1:20 verdunning van RNaseremmer (RI), 1:200 verdunning van de ssDNA-verdunning en de resterende 5x SSC.
    3. Voeg kleuroplossing toe (150 μL per chip) en incubeer 5 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Verwijder de kleuroplossing voorzichtig uit de hoek van de chip met behulp van een pipet.
      OPMERKING: Als u de verwijderbare siliconenkamer gebruikt, verwijder deze dan voordat u de chip bevlekt met een ssDNA-kleurstofmengsel.
    4. Was de chip twee keer met 0,1x SSC (150 μL per chip per keer) gedurende 10-15 s. Droog de randen van het objectglaasje na de tweede wasbeurt voorzichtig af met lenzenpapier (zonder de chip aan te raken).
    5. Voeg ~3-5 μL glycerol toe (gebruik minder voor een omgekeerde microscoop) om de klaverslip te monteren (pas op voor luchtbellen).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het juiste volume glycerol op het diagebied wordt aangebracht, meestal ongeveer 4 μL voor een chip van 1 cm2. Het gebruik van te veel glycerol kan ervoor zorgen dat het dekglaasje verschuift wanneer het glaasje verticaal wordt gehouden. Het gebruik van te weinig glycerol verhoogt het risico op weefselbeschadiging wanneer het dekglaasje wordt verwijderd en kan luchtbellen introduceren, wat een negatieve invloed kan hebben op de beeldvorming en segmentatieresultaten van één cel.
    6. Laat het dekglaasje vanaf ongeveer 1 cm hoogte op de chip vallen. Als u een ingegrepen microscoop gebruikt, zorg er dan voor dat het dekglaasje er niet af glijdt als het verticaal wordt gehouden. Als het toch opnieuw stijgt zonder meer glycerol toe te voegen.
    7. Leg fluorescerende beelden vast van met ssDNA gekleurd weefsel met een breedveldmicroscoop met 10% overlap tussen afbeeldingstegels.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een handmatige scherpstelkaart van 9-13 punten te maken met een breedveldmicroscoop met behulp van een 10x objectief. Een confocale microscoop kan worden gebruikt, maar deze is veel gevoeliger voor focale veranderingen in het weefsel en de chip.
    8. Naai in beeldverwerkingssoftware zoals ImageJ, gebruikmakend van theoretische overlap om de geschatte positionering van elke tegel te genereren en voer vervolgens pixel-matching computationele overlap uit om beeldtegels te verfijnen
    9. Verwerk afbeeldingen in de StereoMap-software en zorg ervoor dat de beeldkwaliteit slaagt voordat u verder gaat.
    10. Dompel de Stereo-seq-dia onder in 30 ml 0,1x SSC totdat het dekglaasje loskomt.

7. Decrosslinking proces

OPMERKING: Vermijd het aanraken of kantelen van de chip tijdens deze stap en pipetteer voorzichtig.

  1. Zorg ervoor dat het FFPE-decrosslinking-reagens op warme kamertemperatuur (~25 °C) is en inspecteer of er geen deeltjes zijn die de oplossing troebel maken. Als er deeltjes zichtbaar zijn, verwarm dan voor gebruik tot 55 °C en koel af tot 30 °C.
  2. Zet de thermocycler aan met de volgende instellingen: 30 °C voor evenwicht (een verwarmd deksel van 85 °C); 95 °C voor een incubatie van 30 minuten; 4 °C oneindige houdtijd.
  3. Monteer de cassettepakking en plaats vervolgens de Stereo-seq-chipschuif in de cassette.
  4. Voeg FFPE-decrosslinkingreagens (400 μl per chip) toe aan het putje van de cassette die de chip bevat. Breng afdichtingstape aan op de cassette en controleer of deze goed is afgesloten.
  5. Begin de incubatie van 30 minuten bij 95 °C vanaf stap 7.2. Plaats na 10 minuten 10 ml methanol in een container van 15 ml (ongeveer 1 ml per dia is nodig) in een vriezer van -20 °C.
  6. Verwijder voorzichtig de spanen van de thermocycler, breng de cassette over naar de bank en verwijder de afdichtingstape.
  7. Verwijder het FFPE-decrosslinking-reagens en gooi het weg met behulp van een pipet. Zodra alle decrosslinking-reagentia zijn verwijderd, maakt u de cassette en pakking los en gooit u deze weg.
  8. Breng de Stereo-seq dia in evenwicht tot kamertemperatuur ~23 °C. Droog onder een steriele zuurkast de rand van de objectglaasje af en breng een nieuwe siliconenkamer aan (indien van toepassing). Voeg 500 μL gekoelde methanol toe uit de vriezer van -20 °C en zorg ervoor dat het hele gedeelte 20 minuten volledig ondergedompeld is.
    OPMERKING: Als alternatief kan de hele Stereo-seq-dia worden ondergedompeld in een conische buis van 50 ml gevuld met 30 ml gekoelde methanol.
  9. Verwarm de 1x PR-oplossing ongeveer 5 minuten voor het einde van de methanolfixatie voor gebruik op een droog blok van 37 °C gedurende 10 minuten voor gebruik (stap 7.8).
  10. Nadat de fixatie is voltooid, verplaatst u de schuif naar een steriele zuurkast. Veeg overtollige methanol op de dia weg en wacht tot de resterende methanol op de chip is verdampt (~5 min). Monteer een nieuwe cassette en pakking. Zodra de methanol volledig is verdampt, plaatst u de Stereo-seq-chipschuif in de cassette.

8. Permeabilisatie en omgekeerde transcriptie

OPMERKING: Voor de stappen 8.1-8.11 moet u langzaam pipetten en de chip niet aanraken. Overmatige druk veroorzaakt diffusie of vlekken in de DNB's.

  1. Voeg 200 μL permeabilisatiereagens toe aan de chip. Breng afdichtingstape aan op de Stereo-seq schuifcassette en zorg ervoor dat deze goed is afgedicht.
  2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  3. Bereid de wasbuffer voor door voor elke dia 380 μL 0,1x SSC en 20 μL RI (RNA-remmer) toe te voegen. Maak 400 μL per glaasje en bewaar op ijs tot gebruik.
  4. Trek de reagentia voor FFPE reverse transcriptie (FFPE RT) eruit, draai vervolgens al het volgende naar beneden en houd de enzymmix, oligo's en dimeren op ijs. Verwarm de FFPE RT-buffer tot kamertemperatuur (~23 °C).
  5. Bereid 5 minuten voor min voor het einde van de permeabilisatie 200 μL per chip FFPE RT-mix voor. Voeg FFPE RT-buffer (158 μL), ffpe rt-enzymmix (30 μL), ffpe rt-oligo (10 μL) en FFPE-dimeer (2 μL) toe. Meng dit voorzichtig en houd het op ijs.
  6. Houd de chip op de thermocycler en verander de incubatietemperatuur naar kamertemperatuur (~23 °C). Verwijder de verzegeling en gooi de 1x PR-oplossing voorzichtig weg.
  7. Was de chip heel voorzichtig met 200 μL 0,1x SSC (met 5% RI) per 1 cm2 chip.
  8. Verwijder 0,1x SSC (met 5% RI) wash uit de hoek van de chip.
  9. Voeg 200 μL FFPE RT-oplossing toe aan de hoek van de chip.
  10. Breng afdichtingstape aan op de Stereo-seq schuifcassette en zorg ervoor dat deze goed is afgedicht; Anders vermindert verdamping de opbrengst.
  11. Start het protocol FFPE RT incubatie isotherme reactie bij 42 °C met 45 °C verwarmd deksel voor (5 tot 24 uur).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 12 tot 16 uur te incuberen en consistent te zijn in alle experimenten.

9. cDNA-afgifte en zuivering

OPMERKING: Voor de stappen 9.6-9.7 pipetteer langzaam en raak de chip niet aan. Overmatige druk veroorzaakt diffusie of vlekken in de DNB's.

  1. Bereid 400 μL cDNA-afgiftebuffer voor door de cDNA-afgiftebuffer bij 55 °C te verwarmen om eventueel gevormd neerslag op te lossen.
  2. Breng de cDNA-afgiftebuffer in evenwicht tot een warme kamertemperatuur (25 °C). Niet op ijs leggen.
  3. Draai de cDNA-afgiftebuffer en het cDNA-afgifte-enzym op 100 x g in een tafelcentrifuge voor gebruik.
  4. Bereid de cDNA-buffer voor door 20 μL afgifte-enzym toe te voegen aan 380 μL cDNA-afgiftebuffer.
  5. Houd de chip op de thermocycler en verander de incubatietemperatuur naar kamertemperatuur (~23 °C). Verwijder de verzegeling en verwijder de FFPE RT-oplossing voorzichtig en gooi deze weg.
  6. Was de chip één keer, ongelooflijk voorzichtig, met 0,1x SSC per chip (200 μL).
  7. Verwijder 0,1x SSC uit de hoek van de chip en pipetteer zeer voorzichtig.
  8. Voeg 400 μL van de bereide cDNA-afgifteoplossing toe aan elke chip.
  9. Sluit de Stereo-seqs diacassette af door afdichtingstape (of PCR-hoes) op de cassette aan te brengen. Zorg ervoor dat de cassette goed is afgesloten om verdamping, lekkage of vervuiling te voorkomen.
  10. Incubeer gedurende ≥ 5 uur bij 55 °C (minimaal 5 uur tot 24 uur) met deksel verwarmd tot 60 °C.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 5 tot 7 uur te incuberen of om consistent te zijn in alle experimenten met 2 uur.

10. Verzamel de cDNA-afgiftemix

  1. Verwarm NFW voor op 37 °C (minimaal 500 μL per chip van 1 cm2).
  2. Verwijder de verzegeling en pipette krachtig in elke hoek en in het midden van de chip over het weefsel, maar schraap of raak het weefsel niet aan. Verzamel alle cDNA Release Mix van de chip en breng deze over naar een centrifugebuis van 1,5 of 2,0 ml. Noteer de chipidentificatienummers (chip-ID) op elke buis.
  3. Voeg 350 μL voorverwarmd NFW rechtstreeks toe aan het spaanoppervlak. En pipetteer nogmaals krachtig met een kleinere pipet (P100 of P200), waarbij u de punt kantelt om meer schuifkracht uit te oefenen, maar raak het weefsel niet aan en schroot de chip niet.
  4. Combineer de wash uit stap 10.3 (350 μL) met cDNA Release Mix uit stap 10.2 (400 μL). Zorg ervoor dat u alleen de monsters van een enkele chip combineert.
  5. Plaats 100 μL NFW op de chip, sluit de Stereo-seq-chipschuif in de cassette en bewaar deze in de koelkast tot het einde van het protocol.
    OPMERKING: In geval van lage opbrengst, overweeg dan om het cDNA opnieuw vrij te geven. De aanwezigheid van DNA op de chip kan worden beoordeeld met behulp van een ssDNA-kleurstof en reimaging met of zonder dekglaasje.

11. Verzamel de cDNA-kralen opruimen

  1. Resuspendeer cDNA uit stap 10.4 met een gelijk volume aan Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI)-kralen. Meng totdat de kralen gelijkmatig over de oplossing zijn verdeeld om DNA-fragmenten van meer dan ~100 bp te selecteren.
  2. Incubeer gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 27 °C tot 37 °C (aanbevolen 30 °C).
    1. Tijdens de incubatie. Bereid 5 ml 80% verse ethanol in NFW voor elke 2 verwerkte chips.
  3. Neem de buisjes met het geïncubeerde kralenmengsel en draai kort naar beneden op 100 x g op een tafelcentrifuge.
  4. Plaats de buisjes op een magnetisch scheidingsrek en incubeer ze minimaal 5 minuten (totdat de vloeistof helder wordt).
  5. Verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de kralen te verstoren en bewaar het in een schoon gelabelde tube. Label cDNA release met chip-ID en datum.
  6. Voeg 1,5 ml 80% ethanol toe aan de buisjes zonder de kralen te verstoren en incubeer gedurende 30 s voordat u de ethanol verwijdert.
  7. Herhaal stap 11.6 nog een keer, deze keer verwijder je zoveel mogelijk ethanol met behulp van een kleine pipetpunt zonder de kralen te verstoren.
  8. Laat de kralen in de tubes aan de lucht drogen totdat ze niet meer reflecteren. De tijd kan variëren, dus controleer regelmatig om uitdroging (barsten) te voorkomen, wat resulteert in een laag rendement.
    NOTITIE: Meet de luchtvochtigheid en temperatuur van de kamer. Bij hoge temperaturen (27 °C) en een lage luchtvochtigheid (minder dan 20%) drogen de parels zeer snel (3 tot 5 min). Bij lage temperaturen (23 °C) en een hoge luchtvochtigheid (meer dan 40%) drogen de parels veel langzamer (7 tot 15 minuten).
  9. Verwijder de kralenbuisjes uit het magneetrek, voeg 22 μL NFW toe en meng door middel van vortex.
  10. Incubeer in een droog bad of PCR-machine bij 27 °C gedurende 5 tot 15 minuten.
  11. Centrifugeer kort en plaats de buis terug op het magnetische scheidingsrek totdat de vloeistof helder wordt (2 tot 5 min).
  12. Breng 21 μl supernatans met cDNA over in het door het monster gelabelde PCR-buisje van 0,2 ml zonder de kralen te verstoren.
  13. Herhaal stap 11.9 tot 11.12 voor elk buisje en verzamel in totaal 42 μL cDNA. Ga direct verder met de amplificatie van cDNA (stappen 12.1 tot 12.8).
    OPMERKING: Vertraging bij het starten van de amplificatie zal resulteren in een verminderde opbrengst, meer korte lezingen en degradatie van de enkelstrengs DNA-sjabloon.

12. cDNA-amplificatie

  1. Haal de cDNA-amplificatiemix en FFPE cDNA-primers uit de vriezer en leg ze op nat ijs om te ontdooien.
  2. Draai de cDNA-amplificatiemix en FFPE cDNA-primers op een tafelcentrifuge op ~100 x g.
  3. Voeg 50 μL cDNA-amplificatieoplossing en 8 μL FFPE cDNA-primers toe aan elke cDNA-buis vanaf 42 μL (stap 11.13) en plaats deze in een thermocycler met de platte dopadapter om vervorming van de buis te voorkomen.
  4. Voer het thermocyclerprogramma uit voor de cDNA-amplificatie: eerste denaturatie: 95 °C gedurende 5 minuten; cycli: [98 °C gedurende 20 s, 58 °C gedurende 20 s, 72 °C gedurende 3 min] × 15 cycli; laatste verlenging: 72 °C gedurende 5 min; houdtemperatuur: 12 °C (indien onmiddellijke verwerking) / 4° C (indien 's nachts bewaard).
  5. Meet de DNA-concentratie van 1 μL cDNA voor en na het opruimen van de kralen.
    OPMERKING: De hoeveelheid cDNA-product vóór het opruimen moet worden berekend op meer dan 1 μg voor elke chip van 1 cm². De concentratie na het opschonen moet ten minste 10 ng/μL zijn. Lagere opbrengsten worden doorgaans geassocieerd met een verminderde bibliotheekdiversiteit. Significant monsterverlies in dit stadium is gecorreleerd met DV200-scores; DV200 is echter geen perfecte voorspeller van resultaten.
  6. Herhaal het opruimen van cDNA-kralen uit stap 11 (kralen opruimen) met behulp van het PCR-product uit stap 12.4, met drie aanpassingen: gebruik een kleiner PCR-magnetisch rek, voeg slechts 200 μl 80% ethanol toe in stap 11.6 en suspendeer opnieuw in 22 μl Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8) in stap 11.9.
  7. Bewaar kralen in een tube met 20 μL NFW, gelabeld met monsternamen, streepjescode, datum en chip-ID.
  8. Meet de verdeling van het cDNA-fragment met behulp van een fragmentanalysator. Het bereik van de fragmentgrootte moet tussen 250-400 bp liggen. Als de fragmenten te klein zijn, herhaal dan de parelreiniging, maar gebruik kamertemperatuur (~25 °C) in plaats van 27 °C.
    OPTIONEEL STOPPUNT: Na het meten van het cDNA kan het maximaal 1 maand worden bewaard bij -20 °C en maximaal 1 jaar bij -80 °C. Kralen kunnen 1 week bewaard worden in NFW bij 4 °C. Vries kralen niet in.

13. Voorbereiding van de bibliotheek (dag 4)

  1. Amplificatie Reactie Mix Voorbereiding
    1. Verwijder de PCR-amplificatieoplossing van de bibliotheek, de barcodesets van de bibliotheek, het cDNA-product en NFW. Ontdooi het cDNA en de reagentia op ijs en water bij kamertemperatuur en draai gedurende 10 s op 100 x g naar beneden.
  2. Bepaal de barcodestrategie van de bibliotheek voor elke 25 μL PCR-barcodeprimermix.
    OPMERKING: Voor deze sequencer moeten alle basen gelijk worden weergegeven op elke positie in een barcodeset. De meeste commerciële kits die hiermee compatibel zijn, zijn daarom ontworpen met vooraf gedefinieerde barcodetetrads (sets van vier). Deze tetrads kunnen worden toegepast op individuele monsters bij het splitsen over een sequentiebaan, of ze kunnen worden samengevoegd voor een enkele steekproef bij het sequencen van één monster per baan. Het is absoluut noodzakelijk om gebalanceerde barcodes te behouden, omdat ongebalanceerde barcodes de hoeveelheid bruikbare gegevens die door de sequencer worden gegenereerd, verminderen.
  3. Bepaal het volume van cDNA voor 20 ng (bijv. 10 ng/μL zou 2 μL nodig hebben). Maak hiermee een NFW (25 μL) oplossing van verdund cDNA (verdund tot ~1 ng/μL).
  4. Combineer de bibliotheekamplificatiemix (50 μl) met verdund cDNA in NFW (25 μl) en PCR-barcodeprimermix (25 μl) op de PCR-buis van 0,2 ml.
  5. Meng het putje door te pipetteren en draai gedurende 10 s op 100 x g naar beneden. (Niet vortexen)
  6. Plaats de PCR-buisjes van 0.2 ml in de thermocycler en zorg ervoor dat je een inzetstuk hebt om te voorkomen dat de buisjes worden verpletterd.
  7. Voer het thermocyclerprogramma uit voor de cDNA-amplificatie: eerste denaturatie: 95 °C gedurende 5 minuten; cycli: [98 °C gedurende 20 s, 58 °C gedurende 20 s, 72 °C gedurende 3 min] × 8 cycli; laatste verlenging: 72 °C gedurende 5 min; houdtemperatuur: 12 °C (bij onmiddellijke verwerking) / 4 °C indien 's nachts bewaard.
    OPMERKING: Het is mogelijk om verschillende hoeveelheden input cDNA te gebruiken om de bibliotheek voor te bereiden. De gebruikte hoeveelheid is echter van invloed op het aantal PCR-cycli dat nodig is voor amplificatie. De leverancier beveelt bijvoorbeeld 20 ng input-DNA en het gebruik van 8 cycli aan. Het is ook mogelijk om 40 ng te gebruiken met 7 cycli of 80 ng met 6 cycli. Het gebruik van minder dan 20 ng of meer dan 80 ng input cDNA wordt niet aanbevolen.

14. Bibliotheek versterking kralen opruimen

  1. Kwantificeer het onbewerkte bibliotheekproduct zoals gedaan in stap 12.5.
  2. Herhaal het opruimen van kralen uit stap 11 (kralen opruimen) met behulp van het onbewerkte bibliotheekproduct uit stap 13.7 met drie aanpassingen: gebruik een kraal van 0,8:1 tot product, gebruik een kleiner PCR-magnetisch rek, gebruik slechts 200 μl 80% ethanol in vergelijking met stap 11.7 en suspendeer in 22 μl TE-buffer (pH 8) in stap 11.9. Bereid ongeveer 1 ml verse 80% ethanol vers per twee 1 cm2 chips.
  3. OPTIONEEL STOPPUNT: Na het meten van de wisselaar kan deze maximaal 1 maand worden opgeslagen bij -20 °C en maximaal 1 jaar bij -80 °C. Kralen zijn 1 week houdbaar bij NFW bij 4 °C. Vries de kralen niet in.

15. DNBSEQ-T7RS-systeem voor het sequencen van Stereo-Seq Random Oligonucleotide Primed DNB's

  1. Gebruik een PE75-kit op het DNBSEQ-T7RS-systeem om de cycli toe te wijzen als 25 voor Read 1 en 62 voor Read 2 (PE25+62), gevolgd door een index van 10 bp:
    1. De eerste lezing (lees 1 van 25 cycli) legt de ruimtelijke chip-ID (CID) of locatiespecifieke informatie van de op chips gebaseerde barcodes vast.
    2. De tweede lezing (lees 2 van 62 cycli) legt de Molecular Identifier (MID) vast, een willekeurige sequentie van 6 bp, direct bevestigd aan de geninserts met 3 extra donkere cycli die worden gebruikt voor faseringscorrectie en kalibratie van de streepjescode-offset. Dit wordt gevolgd door een geninsertie van 30-59 bp vanaf read 2, die wordt geïdentificeerd door mapping naar bekende genomen of transcriptomen.
      OPMERKING: Langere geninserts zijn mogelijk, maar vereisen verschillende gepaarde eindkits en aanpassing van de mapping-workflow.
    3. De indexcyclus voor demultiplexing beslaat 10 basispunten op basis van de sequentiebarcodes die in stap 13.2 zijn gegroepeerd.
      OPMERKING: Typische sequencingtijd van ongeveer 10-12 uur voor een 75 PE-flowcel. Sequencing wordt meestal gedaan in een sequencing-kern of commerciële faciliteit, en niet een intern proces voor de meeste laboratoria, omdat het een DNBSEQ-T7RS of een vergelijkbaar sequencing-instrument vereist.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De onderstaande gegevens tonen de mogelijkheid aan om segmentatie van één cel uit te voeren met behulp van de SAW-pijplijn en mapping naar niet-poly geadenyleerde RNA's zoals tRNA (TRDMT1) vanuit een FFPE-sectie. De onbevooroordeelde gegevens van Stereo-seq stellen ons in staat om het belang van niet alleen mRNA's te onderzoeken, maar ook tRNA's, rRNA's en niet-gastheer-RNA's (indien relevant). Met behulp van de directe output van de SAW-pijplijn

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Stereo-seq-protocol is zeer gedetailleerd en omvat verschillende kritieke stappen die precisie, timing en een schone omgeving vereisen om succes te garanderen, vooral met microbioom- of niet-hostprofilering die mogelijk specifieke voorzorgsmaatregelen vereist.

Het gebruik van nucleasevrij water tijdens alle stappen is vereist en de afvangchip mag niet worden aangeraakt met iets anders dan het monster en de reagentia. Wees uiterst voorzichtig bij het gebrui...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat dit werk niet werd gefinancierd door Complete Genomics. Complete Genomics draagt echter de kosten van publicatie van dit artikel.  Ze kregen geen geavanceerde kopie of input over de inhoud.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door de Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 en 891490), de Sie Foundation en het Stephanie C. Stelter Endowment Fund. Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met de Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, Department of Veterinary Medicine & Surgery en Advanced Genomics Technology Core, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de National Institutes of Health via MD Anderson's Cancer Center Support Grant P30 CA016672 en Jared Burks' NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1.

We willen ook Compete Genomics bedanken, in het bijzonder Brandon Vanderbush en Tanzeen Yusuff voor technische training en probleemoplossing, evenals Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong en Erin Petrilli. De auteur(s) ontving(en) een set FFPE OMNI- en sequencing-reagentia, evenals toegang tot het T7 Early Access Program, van Complete Genomics tegen een gereduceerde prijs. Bovendien werden sommige reagentia gratis verstrekt voor gebruik in dit onderzoek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubes regular DNAse/RNAseThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456To mix reagents in (other bands are fine) 
100% EthanolSigma-AldrichE7023Molecular grade
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650Used for aliquots 
20x Concentrate Saline Sodium Citrate (SSC) BufferSigma-AldrichS6639-1LUsed to make 5X SSC for staining and 1X SSC for wash steps and coverslip removal.
2100 Bioanalyzer instrumentAgilentDiscountinuedInstument: Bioanalyzer
3 Well Chamber, removableIbidi80381Silicone chamber to reduce volumes during rehydration and methanol fixation.
405nm UV Light SourceVariousN/AFor curing UV resin
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652Used for aliquots and for deparaffinization 
70% Sterile Isopropanol AlcoholTexwipe TX3270For surface decontamination 
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626For Bioanalyzer characterization of cDNA and libraries
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513For Bioanalyzer characterization of RNA
Aluminum FoilVariousN/ATo cover slide during ssDNA staining.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Life Sciences B23317/B23318/B23319SPRI Beads cDNA and Library Clean up
BleachVariousN/ACleaning workstation removing microbiome contamination
CONSTIX Sealed Foam SwabsContec19161023For precise resin cleaning
CoverslipSigma-AldrichBR470045-2000EA
Desiccant PacksVariousN/ARNase free, dust free desiccant packs.
Disposable Face MaskThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001Protection, RNAse contamination and & sterility 
DNA Erase WipesSigma-AldrichL9060-250EADecontamination by wiping off surfaces (wet wipes)
DNA LoBind Tubes 1.5mLEppendorf 22431021Used for collection of cDNA and library post amplifications.
DNA LoBind Tubes 2mLEppendorf 22431048Used for collection of cDNA before amplification.
DNBSEQ OneStep DNB Make Reagent KitComplete Genomics940-001891-00Reagents for DNA nanoball (DNB) preparation and amplification
DNBSEQ-T7RS Cleaning Reagent KitComplete Genomics940-001903-00Cartridge for washing after sequencing complete
DNBSEQ-T7RS DNB Load Reagent KitComplete Genomics940-001894-00Reagents and plate to load DNBs to flow cell
DNBSEQ-T7RS Sequencing Flow CellComplete Genomics940-001902-001 lane/flow cell
DNBSEQ-T7RS Stereo-seq Visualization Reagent KitComplete Genomics940-001893-00The cartridge and reagents for sequencing.
DNBSEQ-T7RS systemComplete GenomicsThis stereo-seq visualization set utilizes DNBSEQ technology. A sequencing run starts with the hybridization of a DNA anchor, then a fluorescent probe is attached to the DNA Nanoball (DNB) using combinatorial probe anchor sequencing (cPAS) chemistry. Finally, the high-resolution imaging system captures the fluorescent signal. After digital processing of the optical signal, the sequencer generates high-quality and accurate sequencing information.
Dust-Off Compressed AirMatinM-6318Important to use this brand or one with similar propellant 
Edge-Rite Microtome BladesThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistology - Used when sectioning samples
Explosion proof FreezerVariousN/ATo chill methanol before and during methanol fixation step.
Histology BrushesVariousN/AHistology - Used when sectioning samples
Hydrochloric acidSigma-Aldrich2104-50MLFor diluting premuliablization enzyme in 0.01 N HCl (pH 2). Standard stock concentration for HCl solution is 0.1 N.
Imaging SystemvariousN/AGC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap RNase Decontamination SolutionThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780Cleaning workstation removing RNAse contamination
Kimtech Delicate Task Wipers Kimtech34155To dry benches, equipment, pipettes, etc.
LabcoatVariousN/APersonal Protection Equipment (PPE)
Lens PaperThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997Various works for drying slides without sheading
Lookout DNA Erase WipesSigma-AldrichL9060Cleaning workstation removing PCR contamination
Magentic Separation Rack 5uL - 0.2 Permagen LabwareMSRLV08For bead sepration in PCR tubes
Magjet Rack 12x1.5 mLThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02For bead sepration in 1.5 mL tubes
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM2235Histology - Used when sectioning samples
Methonal ≥99.9%, suitable for immunofluorescence, HPLCSigma-Aldrich34860For fixation (Needs to be HPLC Grade)
Micro-dissecting ForcepsSigma-AldrichF4142-1EAHistology - Used when sectioning samples
MicropipetteVariousN/A
Molecular Grade Nuclease Free Water Non-DPEC Treated WaterVariousN/ADilutions and elution of beads
Nitrile GlovesVariousN/APPE
OvenVariousN/ATo bake chip
PCR 0.2 mL Tubes with attached capsVariousN/AFor PCR applications
PCR covers VariousN/AReplacement if adhesive on provided cover is weak
PCR Hood & WorkstationMystaireMY-PCR24-010For pre-PCR (RNA to cDNA) steps
pH MeterVariousN/ApH Meter to confirm HCl pH.
Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichA005-COptional to increase tissue adhesion to chip
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ33226Insuterment; DNA quantiy measurement
Qubit dsDNA Quantification Assay KitsThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsStereo seqFFPE TissueSpecies Agnostic ProfilingSpatial RNA DetectionSingle Cell SegmentationMicrobiome ProfilingNon Polyadenylated RNATumor MicroenvironmentSpatial Barcoding

Related Articles