Dit chirurgische protocol is een stapsgewijze handleiding voor het inbrengen van een intrathecale katheter in de subdurale wervelkolom van een knaagdier om een gerichte behandeling toe te dienen.
Methodenartikel
Toegang tot de subdurale ruimte van het ruggenmerg van het knaagdier voor behandeling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De behandeling van ruggenmergaandoeningen of verwondingen is een uitdaging, deels vanwege moeilijkheden bij het ontwikkelen van effectieve behandelingen die rechtstreeks op het ruggenmerg kunnen worden toegepast. De huidige behandelingen voor ruggenmergletsel (SCI) zijn bijvoorbeeld voornamelijk epiduraal. Epidurale therapieën laten echter geen directe interactie met het ruggenmerg toe, waardoor het potentiële behandelingseffect wordt verminderd. Hier wordt een methode voorgesteld om toegang te krijgen tot de subdurale ruimte in een knaagdiermodel voor een directer effect van een bepaalde behandeling. Met behulp van het beschreven protocol werd een succesvolle subdurale implantatie van een bio-elektronisch apparaat voor het opnemen/stimuleren van het ruggenmerg, evenals het veilig inbrengen van een met neurotrofine 3 geladen hydrogel, uitgevoerd. Dieren die in beide toepassingen aan dit protocol werden blootgesteld, vertoonden geen verandering in de functie van de achter- of voorpoot na de procedure en er ontwikkelde zich geen disfunctie tot 12 weken na de procedure. Hoewel de hier gepresenteerde voorbeelden zeer specifiek zijn, kan het voorgestelde protocol in verschillende toepassingen worden gebruikt om een effectievere gelokaliseerde behandeling van neurologische aandoeningen van het ruggenmerg mogelijk te maken.
Inleiding
Ziekten en verwondingen van het ruggenmerg kunnen verwoestende gevolgen hebben voor miljoenen mensen wereldwijd, wat resulteert in aanzienlijke sociale, economische en gezondheidszorglasten 1,2. Verwondingen aan het ruggenmerg en neurodegeneratieve ziekten kunnen leiden tot chronische motorische, sensorische en autonome disfuncties die de kwaliteit van leven en de onafhankelijkheid van de getroffen personen verminderen. De huidige behandelingen, zoals chirurgische ingrepen en farmacotherapie, zijn gericht op het verminderen van aanvankelijke trauma's en het beheersen van secundaire complicaties3. Deze benaderingen bereiken echter zelden substantiële neurale regeneratie of functioneel herstel, waardoor er een dringende behoefte is aan effectievere interventies die gericht zijn op de onderliggende mechanismen.
Een primaire zorg voor de huidige behandelingsstrategieën is de locatie en levering van een gewenste behandeling. Behandelingen zoals neuromodulatie of farmaceutische interventie hebben het vermogen om de neuronale activiteit te beïnvloeden, functioneel herstel te vergemakkelijken en mogelijk verbindingen in beschadigde spinale circuits te herstellen4. Stimulatie van het ruggenmerg kan leiden tot verbeteringen in de motorische controle en verminderde pijn5. Deze strategieën zijn momenteel echter beperkt tot indirecte toediening aan het gewonde weefsel, gericht op de epidurale ruimte, zonder rekening te houden met de dura mater-barrière van het ruggenmerg 6,7,8. Hoewel epidurale behandelingen klinische voordelen hebben aangetoond, zijn ze beperkt vanwege indirecte toegang tot doelneuronale populaties, wat leidt tot mogelijk verminderde effecten van therapeutische middelen.
Onze groep heeft gewerkt aan het overwinnen van deze beperkingen die gepaard gaan met epidurale strategieën en het onderzoeken van het potentieel voor directe subdurale behandeling in modellen voor ruggenmergletsel (SCI). Door katheters in de subdurale ruimte in te brengen, kan de behandeling rechtstreeks op het ruggenmerg worden toegepast, wat zorgt voor een betere interactie met aangetast neuraal weefsel 9,10. Subdurale toediening vermindert ook de barrière-effecten van de dura mater, waardoor de werkzaamheid van elektrische stimulatie en gerichte medicijnafgiftesystemen wordt verbeterd11,12. Deze methode zou de precisie en effectiviteit van de behandeling kunnen verbeteren, wat mogelijk kan leiden tot betere resultaten bij functioneel herstel.
In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor veilige toegang tot de subdurale ruimte van het ruggenmerg van knaagdieren. Deze procedure is gericht op het thoracale gebied van de wervelkolom (T10-T12), maar kan indien nodig op verschillende plaatsen op het snoer worden geïmplementeerd. Anatomische oriëntatiepunten worden gespecificeerd, waardoor regio-identificatie mogelijk is, en gedetailleerde instructies over de laminectomie, durotomie en dura mater-penetratie worden gepresenteerd. Er worden ook twee toepassingen van dit protocol gepresenteerd, waaronder de implantatie van een apparaat voor elektrische stimulatie en de toediening van een hydrogel-medicijnafgiftesysteem (Figuur 1). De geschetste stappen zijn gemakkelijk te reproduceren door onderzoekers met ervaring in knaagdierchirurgie. Dit protocol is geschreven in de context van een kneuzingsmodel van SCI; Het specifieke model van letsel kan echter worden aangepast, afhankelijk van de gewenste experimentele resultaten. De hier beschreven techniek is niet alleen veelbelovend voor het bevorderen van de behandeling van dwarslaesie, maar kan ook een platform bieden voor toekomstig onderzoek naar herstel en regeneratie van het ruggenmerg door middel van nauwkeurige, gelokaliseerde interventies.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Universiteit van Auckland en werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee (AEC) van de instelling en de Animal Welfare Officers (AWO) van de universiteit. Vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 240-260 g werden gebruikt en in groepen gehuisvest (21 °C; 12 uur: 12 uur, licht: donkere cyclus) en kregen ad libitum toegang tot het standaard knaagdierdieet voor en na de operatie. Het wordt aanbevolen om dit protocol eerst te proberen bij afwezigheid van een letselmodel, omdat het de bedoeling is om veilige toegang te bieden tot de subdurale ruimte van het ruggenmerg van knaagdieren. Dit is een belangrijke eerste stap om aan te tonen dat het protocol kan worden toegepast zonder letsel te veroorzaken, waardoor een nauwkeuriger onderzoek van een gewenst letselmodel mogelijk is. Het protocol is geschikt om te worden gecombineerd met de vele verschillende letselmodellen die door onderzoeksgroepen worden gebruikt. Daarom beschrijft het protocol geen specifieke stappen voor het toedienen van blessures, aangezien deze variëren op basis van de toepassing. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Preoperatieve voorbereiding
- Steriliseer alle instrumenten (aanvullende afbeelding 1) en de relevante verbruiksartikelen.
- Weeg de rat(ten) die de volgende dag geopereerd moeten worden.
- Bereken de juiste doses medicijnen die moeten worden toegediend; bupivacaïne (pijnstiller) @ 2 mg/kg, dosis - 0,08 ml/100 g; meloxicam (pijnstiller) @ 2 mg/kg, dosis - 0,04 ml/100 g; buprenorfine (pijnstiller) @ 0,03 mg/kg, dosis - 0,1 ml/100 g; enrofloxacine (antibioticum) @ 10 mg/kg, dosis - 0,08 ml/100 g12,13.
OPMERKING: Bupivacaïne werd subcutaan toegediend op 3-4 plaatsen langs de operatieplaats voorafgaand aan de eerste incisie.
2. Chirurgische voorbereiding
- Zorg ervoor dat het anesthesiesysteem correct is ingesteld (controleer of alle slangen die bij het zuurstof- en anesthesiesysteem horen, correct zijn ingesteld).
- Bereid de vereiste injecties voor op basis van het gewicht van de ratten en een injectie van 3 ml met zoutoplossing die vóór de start moet worden toegediend.
- Zorg ervoor dat het warmtekussen (onderhoudstemperatuur 37 °C), de lamp, de microscoop en het scheerapparaat allemaal zijn ingesteld en functioneren.
NOTITIE: Er is geen specifieke vergroting voor de snijmicroscoop vereist, aangezien de vergroting varieert afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker en de zichtbaarheid tijdens de procedure.
LET OP: Zorg ervoor dat de temperatuur van het dier tijdens de procedure niet onder de 35°C of boven de 40°C daalt
3. Voorbereiding van dieren
- Zorg ervoor dat alle slangen die verband houden met het anesthesiesysteem en de zuurstoftank zijn aangesloten. Als u het anesthesiesysteem gebruikt dat in dit onderzoek is gebruikt (zie materiaaltabel), stelt u de isofluraaninductie in op 3% en voert u het gewicht van het dier in het anesthesiesysteem in om het zuurstofdebiet voor onderhoudsanesthesie in te stellen (aanvullende figuur 1A).
OPMERKING: Houd de anesthesie op een onderhoudsniveau dat geschikt is voor elk individueel dier. Dit kan variëren tussen 1,3%-2%, afhankelijk van het dier. - Plaats de rat in de inductiekamer totdat hij niet meer in staat is om zichzelf op te richten, schakel over naar het gewenste onderhoudsniveau voor isofluraan en verplaats de rat naar de neuskegel.
- Dien 3 ml zoutoplossing en de benodigde medicijninjecties toe, subcutaan, voorafgaand aan het scheren.
OPMERKING: Injecteer na injecties met zoutoplossing en scheren de bupivacaïne op verschillende plekken langs de beoogde incisieplaats - Terwijl u het anesthesieniveau van het dier bewaakt, bereidt u alle instrumenten (microscoop, gereedschap, steriel laken) in het operatiegebied voor. Plaats een steriel laken voor het gereedschap in het gewenste gebied en organiseer het gereedschap op het gordijn, waarbij het steriele veld behouden blijft.
- Scheer de vacht langs de rug van het dier, vanaf de basis van de nek tot de bovenkant van de heupen.
- Desinfecteer het gebied met chloorhexscrub, gevolgd door chloorhex-tinctuur, met een cirkelvormige beweging vanuit het midden van het geschoren gebied (3x), en breng glijmiddel aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Breng de rat over naar het verwarmingskussen onder de microscoop, plaats een pers- en afdichtingslaken over het geschoren gebied en snijd een gat dat groot genoeg is om het operatieveld bloot te leggen, maar niet zo groot dat het ongeschoren vacht bloot komt te liggen.
- Plaats een rectale temperatuursonde om de temperatuur van het dier te controleren en houd ~37 °C aan met het verwarmingskussen. Voer elke 5-10 minuten dierenwelzijnscontroles uit.
- Dien pedaalreflex toe om het chirurgische vlak van anesthesie te bevestigen en begin met de procedure.
4. Weefseldissectie van de wervelkolom
- Maak met behulp van een scalpelmes een lineaire incisie (~6-8 cm) in rostrale naar caudale richting (Figuur 2A), beginnend onder de basis van de nek en zich uitstrekkend over de thoracale bult, waardoor de T9-T13-wervels bloot komen te liggen.
- Koppel het bindweefsel onder de incisieplaats voorzichtig aan de achterkant met een Graefe-tang of een schaar met microveer, om het spierweefsel op de wervelkolom direct bloot te leggen.
- Identificeer het T13-proces door de twee witte V-vormige pezen in de buurt van de caudale helft van de incisie te plaatsen. De processus spinosus direct rostraal ten opzichte van de V aan de staartzijde van het dier is T13 (Figuur 2B).
- Begin bij T13 en ga omhoog naar T9, maak kleine incisies in het bindweefsel tussen elk proces om ze te scheiden voordat u de spier vrijmaakt, om de locatie te behouden naarmate de procedure vordert (Figuur 2C). Snijd vervolgens kanalen in de spier die evenwijdig aan beide zijden van de processus spinosus lopen met behulp van microscripers. Doe dit aan beide zijden van de wervelkolom om de lamina van elk ruggengraatsegment bloot te leggen (Figuur 2D).
- Bevestig serrefijne klemmen aan beide zijden van de spierwanden om een open gezichtsveld naar de wervelkolom te behouden. Bevestig een paar aan de zijkanten van T13, een ander aan de grens van T11/T12 en een ander aan T11/T10 (Figuur 2E).
- Zodra er heldere kanalen zijn gevormd, snijdt u het bindweefsel tussen elk proces weg met behulp van een microschaar of rongeurs (Figuur 2F).
- Maak de kanalen vrij totdat bindweefsel en spier netjes zijn ontleed van elke lamina, van het rostrale deel van T13 tot het caudale deel van T9, waardoor de T10-12-segmenten voor de laminectomieprocedure worden blootgelegd. Succesvolle afronding wordt aangegeven door duidelijk zichtbare lamina aan weerszijden van de processen.
OPMERKING: Een microscoop is niet vereist voor stap 4, maar wordt ten zeerste aanbevolen.
5. Laminectomie
- Zoek het caudale deel van de T12-lamina dat het rostrale deel van T13 overlapt, plaats de punt van de rongeurs eronder en begin voorzichtig met het verwijderen van stukjes lamina, zoals aanbevolen in standaard JoVE-protocollen 14,15 (Figuur 2G).
OPMERKING: Gebruik een tang om de processus spinosus van elke lamina vast te pakken om de stabiliteit te behouden en om de platen voorzichtig op te "tillen" tijdens elke snede met de rongeurs (Figuur 2G). Wanneer u de punt van de rongeurs onder de lamina schuift, moet u de buitenwaartse druk van het ruggenmerg weghouden om mogelijke schade te minimaliseren.
LET OP: Pas op dat u de rongeurs niet te ver naar beneden duwt bij het maken van sneden, omdat dit de dura mater en/of het ruggenmerg zelf kan beschadigen. - Ga van de ene naar de andere kant en ga door met het wegsnijden van stukjes bot van de T12-lamina totdat er voldoende ruimte is om de snede uit te breiden tot in de middellijn van het proces, waardoor het ruggenmerg bloot komt te liggen, met een gat van ongeveer 5 mm breed (Figuur 2H).
OPMERKING: Het verwijderen van bot uit de wervelkolom kan leiden tot bloedingen die het zicht tijdens de procedure kunnen verminderen. Gebruik wattenstaafjes of opgerolde pluisvrije doekjes (aanvullende afbeelding 1B) om dit te beheersen tijdens het uitvoeren van de laminectomie. - Werk de rongeurs onder de lamina aan weerszijden en maak dan een gelijkmatig kanaal vrij naar het craniale gedeelte van T12 (Figuur 2I).
OPMERKING: Het ruggenmerg wordt zichtbaar als voor elk ruggenmergsegment stukken van de laminaire plaat worden verwijderd. - Herhaal stap 5.1 tot en met 5.3 om zowel de T11 als de T10 te verwijderen.
- Ga door met laminectomie, waarbij u aan beide zijden gelijkmatige sneden behoudt, en beweeg rostraal tot T9 (Figuur 2J).
OPMERKING: Voor kneuzing SCI-procedures (zie sectie Representatieve resultaten) moet de lamina boven het gewenste ruggenmergsegment/de gewenste segmenten van het ruggenmerg breed genoeg worden vrijgemaakt om het gebruik van een hulpmiddel tegen kneuzing mogelijk te maken (zie verbreed gebied in het midden van figuur 2K). Voor medicijnafgifte kan de laminectomie net breed genoeg zijn om de toepassing van de gewenste verbinding te visualiseren. - Spoel de thecale zak voorzichtig met zoutoplossing en bereid het gewenste gebied voor op de durotomie zodra de laminectomie is voltooid en een voldoende gebied van T10-T12 is verwijderd (Figuur 2K).
OPMERKING: Deze procedure is specifiek voor toegang tot de spinale segmenten (T10-T12), maar deze methoden kunnen worden gebruikt om laminectomieën uit te voeren op verschillende segmenten langs de wervelkolom.
6. Durotomie voor behandelingstoepassing
- Voer de durotomie (incisie van dura mater) uit met behulp van de dissectiescoop om toegang te krijgen tot de subdurale ruimte van het ruggenmerg (Figuur 3A).
NOTITIE: Pas de vergroting van de scoop aan op basis van de voorkeur van de chirurg voor zichtbaarheid van de dura mater. - Buig een naald van 27 G in een hoek van 90 graden met de afschuining naar boven (Afbeelding 3B).
OPMERKING: Gebruik een paar naaldschroevendraaiers of hemostaten om de naald vast te pakken tijdens het buigen. - Prik voorzichtig met de punt van de naald in de dura mater op het gewenste beginpunt op het ruggenmerg (Figuur 3B).
LET OP: Pas op dat u het onderliggende ruggenmerg of het mediane bloedvat niet beschadigt. - Zodra de dura mater is doorboord, tilt u de naald voorzichtig dorsaal op om een rond gat in de dura mater te scheuren, niet meer dan 2 mm, aan weerszijden van het middellijnbloedvat. Een succesvolle durotomie wordt aangegeven door een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof (CSF) lekkage uit beide gaten.
NOTITIE: Houd een afstand van ten minste enkele mm vanaf het einde van de laminectomie om gemakkelijker toegang te krijgen tot de subdurale ruimte. Steek indien nodig de naaldpunt voorzichtig opnieuw in het oorspronkelijke gat om de grootte te vergroten. - Zorg ervoor dat de positie die is geselecteerd voor de incisie van de durotomie en dat de positie direct ervoor vrij is van vertakkende bloedvaten van het middellijnbloedvat.
LET OP: Beschadig het middellijnbloedvat NIET, omdat dit overmatig bloeden veroorzaakt, waardoor de procedure niet kan worden voltooid. - Gebruik de gaten die in de dura zijn gemaakt om de gewenste behandeling toe te dienen of implanteer een apparaat in de subdurale ruimte. Voor dit protocol worden intrathecale katheters gebruikt voor de toediening van de behandeling om het stimulatieapparaat in positie te brengen of om de hydrogel te injecteren (Figuur 3C).
OPMERKING: Zorg voor een vrij gezichtsveld door continu bloed en/of liquor te verwijderen na duronomieën. - Zorg ervoor dat de uiteinden van de katheters zichtbaar zijn onder de dura voordat u overgaat in het ruggenmerg. Een succesvolle toepassing wordt aangegeven door katheters die soepel over de kleine spinale bloedvaten bewegen terwijl ze zich onder het durale membraan bevinden.
- Nadat de gewenste behandeling is toegediend (Figuur 3D,E), plaatst u een stuk steriel chirurgisch gelschuim in de ruimte die is ontstaan door de laminectomie om te helpen bij hemostase, wondgenezing en het behoud van de structuur van de wervelkolom.
- Gebruik na het plaatsen van gelschuim 4-0 polydioxanon resorbeerbare hechtdraad om de spier- en huidlaag boven de wervelkolom te sluiten.
7. Postoperatieve zorg
- Controleer de dieren dagelijks en geef de vereiste postoperatieve medicijnen (buprenorfine gedurende 2 dagen; enrofloxacine en meloxicam gedurende maximaal 5 dagen). Dien indien nodig subcutaan 1-3 ml zoutoplossing toe (als <10% lichaamsgewicht water wordt verbruikt gedurende 24 uur tijdens de postoperatieve periode).
- Afhankelijk van de procedure, controleer de blaasfunctie, motorische functie, grimasschaal en andere tekenen van dierenwelzijn.
- Verwijder de huidhechtingen ongeveer 10-14 dagen na de operatie.
Resultaten
Het voorgestelde protocol werd toegepast in twee verschillende experimentele settings. De getoonde gegevens zijn representatief voor niet-gewonde groepen, omdat het de bedoeling was om aan te tonen dat de subdurale manipulaties die in de procedure worden beschreven (bij afwezigheid van een verwondingsmodel) de functie niet aantasten. Een bio-elektronisch apparaat werd geïmplanteerd (Figuur 1A) of een hydrogel werd toegediend (Figuur 1B) bij 6-8 weken oude Sprague-Dawley-ratten. De motorische functie van deze dieren werd vergeleken met die van controledieren die een schijnoperatie ondergingen zonder een subdurale procedure met behulp van de BBB-motorfunctieschaal. Verschillende groepen dieren zijn hier vertegenwoordigd, die de levensvatbaarheid van elke procedure en de veiligheid ervan aantonen. Na elke procedure behielden alle dieren 7 dagen na de procedure een normale motorische functie zonder verschil in BBB-score tussen groepen, wat wijst op de veilige implementatie van het beschreven protocol. Daarnaast is een groep dieren (Figuur 4C) met een verminderde motorische functie van de achterpoot vertegenwoordigd ter vergelijking met de subdurale proceduregroepen, om verder aan te tonen dat er geen nadelige effecten werden opgemerkt in de experimentele groepen. Deze groep kreeg een kneuzing SCI-procedure met een kracht van 175 kdyn impactapparaat, zoals beschreven in eerdere literatuur12,13.
Bio-elektronisch implantaat
Voor de implantatie van het hulpmiddel omvat het protocol het creëren van twee durotomie-plaatsen - een voor het binnenkomen van de katheter en een andere voor het verlaten - om de beweging van de geleidekheters onder de dura en de gecontroleerde plaatsing van het apparaat te vergemakkelijken. Het bio-elektronische apparaat bestond uit twee gespleten armen die waren bevestigd aan een PCB-interface die is ingekapseld door een biocompatibele behuizing. De armen zijn tijdelijk verbonden met kleine intrathecale katheters via 7-0 zijden hechtdraad om te helpen bij het positioneren van het implantaat. De katheters worden langzaam door de rostrale durotomiegaten getrokken, onder de dura geschoven en door de uitgang van de durotomiegaten caudaal naar de behandelingslocatie. De bevestigde implantaatarmen werden vervolgens doorgetrokken en op elke hemisectie van het ruggenmerg geplaatst. Het uiteinde van het implantaat wordt gehecht aan de spier die aan het T13-proces is bevestigd. De behuizing wordt rostraal aan de trapezius/latissimus-spier gehecht aan de laminectomie. De huid wordt vervolgens rond de basis van de behuizing gesloten om toegang naar buiten te bieden.
Hydrogel behandeling
Voor de levering van hydrogel is alleen een toegangspunt vereist. De hydrogel werd toegediend via vergelijkbare intrathecale katheters die op dezelfde plaats waren geplaatst als het stimulatieapparaat. De katheters werden geladen met 10 μL van een poloxameerhydrogel12 en werden op dezelfde manier in de subdurale ruimte ingebracht als de implantatiestappen van het apparaat. Eenmaal op hun plaats werden de katheters langzaam teruggetrokken, terwijl de hydrogel continu onder de dura (Figuur1B) op elk hemikoord werd losgelaten. Na elke procedure werden de dieren gedurende 7 dagen gecontroleerd om voldoende herstel te garanderen.
De 21-punts Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)-schaal werd gebruikt voor de beoordeling van de motorische functie16. Dieren in beide groepen werden beoordeeld vóór de procedure (baseline) en 1 dag, 3 dagen en 7 dagen na de operatie. Het gedrag in het open veld werd direct en via geblindeerde video-opnames beoordeeld. Motorische functiescores voor zowel de linker- als de rechterachterpoten voor elke groep werden vergeleken met niet-geopereerde controledieren en een afzonderlijke dwarslaesiegroep om de omvang van eventuele nadelige effecten van de operatie te bepalen. Dieren in de implantaat- of hydrogelgroep vertoonden geen tekort in motorische functie na beide procedures, in vergelijking met niet-geopereerde controles of gewonde SCI-dieren. Merk op dat histologische analyse die de afwezigheid van schade aan het ruggenmerg bevestigt, al is gepubliceerd in ons eerdere werk. Die studie toonde aan dat het gebruik van deze methode om een apparaat te implanteren tot 7 dagenna procedure geen extra ruggenmergtrauma veroorzaakt. Minimale veranderingen in de activiteit van zowel astrocyten (GFAP) als microglia/macrofagen (Iba1) werden waargenomen na implantatie van een apparaat in vergelijking met controledieren. Het oppervlak en de ronding van de coupes van het coronale ruggenmerg direct onder het implantaat werden ook onderzocht, waarbij geen verandering in morfologie werd aangetoond.
Figuur 1: Subdurale behandelingsstrategieën. (A) Voorbeeld van het implantaat en (B) de katheter/spuit die wordt gebruikt voor het injecteren van de hydrogel. (C) Representatieve modellen van zowel het implantaat als de hydrogel die in het ruggenmerg van een rat wordt ingebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beelden van de laminectomie, die het operatieveld weergeven. (A) Oriëntatie van het dier voor chirurgische beelden in figuur 2 en figuur 3. (B) Oriëntatiepunten van de spierpees voor de locatie van proces T13 om het begin van de spierdissectie te begeleiden. (C) Loodrechte sneden om elk proces te identificeren dat via laminectomie moet worden verwijderd. (D) Spierkanalen die evenwijdig aan de processus spinala worden doorgesneden om toegang tot de botplaten mogelijk te maken voor verwijdering. (E) Bulldog serrefine-clips die worden gebruikt om de spier/huid aan weerszijden van de wervelkolom tegen te houden om voldoende operatieruimte te bieden. (F) Verwijdering van witte pezen die elk proces met elkaar verbinden vóór aanvang van de laminectomie. (G) Chirurgisch veld aan het begin van de laminectomie terwijl de rongeurs onder de T12-plaat worden geschoven om te beginnen met het wegsnijden van het bot. (H) De eerste helft van het T12-proces wordt verwijderd om het ruggenmerg bloot te leggen en voldoende ruimte te laten voor de chirurg om rostraal te bewegen en te beginnen met het verwijderen van de resterende processen (T11/T10). (I) Verwijdering van het craniale gedeelte van T12, met volledige verwijdering van het segment. (J) Laminectomie halverwege voltooid op T11 met behulp van bredere sneden voor het aanbrengen van een voorbeeld van een kneuzing SCI. (K) Volledige laminectomie na verwijdering van T10-T12-segmenten, waarbij het dorsale oppervlak van het ruggenmerg volledig wordt blootgelegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stappen voor het uitvoeren van de durotomie en het toepassen van gerichte behandeling. (A) Schema van de locatie van gaten in de dura mater van het ruggenmerg. (B) Chirurgisch veld met een naald van 27 G die de dura binnendringt om de durotomie te creëren; dit gebeurt aan beide zijden van het centrale bloedvat, zoals te zien is in (A). (C) Eerste inbrengen van een katheter die wordt gebruikt voor behandelingstoepassing. (D) Apparaat voor elektrische stimulatie op zijn plaats op het ruggenmerg. (E) Katheters geladen met hydrogel voor injectie op het oppervlak van het ruggenmerg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Postoperatieve toestand en motorische functie. (A) Representatieve beelden van dieren na implantatie van het apparaat en toediening van hydrogel. (B) Representatieve BBB-scores van dieren met een kneuzing van de wervelkolom in vergelijking met dieren die ofwel een subdurale procedure hebben ondergaan (implantaat of hydrogel) of controledieren hebben ondergaan die niet zijn gemanipuleerd. De steekproefomvang van de controlegroep (niet-geopereerd), SCI en implantaatgroep was n = 5 en de steekproefomvang van de Hydrogelgroep was n = 3. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Chirurgische instrumenten. Foto van gebruikte operatiemiddelen. (1) #10 Mes scalpel. (2) Vannas microschaar. (3) Graefe pincet. (4) Serrefine bulldog clips. (5) Rongeurs. (6) Naald van 27 G voor durotomie. (7) Fijne tang. (8) Spuit van 1 ml voor het aanbrengen van een zoutoplossing naar behoefte. (9) Dissectie schaar. (10) Hemostatica om te hechten. (11) Puntige wattenstaafjes. (12) Gesteriliseerde wattenbolletjes. (13) Opgerolde pluisvrije doekjes. Klik hier om deze figuur te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Subdurale versus epidurale ruimte. Schematische weergave van de wervelkolom en het ruggenmerg, waarbij de epidurale vs. subdurale ruimte. Klik hier om deze figuur te downloaden.
Discussie
De hier gepresenteerde methodologie biedt stapsgewijze instructies voor toegang tot de subdurale ruimte van de wervelkolom en toont de veiligheid en haalbaarheid ervan aan de hand van twee voorbeelden van behandelingstoediening aan het thoracale gebied van het ruggenmerg11,12. Talrijke onderzoeksgroepen hebben benaderingen ontwikkeld in een poging om ruggenmergletsel (SCI) te behandelen door middel van elektrische of chemische interventies. De huidige strategieën, waaronder implanteerbare apparaten voor optogenetica17 of elektrische stimulatie18, evenals farmaceutische therapieën met behulp van hydrogels19,20, hebben wisselend succes aangetoond bij het vergemakkelijken van herstel en revalidatie. Nauwkeurige targeting blijft echter een cruciale uitdaging, aangezien de meeste huidige behandelingen buiten de subdurale ruimte worden gegeven. De hier beschreven techniek biedt een veelbelovende benadering voor het rechtstreeks toedienen van interventies aan het ruggenmerg, inclusief een middel voor langdurige toegang tot de subdurale ruimte (aanvullende figuur 2), ter ondersteuning van aanhoudende en gerichte toediening van therapeutische middelen voor dwarslaesie en neurodegeneratieve aandoeningen. Dit heeft belangrijke implicaties voor het omzeilen van de bloed-ruggenmergbarrière, een grote uitdaging bij het ontwikkelen van effectieve behandelingen voor ruggenmergaandoeningen.
Laminectomie
Hoewel laminectomieprocedures bij knaagdieren veel worden gebruikt 17,21,22, zijn er verschillende kritieke aspecten van het protocol die moeten worden opgemerkt. De anatomische oriëntatiepunten die in het bovenstaande protocol worden gebruikt (stap 4.3; Figuur 2A) Zorg voor toegang tot het onderste thoracale gebied van het ruggenmerg en zijn specifiek voor het werk van onze groep. Als de procedure moet worden toegepast op een ander ruggenmerggebied, kan men segmenten rostraal of caudaal tellen tot aan de eerste wervels om de locatie te bepalen. Een andere cruciale overweging is de mate van verwijdering van de lamina. Om het risico op ongewenst letsel aan het ruggenmerg tijdens de procedure te minimaliseren, moeten ten minste twee aaneengesloten niveaus worden verwijderd. Dit zorgt voor voldoende ruimte voor de durotomie en zorgt voor een goede visualisatie. Deze voorzorgsmaatregel vermindert het risico op verwonding van kleine bloedvaten tijdens het inbrengen van de katheter. Overmatige botverwijdering van de zijwand van de wervelkolom moet ook worden vermeden om onnodige bloedingen of instabiliteit van de wervelkolom na de operatie te voorkomen. Door een evenwicht te bewaren tussen adequate toegang en minimale verstoring, zorgt de procedure voor een veiligere en nauwkeurigere behandeling.
Durotomie en inbrengen van de katheter
Het uitvoeren van de durotomie vereist precisie om te voorkomen dat het ruggenmerg doordringt. Onjuist inbrengen kan leiden tot blauwe plekken of snijwonden aan het ruggenmerg of subdurale bloedvaten. De openingen die in de dura worden gemaakt, moeten net groot genoeg zijn voor de gewenste behandelingsstrategie, in dit geval de diameter van de intrathecale katheters, zonder de integriteit van het membraan in gevaar te brengen. Bij het uitvoeren van de durotomie kan hersenvocht lekken wanneer de dura mater wordt doorboord; De hoeveelheid is echter minimaal. Hoewel grote scheuren in dura tot complicaties kunnen leiden, suggereert eerdere literatuur dat kleine gaatjes zoals die worden gebruikt in het beschreven protocol (stap 6.4) in staat zijn zichzelf te genezen via collageenafzetting/vascularisatie23, wat resulteert in geen meetbaar nadelig effect na de procedure. Bij het plaatsen van de katheters moeten ze zo parallel mogelijk aan het ruggenmerg worden ingebracht om het risico op letsel door directe kracht te minimaliseren. Zorgvuldige behandeling is noodzakelijk om buigen of krimpen te voorkomen, wat zorgt voor een vlotte plaatsing en de juiste positionering.
Postoperatieve zorg
Postoperatieve zorg na de procedure is een belangrijke overweging, aangezien knaagdieren doorgaans onder standaardomstandigheden in groepen worden gehuisvest. Agressief gedrag of sociale interacties na deze procedure kunnen de experimentele resultaten beïnvloeden, afhankelijk van het type behandeling dat wordt toegepast. Dit protocol resulteert in een lijn van 6-8 cm huidhechtingen langs de rug van het dier. Het wordt aanbevolen om eenjarige dieren 7-10 dagen na de operatie te houden om wondgenezing mogelijk te maken en mogelijke verwijdering van hechtingen door een kooigenoot te voorkomen. In het geval van een toepassing voor medicijnafgifte kunnen ze, zodra de incisie is genezen, opnieuw worden ondergebracht in eerdere groepen zonder openlijk agressief gedrag of complicaties in verband met de procedure. In het geval van implanteerbare hulpmiddelen mogen dieren alleen in groepen van 2 worden gehuisvest. We hebben ontdekt dat het huisvesten van dieren in groepen van 3 of meer kan leiden tot agressiegerelateerde complicaties met behandelingsresultaten.
Behandeling toepassingen
Hoewel de hier beschreven procedure zich richt op het thoracale ruggenmerg en twee specifieke behandelingsstrategieën, is deze aanpasbaar voor andere delen van de wervelkolom en aanvullende therapeutische toepassingen. Soortgelijke laminectomieprocedures zijn met succes uitgevoerd op verschillende niveaus van de wervelkolom in knaagdiermodellen. De kleine subdurale ruimte bij knaagdieren vormt echter een uitdaging, waardoor er minimale ruimte is voor fouten tijdens de behandeling. Hoewel de laminectomie- en durotomiestappen gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd door mensen die ervaring hebben met knaagdieroperaties, kan een nauwkeurige plaatsing van een apparaat of medicijn onder de dura zonder letsel te veroorzaken extra trainingstijd vergen. Naast chirurgische training zijn er verschillende factoren die kunnen helpen bij de toepassing van de behandeling. Het behouden van een duidelijk gezichtsveld tijdens het toepassen van de behandeling is cruciaal. Zorg er bij het gebruik van intrathecale katheters zoals beschreven in dit onderzoek voor dat er geen gekartelde of ruwe plekken op de katheters zijn voordat u ze onder de dura inbrengt. Zoals hierboven vermeld, is de locatie van de durotomie uiterst belangrijk. Hoe verder het ingangspunt van de katheter verwijderd is van de resterende rostrale lamina, hoe gemakkelijker het is voor de katheters om op één lijn te worden gebracht en evenwijdig aan het ruggenmerg te blijven tijdens het inbrengen. Er moet ook rekening worden gehouden met de timing van behandelingsstrategieën met betrekking tot een blessure. Toekomstig werk zal bestaan uit het vaststellen van deze procedures bij dieren op verschillende tijdstippen na het letsel, om vervolgens evaluatie mogelijk te maken van behandelingen die bedoeld zijn om chronische verwondingen aan te pakken. Dit protocol vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in de toepassing van de behandeling van neurologische aandoeningen van het ruggenmerg en biedt een veelzijdige en nauwkeurige benadering voor het rechtstreeks toedienen van therapieën aan ruggenmergweefsel.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt gefinancierd door CatWalk Spinal Cord Injury Trust en een HRC Sir Charles Hercus Research Fellowship (BH). Dit werk werd ook ondersteund door de adjunct-secretaris van Defensie voor Gezondheidszaken, goedgekeurd door het ministerie van Defensie, voor een bedrag van US $ 534,258, via het Spinal Cord Injury Research Program onder Award No. HT9425-23-1-0492. De schema's in Figuur 2A en Figuur 3A zijn gegenereerd met behulp van Biorender.com.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL en 3 mL spuiten | Amtech | ||
| 1ml Tuberculin-spuiten | BD | 302100 | |
| 2 x Graefe-tangen | FST | 11051-10 | |
| 25G naalden voor medicijntoediening | Nipro | SH811 | |
| 27G naalden voor dura-incisie | Nipro | SH816 | |
| 6 x Tissue bulldog-klemmen | FST | 18051-28 | |
| 70 % Ethanol | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Biogel Surgeons Latex handschoenen | Molnlycke | 822775-01 | |
| Bupivicaine 2 mg/kg | Aspen New Zealand | 2023-02 | |
| Buprenorfine 0.05 mg/kg | Ceva (Vetergesic) | 9000320 | |
| Chlorhexidine en ethanol-tinctuur | Perrigo | K076A | |
| Chlorhexidine scrub | Schulke | LBL11258 | |
| Gebogen rongeurs | FST | 16021-14 | |
| Dumont #4-tang | FST | 11294-00 | |
| Gelfoam, steriele absorberbare gelatine spons | GELFOAM | 09-0342-04-015 | |
| Hamilton-spuit | Hamilton | 80314 | |
| Verwarmingskussen (37 oC) | Kent scientific | SF-01 | |
| Hemostat | FST | 13004-14 | |
| Infinite Horizon impactor en software | Precision systems and instrumentation (PSI) | IH-0400 | |
| Isofluraan | Medsource | onbekend | |
| Metacam 2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| Niet-absorbeerbare hechtdraden (Ethilon 4-0, P-3) | Ethicon | 1603G | |
| O2-tank | |||
| Omax chirurgische microscoop | Jacobs Digital | W43DPT | |
| Press and Seal plasticfolie voor afdekking | Glad | N/A | |
| Scalpelgreep | Fine Science Tools (FST) | 10004-13 | |
| Maat 10 scalpelbladen | Amtech Medical | SH070 | |
| Somnoflow Inductie Suite | Kent Scientific | SF-01 | Lage stroom anesthesiesysteem |
| Steriele absorberende pads en watten | Swisspers | N/A | |
| Steriele wattenstaafjes (standaard + puntig) | help@hand | N/A | |
| Steriele zoutoplossing 0,9% | zelfgemaakt en geautoclaveerd in lab | N/A | |
| Steriele secties van opgerold Kim Wipe | Kimtech Science | 34155 | |
| Temperatuursonde | Kent scientific | SF-01 | |
| Vannas Veerschaar | FST | 15903-08 | |
| Op waterbasis gebaseerde glijmiddel | |||
| Weegschaal | Elk | N/A |
Referenties
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nat Rev Dis Primers. 3, 17018(2017).
- Lee, B. B., Cripps, R. A., Fitzharris, M., Wing, P. C. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: Update 2011, global incidence rate. Spinal Cord. 52 (2), 110-116 (2014).
- Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 282(2019).
- Chari, A., Hentall, I. D., Papadopoulos, M. C., Pereira, E. A. Surgical neurostimulation for spinal cord injury. Brain Sci. 7 (2), 18(2017).
- Krucoff, M. O., et al. Spinal cord stimulation and rehabilitation in an individual with chronic complete L1 paraplegia due to a conus medullaris injury: Motor and functional outcomes at 18 months. Spinal Cord Ser Cases. 6 (1), 96(2020).
- Chalif, J. I., et al. Epidural spinal cord stimulation for spinal cord injury in humans: A systematic review. J Clin Med. 13 (4), 1090(2024).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nat Med. 29 (3), 689-699 (2023).
- Calvert, J. S., Grahn, P. J., Zhao, K. D., Lee, K. H. Emergence of epidural electrical stimulation to facilitate sensorimotor network functionality after spinal cord injury. Neuromodulation. 22 (3), 244-252 (2019).
- Capogrosso, M., et al. Advantages of soft subdural implants for the delivery of electrochemical neuromodulation therapies to the spinal cord. J Neural Eng. 15 (2), 026024(2018).
- Kwiecien, J. M., et al. Neuroprotective effect of subdural infusion of serp-1 in spinal cord trauma. Biomedicines. 8 (10), 372(2020).
- Harland, B., et al. A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats. Adv Sci (Weinh). 9 (20), e2105913(2022).
- Meissner, S., et al. Safe subdural administration and retention of a neurotrophin-3-delivering hydrogel in a rat model of spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), 25424(2024).
- Harland, B., et al. Daily electric field treatment improves functional outcomes after thoracic contusion spinal cord injury in rats. bioRxiv. , (2024).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. 78, e50111(2013).
- Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection. J Vis Exp. (205), e66463(2024).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Shalileh, S., Moallemi, A., Tsuyuki, B., Simard, A. A. P., Shahriari, D. Implantation of optoelectronic devices in the rodent spinal cord. J Vis Exp. (209), e66992(2024).
- Hachmann, J. T., et al. Epidural spinal cord stimulation as an intervention for motor recovery after motor complete spinal cord injury. J Neurophysiol. 126 (6), 1843-1859 (2021).
- Ye, J., et al. Rationally designed, self-assembling, multifunctional hydrogel depot repairs severe spinal cord injury. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100242(2021).
- Wu, W., et al. Supramolecular hydrogel microspheres of platelet-derived growth factor mimetic peptide promote recovery from spinal cord injury. ACS Nano. 17 (4), 3818-3837 (2023).
- Pietruczyk, E. A., Stephen, T. K. L., Alford, S., Lutz, S. E. Laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse. J Vis Exp. (152), e58330(2019).
- Zhou, X. H., et al. Design and evaluation of a novel laminectomy auxiliary device based on rats. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 28 (3), 621-628 (2020).
- Ahmadi, S. A., et al. The effect of L-arginine on dural healing after experimentally induced dural defect in a rat model. World Neurosurg. 97, 98-103 (2017).
Herprints en machtigingen
