Methodenartikel

Subnanometer-resolutie structurele bepaling van hemagglutinine uit cryo-elektronentomografie van griepvirussen

DOI:

10.3791/68636

⸱

7 november 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, University of Massachusetts Chan Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een protocol voor gegevensverwerking van influenzavirussen, in beeld gebracht met behulp van cryo-elektronentomografie en daaropvolgende subtomogrammiddeling van het hemagglutinineglycoproteïne. Dit protocol omvat stapsgewijze gegevensverwerking, van beeldvoorverwerking tot de verfijning van het uiteindelijke model.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronentomografie is een krachtig hulpmiddel om heterogene monsters te visualiseren, met als belangrijkste toepassing structurele karakterisering van pleomorfe virussen. In de afgelopen jaren is subtomogramgemiddelde van virale glycoproteïnen naar voren gekomen als een methode om deze cruciale eiwitten direct zichtbaar te maken op het oppervlak van intacte virionen. Een belangrijk doelwit is het hemagglutinine (HA) glycoproteïne van het influenzavirus, dat de virale envelop dicht bedekt en verantwoordelijk is voor de binding van influenzareceptoren en membraanfusie. Hoewel subtomogramgemiddelden van influenza HA zijn gerapporteerd, zijn hun resoluties beperkt vanwege de lage signaal-ruisverhouding die inherent is aan cryoET en de handmatige inspanning die nodig is om heterogene influenzavirionen te analyseren. Hier wordt een cryoET-analysepijplijn gepresenteerd die verschillende softwarepakketten integreert om tomografische gegevens van influenzavirionen efficiënt en robuust te analyseren. Dit protocol beschrijft de structurele bepaling van HA van influenzavirionen, door middel van stappen van initiële bewegingscorrectie tot uiteindelijke modelbouw. Na deze pijplijn werd een HA-reconstructie met een resolutie van 6,0 Å verkregen uit twee cryoET-datasets verzameld van de A/Puerto Rico/8/34 (PR8) griepstam.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronentomografie (cryoET) is de afgelopen decennia toegepast om snapshots van eiwitcomplexen, virussen, cellen en organismen vast te leggen. cryoET, een modaliteit van cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM), is een structurele biologische methode waarbij een biologisch monster snel wordt ingevroren en vervolgens in verschillende richtingen wordt afgebeeld door middel van kantelen 1,2,3. Afbeeldingen die bij elke oriëntatie zijn gemaakt, worden vervolgens computationeel uitgelijnd met hun gemeenschappelijke kantelas en gereconstrueerd tot een tomogram om een driedimensionaal beeld te bieden4.

Terwijl röntgenkristallografie en cryoEM met één deeltje gezuiverde, structureel homogene moleculen vereisen, kan cryoET een molecuul direct in zijn oorspronkelijke context afbeelden4. Daarom is een belangrijk voordeel van cryoET het vermogen om pleomorfe monsters te visualiseren, zoals vliezige virussen, waaronder influenza 5,6,7. Een andere belofte van cryoET is het vermogen om op verschillende schalen beelden af te beelden. Hoewel tomogrammen doorgaans niet voorbij 5-10 nm8 worden opgelost, kan de integratie van subtomogramgemiddelden, waarbij kopieën van hetzelfde deeltje worden geïdentificeerd, uitgelijnd en gemiddeld, resulteren in een bijna-atomaire resolutie in sommige biologische moleculen zoals ribosomen 9,10. Slechts een beperkt aantal soorten moleculen kan deze resolutie echter bereiken; subtomogramgemiddelden overschrijden doorgaans niet de resolutie van 10-15 Å. Daarentegen bereikt cryoEM met één deeltje routinematig resoluties van 3-4 Å na de resolutierevolutie11. Recente ontwikkelingen in zowel een hogere doorvoer van cryoET-data-acquisitie als analysesoftware hebben het mogelijk gemaakt om de structuurbepaling van subnanometerresoluties van extra biologische moleculen binnen hun oorspronkelijke context te bepalen 12,13,14,15,16,17,18.

Een veelgebruikt gebruik van cryoET is het visualiseren van virusmorfologie, organisatie en structuur. Ondanks de lagere resolutie die deze techniek biedt in vergelijking met cryoEM of röntgenkristallografie met één deeltje, kan cryoET in combinatie met subtomogrammiddeling informatie verschaffen over hoe virale eiwitten zich gedragen in hun oorspronkelijke omgeving en cruciale details geven over hun organisatie in de context van het virion. Een veelvoorkomend doelwit voor cryoET van virussen zijn de oppervlakteglycoproteïnen die vaak worden gebruikt voor de aanhechting en fusie van gastheercellen, aangezien dit vaak de belangrijkste antigenen en doelen zijn voor therapieën of vaccins. Met recente ontwikkelingen in cryoET-verwerkingspakketten is het steeds haalbaarder geworden om subnanometerresolutiegemiddelden van deze glycoproteïnen 19,20,21,22 te bereiken. Een voorbeeld hiervan is hemagglutinine (HA), het belangrijkste eiwit op het oppervlak van influenzavirionen. Dit eiwit geleidt niet alleen zowel receptorbinding als membraanfusie, maar het bedekt ook het virion op een ongelooflijk dichte manier, met honderden tot duizenden HA's op een enkelvoudig virion5. Het hier gepresenteerde protocol (Figuur 1) integreert verschillende veelgebruikte pakketten met interne scripts om stadia af te bakenen van voorverwerking tot modelverfijning voor een subtomogramgemiddelde van influenza HA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Voorbeelddatasets die voor dit protocol worden gebruikt, zijn toegankelijk via EMPIAR-12864, inclusief de twee sets tilt-series die voor dit protocol worden gebruikt. De tilt-reeksen worden verzameld uit handmatig ondergedompelde rasters van gezuiverd influenza A-virus met een fysieke pixelgrootte van 2,09 Å/pixel om een voldoende groot gezichtsveld te garanderen zodat elke kantelreeks meerdere virionen bevat, en ook om reconstructies met de hoogst mogelijke resolutie weer te geven. Voor de eigen datasets van gebruikers wordt aanbevolen om de workflow te starten met onbewerkte kantelfilms. Deze datasets werden verwerkt en gevisualiseerd met behulp van krachtige werkstations. De materiaaltabel bevat de hardware en software die voor dit protocol zijn gebruikt. Alle softwarepakketten die in dit protocol worden gebruikt, zijn open source en kunnen worden gedownload; installatielinks en instructies staan vermeld in de materiaaltabel. Het aanbevolen werkstation voor het verwerken van cryoET-datasets moet zijn uitgerust met ten minste een 8-coreprocessor, een speciale GPU-kaart met 6 GB VRAM, 64 GB RAM en 2 TB lokale opslag.

1. Voorverwerking van gegevens van tilt-films en reconstructie van cryo-elektronentomogrammen in Warp 23 en IMOD 24

  1. Activeer in een terminal een conda-omgeving waarin Warp is geïnstalleerd met behulp van de volgende opdracht:
    conda activate warp_environment
  2. Maak een bestand met instellingen voor framereeksen voor het verwerken van framereeksen. Dit is een configuratiebestand dat metadata bevat over de microscoop, de locatie van de te verwerken gegevens en waar uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen.
    WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
    OPMERKING: Deze gegevens zijn verzameld in de superresolutiemodus.
  3. Schatting van de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) en bewegingscorrectie uitvoeren.
    WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
    OPMERKING: m_grid parameter moet overeenkomen met het aantal subframes in een tilt-film - onze datasets bestonden uit 5 subframes per tilt-film.
  4. Importeer metagegevens van kantelseries, zodat WarpTools kan identificeren welke films bij welke kantelserie horen.
    WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
  5. Nadat de tomostar-map is ingevuld, maakt u een bestand met instellingen voor kantelserie voor de verwerking van kantelseries
    WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
  6. Schrijf tilt-stacks uit en voer geautomatiseerde fiduciële uitlijning van de tilt-serie uit met behulp van het batchruntomo-programma van IMOD met behulp van de Etomo GUI24.
    1. Voer de volgende opdracht uit in de terminal:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      OPMERKING: De tiltseries zijn geëxporteerd met 4x de fysieke pixelgrootte om de uitlijningstijd en rekenkracht te verkorten.
    2. Kies een voorbeeldgegevensset om eerst uitlijningsparameters in te stellen voordat u ze toepast als een sjabloon voor batchruntomo.
    3. Importeer uitlijningsparameters uit IMOD als u batchruntomo gebruikt.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      OPMERKING: Voor deze dataset leverde het gebruik van de Etomo GUI betere resultaten op dan de wrappers in WarpTools.
    4. U kunt ook geautomatiseerde fiducial-loze tiltseries-uitlijning uitvoeren met behulp van de AreTomo25-wrapper in WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      OPMERKING: De AreTomo wrapper is getest met AreTomo1.3.4.
  7. Voer de volgende opdracht uit in de terminal om CTF-parameters voor kantelreeksen te schatten:
    WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
  8. Reconstrueer tomogrammen met behulp van WarpTools.
    1. Omgevingsvariabele instellen:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat tomogrammen compatibel zijn met de volgende fasen van beeldverwerking en visualisatie in andere software die in dit protocol wordt gebruikt.
    2. Om tomogrammen te reconstrueren, voert u in een terminal het volgende uit: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
  9. Herhaal stap 1.2 - 1.8.2 voor alle gegevenssets.

2. Tomogramvoorbewerking en deeltjespicking

  1. Activeer in een terminal een conda-omgeving waarop IsoNet26 is geïnstalleerd.
    conda activate isonet_env
  2. Bereid je voor op de verwerking van tomogrammen door eerst een submap te maken en alle tomogrammen naar die map te verplaatsen.
    mkdir tomo_folder
    mv tomograms*.mrc tomo_folder/
  3. Genereer een sterbestand in de projectmap.
    isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
  4. Open met behulp van een teksteditor het gegenereerde sterbestand en voer de geschatte onscherptewaarde in voor de afbeeldingen met een kanteling van 0 graden in de vierde kolom (_rlnDefocus) voor elk tomogram, die zich in het processed_items.json bestand in de map warp_tiltseries kan bevinden.
    OPMERKING: De onscherptewaarde moet voor IsoNet in angstrom zijn. Warp schrijft onscherptewaarden uit in μm, waarvoor een vermenigvuldigingsfactor van 10.000 nodig is.
  5. Voer de opdracht CTF deconvolve uit in de terminal.
    isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
  6. Start na het deconvolen EMAN2 GUI27 om te beginnen met het voorbewerken van tomogrammen voor het plukken van deeltjes.
    conda activate eman_env
    e2projectmanager.py
  7. Klik onder Tomografie met de linkermuisknop op de pijl naast Ruwe gegevens en selecteer Tomogrammen importeren in het vervolgkeuzemenu.
  8. Klik met de linkermuisknop op de pijl naast Segmentatie en selecteer Tomogrammen voorverwerken.
    OPMERKING: De standaardparameters zijn waarschijnlijk geschikt voor veel gegevenssets. Voor deze tomogrammen werd een laagdoorlaatfilter op 4 Å toegepast en werden kantelbeelden genormaliseerd. Na voorverwerking wordt er automatisch een info directory gegenereerd door EMAN2 met lege .json bestanden (met vergelijkbare basisnamen als voorbewerkte bestanden). De angpix moet worden toegevoegd aan de json-bestanden voordat er deeltjes worden geplukt.
  9. Train het convolutionele neurale netwerk (CNN) om HA-glycoproteïne te herkennen.
    1. Wijzig de werkmap naar de locatie van de tomogrammen die moeten worden gebruikt voor CNN-training en deeltjespicking:
      cd path/to/tomograms
    2. Gebruik de terminal om het CNN-trainingsvenster te openen.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
    3. Controleer of er vier vensters zijn geopend: een met de informatie over CNN-parameters en tomogrammen in de directory, en de andere drie vensters met afbeeldingen van goede referenties (positief), slechte referenties (negatief) en deeltjes geselecteerd door de CNN (deeltjes).
    4. Klik met de linkermuisknop op de CNN-GUI om een nieuwe CNN te initialiseren. Stel de standaard leersnelheid in op 0,0001 en de doosgrootte op 8.
    5. Klik onder de kolom Bestandsnaam met de linkermuisknop op een representatief tomogram om het in een nieuw venster te openen.
      OPMERKING: Er kan slechts één tomogram tegelijk open zijn.
      1. Om door de z-as van een tomogram te gaan, plaatst u de cursor op het geopende tomogram en drukt u op het scrollwiel van de computermuis om een nieuw venster te openen. De schuifregelaar met het label N# verandert de z-as.
    6. Selecteer op het geopende tomogram 10-20 kenmerken die overeenkomen met HA met de linkermuisknop in het deelvenster Positief.
      OPMERKING: Selecteer zowel boven- als zijaanzichten van HA, die ofwel als cilinders of driehoeken boven het membraan verschijnen, als goede referenties voor een robuuster netwerk.
      1. Afbeeldingen van positieve verwijzingen verschijnen in het venster Positief . Als u een verwijzing wilt verwijderen, houdt u de Shift-toets ingedrukt en klikt u met de linkermuisknop op een referentieafbeelding.
    7. Schakel over naar het negatiefpaneel en selecteer 10-20 referenties die overeenkomen met kenmerken zoals lege membraanpatches, vRNP-dichtheid, fiduciale markeringen en puin.
      OPMERKING: Verwijzingen verschijnen in het negatiefvenster .
    8. Start CNN-training door met de linkermuisknop op de knop Trein in het hoofdvenster te klikken.
      OPMERKING: Het aantal iteraties (Niter) in het hoofdvenster verandert het aantal iteraties van de training dat de CNN ondergaat. Beveel aan om de parameter in te stellen op 50.
    9. Zodra de CNN is getraind op de geselecteerde referenties, klikt u met de linkermuisknop op Toepassen om de CNN te gebruiken om deeltjes in het geopende tomogram te selecteren.
      OPMERKING: Afbeeldingen van geplukte deeltjes zijn te zien in het venster Deeltjes. Geselecteerde deeltjes worden ook in blauwe cirkels op het tomogram weergegeven.
    10. Ga door met het selecteren van positieve en negatieve verwijzingen op basis van het toegepaste netwerk, en sla de voortgang regelmatig op via de knop Opslaan .
    11. Als u tevreden bent, selecteert u Alles toepassen om de CNN deeltjes te laten selecteren in alle tomogrammen in de directory en de resultaten op verschillende tomogrammen te evalueren; Voer indien nodig aanvullende training uit.
  10. Sla de coördinaten op in een tekstbestand voor elk tomogram.
    1. Open de EMAN2 GUI met behulp van de e2projectmanager.py opdracht.
    2. Klik op de pijl naast Subtomogram Gemiddelde en klik op Handmatig boksen.
    3. Voer de naam van een tomogram in en klik op Starten.
    4. Sla de coördinaten op in het tekstbestand door Bestand te selecteren > Vak Coördinaten opslaan > tomogram_ha.txt.
    5. Navigeer naar de submap neuralnetten en de submap info om een back-up te maken van nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf en boxes3dref.hdf.
  11. Om ervoor te zorgen dat analyse alleen wordt uitgevoerd op volledig geassembleerde virionen waar de aanwezigheid van de matrix (M1) eiwitlaag en het virale ribonucleoproteïne (vRNP) complex duidelijk is, traint u een tweede convolutioneel neuraal netwerk om M1-eiwit te herkennen.
    1. Volg hetzelfde protocol als beschreven in stap 2.9 en wijzig de grootte van de trainingsbox van 8 naar 14.

3. Curatie van deeltjes

  1. Download notebooks van https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
  2. Open CNN_Particle_Cleaning.ipynb notebook en laad de benodigde modules.
    OPMERKING: Het script gebruikt Open3D28 als een pakket om deeltjescoördinaten te visualiseren als 3D-puntenwolken.
  3. Laad tekstbestanden die overeenkomen met HA- en M1-coördinaten en bekijk ze als 3D-puntenwolken met behulp van het Open3D-pakket.
  4. Filter HA-coördinatenuitschieters uit met behulp van statistische uitschieterverwijdering zoals geïmplementeerd in Open3D.
    OPMERKING: Voorgestelde beginwaarden voor HA zijn nb_neighbors = 50 (aantal aangrenzende coördinaten rond een coördinaat) en std_ratio = 0,5.
  5. Bereken de afstand tussen de HA- en M1-puntenwolken. Alle HA-coördinaten op meer dan 20 pixels afstand van de M1-puntenwolk worden dan geïdentificeerd als een uitbijter. Alle deeltjescoördinaten die niet als uitschieter zijn geïdentificeerd, worden opgeslagen in een uitvoer-.txt bestand.
    OPMERKING: 20 pixels komen overeen met een afstand van ongeveer 16 nm met een pixelgrootte van 8,35 Å/pixel. Het midden van een HA-trimeer naar de M1-laag is ongeveer 15 nm in onze tomogrammen.
  6. Construeer alle deeltjes en sla ze op als starfiles met behulp van pts2starfile.ipynb.

4. Iteratieve subtomogrammiddeling en classificatie

  1. Gebruik WarpTools om deeltjes te extraheren met een binningfactor van 4 en voer de eerste rondes van subtomogramgemiddelde uit in RELION429.
    WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
    OPMERKING: De voorgestelde doosgrootte van 48 x 48 x 48 pixels, wat overeenkomt met een doos van ~360 Å3die groot genoeg zou zijn om een array van 7-8 HA te bevatten.
    1. Converteer warp starfile naar RELION 4-compatibel bestand
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
    2. Genereer een eerste referentie met behulp van relion_refine_mpi op een subset van deeltjes.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
      mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
    3. Gebruik relion_refine_mpi om 3D-autoraffinage uit te voeren op de subtomogrammen.
      1. Voorbeeld opdracht: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
        OPMERKING: De eerste globale en lokale bemonstering werd ingesteld op 7,5 en 1,8 graden, wat overeenkomt met een healpix-orde van 4 en lokale healpix van 2. De eerste verfijningen maken vooral gebruik van de sterke dichtheid van het membraan, het M1-eiwit en de HA-array. Het translatie-offsetbereik mag groter zijn om eventuele verschuivingen te omvatten die kunnen optreden bij het uitlijnen van de matrix.
    4. Herhaal de verfijning nadat de eerste verfijningsrun is samengekomen, waarbij de vertaling wordt gewijzigd in 8 en stap in 2.
  2. Maak gebruik van 2D-classificatie om ongewenste deeltjes weg te gooien met behulp van relion_refine.
    1. Voorbeeld opdracht: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      OPMERKING: 2D-classificatie werd gebruikt in plaats van 3D-classificatie omdat het rekenkundig efficiënter is. Subtomogrammen kunnen direct worden gebruikt als input voor de 2D-classificatietaak zonder extra beeldverwerking.
    2. Combineer klassen met een identificeerbare HA-array met cilindrische HA-, membraan- en M1-dichtheid met behulp van relion_star_handler.
    3. Maak eerst sterbestanden met goede klassen.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
    4. Gebruik vervolgens de volgende opdracht relion_star_handler om de afzonderlijke sterbestanden te combineren.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
  3. Herextraheer bij bin2 en niet-binned deeltjes voor iteratieve lokale verfijning.
    1. Voor bin2-verfijning extraheert u deeltjes met een kleinere doosgrootte van 80 en voert u een lokale zoekopdracht uit met zowel healpix als lokale healpix ingesteld op 4 (lokale hoekbemonstering van 1,8 graden).
    2. Combineer in dit stadium deeltjessets uit verschillende datasets met behulp van relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
    3. Maak na de eerste verfijningsronde een cilindrisch masker met behulp van e2filtertool.py in de EMAN2-omgeving die het centrale HA plus-membraan en de M1-dichtheid omvat.
      OPMERKING: Parameters die worden gebruikt voor het cilindrische masker: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; Alle andere parameters zijn niet aangevinkt.
    4. Voer nog een extra verfijningsronde uit met het masker aangebracht.
    5. Voer nog een ronde van 2D-classificatie uit om uitschieters te elimineren die niet zijn uitgelijnd met de centrale HA en extra puin.
    6. Herhaal het proces met niet-binned deeltjes met een doosgrootte van 120 en maak een zacht masker dat de centrale HA bedekt, lijn de verwijzing uit met C3-symmetrie en pas symmetrie toe in deze verfijningsfase.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      OPMERKING: De uiteindelijke resolutie die met RELION werd bereikt, was 6,1 Å.
  4. Definitieve verfijning in MTools9
    1. Creëer een verfijningspopulatie (na activering van de Warp conda-omgeving).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
    2. Voeg gegevensbronnen toe voor elke gegevensset.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Herhaal de vorige stap met aanvullende gegevenssets.
    3. Creëer de verfijningssoort.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
    4. Verfijning van meerdere deeltjes.
      1. Verfijn eerst de deeltjeshoudingen met het commando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Verfijn vervolgens zowel deeltjeshoudingen als sferische aberratie met het commando: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
        OPMERKING: De verfijning is hier gestopt omdat verdere iteraties de resolutie niet verbeterden. Verschillende combinaties van parameters die niet uitputtend zijn getest, kunnen de resultaten echter blijven verbeteren.

5. Verfijning van het model

  1. Gebruik ChimeraX30 om de uiteindelijke kaart en een atomair model van HA in te laden.
  2. Breng alle segmenten die overeenkomen met het HA-ectodomein in kaart en combineer ze en gebruik de tool Aanpassen aan segmenten om in het HA-model aan te meren.
    1. Sla getransformeerde coördinaten van het model op.
  3. Open de Phenix GUI31 en gebruik de Real Space Refinement-tool .
    1. Wanneer u wordt gevraagd om bestanden toe te voegen, voegt u het getransformeerde HA-model en de kaart toe en vult u de resolutie van de uiteindelijke reconstructie in.
    2. Voer vijf rondes uit van wereldwijde minimalisering, lokale aanpassing van rotameren, verfijning van de bezetting en verfijning van de ADP van de groep.
  4. Visualiseer de uiteindelijke reconstructie en modelleer met behulp van ChimeraX.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het gebruik van dit verwerkingsprotocol aan te tonen (Figuur 1), werd de eerder geschetste workflow toegepast op twee datasets van 25 tomogrammen gecombineerd, verkregen uit een H1N1 influenza A-virusstam (A/Puerto Rico/8/1934). Parameters voor gegevensverzameling worden beschreven in tabel 1. Figuur 2 illustreert een representatief tomogram en ingezoomde weergaven van pleomorfe influenzavirionen. Gevarieerde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een beter structureel begrip van kritieke virale eiwitten kan de ontdekking van nieuwe behandelingen tegen deze virussen versnellen. In het afgelopen decennium heeft de resolutierevolutie de bepaling van virale structuren met hoge resolutie versneld met behulp van cryoEM met één deeltje, maar deze methode is beperkt tot gezuiverde eiwitten of niet-omhulde virussen met icosaëdrische symmetrie. CryoET daarentegen is in staat om morfologisch diverse vliezige virionen in 3D te visualiseren, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag nuttige discussies met het Schiffer Lab erkennen. We willen ook de UMass Chan cryoEM Core-faciliteit bedanken voor hun hulp bij het verzamelen van gegevens en voor het bieden van ondersteuning en advies. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences R01GM143773 naar MS en R35GM151996 naar CAS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WXAMDhttps://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4UC San Franciscohttps://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52Baylor College of Medicinehttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27University of Colorado at Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
Influenza analysis scriptsUMass Chan Medical Schoolhttps://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3UCLAhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0Genentechhttps://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000NVIDIA https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D Intel Labshttps://www.open3d.org/
PHENIX 1.21-5207Lawrence Berkeley National Laboratoryphenix-online.org
RELION 4.0MRC Laboratory of Molecular Biologyhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
Ubuntu 20.04Ubuntuhttps://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1UC San Franciscohttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
Warp 2.0.0Genentechhttp://warpem.github.io/warp/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
  2. Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).
  4. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  5. Huang, Q. J., et al. Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks. Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).
  6. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  7. Mangala Prasad, V., et al. Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice. Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).
  8. Förster, F. Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ. J Struct Biol X. 6, 100063(2022).
  9. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  10. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. Chen, S., et al. Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2. Elife. 13, e97222(2024).
  13. Chen, Z., et al. De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking. Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).
  14. Kelley, R., et al. Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii. bioRxiv. , (2024).
  15. Klumpe, S., et al. In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET. Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).
  16. Li, S., et al. The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography. EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).
  17. Song, X., et al. The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography. J Struct Biol. 217 (2), 108212(2025).
  18. Waltz, F., et al. In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain. Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).
  19. Huang, Q. J., et al. Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  20. Turoňová, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  22. Calcraft, T., et al. Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry. Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  25. Zheng, S., et al. AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068(2022).
  26. Liu, Y. T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  27. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  28. Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. Open3D: a modern library for 3D data processing. arXiv. , (2018).
  29. Zivanov, J., et al. A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. Elife. 11, e83724(2022).
  30. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  32. Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography. PLoS Biol. 19 (8), e3001319(2021).
  33. Watanabe, R., et al. Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography. Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).
  34. Woldeyes, R. A., et al. Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease. bioRxiv. , (2025).
  35. Li, W., et al. HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes. Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).
  36. Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo. PLoS Biol. 19 (8), e3001318(2021).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Tran, E. E., et al. Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate. mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cryo Electron TomographySubtomogram AveragingInfluenza HemagglutininViral GlycoproteinsPleomorphic VirusesStructural DeterminationParticle PickingConvolutional Neural Network3D Auto RefinementGlycosylation Sites

Gerelateerde artikelen