Onderzoeksartikel

Een intelligente structurele kleurhydrogelpleister die diagnose en behandeling integreert voor de behandeling van chronische osteomyelitis

DOI:

10.3791/68662

⸱

12 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Department, Tongde Hospital of Zhejiang Province, 2Department of Orthopedics, Tongde Hospital of Zhejiang Province

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een slimme structurele kleuren hydrogel pleister (CPG) voor de diagnose en behandeling van chronische osteomyelitis (COM). De pleister integreert een temperatuurgevoelige GelMA-hydrogel, een pH-gevoelige CSMA-PBA-steiger en salicylzuur voor gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen, infectiemonitoring en het bevorderen van weefselregeneratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische osteomyelitis (COM) is een hardnekkige botinfectie die moeilijk te behandelen is met conventionele antibiotica vanwege problemen zoals resistentie tegen geneesmiddelen en nadelige bijwerkingen. Om deze uitdaging aan te gaan, hebben we een nieuwe slimme structurele kleurhydrogelpleister (CPG) ontwikkeld voor zowel de diagnose als de behandeling van COM. De pleister combineert methylacrylaat chitosan gemodificeerd met fenylboronzuur (CSMA-PBA) als een steiger, temperatuurgevoelige GelMA-hydrogel als vulmiddel en salicylzuur (SA) voor medicijnafgifte. Karakterisering toonde uitstekende mechanische eigenschappen en kleefkracht. Experimenten met het vrijgeven van geneesmiddelen bevestigden dat CPG effectief reageert op pH-veranderingen, waardoor gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen mogelijk is. CPG dient ook als een diagnostisch hulpmiddel door pH- en temperatuurveranderingen op de infectieplaats te detecteren en te helpen bij postoperatief herstel. Antimicrobiële tests toonden een significante remming van de bacteriegroei aan, en in vitro-experimenten toonden het vermogen van CPG aan om de expressie van vasculaire endotheliale groeifactoren te bevorderen en tegelijkertijd ontstekingsmarkers te verminderen. De studie benadrukt de multifunctionele mogelijkheden van de hydrogelpleister, waaronder antimicrobiële, ontstekingsremmende en provasculaire effecten, waardoor het een veelbelovende therapeutische optie is voor chronische osteomyelitis.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische osteomyelitis is een groot probleem geworden voor patiënten vanwege het uitdagende en langdurige behandelingsproces, het hoge risico op falen van de behandeling en recidief1. De huidige behandelingsstrategieën voor osteomyelitis omvatten chirurgisch debridement van necrotisch weefsel en parenterale antibiotica. De noodzaak van hoge doses antibiotica om therapeutische niveaus op de plaats van actie te bieden, blijft echter ineffectief bij de behandeling van de ziekte. Bovendien wordt het gebruik van hooggedoseerde antibiotica in verband gebracht met nadelige complicaties zoals nefrotoxiciteit, ototoxiciteit, antibioticaresistentie en gastro-intestinale bijwerkingen. Lokale medicijnafgifte van antibiotica kan een meer geschikte strategie zijn om deze nadelen te overwinnen. Hoewel lokale toediening van antibiotica botinfecties kan behandelen met minimale bijwerkingen, is het induceren van botregeneratie cruciaal voor een succesvolle behandeling2. Daarom lijkt de gelijktijdige toediening van antibiotica en botgroeifactoren een veelbelovende behandelingsstrategie. In de afgelopen decennia is niet-biologisch afbreekbaar polymethylmethacrylaat (PMMA) de steunpilaar geweest voor lokale antibioticatherapie bij osteomyelitis. Het gebruik van PMMA als lokaal antibioticaafgiftesysteem wordt echter geconfronteerd met beperkingen, zoals de noodzaak van een tweede operatie voor het verwijderen van kralen, de vorming van bacteriële biofilm die oppervlaktekolonisatie bevordert, langdurige afgifte van antibiotica op subtherapeutische niveaus die leiden tot antibioticaresistentie, systemische toxiciteit van resterende monomeren en gebrek aan botinductieve eigenschappen3. De ontwikkeling van biologisch afbreekbare lokale afgiftesystemen met behulp van biocompatibele polymeren kan deze nadelen dus ondervangen. Literatuur suggereert dat zijdefibroïne-nanodeeltjes (SFNP's) die in een zijden steiger zijn verwerkt voor lokale afgifte van vancomycine, kunnen worden gebruikt om ernstige osteomyelitis te behandelen. De afwezigheid van botinductieve bioactieve moleculen in het nanocomposietmateriaal resulteerde er echter in dat de geprepareerde constructen geen significante botregeneratie induceerden. Daarom is het ontwerp van nanocomposiet steigermaterialen die geschikt zijn voor de behandeling van chronische osteomyelitis een uitdagend punt van zorg geweest. Hydrogels op basis van natuurlijke polymeren hebben veel aandacht gekregen vanwege hun structurele gelijkenis met de extracellulaire matrix (ECM) en hun vermogen om de afgifte van geneesmiddelen te beheersen4.

Een opvallend kenmerk van hydrogels is hun reactievermogen op verschillende factoren, zoals temperatuur en pH. Chronische infecties kunnen de pH verhogen als gevolg van microbiële belasting, ontregeling van de regeneratie-degradatiebalans en verbeterde afbraakmetabole reacties. Bovendien kan chirurgische excisie van gedebrideerd materiaal, zoals necrotisch weefsel en pus, de overgang van de pH naar hogere waarden versnellen5. Daarom is het gebruik van pH-gevoelige hydrogels die in staat zijn om chronische infectie pH te detecteren cruciaal voor de prognose van chronische osteomyelitis.

In deze studie stellen we een geïntegreerde diagnose- en behandelingsaanpak voor met behulp van een intelligente structurele kleurenhydrogelpleister, die over de vereiste kenmerken beschikt voor de behandeling van chronische osteomyelitis, zoals geïllustreerd in figuur 1. Supramoleculaire hydrogels die zijn afgeleid van de assemblage van supramoleculaire polymeernetwerken zijn aantrekkelijke materialen die vergelijkbaar zijn met de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM). Vanwege hun uitstekende eigenschappen, waaronder de juiste mechanische sterkte, zelfherstellende, antibacteriële en ontstekingsremmende eigenschappen, hebben supramoleculaire hydrogels vele toepassingen gevonden op biomedisch gebied6. Daarentegen heeft structurele kleur, als een soort kleur die wordt geproduceerd door unieke interacties van licht met intrinsieke periodieke nanostructuren, veel aandacht gekregen op gebieden zoals optische displays, anti-namaaklabels en draagbare elektronische apparaten. Met name wanneer structurele kleurmaterialen zijn opgebouwd uit responsieve polymeren, kan hun kleur worden aangepast door verschillende stimuli door uitzetting of inkrimping van deze polymeren, wat het potentieel van deze materialen als sensoren suggereert. Daarom kan worden voorgesteld dat het combineren van supramoleculaire hydrogels met structurele kleuren een unieke strategie zal bieden voor het bouwen van nieuwe hydrogelpleisters voor de behandeling van chronische osteomyelitis 7,8,9.

Hierin ontwikkelden we een geïntegreerde diagnose- en behandelingsaanpak met behulp van een intelligente structurele kleurhydrogelpleister (CPG) bestaande uit gemengd gemodificeerd methylacrylaat chitosan met fenylboronzuur (CSMA-PBA) als een anti-eiwit stenen steiger, temperatuurgevoelige GelMA-hydrogel als vulmiddel en geladen met salicylzuur (SA)10. Vanwege de omkeerbaarheid van waterstofbruggen en niet-covalente interacties binnen het netwerk, vertoonde de resulterende hydrogelpleister niet alleen uitstekende mechanische eigenschappen, maar bezat hij ook zelfherstellende eigenschappen. Bovendien vertoonde deze hydrogelpleister door de aanwezigheid van CSMA ook een krachtige antibacteriële bioactiviteit. Bovendien kan de hydrogelpleister, door gebruik te maken van de thermische respons van het GelMA-polymeer, actieve stoffen afgeven wanneer deze op de relatief hogere temperatuurplaats van ontsteking wordt geplaatst. Tegelijkertijd reageerde de hydrogel vanwege de aanwezigheid van boronaatesterbindingen in CSMA-PBA op veranderingen in de pHvan het milieu 11. Op basis van deze voordelen hebben we aangetoond dat de voorgestelde supramoleculaire hydrogelpleister met structurele kleur chronische osteomyelitis kan behandelen door de expressie van ontstekingsfactoren, antibacteriële activiteit te verlagen en angiogenese te bevorderen. Met name door gebruik te maken van de unieke optische eigenschappen van de anti-eiwit stenen steiger, zou de hydrogelpleister zelfs een kleurveranderend vermogen kunnen vertonen als reactie op temperatuurstimuli, wat een aanzienlijk potentieel aantoont bij het monitoren en beheersen van chronische osteomyelitis en het begeleiden van klinische behandeling.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie en uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH-publicatie nr. 80-23, herzien in 1978). Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8 weken oud) werden gebruikt in de experimenten.

Bereiding van silica colloïdale kristalsjablonen (SCC's)
SCC's werden opgesteld zoals eerder beschreven 12,13,14. Gereinigde en met plasma behandelde glasplaatjes werden ondergedompeld in een 5%-oplossing van monodisperse silica-nanodeeltjes (12 nm in diameter) gedispergeerd in gedeïoniseerd water. De oplossing werd gedurende 1 uur continu geroerd bij kamertemperatuur (25 °C) om de gelijkmatige dispersie van silica-nanodeeltjes te garanderen. De objectglaasjes werden uit de oplossing gehaald en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan de lucht gedroogd. Het droogproces was van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de nanodeeltjes goed op het oppervlak van de glasplaatjes hechten. Na het drogen aan de lucht werden de objectglaasjes gedurende 2 dagen in een geventileerde oven bij 60 °C geplaatst om het resterende oplosmiddel te verdampen en de vorming van colloïdale kristallen te vergemakkelijken. Tijdens deze verdamping werden de dia's in een hoek van 45° geplaatst om de vorming van geordende colloïdale kristalarrays te bevorderen. De geordende colloïdale kristalarrays werden gekenmerkt door zelfassemblage en vertoonden verschillende structurele kleuren, afhankelijk van de afstand tussen de deeltjes. Deze arrays werden vervolgens gebruikt als sjablonen voor de daaropvolgende fabricage van hydrogelpleisters.

Voorbereiding van geïntegreerde diagnose en behandeling intelligente structurele kleur hydrogel pleisters (CPG)
Anti-eiwit stenen steigers werden gerepliceerd uit de holtes van silica colloïdale kristalsjablonen (SCC's). Gereinigde glasplaatjes werden eerst ondergedompeld in een 5%-oplossing van monodisperse silica-nanodeeltjes (12 nm in diameter) in gedeïoniseerd water, en de oplossing werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (25 °C) geroerd om een uniforme verspreiding van de nanodeeltjes over het oppervlak te garanderen. Het roerproces was cruciaal om de vorming van aggregaten te voorkomen en een homogene verdeling van nanodeeltjes te garanderen. Na onderdompeling werden de objectglaasjes gedurende 1 uur aan de lucht gedroogd bij kamertemperatuur (RT), gevolgd door ovendroging bij 60 °C gedurende 2 dagen om de verdamping van het oplosmiddel te vergemakkelijken en de zelfassemblage van de silica-nanodeeltjes tot goed geordende colloïdale kristalarrays te bevorderen. Tijdens de verdamping werden de dia's in een hoek van 45° geplaatst om de uitlijning van nanodeeltjes te vergemakkelijken, waardoor de vorming van een periodieke array met gecontroleerde afstanden tussen deeltjes werd bevorderd. Deze geordende array vertoonde structurele kleur, een karakteristiek kenmerk van de colloïdale kristallen, en diende als sjabloon voor de daaropvolgende hydrogelstructuur.

De bereide SCC's werden vervolgens gedrenkt in de CPG-pre-geloplossing, die bestond uit GelMA in een concentratie van 10% w/v opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De monsters werden 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) bewaard om een grondige infiltratie van de GelMA in de holtes tussen de silica-nanodeeltjes te garanderen, waardoor een uniforme verdeling binnen de sjabloonstructuur werd gegarandeerd. Deze stap was van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de hydrogelmatrix gelijkmatig in de sjabloon werd opgenomen en dat de uiteindelijke hydrogelstructuur de geordende nanodeeltjesrangschikking van de SCC's repliceerde. Na het weken werd de pre-geloplossing gepolymeriseerd onder UV-licht (365 nm) met een intensiteit van 3 mW/cm2 gedurende 5 minuten. Deze UV-blootstelling leidde tot de verknoping van GelMA, waardoor de hydrogelmatrix stolde. De belichtingstijd en -intensiteit werden zorgvuldig geoptimaliseerd om voldoende verknoping te bereiken zonder de hydrogel te overbelichten, wat zou kunnen leiden tot overmatige geleering of verlies van sjabloonstructuur.

Karakterisering van CPG
De dwarsdoorsnedemorfologie van de hydrogel werd waargenomen met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM) met een versnellingsspanning van 5 kV na het coaten van de monsters (1 mm x 1 mm) met goud15. Dit stelde ons in staat om de nanoporeuze structuur te visualiseren en de uniformiteit van het hydrogelnetwerk te bevestigen. Het zwellingsgedrag werd geëvalueerd door 10 mg hydrogelmonsters onder te dompelen in 10 ml PBS met verschillende tijdsintervallen (0, 30, 60, 120 en 180 min). Het percentage zwelling werd berekend door de toename van het hydrogelvolume in de loop van de tijd te meten, wat inzicht gaf in het vermogen van de hydrogel om onder verschillende omstandigheden water te absorberen. Reologische analyse werd uitgevoerd met behulp van een reometer met een rek van 1%, waarbij hoekfrequenties werden toegepast van 1 rad/s tot 100 rad/s om de opslagmodulus (G') en verliesmodulus (G'') te meten. Deze stap was essentieel om de mechanische eigenschappen van de hydrogel te begrijpen, inclusief het visco-elastische gedrag onder spanning. De eigenschappen van de afschuiflijm werden geëvalueerd met een universele trektestmachine (Instron) volgens ASTM F2255-05 (2015) met een snelheid van 10 mm/min en een voorbelasting van 0,01 N om het vermogen van de hydrogel om zich aan biologische weefsels te hechten te beoordelen. De afgifte van het geneesmiddel werd geëvalueerd met behulp van een UV-spectrofotometer door de absorptie te controleren bij λ = 280 nm na onderdompeling van de hydrogel in 5 ml PBS (pH 7,4). De afgifte werd gekwantificeerd met behulp van een standaardcurve van salicylzuurconcentraties om de gecontroleerde afgifte van de CPG-hydrogel te bevestigen. Ten slotte werden hydrogels gedurende 30 minuten ondergedompeld in bufferoplossingen met een pH van 4,5 en 7,2 om de pH-responsiviteit te beoordelen, waarbij veranderingen in volume en uiterlijk onder verschillende pH-omstandigheden werden waargenomen16.

Temperatuur en pH-responsiviteit van CPG-pleisters
CPG-pleisters (ongeveer 2 mm in diameter) werden in een bufferoplossing van 5 ml met een pH van 7,2 geplaatst en gedurende 30 minuten op 37 °C gehouden met behulp van een waterbad met temperatuurregeling om fysiologische omstandigheden na te bootsen. Reflectiespectra werden gemeten met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer bij golflengten variërend van 400 nm tot 800 nm. Na de eerste metingen werden de pleisters overgebracht naar bufferoplossingen met verschillende pH-waarden (bijv. pH 4,5, 7,2 en 9,0) en gedurende 30 minuten op 37 °C gehouden. De reactie op de micro-omgeving, inclusief eventuele kleurveranderingen, werd visueel waargenomen en reflectiespectra werden opnieuw geregistreerd om de kleurverschuiving te analyseren. Deze temperatuur- en pH-responsiviteit levert waardevolle informatie op over hoe de hydrogel reageert op veranderingen in de wondomgeving.

In vitro antibacterieel testen
Antibacteriële tests werden uitgevoerd met behulp van standaardprocedures. Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) en Escherichia coli (E. coli, ATCC 53868) stammen werden gebruikt om de antibacteriële activiteit van CPG-pleisters te beoordelen. Deze standaard referentiestammen werden gekocht bij de American Type Culture Collection (ATCC) en werden gebruikt als kwaliteitscontrolestammen (QC) om de antimicrobiële testprocedures te valideren. Antimicrobiële gevoeligheidstesten werden uitgevoerd met behulp van de microdilutiemethode voor bouillon volgens de CLSI M100-richtlijnen. De bacteriële suspensies werden bereid in Mueller-Hinton-bouillon, een standaardmedium voor antimicrobiële tests. De troebelheid werd aangepast naar een McFarland-norm van 0,5, wat overeenkomt met ongeveer 1,5 × 108 CFU/ml. De suspensies werden vervolgens geënt met CPG-pleisters (2 mm in diameter), bereid met gedeïoniseerd water of pH 6,0 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES) buffer (10 mM). De pleisters werden toegevoegd aan de bacteriële suspensies in een verhouding van één pleister per 1 ml cultuur. De suspensies werden gedurende 24 uur bij 37 °C geïncubeerd. Na incubatie werd de bacteriegroei beoordeeld door seriële verdunningen van de culturen op voedingsagar te plateren, en kolonievormende eenheden (CFU's) werden geteld na een incubatie van 24 uur bij 37 °C. Deze procedure leverde een kwantitatieve maat op voor de antibacteriële werkzaamheid.

Evaluatie van de biocompatibiliteit
Experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven. CPG-pleisters werden verwerkt door dialyse in PBS (pH 7,4) gedurende 4 uur, gevolgd door ethanolsterilisatie (70%) gedurende 10 minuten en UV-desinfectie (365 nm) gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat alle biologische verontreinigingen werden verwijderd. L929-cellen (ATCC CCL-1) werden gekweekt in DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C met 5% CO2 om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes bij 2 × 105 cellen/ml, met of zonder CPG-pleisters (2 mm in diameter), in drievoud. De cellen werden verdeeld in drie experimentele groepen: blanco controle, CPG-groep en CPG (MES) -groep. Na 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met behulp van de MTT-test, een algemeen aanvaarde methode voor het beoordelen van de metabole activiteit van cellen. Voor de MTT-test werd 20 μL MTT (5 mg/ml) aan elk putje toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 4 uur. Na incubatie werd het medium verwijderd en werd 150 μL DMSO toegevoegd om de formazankristallen die door de levende cellen werden gevormd, op te lossen. De extinctie werd gemeten bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer om het aantal levensvatbare cellen te kwantificeren. Deze aanpak zorgde voor een betrouwbare beoordeling van de cytotoxiciteit en biocompatibiliteit van de hydrogelpleisters.

Ontstekingsremmende werking
De antioxiderende werking van CPG werd geëvalueerd met behulp van een ROS-testkit. L929-cellen (ATCC CCL-1) werden gekweekt in DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur om celaanhechting en initiële proliferatie mogelijk te maken. Om oxidatieve stress te induceren, werden cellen gedurende 12 uur behandeld met 3 μg/ml waterstofperoxide (H2O2). Na oxidatieve stressinductie werd hydrogelextract (bereid door 1 mg CPG-hydrogel op te lossen in 1 ml DMEM-medium) aan de cellen toegevoegd. Cellen werden nog eens 12 uur geïncubeerd om de mogelijke antioxiderende effecten van de CPG-hydrogel mogelijk te maken. Vervolgens werden de cellen gekleurd met 10 μM DCFH-DA-oplossing (verdund in DMEM-medium) en gedurende 20 minuten bij 37 °C geïncubeerd. DCFH-DA is een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om reactieve zuurstofspecies (ROS) in cellen te detecteren. Na kleuring werden de cellen gewassen met PBS en werden fluorescentiebeelden vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 530 nm. De intensiteit van de groene fluorescentie was omgekeerd gecorreleerd met de antioxiderende activiteit van de hydrogel, wat een visuele beoordeling opleverde van het vermogen van de hydrogel om oxidatieve stress in cellen te verminderen.

Osteomyelitis bij ratten diermodel
Er werd een chronisch osteomyelitismodel opgesteld: mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8 weken oud) werden verdoofd met isofluraan (2-3% in zuurstof) om ervoor te zorgen dat ze tijdens de operatie immobiel en pijnvrij bleven. Er werd een incisie van 2 cm gemaakt aan de zijkant van het linkerdijbeen en met een steriele 27-G-naald werd 1 107 CFU van S. aureus rechtstreeks in het trabeculaire gebied van het dijbeen geïnjecteerd. De injectie werd uitgevoerd in de beenmergholte van het dijbeen om een infectie te induceren in de mergruimte, de primaire plaats voor osteomyelitis. De bacteriën werden langzaam afgeleverd om een goede afzetting in het beenmerg te garanderen. Na 10 dagen werden de ratten geëuthanaseerd met behulp van CO2 -inhalatie en werden de geïnfecteerde dijbenen zorgvuldig ontleed. Granulatieweefsel werd weggesneden van de infectieplaats en onmiddellijk ondergedompeld in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur om de weefselintegriteit te behouden. Na fixatie werd het botweefsel gedurende 48-72 uur ontkalkt met een ontkalkingsmiddel (bijv. EDTA), afhankelijk van de grootte van het bot, om de juiste doorsnede mogelijk te maken voor histologische en immunohistochemische analyse. De ontkalkte botmonsters werden vervolgens verwerkt voor histologisch onderzoek, immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentiekleuring. Voor kwantitatieve real-time PCR (qPCR)-analyse werd granulatieweefsel bewaard bij -80 °C voor daaropvolgende RNA-extractie, waardoor genexpressieprofielen met betrekking tot ontsteking, botregeneratie en immuunresponsen konden worden geanalyseerd

Evaluatie van de behandeling van osteomyelitis in vivo
Granulatieweefsel werd ingebed in paraffine en met behulp van een microtoom op 5 μm doorgesneden. De secties werden gekleurd met Masson's trichrome kleuring (15 minuten met hematoxyline, 1 uur met anilineblauw) om collageenafzetting en weefselremodellering te evalueren. Hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring (5 minuten met hematoxyline, 2 minuten met eosine) werd gebruikt om de algemene weefselmorfologie en ontsteking te observeren. Immunohistochemie (IHC) met anti-CD31 (1:100) en anti-EGF (1:200) werd uitgevoerd gedurende 1 uur bij 37 °C, gevolgd door incubatie van secundaire antilichamen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten met behulp van anti-muis IgG of anti-konijn IgG (verdund 1:200), afhankelijk van het primaire antilichaam dat wordt gebruikt, om angiogenese en groeifactorexpressie te evalueren. Immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd met anti-VEGF (1:100) en anti-bFGF (1:200) gedurende 1 uur bij 37 °C, gevolgd door incubatie van secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij RT. Secties werden geobserveerd voor CD31-, EGF-, VEGF- en bFGF-expressie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Voor kwantitatieve real-time PCR (qPCR)-analyse werd mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-1β en IL-6) geanalyseerd na RNA-extractie met RNAiso Plus en cDNA-synthese met behulp van de PrimeScript RT-reagenskit. PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR Green PCR Master Mix om de ontstekingsreactie op moleculair niveau kwantitatief te beoordelen.

Maatregelen voor kwaliteitscontrole
Om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten te garanderen, werden alle procedures uitgevoerd volgens gestandaardiseerde protocollen. Elk experiment omvatte geschikte controlegroepen, zoals blanco controles (ratten die besmet waren met S. aureus maar geen behandeling kregen), controlegroepen (ratten die chirurgische ingrepen ondergingen zonder bacteriële infectie en geen behandeling) en vergelijkende behandelingsgroepen (ratten die verschillende behandelingen kregen voor osteomyelitis, zoals antibiotica of een experimenteel medicijn), om de variabiliteit te minimaliseren. Alle testen werden in drievoud uitgevoerd om consistentie te garanderen en experimentele bias te verminderen. Elke groep bevatte 6 ratten om statistische significantie te garanderen. Instrumenten, waaronder een UV-Vis-spectrofotometer, reometer en trekbank, werden voor gebruik routinematig gekalibreerd volgens de specificaties van de fabrikant. Bacterie- en celculturen werden onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden bereid in een bioveiligheidskast en kleuringsprocedures werden gevolgd met behulp van consistente protocollen om reproduceerbaarheid te garanderen. De gegevensverzameling werd uitgevoerd met uniforme microscoopinstellingen om de variabiliteit tussen monsters te minimaliseren en nauwkeurige metingen te garanderen.

Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism (versie 8.0). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Voor vergelijking tussen meerdere groepen werd een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de post-hoctest van Tukey gebruikt om verschillen in mechanische eigenschappen, thermoresponsief gedrag, antibacteriële activiteit en cellevensvatbaarheid te beoordelen. De t-toets van de student werd gebruikt voor paarsgewijze vergelijkingen wanneer slechts twee groepen werden vergeleken, zoals in het geval van het vergelijken van de reflectiepieken van CPG-pleisters bij verschillende pH-waarden of temperatuurveranderingen. p < 0,05 werd voor alle analyses als statistisch significant beschouwd. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd om de consistentie en reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fabricage en karakterisering van CPG-pleisters (Figuur 1)
In een typisch experiment werden monodisperse silica-nanodeeltjes zelf geassembleerd door verdamping van oplosmiddelen om dicht opeengepakte arrays te vormen, wat resulteerde in structurele kleurcoatings (SCC's)17,18,19, die vervolgens werden gebruikt om multifunctionele structurele kleurhydrogelpleisters te maken, zoals weergegeven in figuur 1. Het proces omvatte de infiltratie van een pre-geloplossing in de nanoschaalopeningen van de SCC's via capillaire werking. UV-polymerisatie werd vervolgens gebruikt om de hybride film van SCC's en hydrogel te vormen. Nadat de SCC's waren weggeëtst, werd een omgekeerde anti-eiwit stenen steiger met een periodieke poreuze structuur verkregen. Ten slotte werd de thermoresponsieve GelMA-hydrogel opgevuld in de openingen op nanoschaal van de anti-eiwitsteensteiger, gevolgd door uitharding, om de onafhankelijke CPG-pleisters te creëren.

Het sterke verknopingsnetwerk van de hydrogel gaf uitstekende mechanische eigenschappen aan de CPG-pleisters. Er werd waargenomen dat de pleisters sterk genoeg waren om rekken te weerstaan zonder enige schade aan te richten en tot 2,5 keer hun oorspronkelijke lengte konden worden uitgerekt. Belangrijk is dat de CPG-pleisters levendige structurele kleuren vertoonden en dynamische kleurveranderingen ondergingen tijdens het uitrekken, een uniek kenmerk dat het gevolg is van de periodieke rangschikking van nanostructuren van hoge orde binnen de pleisters. Deze nanostructuren creëren fotonische bandopeningen (PBG's), waar licht op bepaalde golflengten binnen de PBG selectief wordt gereflecteerd in plaats van doorgelaten, waardoor de CPG-patches hun karakteristieke structurele kleuren en reflectiepieken krijgen.

De piekreflectiepositie van de CPG-patch kan worden geschat met behulp van de vergelijking20:

λ = 1,633dngemiddeld

waarbij d de afstand tussen diffractievlakken is en hetgemiddelde n de gemiddelde brekingsindex van het materiaal is, die wordt berekend als het gemiddelde van de brekingsindices van de componenten, inclusief GelMA-hydrogel en andere materialen die in de pleister worden gebruikt. Deze vergelijking suggereert dat, naarmate de pleister wordt uitgerekt en d afneemt, de reflectiegolflengte afneemt, wat leidt tot een blauwe verschuiving in de structurele kleur van de pleister. De treksterkte van de pleisters werd ook getest en er werd vastgesteld dat de rekcapaciteit van de pleisters afnam doordat de GelMA-hydrogel de openingen op nanoschaal van de anti-eiwitsteensteiger vulde. De vervorming van de CPG-pleisters bij het uitrekken biedt een zeer gevoelige manier voor rekdetectie, waardoor ze geschikt zijn voor toepassingen die mechanische bewaking vereisen.

Thermoresponsief en pH-gevoelig gedrag van CPG-pleisters (Figuur 2)
De CPG-pleisters vertoonden opmerkelijke thermoresponsieve eigenschappen dankzij de GelMA-hydrogel. Bij het verhogen van de omgevingstemperatuur tot 37 °C onderging de hydrogel krimp, waarbij watermoleculen en geladen lading vrijkwamen. Deze krimp resulteerde in een vermindering van de grootte van de nanoporiën in de CPG-pleisters, waardoor hun PBG veranderde en bijgevolg het reflectiespectrum verschoven. Figuur 2 illustreert dit gedrag en laat zien hoe de structurele kleur van de vlekken verandert als reactie op variaties in temperatuur en pH.

Om deze waarnemingen te bevestigen, werden de CPG-pleisters geplaatst in een gesimuleerde chronische infectie-wondomgeving bij 37 °C en pH 7,2. Naarmate de pH van de oplossing toenam, werd een blauwe verschuiving in de reflectiepiek van de CPG-pleisters waargenomen, wat aangeeft dat de grootte van de nanoporiën afnam. Omgekeerd, toen de pH daalde, vertoonden de vlekken een rode verschuiving, wat overeenkomt met een uitzetting van de nanoporiën. Dit pH-gevoelige gedrag werd toegeschreven aan de hydrolyse van booresterbindingen in de CSMA-PBA onder zure omstandigheden, waardoor de bindingen werden verbroken en resulteerde in een roodverschuiving van de structurele kleur. Wanneer de pH echter alkalisch was, werd er geen significante kleurverandering waargenomen, wat wijst op de stabiliteit van de pleisters in basisomstandigheden. Deze bevindingen suggereren dat de CPG-pleisters kunnen worden gebruikt om zowel temperatuur- als pH-veranderingen in wondomgevingen te controleren, wat cruciaal is voor een effectieve wondbehandeling.

Antibacteriële activiteit van CPG-pleisters (Figuur 3)
De antibacteriële eigenschappen van de CPG-pleisters werden geëvalueerd door ze samen te kweken met S. aureus en E. coli. Figuur 3A,B laat zien dat de CPG-pleisters de bacteriegroei aanzienlijk verminderden, wat hun effectieve antibacteriële eigenschappen aantoont. Deze antibacteriële werkzaamheid werd toegeschreven aan de elektrostatische interactie tussen het positief geladen CMCSMA-oppervlak van de pleisters en de negatief geladen bacteriële celwanden21. Deze interactie verstoorde de bacteriële membraanstructuur, wat leidde tot bacteriële dood. De kationische groepen van CMCSMA kunnen binden aan anionische componenten in het bacteriële membraan, wat leidt tot membraandepolarisatie en verhoogde permeabiliteit22. Bovendien kan CMCSMA, vanwege zijn relatief kleine moleculaire grootte en flexibele polymere ketens, effectiever in de lipidedubbellaag doordringen, waardoor intracellulaire stoffen lekken en de metabolische activiteit wordt verstoord. De kleine omvang van de CMCSMA-moleculen vergemakkelijkte hun penetratie in het bacteriële celmembraan verder, waar ze interageerden met essentiële biomoleculen, waardoor het bacteriële metabolisme en enzymsystemen werden verstoord23. Bovendien, gezien het robuuste biofilmvormende vermogen van S. aureus, is het vermeldenswaard dat op chitosan gebaseerde materialen zoals CMCSMA naar verluidt bacteriële biofilms verstoren door de matrix van extracellulaire polymere substantie (EPS) binnen te dringen en de integriteit ervan te verstoren. Hierdoor kunnen de antibacteriële middelen toegang krijgen tot bacteriën die zijn ingebed in biofilms, die doorgaans resistent zijn tegen conventionele antibiotica24,25. Zoals te zien is in figuur 3A, toont de visuele vergelijking van bacteriekolonies duidelijk een substantiële vermindering aan na behandeling met CPG-pleisters, wat hun effectieve bacteriedodende activiteit en hun veelbelovende potentieel voor gebruik in infectiegevoelige wondomgevingen benadrukt.

Biologische functionaliteit van CPG-pleisters (Figuur 4)
De CPG-pleisters vertoonden naast hun antibacteriële eigenschappen een significante biologische functionaliteit. Figuur 4C,D laat zien dat de pleisters effectief reactieve zuurstofsoorten (ROS) in cellen opruimden, zoals aangegeven door het verminderde groene fluorescentiesignaal in de CPG-groep. ROS-opruiming is essentieel bij wondgenezing, omdat overmatige ROS-productie de weefselregeneratie kan belemmeren. De levensvatbaarheid van menselijke endotheelcellen in de navelstrengader (HUVEC's) die samen met de CPG-pleisters werden gekweekt, werd beoordeeld aan de hand van levensvatbaarheidskleuring, zoals weergegeven in figuur 4A. De resultaten gaven aan dat de meerderheid van de cellen in leven was, met slechts een klein deel van de dode cellen, wat suggereert dat de CPG-pleisters de levensvatbaarheid van de cellen bevorderen en de celproliferatie ondersteunen.

Figuur 4B toont de resultaten van een MTT-test, die aantoonde dat de CPG-pleisters de celproliferatie aanzienlijk bevorderden. Bovendien toonde figuur 4F,G aan dat de CPG-pleisters de angiogenese versterkten door de expressie van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en basale fibroblastgroeifactor (bFGF) te bevorderen, die cruciaal zijn voor de proliferatie van endotheelcellen en de vorming van nieuwe bloedvaten. Deze resultaten benadrukken het potentieel van de CPG-pleisters om niet alleen infectie te voorkomen, maar ook de weefselregeneratie te verbeteren en de wondgenezing te versnellen.

In vivo evaluatie van CPG-pleisters (Figuur 5)
In vivo experimenten uitgevoerd met behulp van een chronisch osteomyelitismodel toonden aan dat de CPG-pleisters infectie en ontsteking aanzienlijk verminderden. Figuur 5A toont histologische analyse (H&E-kleuring), waarbij de controlegroep karakteristieke ontsteking, botafbraak, necrotisch weefsel en hoge infiltratie van afweercellen vertoonde, terwijl de behandelingsgroep een significante vermindering van infectie, ontsteking en infiltratie van afweercellen vertoonde. In de CPG-groep werden verhoogde migratie van osteoblasten, transformatie van osteoblasten in botcellen, vasculaire vorming, nieuwe botvorming en verminderde infectie waargenomen, wat de effectiviteit van de CPG-pleisters bij het bevorderen van weefselregeneratie verder bevestigt.

Bovendien toont figuur 5B angiogenese-kleuring, wat bevestigt dat de CPG-pleisters de vorming van nieuwe bloedvaten bevorderden, wat van cruciaal belang is voor weefselherstel. Deze bevindingen suggereren dat de CPG-pleisters een dubbele rol spelen bij zowel het beheersen van infecties als het bevorderen van weefselregeneratie, waardoor ze zeer geschikt zijn voor chronische wondgenezing en botregeneratietoepassingen.

figure-results-1
Figuur 1: Voorbereiding en karakterisering van de structurele kleur hydrogel patch (CPG). (A): Reactie tussen CSMA en PBA; (B): Foto van CPG, die de kleurverandering bij het uitrekken demonstreert; (C): SEM-karakterisering van CPG; (D): Zwellingsgedrag van CPG; (E): Degradatieprofiel van CPG; (F): Kinetiek van geneesmiddelafgifte van CPG. Schaal balk: 100 nm. Foutbalken geven de standaarddeviatie (SD) weer. In de experimentele groep werden zes ratten gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 2: Intelligente detectie van CPG-patch. (A): Variatie van de structurele kleur van de CPG-pleister met veranderingen in omgevingstemperatuur en pH; (B): Spectrale analyse van CPG-pleister bij verschillende temperaturen; (C): Spectrale analyse van CPG-pleister bij verschillende pH-waarden. Schaal staafje: 1 mm. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD, geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Antibacteriële activiteit van CPG-pleister. (A): Representatieve beelden van co-cultuur van S. aureus en E. coli met CPG-patch; (B): Analyse van de waarden van de optische dichtheid (OD). Schaal staafje: 5 mm. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Statistische significantie werd bepaald door eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. Per groep werden zes replicaten gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Biologische functionele evaluatie van CPG-pleister. (A): Levensvatbaarheidskleuring van HUVEC-cellen die samen met de CPG-pleister zijn gekweekt gedurende 48 uur, waarbij levende cellen (groen) en dode cellen (rood) worden getoond; (B): Celproliferatie gemeten door middel van MTT-assay; (C): ROS-kleuring van CPG-pleister; (D): DPPH-opruimingspercentage in de VEGF-groep; (E): q-PCR-analyse van ontstekingsfactoren; (F): Bevordering van angiogenese door CPG-pleister; (G): Western blot-resultaten van VEGF- en bFGF-expressie; (H): Statistische analyse van grijswaardenwaarden van VEGF en bFGF. Schaal balk: 100 μm. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. In elke groep werden zes ratten gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: In vivo experimenten met de CPG-patch. (A): HE kleuring; (B): Angiogenese kleuring. Schaal balk: 100 μm. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD, geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. Elke groep bevatte 6 dieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bevindingen van deze studie tonen de multifunctionaliteit van CPG-hydrogelpleisters aan, met name wat betreft hun structurele kleurveranderingen, temperatuurgevoeligheid, pH-responsiviteit en antimicrobiële eigenschappen. Deze hydrogelpleisters kunnen zichtbare structurele kleurveranderingen ondergaan wanneer ze worden blootgesteld aan mechanische vervorming, en bieden een zeer gevoelig mechanisme voor het bewaken van de spanning. Deze functie komt overeen met eerdere studies die structurele kleur in materialen voor sensortoepassingen hebben onderzocht, waarbij dergelijke kleurverschuivingen worden gebruikt als indicatoren van rek of druk26,27. Onze studie breidt deze bevindingen uit door deze kleurveranderingen te gebruiken als een niet-invasief middel om wondstress te monitoren, wat essentieel is voor het beoordelen van wondgenezing in realtime. De mogelijkheid om dergelijke mechanische spanningen te controleren, biedt cruciale informatie voor clinici, wat mogelijk kan helpen bij het identificeren van vroege tekenen van complicaties, zoals dehiscentie van hechtingen, en zo meer gerichte en tijdige interventies te ondersteunen. Belangrijk is dat de optische uitlezing een direct en intuïtief detectiemechanisme biedt zonder dat er extra stroom of beeldvormingsapparatuur nodig is, en een gedecentraliseerde bewakingsoplossing biedt die ideaal is voor point-of-care of postoperatieve zorg thuis.

Het thermoresponsieve en pH-gevoelige gedrag van de CPG-hydrogelpleisters vergroot hun potentieel voor klinisch gebruik. Naarmate wonden genezen, komen schommelingen in temperatuur en pH vaak voor, vooral in de aanwezigheid van een infectie of ontsteking28. Het is bekend dat verhoogde temperaturen en veranderde pH-waarden op de plaats van de wond verband houden met deze aandoeningen. In deze studie vertoonden de CPG-pleisters gevoeligheid voor dergelijke veranderingen, waardoor real-time monitoring van lokale wondaandoeningen mogelijk was. Deze eigenschap is van bijzondere waarde in klinische omgevingen, waar vroege opsporing van infectie of ontsteking essentieel is voor het optimaliseren van therapeutische strategieën. Het monitoren van temperatuur- en pH-variaties is vooral belangrijk bij wondbehandeling, omdat ze dienen als vroege, niet-invasieve biomarkers van de wondstatus29. Verhoogde temperatuur kan het begin van de infectie signaleren voordat klinische symptomen zich manifesteren, terwijl verschuivingen naar alkalische pH vaak duiden op chroniciteit, microbiële kolonisatie en verminderde genezing. Zure omgevingen daarentegen worden geassocieerd met acute wonden en een beter genezingspotentieel24. De integratie van temperatuur- en pH-gevoelige elementen in wondverbanden maakt dus tijdige interventies en continue beoordeling van de genezingsvoortgang mogelijk, wat wondverslechtering of progressie naar systemische infectie kan voorkomen. Het vermogen van de hydrogel om zich dynamisch aan deze veranderingen aan te passen, biedt clinici ook een nieuw hulpmiddel om de wondstatus continu te controleren, waardoor het genezingsproces nauwkeuriger kan worden gevolgd. Bovendien zorgt een dergelijke dynamische responsiviteit voor spatiotemporele controle over de therapeutische release, waardoor de toediening van geneesmiddelen wordt gesynchroniseerd met pathologische signalen, wat een kerndoelstelling is van moderne slimme biomaterialen.

Bovendien zijn de antimicrobiële eigenschappen van de CPG-hydrogelpleisters van cruciaal belang bij het verminderen van de bacteriële belasting op de wondplaats. Chitosan, dat in de structuur van de hydrogel werd verwerkt, staat al lang bekend om zijn antimicrobiële eigenschappen, vanwege zijn kationische aard, die elektrostatische interacties met de negatief geladen bacteriële celwanden vergemakkelijkt29. Het antibacteriële mechanisme van materialen op basis van chitosan is echter niet beperkt tot het eenvoudig aantrekken van ladingen. Bij contact met bacteriële membranen kan chitosan de membraanpermeabiliteit verhogen, wat leidt tot lekkage van intracellulaire inhoud zoals kaliumionen, eiwitten en nucleïnezuren. Bovendien kan chitosan tweewaardige metaalionen (bijv. Ca2+ en Mg2+) cheleren, waardoor de enzymactiviteit en metabolische functies worden verstoord. Chitosan met een laag moleculair gewicht kan ook de bacteriële celwand binnendringen en zich binden aan DNA, waardoor mRNA-transcriptie en eiwitsynthese worden geremd. Deze veelzijdige mechanismen zijn uitgebreid gedocumenteerd. De poreuze structuur van de hydrogelsteiger versterkt deze effecten verder door het oppervlak en het bacteriële contact te verbeteren, wat resulteert in synergetische antibacteriële werkzaamheid. Deze eigenschap is met name relevant bij de behandeling van chronische infecties, zoals osteomyelitis, waarbij de vorming van biofilm het genezingsproces bemoeilijkt25,30. De resultaten van deze studie tonen aan dat de CPG-hydrogelpleisters effectief waren in het remmen van bacteriegroei, het verminderen van de bacteriële belasting op de wondplaats en mogelijk het creëren van een gunstigere omgeving voor weefselregeneratie. Deze antimicrobiële activiteit, gecombineerd met de andere eigenschappen van de hydrogel, positioneert de pleisters als een veelbelovende kandidaat voor de behandeling van chronische wonden, die vaak worden geplaagd door bacteriële besmetting en vertraagde genezing. Bovendien voorkomt de hydrogel, door lokale bacteriële kolonisatie te remmen, indirect de opregulatie van pro-inflammatoire cytokinen die vaak worden aangehouden in geïnfecteerde chronische wonden, waardoor een pro-regeneratieve micro-omgeving wordt bevorderd.

Hoewel ROS doorgaans wordt geassocieerd met oxidatieve stress en weefselbeschadiging, wordt algemeen erkend dat gecontroleerde generatie van ROS een cruciale rol speelt bij de uitroeiing van bacteriën. ROS, zoals hydroxylradicalen en superoxide-anionen, kunnen bacteriële eiwitten, lipiden en DNA oxideren, wat uiteindelijk leidt tot membraanbreuk en celdood. Daarom dient de aanwezigheid van ROS op gematigde niveaus als een cruciaal onderdeel van aangeboren antimicrobiële afweermechanismen. In de context van chronische osteomyelitis, waarbij bacteriële kolonisatie en biofilmvorming aanhouden, is het elimineren van ziekteverwekkers een voorwaarde voor zinvolle weefselregeneratie. De CPG-hydrogel biedt een evenwichtige aanpak door overmatige ROS te onderdrukken met behoud van effectieve antibacteriële activiteit door CMCSMA-gemedieerde membraanverstoring en biofilmpenetratie. Deze dubbele functie zorgt ervoor dat ontstekingen niet worden verlengd door aanhoudende aanwezigheid van bacteriën, waardoor een overgang van immuunactivering naar een regeneratieve micro-omgeving mogelijk is. Dus, in plaats van lukraak ROS op te ruimen, moduleert dit systeem de oxidatieve micro-omgeving om zowel de bacteriële klaring als de weefselgenezing te ondersteunen.

Naast antimicrobiële activiteit vertoonden de CPG-hydrogelpleisters biologische functionaliteit die cruciaal is voor weefselherstel en regeneratie31. In vitro testen toonden aan dat de hydrogel de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen ondersteunde, evenals angiogenese. Deze bevindingen komen overeen met eerdere studies die het belang van angiogenese bij wondgenezing benadrukten32. Angiogenese is van cruciaal belang voor het leveren van voldoende zuurstof en voedingsstoffen aan het gewonde weefsel, waardoor weefselregeneratie wordt vergemakkelijkt. Bovendien zijn de pro-angiogene effecten van de hydrogel bijzonder belangrijk voor de behandeling van chronische wonden, aangezien deze wonden vaak last hebben van een slechte vascularisatie, wat het genezingsproces belemmert33,34. Door de vorming van bloedvaten te bevorderen, draagt de CPG-hydrogel niet alleen bij aan weefselregeneratie, maar creëert het ook een meer bevorderlijke omgeving voor de overleving van nieuw gevormd weefsel op de lange termijn. Bovendien voegt het vermogen van de hydrogel om de migratie en differentiatie van osteoblasten te bevorderen een aanzienlijke waarde toe in de context van botgenezing, vooral voor patiënten met chronische botinfecties of botdefecten35. De verbetering van osteogenese is een veelbelovende manier om de resultaten te verbeteren bij osteomyelitis en gerelateerde botaandoeningen, waarbij de genezing vaak in het gedrang komt. Een dergelijke osteoinductieve functionaliteit, geïntegreerd met gelokaliseerde infectiebeheersing, pakt een centrale uitdaging aan in musculoskeletale weefselengineering: de behoefte aan convergente oplossingen die zowel antimicrobiële afweer als weefselregeneratie bevorderen in één enkel platform.

De in vivo resultaten bevestigen verder het therapeutisch potentieel van de CPG-hydrogelpleisters en tonen hun vermogen aan om weefselherstel te ondersteunen, infecties te verminderen en osteogenese te bevorderen. In chronische wondmodellen vergemakkelijkten deze hydrogels effectief de wondsluiting en weefselregeneratie. In botregeneratiemodellen bevorderde de CPG-hydrogel de migratie en differentiatie van osteoblasten, waardoor de botgenezing werd verbeterd. Deze bevindingen komen overeen met die van andere onderzoeken die strategieën voor wondgenezing en botregeneratie op basis van hydrogel hebben onderzocht36. Het vermogen van CPG-hydrogelpleisters om tegelijkertijd infecties aan te pakken, angiogenese te bevorderen en osteogenese te ondersteunen, biedt een krachtig platform voor uitgebreide wondverzorging, waardoor het een veelbelovende kandidaat is voor klinisch gebruik.

Ondanks deze veelbelovende resultaten zijn er verschillende beperkingen aan de huidige studie. Ten eerste, terwijl de in vitro en in vivo modellen positieve resultaten lieten zien, werden de preklinische studies voornamelijk uitgevoerd in muizenmodellen. Hoewel muizen veel worden gebruikt voor onderzoeken naar wondgenezing, repliceren ze mogelijk niet volledig de complexiteit van menselijke wondgenezing. Daarom is verdere validatie in grotere diermodellen, evenals in klinische proeven bij mensen, nodig om de veiligheid en werkzaamheid van deze hydrogelpleisters in klinische omgevingen in de praktijk te bevestigen. Ten tweede, hoewel de CPG-hydrogels op korte termijn goede mechanische eigenschappen en biologische functionaliteit vertoonden, blijven hun stabiliteit en degradatiegedrag op lange termijn in vivo onduidelijk. Hydrogels kunnen na verloop van tijd worden afgebroken en hun afbraakproducten kunnen het genezingsproces beïnvloeden of zelfs bijwerkingen veroorzaken. Toekomstige studies zouden zich moeten richten op het optimaliseren van de afbraaksnelheid van deze hydrogels om ervoor te zorgen dat ze op een gecontroleerde manier worden afgebroken, zonder schadelijke bijproducten vrij te geven. Bovendien moet de gecontroleerde afgifte van bioactieve stoffen in de hydrogel verder worden verfijnd om aanhoudende therapeutische effecten in de loop van de tijd te garanderen, vooral voor chronische wondbehandeling.

Hoewel deze studie zich richt op een op hydrogel gebaseerde supramoleculaire steiger, omvatten alternatieve benaderingen om dezelfde therapeutische hypothese aan te pakken elektrochemische biosensoren, microfluïdische wond-op-chip-systemen en slimme verbanden met elektronische componenten voor omgevingsdetectie. In tegenstelling tot de technologieën die vaak stroombronnen en complexe interfaces vereisen, biedt de hier ontwikkelde hydrogelpatch echter een op zichzelf staand, visueel interpreteerbaar platform zonder externe instrumentatie, waardoor het vooral aantrekkelijk is voor omgevingen met beperkte middelen.

Het belang van dit werk ligt in het translationele potentieel ervan. Naast osteomyelitis kan het CPG-platform worden aangepast voor andere ontstekingsgerelateerde aandoeningen, zoals diabetische voetulcera, postoperatieve wondinfecties en monitoring van resectie na de tumor. De integratie van diagnostische en therapeutische functionaliteiten in een enkele hydrogelmatrix biedt een unieke kans voor de ontwikkeling van slimme wondverbanden van de volgende generatie. Bovendien biedt het op fotonische kristallen gebaseerde structurele kleursysteem mogelijkheden voor realtime, colorimetrische biosensing die toepasbaar is in gepersonaliseerde geneeskunde. Bovendien maakt de modulariteit van het CPG-ontwerp aanpassing mogelijk voor toekomstige integratie met stamcellen, exosomen of genafgiftevectoren om de regeneratieve mogelijkheden verder uit te breiden, in lijn met de huidige trajecten in precisieregeneratieve geneeskunde.

Vooruitkijkend moet toekomstig onderzoek zich richten op verschillende belangrijke gebieden. Ten eerste zal het optimaliseren van de samenstelling en structuur van de CPG-hydrogelpleisters cruciaal zijn voor het verbeteren van hun stabiliteit en prestaties op de lange termijn. Het wijzigen van de verknopingsdichtheid en het opnemen van andere bioactieve stoffen, zoals groeifactoren of cytokines, zou het therapeutisch potentieel van de hydrogel voor specifieke klinische toepassingen kunnen verbeteren. Ten tweede zou het uitbreiden van het toepassingsgebied van deze hydrogels van chronische wonden naar andere soorten weefselregeneratie, zoals zenuw- of kraakbeenherstel, hun veelzijdigheid verder kunnen aantonen. Onderzoek naar hoe CPG-hydrogels kunnen worden aangepast aan specifieke wondtypes, zoals diabetische zweren of decubitus, is nodig om hun klinische toepasbaarheid uit te breiden. Ten derde kan de integratie van geavanceerde therapieën, zoals stamceltherapie of gentherapie, met hydrogelpleisters hun regeneratieve eigenschappen verbeteren, waardoor uitgebreidere en effectievere behandelingen mogelijk worden. Ten slotte zullen grootschalige, multicenter klinische onderzoeken en praktijkstudies nodig zijn om de veiligheid, maakbaarheid, gebruikersnaleving en regelgevende gereedheid van het CPG-platform te evalueren, en zo de uiteindelijke klinische vertaling te ondersteunen.

Kortom, CPG-hydrogelpleisters vormen een veelbelovend platform voor geavanceerde wondverzorging en weefselregeneratie. Hun vermogen om wondstress te monitoren, te reageren op temperatuur- en pH-veranderingen, antimicrobiële eigenschappen te vertonen en weefselregeneratie te bevorderen, biedt een veelzijdige benadering voor de behandeling van chronische wonden. Hoewel de resultaten van preklinische studies bemoedigend zijn, zijn verdere optimalisatie en klinische validatie nodig om het potentieel van deze hydrogelpleisters in klinische omgevingen volledig te benutten. Toekomstige onderzoeksrichtingen moeten verbeteringen in de materiaalsamenstelling, bredere toepassingen, integratie met geavanceerde therapeutische strategieën en klinische proeven omvatten om hun werkzaamheid en veiligheid bij mensen vast te stellen.

In dit experiment gebruikten we een combinatie van methyl CSMA-PBA als de inverse opalen steiger, temperatuurgevoelige GelMA-hydrogel als vulmiddel en laadden we het met SA om een CPG-geïntegreerde diagnostische en therapeutische slimme structurele kleurhydrogelpleister te creëren. De experimentele resultaten tonen aan dat deze hydrogelpleister uitstekende mechanische eigenschappen en kleefkracht vertoont. Het kan de groei van bacteriën remmen, de expressie van vasculaire endotheliale groeifactor aanzienlijk opreguleren en de niveaus van ontstekingsfactoren verlagen, waardoor aanzienlijke klinische vooruitzichten worden geboden voor de behandeling van COM. Bovendien, belangrijker nog, op basis van het vermogen van CPG om veranderingen in temperatuur en pH op de plaats van infectie te detecteren, vervult het een toezichthoudende rol bij het postoperatieve herstel van chronische osteomyelitis.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot deze studie. Er waren geen financiële of persoonlijke relaties die van invloed konden zijn op het werk dat in dit manuscript wordt gepresenteerd. De auteurs bevestigen dat er geen AI-tools zijn gebruikt tijdens de voorbereiding van dit manuscript. Alle auteurs hebben de definitieve versie van het manuscript goedgekeurd voor inzending.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Health Commission Scientific Research Fund - Major Health Science and Technology Plan van de provincie Zhejiang (NO. WKJ-ZJ-2419) en Zhejiang Clinovation Pride (Clinical Innovation Team for Traumatic Osteomyelitis) (NO. CXTD202501009). We willen graag onze oprechte dank uitspreken aan iedereen die dit onderzoek heeft gesteund en eraan heeft bijgedragen. Uw begeleiding, hulp en feedback zijn van onschatbare waarde geweest bij het voltooien van dit werk.

BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:
De onbewerkte gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur. Bovendien zijn alle gegevens geüpload naar Zenodo en zijn ze openbaar beschikbaar via de volgende link: https://doi.org/10.5281/zenodo.16785606

BIJDRAGE VAN DE AUTEUR:
Xiaoyu Han en Qiaofeng Guo: Schrijven-beoordelen en redigeren; Xiang Wang en Bingyuan Lin: conceptualisering; Yiyang Liu en Haiyong Ren: methodologie; Kai Huang en Huajun Yu: visualisatie en supervisie. Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrylamide (AM, 99%)Sigma-AldrichA8887Monomeer voor hydrogelpolymerisatie
Acryloyl Chloride (AC, 99%)TCI ChemicalsA0376Gebruikt in chemische modificatiereacties
Alkaline Alumina (200-300 mesh)AladdinA112336Gebruikt voor het zuiveren van methylmethacrylaat
Anti-bFGF-antilichaamSanta Cruzsc-9084Immunogloeiverf voor detectie van groeifactoren
Anti-CD31-antilichaamAbcamab28364Immunohistochemische analyse voor detectie van vasculaire marker
Anti-EGF-antilichaamSigma-AldrichE9644Immunohistochemische kleuring
Anti-VEGF-antilichaamSanta Cruzsc-7269Immunogloeiverf voor angiogenesis
Bis-acrylamide (BIS, 97%)Sigma-AldrichM7279Vernettingsmiddel in hydrogelnetwerk
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)DojindoCK04Beoordeling van celviabiliteit
Chitosan, Methylacroleerd (CSMA-PBA)Sigma-AldrichC3641Scaffoldvorming in hydrogelpatches
DCFH-DA ProbeBeyotimeS0033Detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS)
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)China National Pharmaceutical Group CorporationDMSO-AROplosmiddel voor hydrogelformulering
Escherichia coli (E. coli)ATCC-Gebruikt bij antibacteriële testen
FluorescentiemicroscoopOlympusBX53Immunogloeiverf en celbeeldvorming
Gelatine Methacrylaat (GelMA)Sigma-AldrichG1894Temperatuurresponsief hydrogelcomponent
Zoutzuur (HCl)Chongqing TianyunHCl-ARpH-aanpassing bij synthese
Waterstofperoxide (H2O2)Sigma-AldrichH1009Induceert oxidatieve stress in cellen
Fluorwaterstofzuur (HF, 4%)SinopharmH814912Etsen van silica colloïdale kristallen
Instron Universele TrektestmachineInstron3345Mechanische en hechtsterktetests
L929-cellenATCCCCL-1Gebruikt voor cytotoxiciteits- en biocompatibiliteitstests
Leica MicrotomeLeicaRM2235Gebruikt voor paraffinedoorsneden van weefsels
Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8 weken)Reagan Biotechnology-In vivo chronisch osteomyelitismodel
Masson’s Trichrome KleuringskitSolarbioG1340Histologische kleuring voor fibrose
Methylmethacrylaat (MMA, 99%)Sigma-AldrichM27805Monomeer voor scaffoldvorming
MTT-testkitBeyotimeM5655Celproliferatie en cytotoxiciteitsevaluatie
Paraformaldehyde (4%)ServicebioG1101Weefselfixatie
ParaffineSigma-AldrichP1003Inbeddingsmedium voor histologie
PBS-bufferGibco10010023Gebruikt bij cel- en hydrogelverwerking
Fenylalanine (99%)Sigma-AldrichP5482Gebruikt bij chemische modificatie
Fenylboorzuur (PBA)TCI ChemicalsP0157pH-gevoelig component in hydrogel
Kaliumpersulfaat (KPS)Beijing BaolingweiKPS-ARRadicaalinitiatie bij polymerisatie
PrimeScript RT-reagenskitTakaraRR047AGebruikt voor cDNA-synthese
Reactieve Zuurstofsoorten (ROS) TestkitKeyGen BiotechKGAF019Beoordeling van antioxiderende activiteit
Real-Time PCR-systeemApplied BiosystemsStepOnePlusGene expressie kwantificering
RNAiso PlusTakara9108RNA-extractiereagens
Reometer (HR-1)TA InstrumentsHR-1Reologische karakterisering van hydrogel
Salicylzuur (SA)Sigma-AldrichS3254Geneesmiddelmolecuul in hydrogel
Scanning Elektronenmicroscoop (SEM)JEOLJSM-7500FMorfologische analyse van hydrogelstructuur
Silica Nanodeeltjes (12 nm)Sigma-Aldrich637246Vorming van silica colloïdale kristaltemplates
Natriumhydroxide (NaOH)China National Pharmaceutical Group CorporationNaOH-ARpH-aanpassing
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC-Gebruikt bij antibacteriële testen
SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659qPCR detectiereagens
UV-lichtbron (365 nm, 3 mW/cm²)HerolabUVT-28Gebruikt voor UV-polymerisatie
UV-spectrofotometerShimadzuUV-2600Drug release meting

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, S. M., et al. Tissue engineering treatment in osteomyelitis of the jaws. Tissue Eng Regen Med. 12 (S1), 11-26 (2015).
  2. Masters, E. A., et al. Evolving concepts in bone infection: redefining "biofilm", "acute vs chronic osteomyelitis", "the immune proteome" and "local antibiotic therapy". Bone Res. 7, 20(2019).
  3. Shnol, H., LaPorta, G. A. 3D printed total talar replacement: A promising treatment option for advanced arthritis, avascular osteonecrosis, and osteomyelitis of the ankle. Clin Podiatr Med Surg. 35 (4), 403-422 (2018).
  4. Loc-Carrillo, C., et al. Local intramedullary delivery of vancomycin can prevent the development of long bone Staphylococcus aureus infection. PLoS One. 11 (7), e0160187(2016).
  5. Braun, J., et al. Toxic effect of vancomycin on viability and functionality of different cells involved in tissue regeneration. Antibiotics (Basel). 9 (5), 238(2020).
  6. Spohn, R., et al. Integrated evolutionary analysis reveals antimicrobial peptides with limited resistance. Nat Commun. 10 (1), 4538(2019).
  7. Kang, J., et al. Antimicrobial peptide LL-37 is bactericidal against Staphylococcus aureus biofilms. PLoS One. 14 (6), e0216676(2019).
  8. Li, L., et al. Cathelicidin LL37 promotes osteogenic differentiation in vitro and bone regeneration in vivo. Front Bioeng Biotechnol. 9. 9, 638494(2021).
  9. Pereira, I., et al. In vivo systemic toxicity assessment of an oxidized dextrin-based hydrogel and its effectiveness as a carrier and stabilizer of granular synthetic bone substitutes. J Biomed Mater Res A. 107 (8), 1678-1689 (2019).
  10. Szili, E. J., et al. On plasma activated acetyl donors: Comparing the antibacterial efficacy of tetraacetylethylenediamine and pentaacetate glucose. Plasma. 5 (4), 423-435 (2022).
  11. Ning, J., et al. Argon mitigates impaired wound healing process and enhances wound healing in vitro and in vivo. Theranostics. 9 (2), 477-490 (2019).
  12. Nain, A., et al. Copper sulfide nanoassemblies for catalytic and photoresponsive eradication of bacteria from infected wounds. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (7), 7865-7878 (2021).
  13. Feng, L., et al. Magnetic targeting, tumor microenvironment-responsive intelligent nanocatalysts for enhanced tumor ablation. ACS Nano. 12 (11), 11000-11012 (2018).
  14. Zhu, Y., et al. A multifunctional pro-healing zwitterionic hydrogel for simultaneous optical monitoring of pH and glucose in diabetic wound treatment. Adv Funct Mater. 30, 1905493(2020).
  15. Mirpour, S., et al. Cold atmospheric plasma as an effective method to treat diabetic foot ulcers: A randomized clinical trial. Sci Rep. 10 (1), 10440(2020).
  16. Sabrin, S., et al. Opportunities of electronic and optical sensors in autonomous medical plasma technologies. ACS Sens. 8 (3), 974-993 (2023).
  17. Liu, Z., et al. A novel antifungal plasma-activated hydrogel. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (26), 22941-22949 (2019).
  18. Chen, J., et al. Plasma-activated hydrogels for microbial disinfection. Adv Sci (Weinh). 10 (14), e2207407(2023).
  19. Ghimire, B., et al. The influence of a second ground electrode on hydrogen peroxide production from an atmospheric pressure argon plasma jet and correlation to antibacterial efficacy and mammalian cell cytotoxicity. J Phy D Appl Phys. 55 (12), 125207(2022).
  20. Mohamed, A. A. H., et al. The effect of a second grounded electrode on the atmospheric pressure argon plasma jet. Plasma Res Express. 2, 015011(2020).
  21. Maho, T., et al. Antibacterial action of plasma multi-jets in the context of chronic wound healing. Appl Sci. 11 (20), 9598(2021).
  22. Tharmalingam, N., et al. Mefloquine reduces the bacterial membrane fluidity of Acinetobacter baumannii and distorts the bacterial membrane when combined with polymyxin B. mBio. 16 (4), e0401624(2025).
  23. Fu, Z., et al. Enhanced photothermal therapy for oral cancer using benzothiadiazole-based nanoparticle-loaded hydrogels. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 53 (1), 345-360 (2025).
  24. Chiang, C. Y., et al. Synthesis of photoresponsive hybrid alginate hydrogel with photo-controlled release behavior. Carbohydr Polym. 119, 18(2015).
  25. He, L., et al. Multifunctional dynamic chitosan-guar gum nanocomposite hydrogels in infection and diabetic wound healing. Carbohydr Polym. 354, 123316(2025).
  26. Jaishi, L. R., et al. Metal-Organic Frameworks (MOFs)-based piezoelectric-colorimetric hybrid sensor for monitoring green leaf volatiles. ACS Sens. 9 (12), 6553-6562 (2024).
  27. Wang, J., et al. Cellulose nanocrystals-based optical organohydrogel fiber with customizable iridescent colors for strain and humidity response. Int J Biol Macromol. 275 (Pt 1), 133501(2024).
  28. Su, W., et al. Intelligent response agarose/chitosan hydrogel wound dressing: Synergistic chemotherapy, PDT and PTT effects against bacterial infection. Int J Biol Macromol. 298, 139927(2025).
  29. Haidari, H., et al. Bacteria-activated dual pH- and temperature-responsive hydrogel for targeted elimination of infection and improved wound healing. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (46), 51744(2022).
  30. Dong, J., et al. Vacancies-rich Z-scheme VdW heterojunction as H2S-sensitized synergistic therapeutic nanoplatform against refractory biofilm infections. Biomaterials. 320, 123258(2025).
  31. Tang, J., et al. Revolutionizing pressure ulcer regeneration: Unleashing the potential of extracellular matrix-derived temperature-sensitive injectable antioxidant hydrogel for superior stem cell therapy. Biomaterials. 314, 122880(2025).
  32. Qiu, L., et al. Ultrasound-activated piezoelectric heterojunction drives nanozyme catalysis to induce bacterial cuproptosis-like death and promote bone vascularization and osseointegration. Biomaterials. 320, 123249(2025).
  33. Lai, Y., et al. Advanced healing potential of simple natural hydrogel loaded with sildenafil in combating infectious wounds. Int J Pharm X. 9, 100328(2025).
  34. Chen, S., et al. Quaternized chitosan-based photothermal antibacterial hydrogel with pro-vascularization and on-demand degradation properties for enhanced infected wound healing. Carbohydr Polym. 355, 123350(2025).
  35. Shan, J., et al. End-tail soaking strategy toward robust and biomimetic sandwich-layered hydrogels for full-thickness bone regeneration. Bioact Mater. 49, 486-501 (2025).
  36. Zheng, Y., et al. Hydrogel promotes bone regeneration through various mechanisms: a review. Biomed Tech (Berl). 70 (2), 103-114 (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gecontroleerde afgifte van geneesmiddelenantimicrobi le activiteitpH responsieve hydrogeltemperatuurresponsieve hydrogelvasculaire endotheliale groeifactoranti inflammatoir effectgeneesmiddelafgifte hydrogel

Gerelateerde artikelen